（环境工程专业论文）丝瓜瓤固定白腐菌降解24二氯酚的研究.pdf

硕二匕学位论文 摘要 氯酚类化合物( c p s ) 被广泛用作木材防腐剂、防锈剂、杀菌剂和除草剂等，是 毒性很高的物质，被美国e p a 列入优先控制污染物的黑名单。氯酚类化合物的大 量使用，使得大量的c p s 污染物进入了环境，给自然环境造成很大的危害。含氯 酚类废水的治理也受到越来越多的重视。微生物固定化技术因无二次污染、降解 高效性和经济实用等优点而备受关注。可选择合适的载体来固定对c p s 有降解作 用的菌体，构成一种高效、快速、能连续处理的废水处理系统，可以有效地减少 二次污染，处理含氯酚废水时效果良好，且已表现出了巨大的潜力，成为近年来 国内外学者研究的热点。 本研究采用新型生物载体丝瓜瓤作为固定载体，固定白腐菌中的一种黄孢原 毛平革菌口甩e ，d c j i l 口e 地c j i l ，y s d s p d 厂m 坍) ，控制条件使其在丝瓜瓤上生长，研究中 发现其生长速度快，菌丝与载体结合紧密，单位面积菌体数量多。用此固定菌来 降解废水中的2 ，4 二氯酚，探讨了两种固定化方法的可行性，绘制了固定化细胞 和游离态细胞的生长曲线，研究了胞外酶和吸附在对2 ，4 二氯酚的去除中的作用， 探讨了p h 、温度、摇床转速、初始2 ，4 二氯酚对2 ，4 二氯酚降解的影响，并进行 了固定化细胞流化床的研究，考察了不同水力停留时间( 稀释率) 和气体流量对处 理效果的影响，并进行了动力学分析。 结果表明，通过细胞培养过程中同时加入载体，使菌体附着在载体上生长方 式实现了黄孢原毛平革菌的固定化，最大生物固定量为o 7 9 1 9 细胞g 丝瓜瓤； 固定化细胞生长速率和生长量均优于悬浮生长；含有胞外酶的培养基对2 ，4 二氯 酚没有明显的降解作用；固定化细胞的最佳降解条件为温度3 5 ，p h 为6 ，摇床 转速为1 2 5 m i n 。对于低浓度2 ，4 二氯酚，固定化细胞和游离细胞的降解速度相当； 对于高浓度2 ，4 二氯酚，固定化细胞具有明显优势，不仅可以耐受更高浓度的2 ，4 二氯酚，其降解速率也高于游离细胞，最大降解速率是1 3 9 5 m g ( l d ) ，是游离细 胞的2 倍。不同的水力停留时间( 稀释率) 和气体流量对固定化细胞流化床反应器 连续处理2 ，4 二氯酚的降解效率有很大影响，固定化细胞对2 ，4 二氯酚降解过程 遵循m o n o d 方程，最大反应速率为7 0 0 2 m ( l h ) ，饱和常数为2 6 0 4 5m g l 。 关键词：黄孢原毛平革菌；生物降解；固定化；丝瓜瓤；2 ，4 一二氯酚 a b s t r a c t c h i o r o p h e n o l s ( c p s ) ， e x t e n s i v e l yu s e d a sw o o dp f e s e r v a t i v e s ， r u s i n h l b l o f s ， f u n g i c i d e sa n d h e r b i c i d c s ，i sr a t e da sap r i 0 哪p o l l u t a n tb y t h eu se i l v i r o 砌e n t a l p r o t e c t i o na g e n c yb e c a u s e o ft h i sg r e a tu b i q u i t y t h et r e a t m e n to fc p s p o l l u t e dw a s t e w a t e r sh a sa t t r a c t e dm o r ea n d 毋o r e a t t e n t i 0 1 1 t h ec o m m o n l yu s e dp r o c e d u r e st o r r e m o v i n gc p sf r o mw a s t e w a t e ri n c l u d ef l o c c u l a t i o n ，a d s o r p t i o n ，f i i t r a t i o n o x l d a t i o n a n db i o l o g i c a lt r e a t m e n t s ，a m o n gw h i c hb i o l o g i c a lm e t h o d s u s i n gm i c r o o r g a m s m s a r e p r e f e r a b l eb e c a u s eo f t h e i rl o wc o s t ， e f f c c t i v e n e s sa n d t h el o wp r o d u c t l o no t b y p r o d u c t s t h e p r o p e r c a f r i e r c o u l db ee m p l o y e d t o i m m o b i l z e e f f l c l e n t m i c r o o r g a n i s m st o f o r ma ne f f