（动物学专业论文）应用est同工酶与rapd对狼蛛科部分种属间的亲缘关系研究.pdf

摘要 本研究悫瘸霾工酶技术和r a p d 分子标记技术分裂探讨了蜘蛛磊 狼蛛科中部分属t f 7 的亲缘关系，褥出了如下结论。 i 在用同工酶电泳技术对狼蛛科3 属6 种间亲缘关系的研究中， 发现了： ( i ) 阉秘个体不嗣帮位e s t 嗣王酶霞其所含缝织、器官不阎覆存 在差异( 0 。2 5 0 7 5 ) ，可能和不同部位所执行的代谢疆动功能以及 蜘蛛消化道在体躯中的位置有关；另外同种不同地域及海拔高度的狼 蝾e s t 简工酶也有差剐( 0 2 5 p 0 7 5 ) ，这种差异与地理异质性有关， 瓣蛛生存环境麓謇然生态霞予对嚣工酶酶活性青一定静影晴。 ( 2 ) 同种蜘蛛不同个体的e s t 同工酶存在微小差异 ( 0 9 0 p o 9 5 ) ，这种篷别在种内相对较稳定；同种蜘蛛不同性别个 体也存在差异( 0 7 5 p 0 9 0 ) ，雄性个体的酯酶表达更为充分盛雌雄 性副上能差异大予个体差异。 ( 3 ) 同种个体不同发育时期的e s t 嗣工酶因其在不同发育阶段 的生理特点而存在较大差异( 0 2 5 p 0 7 5 ) ；同种不同饥饿时间处理 后个体e s t 同工酶无论是在酶带的条数及酶的活性上差异都较明显 ( 0 i o p o 。2 5 ) ，通过本次实验褥出，在对蜘蛛进行嗣王酶研究对， 最佳的饥饿处理时间在l 卜2 5 天之阀。 ( 4 ) 酯酶问工酶在狼蛛科低级阶元中县有稳定的种属特异性， 对这一类群的研究具有可行性，因而可以作为属内不同种之间 ( 0 7 5 p 0 9 0 ) 、不同属不同种之间( 0 2 5 p 0 7 5 ) 的分类指标之一， 溺时霹这一类群分类逑位豹搽索其奢一定价值。 2 本研究采用了与兹人不同的蜘蛛总d n a 提取方法研煺法， 成功地运用这简单、经济、高效的方法提取到了能完全满足 r a p d p c r 扩增需要的d n a 样品。改进后的蜘蛛类总d n a 提取方法简 便、恢速、对设备稀试裁要求都不赢，丽牧率和缝度都可满足实验的 要求，特别是对d n a 完整性要求较高的r a p d 技术。 3 应用r a p d 技术对常见的7 种狼蛛的遗传多样性进行了分析， 所得结论与现行的形态学分类相吻合，这说明r a p d 技术是近缘属种 分类鉴定的一种有效辅助手段，可以为桶蟓系统学的磷究提供掰酶分 子永平上的信息，有助于建立客观的分类体系，毯碍进一步探索研究。 关键词：狼蛛科，e s t 阊工酶，r a p d ，电泳，亲缘关系 l l a b s t r a c t i nt h i st h e s i s ，b ya p p l y i n gt h et e c h n o l o g yo fi s o e n z y m ea n d r a n d o m a m p lil ie d p o ly m o r p h icd n a ( r a p d )m a r k e r s ，w e r e s p e c t i v e l ys t u d y t h e g e n e t i cr e l a t i o n s h i p b e t w e e ns o m e s p e c i e si nw o l fs p i d e rf a m i l y t h ec o r o l l a r i e sa r ea sf o l l o w s ： i i nt h er e s e a r c ha b o u tt h eg e n e t i c r e l a t i o n s h i pt ot h es i x t h s p e c i e s ，t h et h i r dg e n e r ai nt h ew o l fs p i d e rf a m i l yb yu s i n g t h e t e c h n o o g yo fi s o e n z y m ee l e c t r i c - p u l s e ，w ef i n d ( 1 ) t h ed i f f e r e n c e s ( 0 2 5 p 0 7 5 ) e x i s ti nd i f f e r e n tp a r t s o fe s ti s o e n z y m e p a t t e r n s i nt h es a m ei n d i v i d u a ld u et o t h e d i f f e r e n c e si ni t s t i s s u e s ，s e g m e n t s ，a n dr e l a t i n gt ot h e m e t a b o l i s mo fi t sd i f f e r e n tp a r t sa n dt h es p i d e r sd i g e s t i n g c h a n n e l s p o s i t i o n i ni t s b o d y i na d d i t i o n ，t h e r ea r e d i f f e r e n c e s ( 0 2 5 p 0 