（植物学专业论文）拟南芥nad（h）激酶在非生物胁迫中的功能分析.pdf

中文摘要 盐渍、干旱和低温等逆境胁迫极大的影响着植物的生长，发育和繁殖，是农业减产的重 要原因。环境胁追可以引起植物体内活性氧的积累，导致细胞结构的氧化破坏，给植株带来 严重伤害。 n a d 0 f 1 激酶是n a d p h 合成途径中的关键酶。近年来拟南芥中的n a d ( i d 激酶( n a d m ， n a d k 2 和n a d k 3 ) 的序列已被发现，但在植物适应环境境胁迫应答中的功能及其作用机制 还不清楚。本文利用分子生物学方法分析了n a d ( h ) 涮t 酶的表达特点和亚细胞定位，并利用突 变体材料研究了其在环境胁迫应答中的功能及其可能机理。 利用细菌，酵母的的n a d ( a ) 激酶基因与拟南芥基因组序列进行比较，推测拟南芥中可能 有3 个n a d ( h ) 激酶类似基因。对n a d m ) 激酶基因在正常组织及胁迫条件下的表达进行了分 析，结果表明n a d k 3 表达受冷、氧化胁迫及a b a 的诱导，暗示n a d k 3 可能参与植物逆境胁 迫响应。 对n a d m ) 激酶蛋白的氨基酸序列进行分析，发现n a d k 2 的氨基酸序列分析发现在n 端 有一叶绿体定位信号，利用n a d k 2 - g f p 瞬时表达结果证实n a d k 2 定位于叶绿体中。 对突变体与野生型拟南芥在胁迫条件下的表型进行分析表明，突变体n a d k 2 在正常情况 下，生长矮小，叶色黄绿。叶绿素含量明显低于野生型的。编码叶绿素合成中的两个关键酶 p o r b ，p o r c 的基因表达水平也低于野生型的。表明，n a d k 2 参与了叶绿素的合成。而且 相对野生型来讲，该突变体对u v b ，干旱，高温和高盐等可产生氧化胁迫的不良环境表现的 更加敏感。突变体n a d k 3 的分析表明，n a d k 3 的缺失会导致植株对氧化胁迫的敏感性增加。 以上结果表明，在野生型拟南芥中，n a d 讲) 激酶是活性氧清除中的关键酶，在防止活性 氧的过量积累、保护细胞内膜系统免受氧化伤害中具有十分重要的作用。我们的工作对进一 步理解植物体体内的氧化清除系统有重要意义。 关键词：掇南芥，n a d ( h ) 澈酶，氧化胁迫 a b s t r a c t e n v i r o n m e n t a ls t r e s ss u c h 勰s a l t , d r o u g h t ，c h i l l i n g ，w a t e r l o g g i n ga r et h em a i nr e s t r i c t i o n f a c t o r so fc r o pp r o d u c t i o n p l a n tc a np r o d u c ea n da c c u m u l a t e dr e a c t i v eo x y g e ns p e c i e st h a t c a u s eo x i d a t i v es t r e s s ，t h e ya r eh i g h l yr e a c t i v ea n dt o x i c ，a n dc a nl e a dt o t h eo x i d a t i v e d e s t r u c t i o no fc e l l s n a d ( h ) k i n a s em a yp l a ya l li m p o r t a n tr o l ei nt h es y n t h e s i so fn a d p h t h r e ed i s t i n c t n a d ki s o f o r m s0 w a d k l ，n a d k 2a n dn a d k 3 ) h a v eb e e ni d e n t i f i e di na r a b i d o p s i s h o w e v e r , t h ep h y s i o l o g i c a lr o l e so fn a d k su n d e re n v i r o n m e n t a ls t r e s sr e m a i nu n c l e a r i n p r e s e n ts t u d y , w ei n v e s t i g a t e dt h ep h y s i o l o g i c a lr o l eo fa r a b i d i p o s i sn a d k s t h es u b e e l l u l a r l o c a l i z a t i o na n de x p r e s s i o np a t t e r no fn a o ( h ) k i n a s eu n d e rs t r e s sw e r ea n a l y z e dt h r o u g h m o l e c u l a rm e t h o d s t h ef u n c t i o no fs a d c a ) k i n a s ei na b i o t i cs t r e s sr e s p o