（应用化学专业论文）猪胰脂肪酶在介孔材料SBA15中的固定化及其催化活性.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 酶作为一种生物催化剂，具有立体选择性、区域选择性，特别是在高温下或 在有机溶剂中容易失活，不能大量应用在工业和医药等领域。由于酶可以在常温、 常压等温和的反应条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应能在酶的催 化下顺利地完成。酶一般必需在温和的条件下才有的催化作用在实际运用中也就 带来了很多问题，从而限制了酶制剂产品的使用和开发，固定化酶就是在这种情 况下产生的。通过固定化，多次重复使用，降低了生产成本，减少了操作的复杂 性，同时固定化酶的耐高温和耐酸碱能力也有所提高。 以三嵌段共聚物表面活性剂p 1 2 3 形成的聚集体为模板剂，在酸性水热环境下 合成棒状介孔材料s b a 15 。通过s a x r d 、n 2 吸附脱附、f t i r 、t e m 和s e m 对样 品进行了表征，结果表明静止状态下所合成s b a 1 5 介孔材料具有长程有序的六方 状介孔结构，样品形貌呈现规则的棒状结构，其棒的长度大约为1 - 2p m ，宽度大 约为o 3p m 。样品具有较高的比表面积4 9 0m 2 9 、孔体积1 0 4c m 3 9 ，孔径为7 6 3 n m ，对于粒径为4 6 2 6 1 1n m 3 的脂肪酶分子很容易进入到介孔材料的孔道中。 以棒状介孔材料s b a 1 5 y o 载体对p p l 进行固定化，通过s a x r d 、n 2 吸附脱附、 f t i r 对介孔材料s b a 1 5 固定化p p l 样品进行了表征，结果表明脂肪酶的进入并没 有破坏棒状介孔材料s b a 1 5 孔道的结构。脂肪酶催化三乙酸甘油酯水解时，主要 研究了催化活性、热稳定性和重复利用次数。与自由酶相比，固定酶的耐碱性和 耐高温能力都有所提高。特别是在6 0o c 条件下，固定化酶的热稳定性要比自由酶 的稳定性好。由于酶的泄露，在重复利用5 次后，固定化酶的活性仍有其最初活性 的3 2 。 在酸性水热环境下以p 1 2 3 为模板剂、t e o s 为硅源合成了光纤状的介孔材料 s b a 一1 5 ，通过s a x r d 、n 2 吸附脱附、t e m 和s e m 对样品进行了表征、分析。结 果表明合成的光纤状的s b a 1 5 介孔材料具有长程有序的六方介孔结构，主要由大 约长为1 0p m 、宽约为0 5p m 棒状结构聚积而组成，样品形貌呈现规则的光纤状结 构。以光纤状介孔材料s b a 1 5 为载体对p p l 脂肪酶进行固定化，主要研究了不同 固定时问o - 3 6h 和不同缓冲溶液的p h = 5 0 - 1 0 0 对脂肪酶分子物理吸附的影响，酶 的最大固定量为9 2 6m gg ，但其酶活性却不是最大，固定酶最大催化活性为p h = 6 0 和3h 。固定酶和自由酶催化三乙酸甘油酯水解的最佳p h 值都为7 o ，但固定酶 却有较宽的p h 适应范围( 6 旧o ) 。我们同时也研究了固定化酶的热稳定性和重复利 用次数，在6 0o c 条件下，固定化酶的热稳定性比自由酶的稳定性好，固定化酶在 催化水解2h 仍保留最初酶活的4 2 ，而自由酶在反应进行1h 时的活性却只有最初 摘要 酶活的2 8 。由于酶的泄漏，在重复利用5 次后，固定化酶活性可保持最初活性的 4 0 。 关键词：棒状s b a 1 5 ；光纤状s b a 1 5 ；猪胰脂肪酶；固定化；三乙酸甘油酯 山东轻工业学院硕士学位论文 a b s t r a c t e n z y m e sc a t a l y t i cr e a c t i o n sh a v eh i g he h e m o - ，r e g i o - ，a n ds t e r e o - s e l e c t i v i t y u n f o r t u n a t e l y ，t h e ya l en o ta l w a y ss u i t e dt oi n d u s t r i a lo rm e d i c a la p p l i c a t i o n s t h e ya r e o f t e nu n s t a b l ea n ds h o wl o wa c t i v i t yi no r g a n i cs o l v e n t so ra th i g ht e m p e r a t u r e s d e n a t u r a t i o no ft h ee n z y m e ，w h i c hd e s t r o y si t sc a t a l y t i ca c t i v i t y ，c a no f t e nb ei n d u c e d b yp ha n dm e c h a n i c a lo rt h e r m a lt r e a t m e n ta sw e l la st h ec o m p o s i t i o no ft h ea d s