7 5 ) i nw o l fs p i d e re s t e r a s e i s o e n z y m e p a t t e r n si nd i f f e r e n tg e o g r a p h i cr e g i o na n de l e v a t i o n ，w h i c h m a yr e l a t et o g e o g r a p h i c a lh e t e r o g e n e i t y t h e e c o l o g i c a l f a c t o r so ft h e1i v i n ge n v i r o n m e n to fs p i d e r sm a ye x e r tc e r t a i n e f f e c to na c t i v a t i o no f i s o e n z y m e ( 2 ) t h es l i g h td i f f e r e n c e s ( 0 9 0 p o 9 5 ) i ne s t e r a s e i s o e n z y m ep a t t e r n so fd i f f e r e n ti n d i v i d u a ls p i d e r so ft h es a m e g e n u sa r er e l a t i v e l ys t a b l ew i t h i nt h eg e n u s ：t h e r ea r ea l s o d i f f e r e n c e s ( 0 7 5 p 0 9 0 ) i n s e x u a l l yd i f f e r e n ti n d i v i d u a l l l i s p i d e r so ft h es a m eg e n u s ，w i t hm a l e sf u l l e re x p r e s s i o ni n e s t e r a s e m o r e o v e r ，t h ed i f f e r e n c e si ns e xa r ew i d e rt h a nt h o s e i ni n d i v i d u a l s ( 3 ) t h e r ea r e r e l a t i v e l y w i d ed i f f e r e n c e si ne s t e r a s e i s o e n z y m ep a t t e r n so ft h es a m ei n d i v i d u a li nd i f f e r e n tg r o w i n g p e r i o d s ，d u et ot h ep h y s i o l o g i c a lf e a t u r e si nd i f f e r e n tg r o w i n g p e r i o d s ：a f t e rt h ei n d i v i d u a le s t e r a s ei s o e n z y m e so ft h es a m e g e n u s a r et e s t e di nd i f f e r e n t h u n g r yt i m e ，t h e r ee x i s t r e l a t i v e l ya p p a r e n td i f f e r e n c e s ( 0 i o p o 2 5 ) e i t h e ro nt h e n u m b e ro fe s t e r a s ep a t t e r n so ro nt h ea c t i v a t i o no fe s t e r a s e w ec o n c l u d e b yt h i se x p e r i m e n tt h a tt h eb e s t h u n g r yt i m ei s 1 0 2 0 d a y s ( 4 ) t h ee s t e r a s ei s o e n z y m ei nl y c o s i d a ef a m i l yh a sas t a b l e p o l y m o r p h o s i s ，w h i c hi so ff e a s i b i1 i t yt ot h er e s e a r c ho ft h i s c a t e g o r y s ot h a tw e c a nt a k ei t a st h e i n d e n t i f i c a t i o no f l y c o s i d a e f a m i l yb e t w e e nt h ed i f f e r e n t s p e c i e so ft h es 锄l e g e n u s ( o 7 5 p 0 9 0 ) ，a n db e t w e e nt h ed i f f e r e n t s p e c i e si n d i f f e r e n tg e n e r a ( 0 2 