n s ew a si n v e s g a t e d u s i n gt h ea r a b i d o p s i sm u t a n to fn a d c a ) k i n a s e ac o m p a r i s o no ft h es e q u e n c ed a t ag a i n e df r o mb a c t e r i aa n dy e a s tn a dk i n a s e sw i t ht h e a r a b i d o p s i sg e n o m er e v e a l st h r e eg e n e se n c o d i n gp u t a t i v en a d ( h ) k i n d s e s t h ee x p r e s s i o n p a t t e r no fn a d k ss h o w st h et r a n s c r i p t i o no f n a d k 3 w a si n d u c e ds i g n i f i c a n t l yb yc o l d ，m v o r a b at r e a t m e n t ，t h i ss u g g e s t st h a t n a d k 3m a yt a k ep a r ti nt h er e s p o n s et os t r e s so fp l a n t n a d k 2 p r o t e i nw a sp r e d i c t e dt oh a v e ac h l o r o p l a s tt a r g e t i n gs e q u e n c ei nt h en t e r m i n a l r e g i o n s u b - c e l l u l a rl o c a l i z a t i o no ft h en a d k 2 - g f pf u s i o np r o t e i ni n d i c a t e dt h a tt h en a d k 2 p r o t e i nw a s l o c a l i z e di nt h ec m o r o p l a s t t h en a d k 2k n o c ko u tm u t a n t ( 肿d 鸵) s h o w e do b v i o u sg r o w t hi n h i b i t i o na n ds m a l l e rr o s e t t e l e a v e sw i t hap a l ey e l l o wc o l o r p a r a l l e lt ot h er e d u c e dc h l o r o p h y l lc o n t e n t ，t h ee x p r e s s i o n l e v e l so ft w op o r g e n e s ，e n c o d i n gk e ye n z y m e si nc h l o r o p h y l ls y n t h e s i s ，w e r ed o w nr e g u l a t e d i nt h en a d k 2p l a n t s t h en a d k 2p l a n t sa l s od i s p l a y e dh y p e r s e n s i t i v i t yt oe n v i r o n m e n t a ls t r e s s e s p r o v o k i n go x i d a t i v es t r e s s ，s u c ha su v b ，d r o u g h t ，h e a ts h o c ka n ds a l i n i t y t h e s er e s u l t ss u g g e s t t h a tn a d k 2m a yb eac h l o r o p l a s tn a dk i n a s ea n dp l a yav i t a lr o l ei nc h l o r o p h y l ls y n t h e s i sa n d c h l o r o p l a s tp r o t e c t i o na g a i n s to x i d a t i v ed a m a g e t h ea n a l y s i so fn a d k 3 m u t a n ts u g g e s t st h a t t h el o s so fn a d i om a ym a k ep l a n t sb es e n s i t i v et oo x i d a t i v es t r e s s s ot h a t ，n a d ( h ) ki sak e yk i n a s ef a m i l yi nr o ss c a v e n g i n gs y s t e m o u rw o r kw i l lm a k eu s u n d e r s t a n do x i d a t i