e c t i v ea n dc o u t i n o u sw a s t ew a t e rt r e a t m e n t s y s t e m w h i c hh a ss h o w ng r e a tp o t e n t i a l a n db e c o m e sah o t s p o to fr e s e a r c h p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o f i u m ，o n ek i n d0 fw h i tr o tf u n g i ，w a s i m m o b l l l z e do n l o o f as p o ng e a n dw a su s e dt o r e m o v e2 ，4 d c pf r o m t h ca q u c o u s s y s t c n l n ： f e a s i b i l i t v0 ft w oi m m o b i l i z a t i o nm e t h o d sw a si n v e s t i g a t e d t h eg r o w t h c u r v e so t i m m o b i l i z e dc e l ia n dt h es u s p e n d e d c e l lw e r em a d e t h er o l co fe x t r a c e l l u l a re n z y m e s i nt h e2 ，4 d c pr e m o v a lw a ss t u d i e d t h e e f f e c t so fp h ，t e m p e r a t u f ea n dr o t a t l o n s p e e do nt h eb i o d e g r a d a t i o nw e r ed i s c u s s e d t h e e f f e c t so fr e s i d e n c et i m ea n dg a s f l o wf a t eo nt h eb i o d e g r a d a t i o ne f f i c i e n c yb yi m m o b i l i z e d c e l lf l u i d b e dr a c t o rw e r e i n v e s t i g a t e d t h ek i n e t i c so ft h ei m m o b i l i z e df u n g u sb i 。d e g r a d a t i o n o n2 ，4 _ d c pw a s a n a l y z e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei m m o b i l i z a t i o nc o u l d b e r e a l i z e d h o u g ht h eg r o w n o ft h ec e l lo nl o o f as p o n g ea n d t h eb i o m a s sc o u l dr e a c h0 7 9 1 9d r yw e i g h t ( gs p o n g e d i s c s ) t h eg r o w t hr a t ea n d t h eb i o m a s so fi m m o b i l i z e df u n g u sw e r eb 叭hb d t e r h a 鼍 t h a to fs u s p e n d e dc e l l s t h ee x t r a c e l l u l a fn u i ds h o w e dn e g l i g i b l e b i o d e g r a d a t l o no f 2 4 d c p ，w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ee x t r a c e l l u l a fe n z y m e s w e r en o td i r e c t l yi n v o l v e dl n t h eb i o d e g r a d a t i o np r o c e s s t h eo p t i m u mt e m p e r a t u r e ，p h a n dr o t a t i o nr a t eo fs h a k l n g t a b l ef o fb i o d e g r a d a t i o nb y i m m o b i l i z e df u n g u s w e r e3 5 ，6 0a n d1 2 5 r m l n r e s p e c t i v e i y i ns e q u e n t i a lb a t c he x p e r i m e n t ，t h eb i o a c t i v i t y o fi