5 p 0 7 5 ) ，a n da t t h es a m et i m ei t i so f s o m ev a l u et ot h er e s e a r c ha b o u tt h ec l a s s i f y i n g s t a t u so ft h i s c a t e g o r y 2 i n t h i s r e s e a r c h ，a n e w 、s i m p l e 、e c o n o m i c a l 、a n d h i g h e f f i c i e n c y m e t h o df o r s p i d e r s g e n o m i c d n a i v e x t r a c t i o n _ c t a b i s a p p l l e ds u c c e s s f u l l y t oe x t r a c tt h e n e e d e dd n as a m p l e s ，w h i c ha r ee n o u g ht os a t i s f yt h er e q u i r e m e n t o fe n l a r g e m e n to fr a p d p c r t h ei m p r o v e dm e t h o do fs p i d e r s g e n o m i c d n ae x t r a c t i o ni ss u c c i n c ta n d e x p e d i t i o u s ，w i t h r e l a t i v e l yl o wr e q u i r e m e n t st ot h ef a c i l i t i e sa n d r e a g e n t s i t s p r o d u c t i o na n d p u r i t yc a nm e e tw it ht h er e q u i r e m e n t so ft h e e x p e r i m e n t ，e s p e c i a l l yo ft h et e c h n o l o g yo fr a p d ，w h i c hh a sa h i g hr e q u i r e m e n tf o rt h ei n t e g r i t yo fd n a 3 t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo f7s p e c i e so fc o m m o nw o l fs p i d e r s i sa n a l y z e db ya p p l y i n gt h er a p dt e c h n o l o g y ，a n dt h er e s u l t i s s u i t a b l ef o rt h ep r e s e n tm o r p h o l o g i c a l t a x o n o m y ，w h i c hs h o w s t h a tt h er a p dt e c h n o l o g yi sa ne f f i c i e n tc o m p l e m e n t a r ym e t h o d f o rt h ec l a s s i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fc l o s e l yr e l a t e d s p e c i e sa n dg e n e r a i td e s e r v e saf u r t h e rs t u d ya n d e x p l o r a t i o n b e c a u s ei t i s h e l p f u l f o rt h e e s t a b l i s h m e n to f a s u b j e c t c l a s s i f i c a t i o n s y s t e mb y p r o v i d i n gi n f o r m a t i o nf o rt h e r e s e a r c ho f s p i d e rs y s t e m a t i c sa tn e wm o l e c u l a rl e v e l k e y w o r d s ：l y c o s i d a e ，e s t e r a s e i s o e n z y m e ，r a p dm a r k e r s e l e c t r o p h o r e s i s ，g e n e t i c r e l a t i o n s h i p v 应用e s t 同工酶与r a p d 对狼蛛科 部分种属间的亲缘关系研究 第一章前言 第一节同工酶技术的原理及其在蜘蛛类研究中的应用 1 1 1 同工酶技术的原理及应用 同工酶是指具有相同或相似的催化功能，但结构不同的一组酶。 它是由染色体上不同的基因或者同一基因的不同等位基因编码的，后 者又称为等位基因酶。