v es t r e s sf u r t h e r k e y ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ，n a o ( i dk i n a s e s ，o x i d a t i v es t r e s s 英文缩写 a b a a m p a p x b s a c a t c d n a d e p c d h a r d n a 英文名称 a b s c i s i ca c i d a m p i c i l l i n a s c o r b a t ep e r o x i d a s e b o v i ns c r a ma l b u m i n c a t a l a s e c o m p l e m e n t a r yd n a d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e d e h y d r o a s c o r b a t er e d u c t a s e d e o x y r i b o n u c l e i ea c i d 缩略词 d e o x y n u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s d n t p m i xo fd a t p d t t p d c t p d g t p )x c o l i e s c h e r i c h i ac o l i e b e t h i d i u mb r o m i d e e d t a e t h y l e n e d i a m i n et e t r a c e t i ca c i d g f p g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n g rg l u t a t h i o n cr e d u c t a s e i p t g l s o p r o p y l t h i o - 1 3 - - d - g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n k a n a m y c i n k dk i l o d a l t o n l bl u d a b e r t a n im e d i a m a p k m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e m d a m a l o n d i a l d e h y d e r a i nm i n u t e m o p s 3 - i n m o r p h o l i n o - p r o p a n e s u l f o n i ca c i d m s m u r a s h i g e s k o o gm e d i a m v m e t h y lv i o l o g e n 中文名称 脱落酸 氨苄青霉素 抗坏血酸过氧化物酶 牛血清白蛋白 过氧化氢酶 互补d n a 焦碳酸二乙脂 脱氢抗坏血酸还原酶 脱氧核糖核酸 脱氧腺苷三磷酸 ( d a t p d i t p d c t p i d g t p 的混合物) 大肠杆菌 溴化乙锭 乙二胺四乙酸 绿色荧光蛋白 谷胱甘肽还原酶 异丙基b d 硫代半乳糖苷 卡那霉素 千道尔顿 l b 培养基 有丝分裂原激发的蛋白激 酶 丙二醛 分钟 3 - ( n 一吗啡啉) - 丙磺酸 m s 培养基 甲基紫精，联二一n 一甲基吡 啶 n b tn i t r ob l u et e t r a z o l i n mc h l o r i d e氯化硝基四氮唑蓝 o d o p t i c a ld e n s i t y 光密度 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 p e g p o | y e t h y l e n e g l y e o ! 聚乙二酵 p o d p e m x i d a s e 过氧化物酶 r i f r i f a m p i c i n利福平 r n a s e a r i b o n u c l e a s e a 核糖核酸酶a r o s r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 活性氧 r t - p c r 融7 。“。 以“锄睥5 ep o i y m 8 “。 。h a 虹 逆转录p c r r u n 虹c o r i b u l o s ed i s p h o s p h a t ec a r b o x y t a s e - o x y g e n a s e ! 