o r b e n t t h i si su n e c o n o m i c a la sa c t i v ee n z y m eb e i n gl o s t t h e s ed i s a d v a n t a g e so fe n z y m e sc a n b eo v e r c o m eb yi m m o b i l i z a t i o no ft h ee n z y m eo n t os o l i ds u p p o r t s i m m o b i l i z a t i o no f e n z y m e so ni n o r g a n i cm a t e r i a l se n s u r e sr e u s a b i l i t yo fe n z y m e s ，m i n i m i z e st h ec o s to f p r o d u c t i o n ，a n do v e r c o m e st h ee c o n o m i cd r a w b a c ka s s o c i a t e dw i t ht h e i ru s e i m m o b i l i z a t i o na l s op r o v i d e so p e r a t i o n a lf l e x i b i l i t ya n di m p r o v e se n z y m e st h e r m a la n d c h e m i c a ls t a b i l i t yu n d e re x t r e m ec o n d i t i o n s r o d l i k es b a - 15 m e s o p o r o u s m a t e r i a lw a s s y n t h e s i z e du s i n ga m p h i p h i l i c p l u r o n i cp o l y m e rs u r f a c t a n tpl2 3 ( e 0 2 0 p 0 7 0 e 0 2 0 ) a ss t r u c t u r e d i r e c t i n ga g e n t t h e s a m p l ew a sc h a r a c t e r i z e db ys e m ，t e m ，s a x r d ，n 2a d s o r p t i o n d e s o r p t i o ni s o t h e r m s a n df t i rs p e c t r a s t a t i cc o n d i t i o n sr e s u l t e di nt h ef o r m a t i o no ft h em o n o d i s p e r s e d r o d - l i k em a t e r i a lw i t har e l a t i v e l yu n i f o r ms i z eo fc a 0 3p mi nw i d t ha n d1 - 2l a mi n l e n g t h i th a dah i g hs p e c i f i cs u r f a c ea r e ao f4 9 0m 2 旷，at o t a lp o r ev o l u m eo f1 0 4 c m 。旷。a n dap o r ed i a m e t e ro f7 6 3n n l t h ep o r ed i a m e t e rw a sl a r g ee n o u g hf o r a c c o m m o d a t i n gp o r c i n ep a n c r e a t i cl i p a s e ( p p l ，4 6 2 6 1 1b 1 t 1 3 ) m o l e c u l e si n s i d e t h ec h a n n e l s t h ep h y s i c a la d s o r p t i o ni m m o b i l i z a t i o no fp p lo nt h er o d l i k es b a 一15 m e s o p o r o u s m a t e r i a li nb u f f e rs o l u t i o n sw a ss t u d i e dv i aad i r e c t o n e s t e p i m m o b ili z a t i o nm e t h o d t h er e s u l t so b t a i n e db ys a x r da n dn 2a d s o r p t i o n d e s o r p t i o n i s o t h e r m sc l e a r l ys h o w e dt h a tp p lw a sa d s o r b e di n t ot h ec h a n n e l so fs b a 1 5a n dt h e o r d e