m m o b i l i z e dc e l l sw a s r e c o v e r e da n di m p r o v e dd u r i n g t h ec u l t u r ea n dt h em a x i m u md e g r a d a t i o n r a t e c o n s t a n to f l 3 9 5m ( l d ) w a sr e a c h e di nr u n5 i nc o 舶u o u s b i o r e a c t o rt e s t h e r e s i d e n c et i m ea n dn o w f a t ca f f e c t e dg f e a t l yo nt h eb e h a v i o ro fn u i d i z e d b e d r e a c t o r a n dt h ek i n e t i cb e h a v i o ro ft h el o o f a i m m o b i l i z e do n1 0 0 f as p o n g ew a st o u n d t o i i 硕士学位论文 f o l l o wt h em o n o de q u a t i o n t h em a x i m u mr e a c t i o nr a t ew a s7 0 0 2 m g ( l h ) ，a n dt h e s a t u r a t i o nc o n s t a n tw a s2 6 0 4 5m g l k e yw o r d s ：j 口刀p ，d c j i l 口e 纪c 秒s d 点p d r f h 朋； d e g r a d a t i o n ； i m m o b i l i z a t i o n ；l 0 0 f a s p o n g e ；2 ，4 - d c p n l 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行 研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本 文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 豸反f 日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文 的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密豳。 ( 请在以上相应方框内打“) 作者签名： 导师签名： 考长匠 日期： 期： 年月 日 年月日 硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 氯代酚类化合物的来源、在环境中的行为及其毒性 1 1 1 氯代酚类化合物的来源及其用途 氯酚是一类非常重要的工业原料，被广泛应用于溶剂、染料、防腐剂、除草 剂、杀虫和杀菌剂等的生产中；加氯的水体、氯化芳烃的泄漏【1 】和含氯有机物的 焚烧等也会产生氯酚。目前，氯酚类化合物对环境的污染主要来源于木材防腐剂 ( 例如五氯苯酚) 、工业废水( 例如纸浆漂白废水) 、事故性泄漏及有机物的燃烧释放 物等。作为工业原料，一氯酚可用于生产多氯酚，二氯酚被用于生产2 ，4 二氯苯 氧乙酸( 2 ，4 d ) ，三氯酚常被用作抗菌剂，如纺织品的防霉剂，木材和胶生产过程 的保护剂等，2 ，4 ，5 三氯酚被用于生产2 ，4 ，5 三氯苯氧乙酸( 2 ，4 ，5 t ) 及相关产品， 2 ，4 ，6 三氯酚不仅可用作皮革和木材的防腐剂，也是合成四氯酚和五氯酚以及其它 杀菌剂的生产原料。以上这两种三氯酚和2 ，3 ，4 ，6 四氯酚的产量较少。五氯酚( p c p ) 被广泛的用作木材防腐剂，粘结剂中的添加剂，结构材料，植物，皮革，涂料， 造纸和油井钻探的污泥中，在美国的年产量高达1 2 5 亿吨。 氯酚进入环境后，因这类化合物的水溶性在芳香类化合物中相对较大，土壤 对它的吸附和固定作用较弱，故可以以水为载体广泛地扩散。许多学者在土壤、 沉积物、固体废弃物、污泥、地下水、地表水给雨水中均已检测到氯酚的存在f 2 ，3 】。 1 1 2 氯酚类化合物的危害 由于污水排放，农药使用，泄漏事故等种种原因进入环境中的氯代酚类化合 物会对各种生物产生毒害作用1 4 j ，严重时会导致整个生态系统的破坏。几乎所有 的氯代有机物都有毒，其中很多化合物被认为具有“致癌、致畸、致突变”效应( 二 致效应) 或可疑的三致效应；同时近年来的研究表明，许多氯代有机化合物是内分 泌干扰物或是潜在的内分泌干扰物，当它们长期低剂量存在时，容易使人和生物 的内分泌系统紊乱。低氯酚可能不致癌或致畸，但对多种细菌和酵母有致突变作 用。有些氯酚如三氯酚会与t o d 以二恶英) 混杂，而己知t c d d 是致畸性化合物。 无论氯酚类化合物是否具有三致效应，由于它能使细胞蛋白质发生变性和沉 淀，因而对各种细胞都有损伤作用。氯取代基的数目越多，氯酚的毒性就越大， 而氯取代基数目相同时，通常对位取代酚一般比邻位和间位取代酚毒性大【5 1 。 