毒二孑酸核酮糖羧化酶 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e 十二烷基磺酸钠 s d s i p a g es d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i ss d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 s s c s t a n d a r ds a l i n ec i t r a t e 标准柠檬酸钠盐 t a e t r i s - a c e t a t e - e d t a t r i s 乙酸电泳缓冲液 t c at r i c h l o r o a c e t i ca c i d 三氯乙酸 t e t f i s - e d t a t r i s 盐酸电泳缓冲液 t e m e d n n ，n ，n - t e t r a m e t h y le t h y l e n e d i a m i n e n ，n 。n ，n - 四甲基乙二胺 t r i s t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 u v - bu l t r a v i o l e t - b 紫外光一b w t w i l d t y p e 野生型 x g a l 5 b r 。m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y l - b - d - g a l a c t o s i d e 嚣苷- 4 - 躺堋隙岳0 。半 i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的 学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名t 芸| 七德喀 时间：2 0 0 s 年a 月s 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复翩手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，但这需在解密以后，即一年后( 2 0 0 6 年6 月) 。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名 时间：2 0 0 5 年6 月8 日 时问：2 0 0 5 年6 月8 目 厢t 锹 翘： 刊 鼬 中国农业大学博士学位论文 第一章生物体内的活性氧与清除括性氧系统 第一章文献综述 1 1 生物体内的活性氧与清除活性氧系统 活性氧( r o s ) 调控了植物的许多生理过程。同时，作为一种毒性分子，对植物又具有伤 害作用。我们对植物如何解决这种矛盾的理解还比较浅。不过，细胞内维持一种稳定的活性 氧水平对植物来说还是至若重要的。在拟南芥中，大约1 5 2 个基因组成的网络系统调控着体 内活性氧的水平。该网络中产生与清除活性氧的蛋白时刻处于高度动态之中。近年来，虽然 该网络中的许多关键蛋白已被发现。但是，有关相应的调控模式和保护作用及控制生长发育 和胁迫响应的信号调控网络方面还有很多问题需要继续探讨。 1 1 1 活性氧的种类 自从2 7 亿年前，有氧光合生物出现以来，活性氧一直就伴随着需氧生物( h a l l i w e n ，be t a l ， 1 9 8 9 ) 。空气中的氧是二价自由基，即具有两个不配对电子。这个特性使氧在一般条件下不参 与有机分子的反应，除非其处于激活状态。活性氧包括单线态氧( 1 0 2 ) ，超氧阴离子( o i ) ， 过氧化氢( h 2 0 2 ) ，羟自由基( h o - ) 。 1 1 2 活性氧的生理作用 与0 2 相比，它们能量很高，具有毒性，可以导致细胞结构的氧化破坏( a s a d a ，k e ta 1 1 9 8 7 ) 。 因而，所有的需氧生物也同时进化出了有效的活性氧清除机制。近年来，r o s 的研究又有了 新的发现内容，人们发现r o s 调控了生长发育，细胞循环，程序化死亡，激素信号转导和非 生物胁迫响应等一系列生物过程( k o v t u ny e ta 1 ，2 0 0 0 ：m u l l i n e a u x ，pa n dk a r p i n s k i ，s 2 0 0 2 ； t o r t e s ，m a e ta 1 2 0 0 2 ；f o g c m & n ，j e ta 1 2 0 0 3 ；k w a k ，j m e ta 1 2 0 0 3 ：j i a n g ，ke ta 1 2 0 0 3 ： d a t ，j e ta 1 2 0 0 0 ；n e i l l ，s e ta 1 2 0 0 2 ) 。这些研究扩展了我们对r o s 的认识，表明r o s 在生 物体内具有着双重作用：一方面，作为有氧代谢的副产物，另一方面又调控生长发育和防御 途径中的关键因子。 1 1 2 1 活住氯的毒害作用 氧化损伤常与膜脂过氧化联系在一起，氧自由基损伤生物膜的观点己被普遍接受。目前 许多研究已证实了活性氧能导致蛋白质与核酸的降解，在严重胁迫条件下，活性氧毒害作用 有时甚至是致死反应。 活性氧对生物膜的损伤 生物膜由磷脂双分子层组成，脂肪酸链通过酯键连接在甘油骨架的c 1 和c 2 上。自由基 的过氧化反应程度与脂肪酸双链的数量和位置有关( f r a n k e le n 1 9 8 5 ) 。 