r e dm e s o p o r o u ss t r u c t u r eo fs b a - l5a f t e ra d s o r p t i o no fp p lw a sr e t a i n e d t h e c a t a l y t i ca c t i v i t y ，t h e r m a ls t a b i l i t y ，a n dr e u s a b i l i t yo ft h ei m m o b i l i z e dp p lw e r e m e a s u r e di np h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o nb yh y d r o l y s i so ft r i a c e t i n t h ei m m o b i l i z e dp p l s h o w e de x c e l l e n ta d a p t a b i l i t ya th i g h e rp ha n db e t t e rt h e r m a ls t a b i l i t yc o m p a r i n gw i t h f r e ep p l t h ei m m o b i l i z e dp p lh a dag o o dt h e r m a ls t a b i l i t yw h e ni tw a si n c u b a t e da t 6 0o c t h er e l a t i v ea c t i v i t yo fi m m o b i l i z e dp p lo nr o d 1 i k es b a 1 5h a sb e e nf o u n dt o b e3 2 o fi t so r i g i n a l a c t i v i t ya f t e rt h ef i f t hr e u s ed u et ol e a k a g eo fl i p a s e sf r o mt h e c h a n n e l so ft h em e s o p o r o u sm a t e r i a l a b s t r a c t f i b e r - l i k es b a - 15m a t e r i a lw i t hh i g h l yo r d e r e dm e s o s t r u c t u r e sh a v eb e e np r e p a r e d b yao n e - s t e ph y d r o t h e r m a ls y n t h e s i sm e t h o do ft e t r a e t h o x y s i l a n e ( t e o s ) i na na c i d i c s o l u t i o nu s i n gs u r f a c t a n tp12 3a ss t r u c t u r e - d i r e c t i n gr e a g e n t t h ep r e p a r e dm a t e r i a l s w e r ec h a r a c t e r i z e db yt e m ，s a x r d ，f t i ra n dn 2a d s o r p t i o n d e s o r p t i o ne x p e r i m e n t s s b a 一15h a saf i b e r l i k em o r p h o l o g y ，b ys t a c k i n ga n dc o u p l i n go fr o d - l i k ep a r t i c l e so f w h i c hr e s p e c t i v el e n g t ha n dw i d t ha r ec a 1 ma n dc a 0 5l a m a ni m m o b i l i z e d e n z y m eh a db e e np r e p a r e db yi n c o r p o r a t i o no fp p li nt h ec h a n n e l so ff i b e r l i k e s b a 一15 t h ep h y s i c a l a d s o r p t i o n s o fp p lo nt h ef i b e r l i k es b a - 15m e s o p o r o u s m a t e r i a li nb u f f e rs o l u t i o nw i t hd i f f e r e n tp hv a l u e s ( p h = 5 - 1 0 ) a n dt i m e s ( 0 - 3 6h ) h a d b e e ns t u d i e d ah i g hl i p a s el o a d i n g ( 9 2 6m ge n z y m ep e rg r a ms i l i