它不是基因的直接产物，从基因到酶，即d n a 蛋白质，中间还要经过转录、转译过程，但也完全证明基因通过 转录、转译，确实决定着酶蛋白的合成，即酶蛋白的多肽链结构决定 于d n a 分子上基因的核苷酸排列顺序，所以同工酶结构的差异主要 来源于基因的差异。同工酶研究是从基因的产物来认识特定基因的存 在及其结构特征的，其生化表型反映了其基因型，这样就可从宏观现 象来探讨其微观结构。由此产生的同工酶技术是一种将蛋白质结构的 近代知识与同工酶概念联系起来，通过电泳和组织化学方法进行特异 性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带标记 出来的一种用于估计生物问蛋白质差异比较简便的方法【。 自出现后，随着同工酶分析方法的进步，同工酶技术很快成为在 分子水平上研究生物现象的一项重要手段，在医学、生理学、分类学、 病理学、遗传学、发育生物学、进化系统学及育种学中都得到了日益 广泛的应用。而在分类学方面，它最主要的贡献是在酶蛋白方面，其 优点在于能将调查的酶蛋白显色而不需要任何纯化方法，且用同一染 色方法和底物显示出的酶带在遗传和生化上是同源的，从而为酶蛋白 的遗传分析，进而对其变异和进化现象做快速的定量研究。实践证明， 同工酶电泳技术在分类学的三个水平，即种类识别和鉴定、分类阶元 的确立和进化关系的研究上都有十分广泛的应用前景。 应用电泳方法可以用于区分和识别近缘种。它所依据的原理是具 有生殖隔离的种类间无基因交流，各自保持独立的基因库，因而生殖 隔离的物种间常在一些座位上具有各自独特的等位基因。由电泳测得 类群之间同一酶位点上不同等位基因的频率，根据种群遗传学原理即 可判断它们之间是否发生过交配( 基因交流) ，从而确定它们的分类 地位。如霍绍棠等( 1 9 9 4 年) 【2 1 对形态分化不明显的几种赤眼蜂进行 了同工酶的比较研究，认为利用同工酶的电泳技术可区别赤眼蜂的近 似种和近缘种。唐烨等( 2 0 0 2 年) 3 j 用同工酶电泳技术对两种在生物 学、生态学及形态特征等方面极为相似的天牛进行了比较，结果表明 这两种天牛应归属为同一种，其中黄斑星天牛为其同物异名。 用电泳技术可解决类群的分类地位问题。由于自然界的复杂性， 个具有共同祖先的自然群，不一定全部成员都具有某种显而易见的 “代表性特征”，相反由于趋同的存在，表征总体相似程度很高的类 群，不一定具有共同的祖先，而不同的分类学家对生物的性状持不同 的理解和看法，因而对种类的归属看法不一。这种情况下，运用电泳 技术得出的数据，并结合其它资料能很好地解决这类争端。如王可玲 等( 1 9 9 4 年) 4 1 通过对中国近海带鱼9 个取样群体4 7 2 尾鱼的1 1 种 同工酶进行生化遗传分析，认为中国近海带鱼不是过去认为的一个种 的3 5 个种群，而是存在3 个不同种的8 个种群。黄原等( 1 9 9 9 年) 5 1 分析了癞蝗科3 属及一种共1 4 个种群的同工酶，证明了e s t 在属 内具有某些共性，其生化和形态特征结合进行的聚类分析提出：将短 鼻蝗属的3 个类群提升到属或至少是亚属的地位。 同工酶电泳技术在分类上应用最广泛的领域是关于种问亲缘关 系和发育进化的研究。方法是通过对被测种群或物种的大量位点控制 的同工酶的测定，计算各位点等位酶中出现的各等位基因的频率，再 应用r o g e r 和n e i 的遗传距离估算公式，求出类群间的遗传距离，在 此基础上用数值分类法或其它系统发育构建方法，可得到分类单元问 的系统发育关系图，以验证或改进由其它资料建立的分类关系。如李 绍文等( 1 9 8 9 年) 【6 】利用p a g e 法对6 种马铃薯1 4 种酶的1 7 个位点 进行了研究分析，并计算了种间遗传距离，建立了6 个种的演化关系。 张迎春等( 1 9 9 9 年) 7 1 对鞘翅目瓢虫科中几个常见属种的酯酶同工酶 谱进行比较研究，来探讨它们之间的亲缘关系和分类地位。 此外，同工酶电泳技术还可用于一个物种不同组织、不同发育阶 段的幼体、成体的识别和鉴定等生理生化方面的研究。因为许多基因 座位的酶在生物一生中都相同，而在不同种间却不同，这种物种特异 性的等位基因可用于鉴别卵、幼虫和成虫，并构建酶性状检索表。如 陈晓虹等( 2 0 0 0 年) 【剐对商城肥鲵7 种组织的酯酶、过氧化物同工酶 谱系进行研究，表明存在较大的组织特异性。郭晓霞等( 2 0 0 2 年) 9 1 利用凝胶电泳法研究菜粉蝶不同发育期的酯酶同工酶，探讨其在个体 发育过程中的作用。 总之，同工酶技术在动物分类学中的应用，打破了传统形态分类 学的局限性，为分类学的研究提供了新的方法、手段和依据，极大地 推动了分类学的发展，是分类学由宏观向微观发展的一次大跃进。 1 1 2 同工酶在蜘蛛目中的研究现状 在蜘蛛方面，国内学者已先后以同工酶为手段做过一些研究工 作。