天然有机物的氯化和水消毒剂均能产生卤代酚副产物，长期饮用被氯酚污染 的水，可引起头昏、出疹、贫血及各种神经系统症状。许多氯酚化合物降解过程 丝瓜瓤固定白腐菌降解2 ，4 二氯酚的研究 的中间产物例如氯代邻苯二酚或者是氯代开环产物也具有毒性，会对生物体的生 长产生抑制作用。 氯酚类化合物对环境的污染己受到了世界性的关注。美国环保署公布的6 5 类1 2 9 种优先污染物名单包括从一氯酚，二氯酚，三氯酚，五氯酚等十几种氯酚 类化合物。我国制定的国家危险品名录包括了从一氯酚到五氯酚等各种氯酚。 我国的污水综合排放标准( g b 8 9 7 8 1 9 9 6 ) 也对氯酚的排放做出了具体规定，要求 1 9 9 8 年1 月1 日以后建设的一切排污单位，对氯酚的排放必须遵循以下标准( 表 1 1 ) 。 表1 1 氯酚类化合物的排放标准 1 2 微生物对氯代芳香化合物的降解机制 氯代酚类化合物与其它芳香化合物相比，更难以被微生物降解，主要原因在 于高负电性的氯原子使苯环成为一个难以被氧化的疏电子环。氯代酚类化合物降 解的关键在于脱氯。根据脱氯过程中电子的得失，可将氯代酚类化合物生物降解 分为氧化脱氯和还原脱氯。除了脱氯机制以外，氯代酚类化合物还有共代谢降解 机制。 ( 1 ) 氧化脱氯机制 在好氧条件下，氯代酚类化合物的降解是在一系列酶的作用下通过进入电子 呼吸链来进行的，它的开环裂解需要通过氧从苯环分子中获得电子来完成。由于 氯原子对苯环上的电子产生强烈吸引，使苯环上电子云密度大大降低而成为一个 疏电子环，因而氯代酚类化合物较难发生亲电反应，氧化过程难度增加，取代氯 原子越多，环上的电子云密度就越低，越难以被氧化降解。 在好氧条件下，低氯代酚类化合物的降解反应一般遵循一种相似的先开环再 脱氯的机制。首先在羚化酶的作用下在苯环上加入另外一个轻基，形成重要的中 间产物氯代邻苯二酚。氯代邻苯二酚在加氧酶的作用下开环形成相应的氯代粘康 酸，然后在内脂化过程中脱出氯离子。脱氯过程如图1 1 所示。多氯代酚的降解 与低氯代酚有着不同的途径。d i n e s h 等研究了真菌对2 ，4 ，5 三氯代酚的降解过程 2 硕上学位论文 旧j 。降解开始于木质素氧化酶催化作用下脱去经基对位的氯原子将其氧化成2 ，5 二氯1 ，4 苯醌，2 ，5 二氯1 ，4 二羟基苯则是醌的还原产物，再进一步由过氧化酶 催化的氧化脱氯反应使苯环上的氯全部被轻基取代，在开环之前苯环上的氯己经 被全部脱去，使得苯环容易打开，进而被完全矿化。p c p 有着与三氯代酚相似的 降解过程，由催化酶作用首先在对位发生轻基化反应，生成四氯代对苯二酚，而 后连续脱去3 个氯，生成1 ，2 ，4 三羟基苯，该化合物开环后最终矿化成c 0 2 。 图1 1 氯代邻苯二酚的氧化脱氯过程 ( 2 ) 还原脱氯机制 还原脱氯是指氯代酚类化合物在得到电子的同时去掉一个氯取代基并且释放 出一个氯离子的过程。还原脱氯主要发生在厌氧条件或缺氧条件。由于氯原子强 烈的吸电子性，使苯环上电子云密度降低，在好氧条件下，氧化酶很难从苯环上 获取电子而发生氧化反应，而且氯原子取代个数越多，苯环上的电子云密度就越 低，氧化就越困难。而在厌氧或缺氧条件下，环境的氧化还原电位较低，电子云 密度较低的苯环在酶作用下容易受到还原剂的亲核攻击，从而氯原子被取代，显 示出较好的厌氧生物降解性。还原脱氯使氯原子数目减少，降低这些难降解有机 物的毒性。易于被别的微生物同化。 还原脱氯是一种重要的氯代酚类化合物的降解机制，自上世纪8 0 年代以来， 众多学者进行了相关的研究。对沉积物中2 ，4 d c p 的还原降解过程的研究发现， 2 ，4 d c p 首先脱掉邻位的氯生成4 c p ，然后脱掉第二个氯生成苯酚，最终被彻底 降解为甲烷和c 0 2 ，相关研究还发现【7 j ，羚基邻位的氯比其它位置的氯容易脱除。 因此对于3 ，4 二氯代酚，3 ，5 二氯代酚，由于这两种二氯代酚的氯不在轻基邻位， 较其它二氯代酚更难被降解。b e a v e n 等通过接种降解菌研究了沉积物中三氯代 酚和五氯代酚在厌氧条件下的还原脱氯过程【引，发现2 ，4 ，6 二氯代酚降解的中间产 物包括：苯酚，4 c p ，2 ，4 d c p ，甲基酚等；五氯代酚降解的中间产物包括：2 ，3 ，4 ，5 四氯代酚，3 ，4 ，5 三氯代酚，3 ，5 二氯代酚，3 氯代酚，苯酚，甲基酚等。 ( 3 ) 共代谢降解机制 如前所述，许多氯代芳香化合物难以被微生物直接作为生长基质，但可通过 选择一种合适的生长基质来诱导产生它们所需的酶及产生足够的能量驱动它们的 最初转化。在有关氯代酚类化合物的生物降解相关研究中也有不少关于共代谢的 报道。s p a i n 和h a g g b l o m 等研究发现【9 1 ，生长在酚或甲苯上的假单胞菌 3 丝瓜瓤固定白腐菌降解2 ，4 二氯酚的研究 体已h 咖肌d n 口s 尸“f f 如p 1 ) 产生的一种加氧酶能够将几种一氯代酚和二氯代酚单轻 基转化成氯邻二酚，羟基化的化合物在纯培养中不能被继续降解，但在混合培养 中很容易被其他细菌所转化。清华大学的施汉昌等研究了厌氧条件下不同污泥中 投加葡萄糖对2 ，4 ，6 三氯代酚降解的影响。