c a ) c a nb eo b t a i n e d ， b u ti td i s a g r e e dw i t ht h eh i g hc a t a l y t i ca c t i v i t y t h ea d s o r b e dm a x i m u ma c t i v i t i e sw e r e o b s e r v e da tp h = 6 0a n d3h t h eo p t i m a lp ho ft h eh y d r o l y s i so ft r ia c e t i nf o rt h e i m m o b i l i z e da n df r e ep p lw a sa t7 0 t h ei m m o b i l i z e dp p ls h o w e dm u c hm o r e e x c e l l e n ta d a p t a b i l i t yo ft h eh y d r o l y s i so ft r i a c e t i nc o m p a r e dt of r e ep p ld u r i n gp h2 6 0 _ 9 0 m e a n w h i l e t h et h e r m a ls t a b i l i t yo ft h ec a t a l y s ta n di t sr e u s a b i l i t yw e r et e s t e d b yp e r f o r m i n gs u b s e q u e n tr e a c t i o nc y c l e so fh y d r o l y s i so ft r i a c e t i n t h ei m m o b i l i z e d p p lh a dag o o dt h e r m a ls t a b i l i t yw h e ni tw a si n c u b a t e da t6 0o c t h er e l a t i v ea c t i v i t yo f i m m o b i l i z e dp p lh o l do v e r4 2 o ft h ei n i t i a lh y d r o l y s i sa c t i v i t ya f t e rr e a c t i o n2h ， w h i l et h a to ft h ef r e ep p lr e m a i n e do n l y2 8 o ft h ei n i t i a la c t i v i t ya f t e rr e a c t i o n1 h t h ea c t i v i t yo ft h ei m m o b i l i z e dp p lf e l lo f fr a p i d l yt ob e4 0 o fi t so r i g i n a la c t i v i t y a f t e rf i v es u c c e s s i v eb a t c hr e a c t i o n s k e yw o r d s ：r o d - l i k e s b a 一15 ，f i b e r l i k es b a - 15 ，p o r c i n ep a n c r e a t i c l i p a s e ， i m m o b i l i z a t i o n ，t r i a c e t i n 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名：日期： 学位论文知识产权权属声明 年月乒日 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名： 日期：2 仁年上月卫同 易一蝽她衅 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 脂肪酶简介 脂肪酶( 1 i p a s ee c3 1 1 3 ) 全称为甘油三酯基水解酶，是一类特殊的酯基水解 酶，它能在油水界面上催化酯水解和醇解、酯合成、酯交换、内酯合成、多肽合 成、高聚物合成及立体异构体拆分等有机反应，是目前被重点研究的酯催化剂【l ，2 】。 它可将甘油三酯分解成脂肪酸和甘油或进行其逆反应，它的底物甘油三酯的醇部 分是甘油，而酸部分是水不溶的1 2 个碳原子以上的长链脂肪酸。根据酶水解特性 可分为1 ，3 一位置特异性脂肪酶和无特异性脂肪酶。脂肪酶催化水解反应的特征在 于，酶是溶于水的，而底物却不溶于水，因此催化反应只能在油水接触的界面上 进行p 引。影响反应速度的主要因素是界面面积。可以说，脂肪酶是一种专门在异 相系统( 油一水) 界面上水解特殊酯( 脂肪酸甘油酯) 类的酶。脂肪酶在动植物的各种组 织及许多微生物中普遍存在，对它的研究已有上百年的历史。1 8 3 4 年就有报道兔 胰脂肪酶；1 8 5 4 年报道胃脂肪酶；1 8 7 1 年报道植物种子脂肪酶。微生物脂肪酶具 有较高的催化性能，与其它催化剂相比，脂肪酶所催化的反应具有更加优越的特 点。