邱琼华等( 1 9 8 9 年) 1 0 l 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对陕西七 纺器蛛和拉土蛛进行了不同组织的酯酶同工酶比较，认为该酶的分布 具有组织特异性，在应用生化方法进行分类学的研究时，应该注意样 品来源的同一性；黄红等( 1 9 9 2 年) 1 1 1 对农田常见三种微蛛的同工 酶进行研究，指出酯酶同工酶不仅可以用于鉴定蜘蛛种类，而且还可 以用于研究蜘蛛的发育生物学；雷朝亮等( 1 9 9 2 年) 1 2 1 对星豹蛛捕 食猎物甜菜夜蛾前后其酯酶同工酶的变化进行了电泳分析，以探讨应 用电泳方法鉴定星豹蛛的猎物种类和捕食后的最佳检测时间；肖春 ( 1 9 9 5 年) 1 3 1 应用同工酶技术研究了雌性锥腹肖蛸体躯不同部位的 酯酶同工酶、过氧化物同工酶、乳酸脱氢同工酶，为进一步研究该蜘 蛛的生理及应用打下基础；肖春( 1 9 9 6 年) 【1 4 1 通过电泳技术来研究 取食后锥腹肖蛸雌蛛体内不同部位同工酶的变化，来证实雌蛛体内的 猎物是如何影响雌蛛体内的同工酶的；王新国等( 1 9 9 9 年) i s l 采取 群体取样，对陕西8 种常见狼蛛的酯酶同工酶作遗传学分析，为进一 步探索酯酶同工酶的分类学价值和了解物种间亲缘关系提供遗传及 生化方面的依据：王晓霞等( 2 0 0 3 年) 1 1 6 1 比较4 种园蛛科蜘蛛的3 种同工酶，探讨它们之间发育和进化的关系。随着同工酶技术和数值 分类法的日趋完善，同工酶电泳技术将在蜘蛛目现代系统学研究中发 挥越来越重要的作用。 第二节r a p d 分子标记技术的原理及其在蜘蛛类研究中的应用 1 2 1 r a p d 技术的原理和特点 r a p d 是随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c d n a ) 的英文缩写。r a p d 是1 9 9 0 年由w i l l i a m s 和w e l s h 两个研究小 组同时发展起来的一项d n a 分子水平上的大分子多态检测技术。 r a p d 技术是p c r 技术的延伸，其原理是利用一系列不同的碱基随 机排列的寡聚核苷酸( 通常为9 1 0 个碱基) 单链作为引物对所研究 的基因组d n a 进行p c r 扩增，扩增产物通过聚丙烯酸胺或琼脂糖凝 胶电泳分离，e b 显色或放射性自显影来检测扩增d n a 片段的多态 性，这些扩增d n a 片段的多态性反映了基因组相应区域的d n a 的 多态性1 7 1 。 r a p d 所用的一系列引物d n a 序列各不相同，但对于任一特定 的引物，它同基因组d n a 序列有其特定的结合位点。这些特定的结 合位点在基因组某些区域内的分布如符合p c r 扩增反应的条件，即 引物在模板的两条链上有互补位置，且引物3 、端相距在一定的长度范 围内，就可以扩增出d n a 片段。不同物种的基因组中与引物相匹配 的碱基序列的空间位置和数目可能不同，经p c r 扩增后，扩增产物 的大小和数量也将不同，这些差异可以通过凝胶电泳显示。也就是说， 当模板上在一定范围内有与引物互补的序列时，此范围内的d n a 片 段就可以扩增出来，它可以检测在引物结合序列上发生的碱基突变， 如大片段缺失、重复、异位、插x t 1 8 】。因此，如果基因组在这些区域 发生d n a 片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点 分布发生相应变化，而使p c r 产物增加、缺少或发生分子量的改变。 通过对p c r 产物的检测即可测出基因组d n a 在这些区域的多态性。 由于进行r a p d 分析时可用引物量很大，虽然对每个引物而言其检 测基因d n a 多态性的区域是有限的，但是利用一系列引物则可以使 检测区域几乎覆盖整个基因组。因此，r a p d 可以对整个基因组d n a 进行多态性检测，这就是r a p d 检测多态性d n a 的原理。 发明r a p d 技术时w i l l i a m s 等 1 9 1 即指出，r a p d 标记十分适用 于基因定位、动物育种和群体遗传学的研究。其主要优点是：第一， 它具有极大的丰富性，可反映整个基因组的变化，即它所用的碱基排 列是随机的，所用引物一般为1 0 b p 的短核苷酸，在整个基因组内的 结合位点多，且引物数也多达几百种，所探测的范围能涉及到整个基 因组，同一套引物可对多个物种或群体进行多态性分析，从而找出两 个基因组之间的微小差异来区分种属，所探测的结果也因为随机性和 所探测的范围涉及到整个基因组，具有更为可靠的统计性：第二，具 极大的探测性，采用随机引物，r a p d 技术可以在对物种没有任何分 子生物学研究背景的情况下，对物种的基因组进行d n a 片段多态性 分析，无需合成特定的序列引物，从而大大降低了研究成本；第三， 具高效性和灵敏性，即可在短期内获得大量多态性d n a 片段，同时 通过这些片段将发生某些遗传变异的个体，甚至是亲缘关系非常近的 个体准确地分离出来，以搞清其分类地位：第四，它还具有分子识别 率高，不需要放射性标记、分子杂交等工作，对环境污染小等优点； 此外，它对材料要求低、所需材料量很少、操作简便、快速、费用低， 即整个实验能在2 4 小时以内完成，而且无须昂贵的试剂和设备，只 要具备分子生物学实验的基本条件就可以进行 2 0 】。但r a p d 也有其 缺点，即每个标记提供的信息量少，受反应条件影响很火，且对设备、 条件及操作的要求都很严格，又由于敏感性高，如果出现引物与模板 d n a 的局部配对错误，就会产生假带，虽然这些假带可以通过重复 试验加以排除，但对于大量样品的检测，重复试验则带来一定的麻烦。 