结果表明【1 0 】：补充碳源大大提高了啤 酒废水污泥对氯代酚的降解作用；但对于有机废水污泥来说，补充碳源所起的作 用就不很明显：对造纸水污泥，补充碳源条件下的降解常数小于氯代酚作为唯一 碳源条件下的降解常数，表现为抑制作用。该研究说明，不同的微生物种群具有 不同的降解酶系统和代谢机制，不能简单的认为投加易降解碳源就会促进共代谢 作用。对于共代谢第一基质的选择要通过试验加以确定。 图1 22 ，4 d c p 的还原脱氯过程 1 3 固定化细胞技术及其应用的研究与进展 c q + c h 4 固定化微生物( 1 m m o b i l i z e dm i c r o b e ，i m ) 的定义为将微生物自然固定或定位 于一定的有限空间，保持固有的催化活性，并能连续的重复使用。早在十九世纪 初就发现，某些微生物细胞具有一种吸附在固体物质表面的天然倾向和特殊功能， 并以这种方式被束缚固定起来。当时，曾利用这种被吸附的微生物细胞，在滴滤 式反应系统中生产醋酸f 1 1 】，此后有人用类似的方法处理污水1 1 2 l 。 现代的细胞固定化技术是在固定化酶技术的推动下发展起来的，是一个快速 发展的领域。微生物细胞通过固定化后，具有如下优点i ”d 5 l ：可以连续使用或重 复使用：可以简化产物的提取和纯化工作；同一情况下，固定化细胞往往比相同 的自由细胞更为稳定；固定化细胞的过程易于自控，且有利于开发各种不同类型 的反应器；采用固定化细胞便于控制，较少受微生物污染，产品与生物催化剂容 易分离；固定化作用可使稠密的细菌群体改变悬浮介质的流变性质；与出现在溶 液中的自由悬浮细胞相比较，其流体粘度很低，在反应器中，乳度很低的流体容 易混合，质量交换性能也很好。固定化细胞可以是死细胞，也可以是增殖细胞或 休止细胞。对于多酶和或需要辅因子的酶催化反应体系，固定化活细胞，有明显 的优势。固定化细胞可以省去提取和纯化酶的冗长手续和时间的耗费；提高酶的 稳定性：可以通过酶活性的更新，大大增进运转的稳定性酶活的更新可以重复诱 导，也可以让固定化细胞在原位上分离，充分发挥生物催化反应的优势。1 9 7 3 年， 4 硕士学位论文 日本首次在工业上成功地利用固定化微生物细胞连续生产l 天冬氨酸。之后，固 定化细胞技术受到广泛重视，并很快从固定化休止细胞发展到固定化增殖细胞。 至今，在生产菌种方面已很少有未被涉足过的研究领域。在我国，固定化生物催 化剂的研究始于2 0 世纪7 0 年代，中国科学院微生物研究所和上海生物化学研究 所同时开始了固定化酶的研究工作。2 0 实世纪7 0 年代后期，许多单位相继开展 了固定化酶和固定化细胞的应用研究。1 9 7 8 年，首届酶工程会议后，固定化生物 催化剂的研究和应用迅速扩展到全国各地，并取得了一些可喜的成绩。1 9 8 1 年英 国帝国化学工业公司研究成功固定化微生物技术，并首先建立了固定化微生物处 理含氰废气和含氰废水的工业化装置，成为生物工程在“三废 治理中使用固定 化微生物的首批生物反应装置。1 9 8 5 年日本建设省开始设计“利用生物工艺学于 新排水处理系统 ，组织栗田、三井、千代田、三机工业、石川岛播磨重工业、新 日铁等十七个社团进行开发微生物固定化载体及固定化技术的研究，日本下水道 事业团体也组织日立等单位研究去除废水中氮的微生物固定化技术：组织久保田、 铁工等单位研究处理高浓度有机废水的微生物固定化技术。美国已将淡水处理用 的固定化微生物商品化，掌握了技术开发的主导权。近几年，法国和西德等国家 也报道了有关的研究和实验资料。目前，在这一领域中各国正展开激烈竞争，使 应用固定化微生物的发展速度超过了固定化酶。 固定化技术起源于研究酶的固定化，固定化酶的研究发展可分为两个阶段， “第一阶段 主要是载体的开发、固定化方法的研究及其应用技术的发展：目前， 已进入了“第二阶段，主要包括辅酶系统或a t p ，a d p ，a m p 系统的多酶反应 系统的建立，以及疏水体系或含水很低的体系的固定化酶催化反应的研究。由于 从生物体内提取酶的操作复杂，费用较高，固定化细胞技术逐步被人们研究和应 用起来，并得到迅速的发展。近年来又从静止的固定化细胞发展到固定化活细胞 ( 增殖细胞) 。 对于细胞而言，微生物细胞自身就是一个天然的固定化酶反应器，能完成多 步酶催化反应，通常能保留某些酶促反应所必须的a t p ，m g ，n a d 等，因此， 在参与反应时无需补加这些辅助因子。近年来固定化细胞技术的研究重点仍然是 载体的开发、固定化方法的改进以及高效反应器的构建与运行。 固定化技术渗透到环境科学领域，使生物治理技术在新层次上得到了发展。 固定化细胞技术在废水处理领域中具有独特的优越性和巨大的潜力，主要表现在 以下5 个方面： ( 1 ) 能有效维持反应器中较高的生物量浓度，更有利于生化反应的发生； ( 2 ) 易于实现固液分离，有利于提高处理出水的水质； ( 3 ) 有利于代时长的微生物的存留； ( 4 ) 投资少，成本低，运行稳定，处理程度高，有较好的抗冲击负荷的能力： 5 丝瓜瓤固定自腐菌降解2 ，4 ，二氯酚的研究 ( 5 ) 适用范围广，尤其适合于处理含有有毒有害物质的废水。 近几十年来，国内外都开展了固定化细胞技术的运用研究，用以处理难降解 有机废水、高浓度有机废水、含重金属废水、含氰废水、污水的脱氮除磷、印染 废水脱色等，成效显著。