酶的反应具有高催化活性和较强专一性、选择性，反应的副产物少，在较温 和的条件下进行反应，耗能少，设备投资小，对环境无污染，产品质量好卜1 2 j 。 脂肪酶的活性中心具有特殊的催化特性，这个特性和脂肪酶的结构相关。早 在1 9 9 0 年，人们就开始了对脂肪酶的三维结构进行阐述。 1 1 1 脂肪酶的“盖子”结构 脂肪酶的结构中，令人特别感兴趣的是，脂肪酶的活性位点上有一个螺旋型片 段的“盖子”1 1 3 , 1 4 j ，盖子的存在使酶的活性中心与分子表面被隔开，形成由暴露憎水 基包围的、由亲水基组成的脂肪酶亲电区( 氧负离子洞) 。对脂肪酶的化学修饰和固 定化，或者是生物印迹对脂肪酶催化活性的改变，与“盖子”的重新定向排列不无关 烈”j 。在底物( 如酸、醇或酯等) 存在的情况下，酶的构象发生变化，“盖子”就被打 开，含活性部位的疏水基团就暴露出来，这样就易于与底物结合了。其原因在于， “盖子”中n 螺旋的双亲性会影响脂肪酶和底物在油水界面的结合能力，其双亲性的 减弱将导致脂肪酶活性的降低。“盖子”的外表面相对亲水，而其面向催化部位的内 表面则相对疏水，由于脂肪酶和油水界面的缔合作用，使盖子张开，活性部位得 到暴露，这使得底物和脂肪酶的结合能力增强，此时底物就容易进入疏水性的通 道而与活性部位结合，形成酶一底物复合物。 图1 1 显示了一种l i p a s e 活性位点的三维结构，以及三元组氨基酸残基和盖子结 构。研究袤明，来源小川的脂肪酶，其氨基酸组l 成数日从2 7 0 - 6 4 1 小等，氨牡酸的 顺序l l ，能有很大的差别，脂肪酶的分子量为2 9 0 0 0 1 0 0 0 0 0 道尔顿，f i = 山十重物的 同游性和进化过程的保i r 性，其活性i l ，心i 基域的氩基酸序列还是非常相似的。火 部分脂肪酶是一娄丝氩酸水解酶，尽管氧基酸序列有些许羞别，但是都具有相似 的折叠方式和活性- p 心立体结构。般地，脂肪酶的多肽链折叠成两个结构域， 即n - 术端和c 术端结构域，n 木端的活性部位什条t 4 以结合长链脂肪酸的疏水 性通馗，泼通道从催化部位的s e r 直剑分了的表面”“。对于干h 似的活性l l 心，人们 通过对多种脂肪酶进行克隆和表达，并利i j x 衍射等手段和定向修饰等技术删定了 廊的馘坫酸组成、品体结构、等屯点等。 “：群裟擘糍。每：；激嚣羔：嬲嚣；“ 嘲】lj j r 胁酶活性中心的一维结构 1 1 2 脂肪酶的催化机理 月 胁蟛的活性催化部位主要山个催化一联体( t r i a d ) 构成：即组氦酸( h i s ) 、色 氨酸( s e 呻和天冬氨酸( a s p ) m i 。通常情况下，脂肪酶的活性中心丝氨酸残基的侧镀 构缘在空叫结构方面与丝氨酸蛋白酶的非常相似所不l 刊的是脂肪酶的活性中心 隐藏存蚩r 1 质内部，而被不刊的“盖子”所覆盖。脂肪酶的特殊的结构特点导致其特 有的应川价值。脂肪酶区别下其他酯酶主要在于脂肪酶作用于油一水界面，而且表 现出特有的界而活性( i n t e r r a c i a la c t i v a t i o n ) ”。b r o c k e h o r 刑睦h 了脂肪酶在油一水界 面定向的假设模型( 见幽l2 ) 。所谓的界面被认为是两个彼此分离的完全不同的相 差，在分了水平上相当于两个临接的有序分子层，一个比较亲水，一个比较疏水， 这个特性和脂胁酶的结构相关。对界l h j 的形成可提高脂肪酶活性的理论解释如f ： 山东轻工业学院硕士学位论文 ( 1 ) 所有脂肪酶的一级结构都相似，包括重要区域h i s xyg l y z s e r w g 或 y g l y h i s s e r - w - g l y ( 这里x 、y 、z 、w 表示基因氨基酸残基) ；( 2 ) 活性中心部位 是丝氨酸残基被仅螺旋掩盖，当脂肪酶与界面相接触时，此盖打开，通过亲电子域 的创造导致脂肪酶的构象改变，此亲电子域在丝氨酸残基周围，由疏水残基的暴 露和亲水残基的包埋来完成。从而增加了脂类底物复合物的亲和性，并稳定了催 化过程中的过渡态中间产物1 2 0 1 ，而酶分子的周围通常存留一定量的水分，从而保 证在油一水界面和有机相中的自体激活。脂肪酶在油一水界面上被激活的比率很高， 可达1 0 倍以上( 水解活力) 。脂肪酶的催化特性在于在油水界面上其催化活力最大， 这早在1 9 5 8 年被s a r d a 和d e s n n e l v 发现。 1 2 脂肪酶的修饰 r o ： 图1 2 脂肪酶油一水界面定向假设模型 1 2 1 脂肪酶的固定化 固定化酶的研究始于1 9 1 0 年，正式研究于2 0 世纪6 0 年代，7 0 年代已在全世界 普遍开展。脂肪酶的固定化是酶工程的核心内容，近年来人们对该领域投入了极 大的关注，对固定脂肪酶的深入研究有利于脂肪酶的工业应用的发展。游离酶一 般不溶于有机溶剂，在有机溶剂中会聚集成团，而且在有机溶剂中非常不稳定， 使用后也不易分离。固定化酶( i m m i b o l i z e de n z y m e ) 是指在一定空i 日j 内呈闭锁状态 存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。