另外由于r a p d 所用引物通常比一般p c r 反应引物短，这进一步增 加了重复试验的难度。由于其重复性差、共迁移的p a p d 标记间有时 无同源性等问题，常常影响结论的可靠性，甚至得出相反的结果。尽 管如此，由于r a p d 对基因组多态性的检测不需要预知基因组的序 列特征，易于标准化，所检出的多态点可覆盖整个基因组，以及简捷、 灵敏，对材料要求不高，其引物没有物种界限等特点，这一技术不仅 渗透到基因组研究的各个方面，在物种亲缘关系及系统分类上也得到 了广泛应用。 经典形态分类学以其简便、易行和快速等特点仍是分类学的主 流，但对种类繁杂、形态多样、进化程度不一、演化途径复杂的生物 种类进行形态分类所面临的困难是巨大的：生物的趋同进化和平行进 化可能使两种分类单元完全不同的物种表现相似的形态，即所谓复系 或并系现象，因而就有可能把复系或并系归为同一分类单元；各种形 态性状在分类中的地位和作用不同，而我们又无法对各种形态给出客 观的加权量；同时，环境条件对形态性状影响较大，同一性状在不同 的环境中可能表现出很大的差异，形态相似并不意味着这一性状相同 2 1 1 。面对分类的难题，r a p d 标记以其独特的优点顺应了这一要求， 结合传统的形态特征描绘，来弥补仅依据形态特征进行研究时所存在 的主观性的不足，区别在垂直遗传和协同进化中所形成的疑难种和近 似种同物异名、异物同名、疑难种、近缘种及隐种。此外，r a p d 技 术还能利用前人采集的标本进行d n a 的分子多态性分析，这样可以 极大地扩展分类和系统演化的分子生物学研究范围，有助于建立正确 和完善的分类体系，进而构建分子系统演化树，重现生物系统演化进 程的历史原貌。 1 2 2r a p d 分子标记技术在蜘蛛目中的应用现状 r a p d 技术自9 0 年代问世以来，已得到了飞速的发展，但利用 r a p d 技术研究蜘蛛的报道不多，国外有h e t t l e 等( 1 9 9 7 年) 2 2 1 评 价了应用r a p d 技术检测蜘蛛遗传多样性的可行性。c u s h i n g 等( 1 9 9 8 年) 2 3 1 利用r a p d 分子标记技术分析了美国南部两种生活在蚁巢附 近的皿蛛种群的遗传多样性，发现相邻种群比远距离种群间保持遗传 相似性的机率要大得多。国内徐湘等( 1 9 9 9c f ) e 2 4 1 应用r a p d 技术对蜘 蛛系统发生关系进行了检测，进一步从d n a 分子水平上为其系统演 化提供了新的证据。王智等( 2 0 0 2 年) 2 5 1 用r a p d 技术对蜘蛛目3 种不同生态类型的代表动物基因组d n a 的多态性进行研究，分析它 们相互之间的系统演化关系。童丽娟等( 2 0 0 2 年) m 1 对园蛛科6 种 蜘蛛的遗传多样性进行研究，从d n a 水平上探讨其分类地位和亲缘 关系。可以预料，随着技术手段和统计分析方法的成熟，r a p d 技术 将在蜘蛛目领域内的研究中发挥巨大的作用。 第二章应用同工酶技术对狼蛛科3 属6 种间亲缘关系分析 第一节实验材料和方法 2 1 1 实验材料 用于同工酶分析的材料均为活体标本，采回后在实验室用清水喂 养备用。供试材料的种类名称、采集时间和采集地点等见表2 - 1 ： 表2 - 1 材料来源t a b l e2 - 1m a t e r i a lr e s o u r c e s 2 1 2 主要仪器和试剂 匀浆器；d y c z - - 2 8 b 型夹芯式垂直电泳槽；t g l 1 6 a 台式高 速冷冻离心机。a c r ；b i s ：固兰r _ r 盐；除少数为进口，其余均为 国产分析纯。 2 1 3 实验方法 目前，分类学上应用的电泳方法主要有三类：淀粉凝胶电泳、聚 丙烯酰胺电泳和等电聚焦电泳。这些技术的电泳原理都基本相同，只 是所使用的电泳支持介质不同。自从1 9 5 9 年r a y m o n d 和 w e i n t m u b 首次使用聚丙烯酰胺作为电泳的支持介质，特别是1 9 6 4 年 o m s t e i n 和d a v i s 发表他们有关的基础工作一类，聚丙烯酰胺已成为 目前最常用的支持介质，聚丙烯酰胺凝胶电泳技术也因其分辨率高、 化学性能稳定、样品不易扩散、集浓缩效应、分子筛效应和电荷效应 为一体等众多优点，成为目前生化上常用的一种电泳技术。 酯酶同工酶是能水解酯键的一组酶，在动物体内不仅含量丰富， 而且组成很复杂，这组酶即受到d n a 上不同位点的控制，同时又受 到同一位点不同等位基因的控制，因而表现的酶谱很复杂，是多态性 很高的一组同工酶。由于酯酶同工酶的重要性远大于其它酶类，因此 对狼蛛科部分种属的同工酶研究也以此酶类为研究方向。 本文采用垂直板型聚丙烯酰胺凝胶电泳( v e r t i c a ls l a bp a g e ) 法 对狼蛛科部分3 属6 种蜘蛛进行了e s t 同工酶的研究。 