以难降解有机废水为例，工业废水中含有的芳烃类化合 物、硝基化合物、有机农药、酚类等物质，在其浓度低时，可被微生物缓慢吸收 利用得以分解，在高浓度时则因产生抑制性而难以被吸收利用。对于这些难降解 的物质，通过筛选分离出具有高效降解性能的优势菌属，运用固定化细胞技术处 理这类废水，在降解效果、微生物的耐受性、运行的稳定性等方面均优于传统的 生物处理。 固定化细胞的定义也说明了固定化细胞与游离细胞相比所具有的优势，归纳 起来主要的优点表现【l n l 8 】在提高了细胞密度和流动速率，这一优点大幅度提高了 微生物细胞产量，而且在稀释率高于微生物生长率的情况下，能够有效的解决污 染问题。但同时细胞固定化后也存在一些问题，如固定化后，新陈代谢慢，底物 和产物扩散受到影响等，固定化细胞的优缺点可概括表1 2 。 表1 2 固定化细胞与悬浮细胞相比的优缺点钔 优点缺点 高细胞浓度 较高的细胞流动速率 高稀释度下可减少杂菌污染 产品易纯化 必须确保底物和产物的扩散 细胞的新陈代谢有所改变 固定化细胞的费用高 由于固定化微生物技术既不需要把酶从细胞中提取出来，也不需要加以纯化， 酶活力损失少。因此固定化细胞技术己超过固定化酶技术的应用，目前已广泛应 用于工业、制药、化工、食品发酵、环境污染治理与检测和能源开发等多种领域。 关于固定化微生物技术的研究很多，其中主要是关于载体和固定化方法的研 究。 1 3 1 微生物固定化的环境特征 影响微生物固定化进程的环境因素较多，如温度、p h 值和水流状态等。 ( 1 ) 温度 不同的微生物具有不同的适宜温度范围，由于载体具有阻挡热量传递的作用， 因此在适宜温度范围上，固定化微生物具有比游离微生物具有更大的范围，从而 扩大了固定化的应用范围。 ( 2 ) p h 值 一般来说，不同的微生物具有不同的等电点( 细菌的等电点在3 5 左右) 。p h 值对固定化速率的影响主要表现为微生物的表面带电特性。当p h 值大于细菌的 6 硕士学位论文 等电点时，细菌表面由于氨基酸的电离作用而显负电性；若p h 值小于细菌的等 电点，细菌表面将显正电性。当微生物处于等电点状态时，其表面的z e t a 电位趋 于零，表面溶剂化结构基本消失，并在液相中处于一种稳定状态，为了减少表面 自由能，微生物趋于吸附到载体表面或自由聚集以达到新的稳定。有实验表明， p h 值在等电点附近，微生物固定化速率较大。 ( 3 ) 水力流态 水力流态对微生物固定化的影响至关重要，尤其是目前废水处理中常用的结 合固定化法和微生物自身固定化法。在实际废水处理中，一方面需要一定的紊动 程度为微生物与废水接触创造良好的条件；另一方面水流的紊动程度应该控制在 一定的范围内以利于微生物在载体表面的附着生长。如何合理的控制和选择废水 生物处理反应器中的水力学条件，是许多利用固定化微生物技术进行废水处理的 工艺运行中需要解决的主要问题。 1 3 2 微生物固定化的主要影响因素 影响微生物固定化的主要因素有三大类：微生物的自身特性、载体特性和环 境特征。 1 3 2 1 微生物的特质 ( 1 ) 微生物活性 活性高的微生物有利于通过其代谢作用而分泌更多的多聚糖类物质，依靠多 聚糖所具有的黏性作用可促进微生物与载体的黏附，缩短附着时间，从而加快固 定化进程。较高的微生物活性使其具有较高的能量水平，有利于微生物在向载体 表面的主动或被动输送和附着过程中，克服和削弱各种作用力的不利影响，提高 其初始积累速率。有研究表明，微生物的活性不同，其表面性质也有所不同。微 生物表面的化学组成直接影响其在载体表面的固定过程。 ( 2 ) 微生物浓度 水体中微生物浓度在一定程度上影响其向载体表面输送的速度，同时也决定 了其与载体表面接触率的高低，从而影响固定化进程。微生物浓度高将加速微生 物向载体表面传递，增加其与载体的接触几率，从而使固定化过程速率加快，同 时存在一个临界浓度，当浓度低于临界浓度时，微生物从液相向载体表面的传递、 扩散是决定固定化速率的控制因素，超过临界浓度后，载体表面积将成为固定化 速率的主要控制因素。 1 3 2 2 载体的性质 影响固定化速率的重要因素有载体的表面粗糙度及其表面电荷。 ( 1 ) 载体的表面粗糙度 7 丝瓜瓤固定白腐菌降解2 ，4 二氯酚的研究 载体表面越粗糙，越利于微生物的附着固定。表面粗糙的载体材料可提供更 多的有效接触面积；表面的粗糙情况，如空洞、缝隙等对已经吸附的微生物具有 保护伞的作用，免受水力扰动、剪切和冲刷的影响，从而提高单位体积的生物量 及其生物稳定性。 ( 2 ) 载体的表面带电性 微生物在一般环境条件下表面都是带负电荷，因此使用表面带有正电荷的材 料作载体，有利于固定化的进行。目前常用的载体材料大多是高分子聚合物，如 对这些物质进行适当的表面处理( 化学氧化、低温等离子转型处理等) ，使他们表 面带有正电荷，可很大程度上提高固定化速率。 1 3 3 细胞固定化方法的选择 吸附法是与微生物悬浮液接触的任何表面，都可能由于吸附作用而成为微生 物附着生长的载体。这种固体表面上微生物生长的效果，长期以来以被人们所确 认。