与游离酶相比， 固定化酶具有下列优点【2 u ： ( 1 ) 扩大了酶与底物的接触面积，有利于底物分子的扩散； ( 2 ) 易将固定化酶与底物、产物分开； ( 3 ) 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应； ( 4 ) 在大多数情况下，提高了酶的热力学稳定性； ( 5 ) 酶反应过程能够加以严格控制； ( 6 ) 产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺； 3 第l 章绪论 ( 7 ) 较游离酶更适合于多酶反应； ( 8 ) 可以增加产物的收率，提高产物的质量； ( 9 ) 酶的使用效率提高，成本降低。 虽然固定化技术具备如上的优点，解决了一些传统的问题。但是脂肪酶的价格 较高，并且由于酶分子从游离态变成结合于载体的状态，酶分子的构象发生了改 变，也就带来了一系列新的问题1 2 2 】： ( 1 ) 酶固定化过程中发生的物理化学变化会使酶的活性中心受损，致使酶的活 性降低； ( 2 ) 只能用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物； ( 3 ) 酶连接在固相载体上后，酶的构型和活性中心都会发生改变，而且载体侧 链可能和骨架造成空间位阻，从而影响了底物接近酶分子； ( 4 ) 与完整菌体相比不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应； ( 5 ) 胞内酶必须经过酶的分离手续； ( 6 ) 固定化酶的机械性能较差； ( 7 ) 固定化颗粒成型困难。 1 2 2 固定化酶的制备方法 脂肪酶是由生物细胞产生的具有催化活性的蛋白质，对环境十分敏感，物理 因素、化学因素和生物因素的变化均有可能导致酶活力的丧失1 2 ”5 1 。单纯使用天 然酶进行催化时，天然酶提取过程繁琐，不易回收，反应后的体系中残留有大量 的酶蛋白，不利于产物分离，从而造成催化反应的成本极为昂贵，不利于工业化 生产1 2 8 1 。因此人们普遍采用固定化酶的方法对酶进行修饰，以提高生物酶的经 济价值。 酶在进行催化作用时，需要酶本身具有特有的高级结构和活性中心。此活性 中心具有二个机能不同的部位。一是参与酶促反应的反应部位，或称催化部位； 另一是支配反应时对底物有高度专一性的专一部位，或称结合部位。这些部位， 在各种酶中都分别由一定的某些氨基酸残基所形成。酶在固定化状态下发生催化 作用时，需要保持这些结构，并且要使这些活性中心的氨基酸残基不起变化1 2 2 1 。 在活性中心的氨基酸残基或高级结构发生变化时，就会出现完全没有酶促作用或 改变酶对底物的专一性。在酶蛋白的高级结构中，为了保持氢键、疏水键、离子 键等比较弱的键，在固定化时，应避免高温、强酸、强碱处理。此外，有机溶液、 浓的盐类有时也会使酶失活，所以应在极其缓和的条件下进行固定化【3 3 - 3 引。 传统的酶的固定化方法可分为三类【3 6 】：物理吸附法、物理包埋法、化学键合法 ( 共价法和交联法) 。 4 山东轻工业学院硕士学位论文 ( 1 ) 吸附法 吸附法是一种常用的方法，在经济上也最有吸引力，只要将酶液于具有活泼 表面的吸附剂接触，再经洗涤去未被吸附的酶，便能制得固定化酶。这种方法的 优点是成本低，操作简单，固定化条件温和，载体能再生，固定化酶活力高。在 脂肪酶的固定化方法中，吸附法研究得较多。 ( 2 ) 包埋法 将酶包埋在高聚物内，是一种反应条件温和，很少改变酶结构的固定化方法。 此法的缺点是只有小分子底物可以通过高聚物网架扩散，对那些底物和产物是大 分子的酶并不合适。包埋法分为：凝胶包埋法和微囊包埋法。 ( 3 ) 化学键合法( 共价法和交联法) 这种方法是研究中最活跃的一类方法。其原理是酶蛋白分子上的功能基团和 固体支持物表面上的反应基团之间形成共价键，因而将酶固定在支持物。 共价交联法的基本原理是酶分子和功能试剂之间形成共价键得到三相的交联 网架结构。用多功能试剂进行酶蛋白分子之间的交联，除了酶分子间的交联外， 还存在一定程度的分子内交联。大多数传统的固定化是将酶固定在水不溶的有机 大分子上，这样虽然能方便地将酶与底物产物分离，也可以使酶得到回收利用， 但也减弱了酶的催化能力，所以研究者就利用水不溶大分子间可通过次级键合力 形成不溶性大分子复合物沉淀作为酶的载体。 1 3 介孑l 材料 根据国际纯粹与应用化学联合会( i u p a c ) 的建议，纳米孔材料可做以下简单分 类：孔径小于2 0n l n 的为微孔材料，孔径大于5 0 0n n l 的为大孔材料，而孔径介于 2 0 - 5 0 0a m 之间的则为介孔材料。其中微孔分子筛( 包括活性炭硅、钙石等) e h 于孔 道太小而在大分子的吸附分离催化等方面的应用受到很大的限制，而大孔材料( 包 括多孔陶瓷、气凝胶水泥等) 虽然孔径较大，但由于其孔径分布太宽，而在立体选 择性吸附脱附及催化等方面存在严重的局限性。 