2 1 3 1p a g e 的基本原理 聚丙烯酰胺凝胶见用是以聚丙烯酰胺凝胶( p a g e ) 作为支持物 的- t e e 电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺( a c r ) 和交联 剂n n 一甲叉双丙烯酰胺( b i s ) ( 又称亚甲基双丙烯酰胺) 在加速剂 过硫酸胺( a p ) 和催化剂( t e m e d ) 的作用下聚合交联而成的三维 网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳。这种电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯 酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系( 即凝胶层的不连 续性、缓冲离子的不连续性、p h 的不连续性及电位梯度的不连续性) 使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带( 厚度为 o 0 0 1 c m ) ，然后再进行电泳分离。分离物能否通过凝胶以及通过的速 度取决于凝胶孔径的大小，而凝胶孔径大小由单体和双体在凝胶中的 总浓度( t ) 以及双体占总浓度的百分含量( c ) 即交联度决定。其 计算公式为： 凝胶浓度：t = ( a + b ) m 1 0 0 ( 公式2 1 ) 交联度：c = b ( a + b ) 1 0 0 ( 公式2 2 ) 式中a 代表a c r 的重量( g ) ：b 代表b i s 的重量( g ) ；m 代表溶液的体积 ( m 1 ) 。 由上式可知，凝胶浓度不同，其交联度也不同，交联度随总浓度 ( t ) 的增加而降低，因此，当总浓度一定，交联度增加时，筛孔直 径降低。b j d a v i s 的实验发现，a c r 2 ，b i s 0 5 ，凝胶就不能聚 合。当增加a c r 浓度时要适当降低b i s 的浓度。通常，t 为2 5 时， a b = 2 0 左右；t 为5 1 0 时，a b = 4 0 左右；t 为1 5 2 0 时，a b = 1 2 5 2 0 0 左右。为此e c r i c h a r d 等提出一个选择c 和t 的经验公式： c = 6 5 0 3 7 。此公式适用于t 为5 - - - 2 0 范围内的c 值，其值可有1 的变化。在研究大分子核酸时，常用t = 2 4 的大孔径凝胶，此时凝 胶太软，不易操作，可加入0 5 琼脂糖。在t = 3 时，也可加入2 0 的蔗糖以增加机械性能，此时，并不影响凝胶孔径的大小，一般情况 下，当分析一个未知样品时，常选用7 5 的标准凝胶或用4 0 o , - , 1 0 的梯度凝胶试验，以便选到理想的凝胶浓度。 本文采用高p h _ 一不连续电泳系统，由两层不同的凝胶和三种不 连续缓冲系统组成，凝胶选用a p - - t e m e d 催化系统( a p 是提供自 由基的引发剂，t e m e d 是加速引发自由基的加速剂) 。上层凝胶为 浓缩胶( 大孔胶) ，t = 3 1 ，c - 2 ，p h = 6 7 ，孔径大，样品在此 层胶中按分子大d , $ 1 1 静电荷多少初步分层浓缩；下层凝胶为分离胶 ( 小孔胶) ，t = 7 7 ，c = 2 6 ，p h = 8 9 ，孔径小，被初步浓缩的样 品进入分离胶后，由于分子筛效应和电荷效应，使样品进一步浓缩成 细带。同时，电极缓冲液( p h = 8 3 ) 与两层凝胶中的缓冲液由于组成 成分、p h 和离子强度方面各不相同，形成电泳系统的又一不连续性， 电泳对系统中的各类离子按特定次序并夹带样品向前移动，使样品逐 渐分成细带。 2 1 3 2 同工酶技术的建立 2 1 3 2 1 样品制备 将已经过不同处理的蜘蛛取出，置预冷的玻璃匀浆器中，加入适 量提取液( 0 0 1 m 的磷酸缓冲液) ，在冰浴条件下迅速研磨，予 1 0 0 0 0 r m i n 下离心2 0 m i n ( 温度控制在4 。c ) ，用取液器将上清液移至 1 5 m l 带盖小离心管中。暂置46 c 冰箱中保存待用。 2 1 3 2 2 凝胶制备 将配制好的电泳工作溶液盛于棕色瓶中，置4 。c 冰箱保存备用。 工作溶液及凝胶配制见表2 2 。 表2 - 2工作溶液及凝胶配制 分 离 胶 浓 缩 胶 电 极 工作溶液每模用量 l m h c l4 8 m l t r i s 1 8 2 9 加水至1 0 0 m lp h8 9 过滤 a c r 3 0 9 b i s o 8 9 加水至l o o m l 过滤 t e m e d 水 l o a p 1 m h c l4 8 m l 1 r i s 5 9 8 9 配制体积比 2 5 2 5 5 0 加水至1 0 0 m lp h6 7 2 m l 2 5 a c r 5 9 b i s 1 2 5 9 加水至5 0 m l 过滤 2 m l 2 5 t e m e d 1 0 u l 水4ml 5 0 1 0 a p 6 0 u l t r i s 6 9 g l y 2 8 8 9 加水至1 lp h8 3 1 6 0 0 m l 1 0 分离胶制备：按表2 - 2 中配制量将工作溶液置于干净小烧杯中 混匀，从长玻璃板中央沿壁倒入胶模内，加胶高度距样品模板下缘约 m m ，m 渤 洲 刚 洲 缓冲液 2 c m 。