有时，微生物本身并不具有吸附能力，+ 但是，通过改变细胞或固体载体表面 的理化性质【2 0 1 ，可以使微生物细胞以离子引力【2 ，或借助化学键【2 2 】均吸附到载 体上。 这种吸附方法早在1 8 2 0 年就用于由酒精生产速酿酸1 2 3 1 。也曾经有人用此法 生产啤酒，酒精和污水处理【2 4 l 等方面，也有人用此法固定哺乳动物细胞，生产生 化药物。 利用吸附载体将生物催化剂吸附到其表面从而制得固定化生物催化剂的方 法，称为物理吸附法。常用的吸附载体包括：活性炭、木屑、多孔玻璃、多孔陶 瓷、硅藻土、硅胶、纤维素、聚氨酷泡沫、离子交换树脂等。 作为一种固定化方法，吸附是一种简单易行、条件温和的方法。并且固定化 载体可以再生，微生物经吸附后活性可以得到保留其缺点是所吸附固定的微生物 不够牢固，容易脱落。吸附法固定化微生物广泛应用于环境污染控制方面。施翔 等【2 5 l 选用了j x 1 0 1 吸附树脂对硝基苯酚废水进行了处理和回收，取得满意的效 果。张秋香，华志明等f 2 6 j 提出了用活性炭吸附处理对氨基苯酚( p a p ) 废水的工艺 流程，用此法处理后的废水，对氨基苯酚含量小于0 0 0 1 ，从而实现了对氨基苯 酚绿色生产过程。 交联法又称无载体固定化法，分为物理交联法和化学交联法。该法不利用载 体，生物催化剂之间依靠物理或化学作用相互结合。化学交联法由于所使用的化 学药品的毒性，它在固定化活细胞的应用方面受到了明显的限制。交联法只用在 催化单一反应的微生物细胞。物理交联法是指微生物培养过程中，适当改变细胞 悬浮液的培养条件( 如离子强度、温度、p h 值等) ，使微生物细胞间发生直接作用 而颗粒化或絮凝来实现固定化的方法。影响微生物细胞颗粒化的因素有：搅拌强 8 硕：e 学位论文 度、培养基组成、p h 值、溶解氧浓度、添加剂等。物理交联法的优点是细胞密 度大、固定化条件温和，但是机械强度差、细胞堆积密度大导致物质传递尤其是 氧传递困难，因此不适用于耗氧微生物的固定化。使用交联法固定化微生物降解 环境污染物的文献鲜有报道。 微生物细胞的固定化方法，以包埋法最为常用。包埋法是将微生物细胞截留 在水不溶性聚合物凝胶的网络中，从而使细胞固定化。聚合物凝胶可通过单体或 预聚物聚合成水不溶性高分子，或通过物理方法( 如改变溶剂、温度、p h 值) 或化 学方法( 如离子移变、化学反应) 使可溶性高分子化合物不溶化。凝胶聚合物的网 络可以阻止细胞的泄露，同时能让基质渗入和产物扩散出来。包埋法的特点是能 将固定化微生物制成各种形状( 球状、块状、圆柱状、膜状、布状、管状等) ，并 且固定化后的微生物能增殖，所以对它的研究最多，应用也最广。s a h a s r a b u d h e 等【2 7 】研究了利用固定化假单抱菌对混合氯代芳烃进行脱氯。p e r s c h i 等【2 8 j 以海藻 酸钙为载体包埋固定化食酸假单孢菌筇e h 如朋d 珂口c 讹y d r 淞，用于连续降解3 氯苯 胺。w i e s e l 等【2 9 j 利用固定化混合菌群降解多环芳烃。试验结果表明：固定化细胞 能利用这些物质进行生长并使之完全降解。固定化细胞分别在培养1 、2 和1 5 d 后，酚、蔡、菲均能被彻底降解。与游离细胞相比，固定化细胞表现出生长稳定， 且具有较强的降解能力。w a g n e r 1 3 0j 等利用固定化假单胞菌n e 蹦如朋伽口s 在外循环 三相流化床反应器中降解蔡2 磺酸，并研究了生物膜扩散限制对反应动力学的影 响。他们采用的载体是平均直径为2 1 躯m 的砂粒，反应器中载体浓度为2 0 3 0 g l ，生物膜厚度为( 7 5 1 0 ) m ，c o d 容积负荷达5 8 k g ( m 3 d ) 。l e e 等 3 1 】用海藻 酸钙凝胶包埋固定化尸f 川e f d 6 口c 纪，j p 细胞进行了降解吡啶的研究。结果表明：与 游离细胞相比，固定化细胞的比降解速率和对吡啶毒性的承受能力并没有提高， 这与大多研究者的结论相反。但由于固定化细胞具有较高的生物浓度，所以其体 积降解速率较高，鉴于固定化细胞具有较高的生物浓度和可以重复利用，他们认 为利用固定化细胞降解吡啶是可行的 膜截留固定化技：术是将微生物细胞通过半透膜、中空纤维膜、超滤膜等截 留。该方法具有以下优点：可以使基质与微生物细胞充分接触，进行有效的反应； 固定化方法简单，微生物的生长和固定化一步完成，固定化过程中不涉及化学反 应，对细胞的活性无影响；生物催化剂可以再生；反应过程中，生物催化剂易与产 物分离，可连续除去抑制物，简化提取工艺；通过控制膜的孔径可以选择性控制 底物和产物的扩散，防止细胞的泄露。该法的缺点是，由于膜的污染堵塞导致反 应速率下降。随着新的膜技术及新的膜反应器的开发利用，膜截留固定化微生物 细胞具有潜在的应用价值。使用膜截留固定化技术微生物降解环境污染物的文献 鲜有报道。 综合上述分析，尽管固定化方法多种多样，但是没有一种理想的、普遍适用 9 丝瓜瓤固定白腐菌降解2 ，4 二氯酚的研究 的方法。化学固定化法( 包括化学交联法和化学结合法) 涉及细胞的化学修饰，但 是化学试剂的毒性对细胞会有损害，因此，不适用于制备固定化活细胞。交联法 和聚电解质复合包埋法的突出优点是可以获得很高的细胞密度，但由于缺乏良好 的机械强度而不能得到广泛的应用。