而新一代的介孔材料由于具有较大的比表面积和孔体积；均一的且在纳米尺 寸上连续可调的孔径；从一维到三维的规则有序的孔道结构；可控的形貌，如膜、 片、球等；表面基团可官能化；s i 0 2 无生理毒性等一系列优点，使得它们在大分子 或大离子吸附和分离、化学传感器、生物医学化工催化、环境保护以及纳米材料 的合成等领域，展现出较传统沸石分子筛无可比拟的优越性和广阔的应用前景。 因此自从1 9 9 2 年美国m o b i l 公司科学家首先成功地利用烷基季铵盐阳离子表面活 性剂为模板剂，合成出孔径在1 5 1 0a m 范围可调变的新型m 4 1s 系列氧化硅铝基有 序介孔分子筛以后【3 7 , 3 8 1 ，介孔材料的研究迅速成为国际上的一个研究热点，尤其 是近年来，随着合成技术的不断创新，h m s 、m s u 、s b a 介孔材料系列，a 1 2 0 3 、 5 第1 章绪论 p b 0 2 、f e 2 0 3 、w 0 3 、v 2 0 3 、m 0 0 3 、z r 0 2 等金属氧化物，介孔物质部分金属硫化 物、磷酸盐分子筛以及上述硅基介孔分子筛的金属杂原子衍生物不断见诸报道， 使介孔材料的研究呈现出蓬勃发展的景象。有关它们的合成方法、合成机理、骨 架改性、表面修饰等方面的研究已经取得了丰硕的成果 1 3 1 介孑l 材料的合成 合成介孔材料的常用方法是水热合成法，室温合成法f 3 9 】、微波合成法【4 0 1 、湿 胶焙烧法、相转变法【4 2 1 及在非水体系中【4 3 】合成也有一些报道。典型的介孔材料 的合成体系由表面活性剂模板构成，分子筛骨架的无机物种和溶剂相组成。选择 无机相的主要理论依据是s 0 1 g e l 化学，即原料的水解和缩聚速度适当，且经过水热 过程等处理后，提高其缩聚程度。根据目标介孔材料的骨架组成，元素无机物种 可以是直接加入的无机盐，也可以足水解后可以产生无机低聚体的有机金属氧化 物，如s “o e t ) 4 、a l ( i o p r ) 3 等。 在不同的合成体系中，形成介孔分子筛的一个共同点是表面活性剂极性头和 无机物种存在。界面组装作用力改变两相界面作用力的不同类型( 如静电作用、氢 键作用或配位作用) 或调变其相对大小( 如调变胶束表面电荷密度可以调节两相静 电引力大小，调变反应温度可以调节氢键作用粒大小等) 可以使合成路线多样化。 利用不同的界面组装作用，使用不同的表面活性剂和无机物种形成特定的合成体 系，可以得到结构形貌和孔径大小不同的介孔分子筛，这些为促进介孔分子筛在 不同领域的应用开发奠定了基础。 用于合成介孔分子筛的表面活性剂根据亲水基电性质的不同主要分为四个类 型： ( 1 ) 阴离子型， c m h 2 m + l o s 0 3 n a 等； ( 2 ) 阳离子型， c m h 2 m + , ( c h 3 ) 3 n + c i ； 具有带负电的极性基团，常用的有c m h 2 m + i c o o n a ，或 具有带正电的极性基团，常用的有c m h 2 m + l ( c h 3 ) 3 n + b r 或 ( 3 ) 非离子型，极性基团不带电，常用的有长链烷胺c m h 2 m + l n h 2 以及聚氧乙烯 聚氧丙烯共聚物( p e o p p o ) 等； ( 4 ) 两性型，带两个亲水基团，一个正电、一个负电，如三甲基胺乙内酯( 一 端是带正电的四元铵基另一端是带负电的羧基) 等。 用不同类型的表面活性剂作为模板可以有不同的合成途径。 考虑到表面活性剂的本性、溶胶凝胶化学、电荷匹配以及溶剂等多种因素， 根据表面活性剂与无机离子的作用方式的差异，合成介孔分子筛时可以选择不同 的路线。在碱性溶液中，合成硅酸盐介孔材料过程中，氧化硅物种是低聚的硅酸 根阴离子( i 。) ，因此使用表面活性剂阳离子s + 来使带负电荷的无机物种i 。有序化，即 6 山东轻工业学院硕士学位论文 通过电荷库仑力使有机无机相互作用( s + i 。作用) ，从而产生有机无机介观结构。s r 作用产生介观结构的例子是阳离子离聚的铝十三聚体k e g g i n 离子与阴离子表面活 性剂如十二烷基磺酸盐相互作用。相同的种类电荷有机无机组合也是可能的，但 是需要一相反的电荷离子存在，例女u s + x 。r 相互作用，这里s + 是季铵盐阳离子表面 活性剂，x 是c l 等卤素离子，也可以是s 0 4 2 ，n 0 3 。，r 是在强酸性溶液中带电荷 的氧化硅物种。在酸性介质中全硅介孔材料，开始是s + x i + 靠库仑静电力相互作用， 更确切地说是通过氢键相互作用，然后逐渐变成结构为i + x s + 的产物，与此相对应 的是s 。m + i 。( m 也可以是n a + ，k + 等阳离子) 。在基本上没有电荷参与的介孔结构也能 生成s o i o 组合，s o 是中性的有机胺表面活性剂或非离子表面活性剂，这种s o l o 实质 是通过氢键相互作用的，但这种氢键相互作用，并非很纯。s o 和i o 在酸碱介质中都 可以部分质子化或带有电荷，因此纯粹的s o i o 作用是不存在的。有机物和无机物种 也可以通过配位键s i 连接作用，例如乙氧基铌( v ) 与长链烷基胺在无水条件下反 应，生成过渡金属氧化铌介孔结构。另一个组合是共价键s i 作用，例如使用含硅 的表面活性剂作为模板剂，与来自其它硅源的氧化硅物种反应生成介孔材料。总 之在这些过程中，所合成介孔材料的有序度与自组装过程中的无机有机作用力大 小密切相关。 