用注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层3 4 m m 厚的 正丁醇( 使胶面水平，并防止空气中氧对凝胶聚合过程的干扰) 。为 防止渗漏，在上、下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。待凝胶聚合好 后( 室温下约需3 0 - - - 4 0 r a i n ) ，倒去正丁醇，并用蒸馏水冲洗胶面多 次，然后有滤纸吸尽残留的水即可。 浓缩胶制备：将按表2 2 配制好的浓缩胶倒入模内已聚合的分离 胶上，加至距短玻璃板上缘o 5 c m 处，迅速插入样品梳，待凝胶完全 聚合好后( 时间约为2 0 - - 3 0 m i n ) ，拔出样品梳，用窄滤纸条吸去样 品凹槽内多余的水分。 2 1 3 2 3 点样与电泳 将预冷的电极缓冲液轻轻加入玻璃板两侧的电泳槽内( 避免产生 气泡) ，加电极缓冲液的量以没过短玻璃板约0 5 c m 为宜。 用微量进样器取4 0 一6 0 u l 的样品，加等体积4 0 的蔗糖( 内 含少许溴酚蓝) ，充分混匀后小心地注入凝胶样品凹槽底部。 将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接。电泳 1 0 m i n 左右，将电泳槽移入4 。c 冰箱内，这样一方面可以防止电泳发 热影响酶活性，另一方面又可防止胶面断裂等问题。开始时控制电压 为2 0 0 v ，待指示剂进入分离胶时将电压升至3 0 0 v ，全程约需4 6 h 。 2 1 3 2 4 染色和固定 电泳结束后，倒出电泳缓冲液，取出胶模，用蒸馏水冲洗胶面数 次，小心揭去上层短玻璃板，切去浓缩胶，在点样起始端正对右下角 切下一小块做标记，移入盛有染色液的大培养皿中，室温下染色 3 0 m i n 。染色液配方见表2 - 3 。 表2 3 酯酶同工酶染色系统 t a b l e2 - 3s t a i n i n gs y s t e m so fe s ti s o e n z y m e s 类别试剂 用量 一乙酸萘酯 挚固蓝r r 盐 色 “ 液0 2 mt r i s h c t ( p h 6 0 ) 固定液 蒸馏水 7 乙醇 3 0 m g 1 2 0 m g 2 0 m l 8 0 m l 2 0 0 m l 2 1 3 2 5 酶谱记录、拍照 酶谱记录中最主要的是酶带位置的确定，为使电泳酶带在不同研 究之间进行比较，必须对染色后的凝胶中具有不同迁移率的酶带进行 测量并使表达标准化。测量迁移率时，用游标卡尺量出指示剂和酶带 分别移动的距离，用下式表示： r m = x z x l( 公式2 3 ) 式中，x l 为固定染色后凝胶中指示剂的迁移距离，x 2 为固定染 色后凝胶中酶带的迁移距离。迫于实验条件的限制，本文照片直接采 用湿的凝胶拍照，c a n o np o w e r s h o tg 2 数码相机成相，后直接在打印 机上输出，用游标卡尺测量指示剂和酶带分别移动的距离，计算出 r a n 值。 2 1 3 2 6 数据处理、聚类分析 将各种处理中没出现的酶带编码为0 ，出现的酶带编码为1 ，对 所得数据进行非参量统计( n o n p a r a m e t r i cs t a t i s t i c s ) x2 检验， 推断它们的相关程度，即发生概率，由此比较其差异程度。 聚类分析( c l u s t e ra n a l y s i s ) 是用数学方法将一批样本( 变量) ， 按照它们性质上亲疏远近的程度进行分类的科学。系统聚类的具体方 法很多，其差异在于类与类之间采用何种相似( 或相异) 系数以及如 何进行并类，本文运用目前应用最广，最为普遍的距离系数欧氏 距离( e u c l i d t a nd i s t a n c e ) ，采用系统聚类法进行聚类分析。以每一种 不出现的酶带编码为0 ，出现的酶带记为1 ，建立原始数据矩阵( 其 中，i = l ，2 ，n 表示样品数；j = l ，2 ，p 表示性状数) ： x i i 2x l lx 2 2 x l v x 2 1x 2 2 x 2 p x mx n 2 x n p 然后对原始数据标准化，转化为欧式距离，再用o p sv 3 0 1 专业 版中的离差平方和法进行聚类分析，得出聚类图。 第二节实验结果与分析 2 2 1 同种狼蛛体躯不同部位e s t 同工酶的比较 图2 一l 拟环纹豹蛛不同部位的e s t f i g 2 - 1t h ee s t e r a s e1 1s o e n z y m ep a t t e r n so fd i f f e r e n tp a n so f p a r d o s a p s e u d o a n n u l a t a 1 整体( w h o l e ) 2 四肢( 1 i m b )3 头胸部( c e p h a l o t h o r a x ) 4 腹部( y e n t e r ) 对拟环纹豹蛛个体的四肢、头胸部、腹部及整体的e s t 同工酶 进行了比较。电泳结果( 见图2 - 1 ) 显示拟环纹豹蛛四肢、头胸部、 腹部及整体的酶谱存在一定差异，计算非参量统计x2 为3 1 3 0 6 ，可 得0 2 5 p 0 7 5 。表现在四肢酶带最少，