载体结合( 除共价结合法外) 的固定操作简单， 条件温和，且载体可以再生；但细胞与载体之间的结合力较弱，因此，操作稳定 性不好。包埋法有较好的综合性能，催化活性保留和存活力都较高，且包埋体在 反应工程( 包括反应器的设计、操作稳定性等) 中应用灵活，因此，包埋法成为整 个固定化生物催化技术中应用最为广泛的固定化方法，但是，包埋载体的扩散阻 力大，使细胞的催化活性受到抑制，且不适用于大分子物质的反应。各种固定化 方法比较总结于表1 3 。 表1 3 各种固定化方法及其优缺点 综上所述在各种微生物的固定化方法中，吸附法操作简单；载体便宜、易得； 对微生物无毒，对细胞活性影响较小；载体可再生回用其较高的活力保存能力以 及适合的操作稳定性；有利于微生物的生长繁殖，有利于微生物代谢过程中所需 氧气和营养物质以及代谢产生的废物的传质过程，优点更为突出。因此，本研究 亦采用吸附固定化黄孢原毛平革菌的方法降解溶液中的2 ，4 d c p 。 1 3 4 固定化载体的选择 不同的固定化方法对固定化载体有不同的要求，理想的微生物固定化载体应 具备以下条件：机械强度高，寿命长，具备一定的容量，价格低廉；性质稳定、 l o 硕二七学位论文 不易被生物降解；固定化过程简单，常温下易于成形，固定化过程及固定化后对 微生物无毒；生化及热力学稳定性好；基质通透性好，沉淀分离性好；具有惰性， 不能干扰生物分子的功能。 常见的几种固定化载体性能比较如表1 4 。 表1 4 几种固定化载体的性能比较 常用的固定化微生物的载体可分为无机载体、有机高分子载体和复合载体三 大类： ( 1 ) 无机载体如多孔玻璃、硅藻土、石英砂等、沙子、碳酸盐类、各种玻璃 材料、沸石类、陶瓷材料、碳纤维、矿渣、活性炭等。无机类载体普遍具有机械 强度相对较高的特点、且大多数化学性质比较稳定，可提供较大的比表面积，微 生物主要以附着在其表面实现固定化；其主要不足是密度较大。 ( 2 ) 有机载体还可分为两类：一类是高分子凝胶载体，如琼脂、角叉莱胶和 海藻酸钙等；另一类是有机合成高分子凝胶载体，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇 凝胶、光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。有机类载体是微生物固定技术中使用的主 要载体材料。主要有p v c 、p e 、p s 、p p 、各类树脂、塑料、纤维以及明胶等。其 中有机高分子类材料适用于悬浮态完全混合反应器( 生物流化床、曝气生物滤池等) 的微生物固定化，而塑料类载体多适用于固定床( 如普通生物滤池) 或混合型( 如流 化床) 工艺。有机类载体可以根据处理工艺过程的需要加工成各种形状，以更好的 满足反应器物理、生物特性的需要，同时提高载体的表面积。 ( 3 ) 复合载体是一种新型载体，由无机载体和有机载体材料结合而成，使两 类材料的性能互补，从而显示复合载体材料的优越性。可有效解决固定化细胞应 用于废水处理所面临的成球难、易破碎、活性丧失大等问题，在降低成本、提高 废水处理效果等方面具有明显的优势。 丝瓜瓤同定白腐菌降解2 ，4 二氯酚的研究 1 3 5 固定化菌种来源 1 3 5 1 固定化菌类 许多种类的真菌和酵母在自然界普遍存在，其菌体可以从某些发酵过程中大 量得到，因此使这些微生物成为选择生物吸附剂的良好材料。已有研究的真菌如 酵母( c e ，- e y 括砌e ) ，霉菌( 尺j l f z d p m ss p p ) 等。霉菌和酵母能够吸附和积累重金 属，这一特征既有为代谢目的的主动金属离子吸附，也有细胞以及组成成分的化 学补偿而引起的被动吸附和结合。某些类型的真菌和酵母对金属离子的明显生物 吸附作用可以用于从水溶液中吸附和浓缩金属离子。 真菌不仅对单个金属能有效的吸附，而且，由同一种菌体对多于一种金属的 吸附也有很多的研究和报道。实际上，在测定的溶液种常存在各种金属离子的混 合物。在吸附过程中要分清主动吸附和被动吸附是不太现实的，特别是在涉及活 细胞的工作中。 1 3 5 2 固定化藻类 近3 0 年来国内外在细菌、真菌、海藻应用于生物吸附方面均做了大量的研究， 但根据其现状和发展趋势看，海藻是其中研究较多的，这可能与海藻来源广泛、 蕴藏丰富有关。同时，大量报道表明，藻类可有效地吸收和富集污水中的重金属， 富集倍数可达几千倍，而其富集重金属容量可达藻干重的1 0 。各种海藻具有不 同的、特殊的结合金属离子的性质。w i l k i n s e n 等人对海藻酸钙固定小球藻去除污 水中重金属汞的研究表明，处理1 2 d ，固定化小球藻可去除9 9 的汞。固定化增加 了藻细胞的生理活性，固定在载体内的小球藻能富积7 0 的汞，而悬浮的小球藻 仅富集4 0 。据分析在固定化小球藻对汞的去除中，除去藻体的吸附，藻类代谢 活动引起汞的挥发2 0 ，载体凝胶吸附1 0 。目前国外已经有使用死的微生物制 成生物吸附剂去除水中重金属的专利，例如：a m t b i o c l a i m 工艺就是利用死的 芽抱杆菌制成球状生物吸附剂吸附水中重金属离子。在美国已有两个科研机构研 究提供商业用途的生物吸附剂，一个是以废弃的微生物为对象，另一个是以藻类 为对象。 1 4