不同的反应条件可以导致不同结构的介孔分子筛的生成。由于介孔材料的合成 对反应条件比较敏感，即使相同的原料和制备过程，但工艺参数的微小差异如表 面活性剂、反应温度、反应时i 日j 或水热条件的不同，也可以得到不同结构的介孔 材料。自从1 9 9 2 年m o b i l 公司合成出m 4 1 s 系列，六方相的m c m 4 1 、立方相的 m c m 一4 8 和层状的m c m 5 0 的介孔分子筛以后，一系列具有不同结构的分子筛相继 被合成： ( 1 ) f s m 1 6 ：1 9 9 0 年y a n a g i a w a 等【4 4 】将层状硅酸盐材料k a n e m i t e ( 组成为 n a h s i 2 0 5 3 h 2 0 ) ，与长链烷基三甲基铵( a t m a ) 在碱性条件下混合处理，发生离子 交换作用，得到孔径分布狭窄的三维介孔氧化硅材料。这是最早发现的氧化硅介 孔材料，但因其结构不够理想，当时没有引起注意。后来l n a g a k i 等1 4 5 j 对这种方法 进行了改进，提出了介孔材料的相转变模型，并深入探讨了f s m 的结构特征、吸 附行为及金属离子的掺杂性能。 ( 2 ) h m s ：这是t a n e v 等利用长链伯胺分子做模板剂，合成的一类具有六方结构 但长程有序度不是很好的介孔材料。他们认为反应是按照s o i o 途径通过氢键的作用 而生成【4 6 1 ，与利用阳离子表面活性剂合成的介孔材料相比，h m s 材料的孔壁较厚， 热稳定性和水热稳定性都有所提高，并且具有反应条件温和模板剂可以回收利用 等优点。但是c o m a l 4 。7 。，对此提出了质疑，认为还有部分静电机制在起作用。 ( 3 ) s b a m ：这是s t u c k y 等1 4 8 】报道的一种含有笼型结构的二氧化硅介孔材料。它 是利用双链结构的表面活性剂如c n h 2 n + l n + m e 2 ( c h 2 ) s n + m e 2 c m h 2 叶l ( 记作c n 母m ) 作 7 第l 章绪论 为模板剂，通过改变两侧或中间烷基链的长度和性质，在强酸性条件下合成的。 它包括三种结构类型立方相的s b a 1 、三维六方相s b a 2 及二维六方相s b a 3 。最 近该组又利用高分子量的嵌段共聚物为模板剂，合成出较大孔径的介孔材料。其 中使用聚环氧乙烷聚环氧丙烷聚环氧乙烷三嵌段共聚物( p e o p p o p e o ) 为结构 导向剂时，可合成出高度有序，孔径大小在4 6 - 3 0n n l 可调变，无机墙壁厚且水热 稳定的s b a 1 5 4 9 1 。使用具有较大p e o 链段的嵌段共聚物时，还可合成出立方笼状 结构的s b a 1 6 1 5 ，其晶胞参数可达到1 7 6n n l 。 ( 4 ) k i t 1 ：r y o o 等1 5 1 l 首先合成的一种结构无序的介孔氧化硅材料，与m c m 一4 1 材料相比，这种材料具有高的比表面积、均一的孔道结构，其特别之处为三维结 构。相互交错这有利于进行吸附、分离、催化等方面中的物质运输，因此在这些 方面具有一定的应用前景。 ( 5 ) m s u - x 这是一类用非离子表面活性剂为模板，通过氢键作用以s o i o 途径 合成的、长程有序度也不是很好的介孔材料【5 2 1 。其特点是反应条件温和，在中性 室温下即可进行，而且表面活性剂能够被生物降解，毒性较低，因此也有一定的 应用前景。 1 3 2 介孔材料的合成机理 由上述内容可知介孔材料主要通过可溶性硅源与表面活性剂胶束通过自组装 的方式形成，为解释介孔材料的形成机理，人们提出了多种模型。其中较有代表 性的有液晶模板机理、棒状自组装机理和协同作用机理。 ( 1 ) 液晶模板机理( l i q u i dc r y s t a lt e m p l a t i n gm e c h a n i s m ，l c t ) 液晶模板机理是介孔材料的黼b e c k s h k r e s g e 等1 3 7 , 3 8 1 为了解释m c m 一4 1 的 合成机理，根据介孔材料的微结构与表面活性剂在水溶液中形成的液晶结构相似 性而提出的。主要认为介孔分子筛的合成是以表面活性剂的不同溶致液晶相为模 板，其示意图如图1 3 所示。在该机理中他们认为表面活性剂首先在溶液中形成棒 状胶束，并规则地排列成为六方结构的液晶相。其次，在加入无机硅源物质后， 他们沉积在棒状胶束的周围从而形成以液晶相为模板的有机一无机复合物( 图1 3 a 途径) 。但是考虑到表面活性剂的液晶结构对溶液的性质非常敏感，他们又提出了 另外一种可能的反应途径。硅源物质的加入导致它们与表面活性剂胶束一起通过 自组装作用而形成六方有序结构( 图1 3 b 途径) 。根据l c t 机理，可利用表面活性剂 胶束的有效堆积参数与不同溶致液晶相结构之间的关系来指导如何利用不同结构 的表面活性剂或加入助剂来设计合成不同结构的介孔分子筛。 但是在实际的合成过程中使用表面活性剂的浓度一般远低于表面活性剂形成 液晶相所需要的最低浓度，例如在合成m c m 4 1 的过程中所用的表面活性剂十六烷 基三甲基溴化