在不良环境胁迫下，细胞内会造成脂过氧化产物如m d a 、乙烷或其它氧化物的积累，人 中国农业大学博士学位论文 第一章生物体内的活性氧与清除活性氧系统 们一般认为生物体内氧自由基会优先降解不饱和脂肪酸。早在1 9 7 8 年n i e h a u s 就提出了生物 膜脂过氧化反应的机制。他认为除了攻击脂肪酸外，0 2 - 攻击磷脂的酯键也是重要的反应之一。 活性氧对蛋白质的氧化损伤 蛋白羰基化作用是一种不可逆的氧化过程，会导致蛋白功能的丧失( s t a d t m a n ，1 9 9 2 ) 。活性 氧攻击蛋白会导致特定氨基酸残基氧化、肽链的断裂、反应产物的交联和改变蛋白质电荷数。 蛋白质中不同氨基酸残基对活性氧的敏感性不同。含硫和巯基的氨基酸是活性氧的敏感位点， 如 r y r 、p h e 、t r p 、m e t 和c y s 。活性氧能够置换出半胱氨酸的氢原子，形成硫自由基从而 能够与另外一个硫自由基交联形成二硫桥。 活性氧对d n a 的损伤 d n a 面临氧自由基攻击是很脆弱的，活性氧能诱导d n a 裂解、缺失突变或其它致死突 变，从而导致d n a 的断裂及一些d n a 蛋白交联复合物形成。 1 i 2 2 活性氧参与细胞的信号转导 大肠杆菌中受活性氧调节的转录因子 对氧的敏感反应是生物进化的一个必要的条件，活性氧被证实参与原核与真核生物细胞 的信号转导过程。在细菌，酵母等单细胞生物中，转录因子作为感受r o s 的受体并激活各种 防御途径，调节体内代谢过程降低r o s 的产生( c o s t a ，va n dm o r a d a s f e r r e i r a ，p 2 0 0 1 ； g e o r g i o u ，g2 0 0 2 ) 。这是调控r o s 的一种最基本循环模式。 在e c o l i 中，一些调节因子参与活性氧调节的基因表达( p e a tm f , 1 9 9 5 ) 。细菌中存在两套 不同的胁迫诱导系统，即受h 2 0 ：诱导的过氧化物刺激子( s t i m u l o n ) 系统和受0 2 诱导的超氧离子 刺激子系统，每个系统各包含3 0 多种可诱导蛋白，这些蛋白由不同的调控因子( r e g u l a t o r ) 控制，其 中超氧离子刺激子系统中的s o x r 、s o x s 调控蛋白可控制该系统m a s o d ( s o d a ) 、f e s o d ( s o d b ) 等7 种蛋白的表达( e l t h o n t e ，1 9 8 7 ) ；o x y r 为过氧化物刺激子系统中的调控蛋白，它对编码过氧 化氢酶1 、g r 的k a t g 、g o t 基因的表达起正调控作用。虽然这两类调控蛋白及其调控的基因 构成的调控子( r e g u l o n ) 之间是相互独立的，但它们与热激诱导蛋白以及超氧离子刺激子系统及 过氧化物刺激子系统所含蛋白之间部分重叠的现象，显示细菌对氧化胁迫、热激在调控水平上 可能有共同的机制。细菌中已经明确o x y r 调控蛋白对k a t g 、g o t 的正调控通过其自身的氧化 还原来实现，它在h 2 0 2 作用下，由还原型o x y r 转变为氧化型o x y r 。目前认为o x y r 主要在转 录水平上调控，它与r n a 聚合酶相互作用，激活k a t g 、g o r 的转录( z h e n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 活性氯在高等真核生物细胞信号转导中的作用 植物中的钙信号主要是通过钙的储存与释放来实现的，而r o s 信号则是通过其产生与清 除来实现的。不同的发育或环境信号都会流入r o s 信号转导网络并干扰胞内的r o s 动态平衡。 r o s 的变化会被不同的蛋白，酶或受体感受到，并调节不同的发育，代谢和防御途径。r o s 2 中国农业大学博士学位论文第一章生物体内的活性氧与清除活性氧系统 有许多不同的来源其中n a d p h 氧化酶是研究的最清楚的一个。r o s 的清除由一系列的r o s 清除酶系统来负责。这是一个非常复杂而又严谨的调控系统。这其中牵扯到r o s 的产生，持 续时问，信号的放大及信号反馈等等 晟近，在拟南芥中的研究证明h 2 0 2 是参与信号转导的重要活性氧分子。h 2 0 2 能够激活特 异的细胞促分裂蛋白激t l i ( m a r r g k 3 蛋白m 盱1 ，从而诱导特异的胁迫反应基因的表达( k o v t u n y e t a l ，2 0 0 0 ) 。p e i 等的研究结果表明h 2 0 2 参与了a b a 诱导的质膜上c a “通道激活的过程( p e i 甜a 1 ，2 0 0 0 ) ，进而诱导下游的适应性反应。a - h m a c h e m e s s 等以拟南芥为材料研究u v - b 诱导 的基因表达中活性氧作用。发现胞内h 2 0 2 水平升高会导致p r 1 和l h c b 基因转录水平的增加， 而h 2 0 2 水平的升高主要来源于o f ( a h m a c h e m e s se ta 1 ，2 0 0 1 ) 。总之，在模式植物拟南芥 中活性氧参与了信号转导研究己取得了重要进展，但仍有很多工作要做。 非生物逆境如盐、辐射、创伤、臭氧、二氧化硫、极端温度及水份胁迫等引起植物的初 始反应中都有活性氧类的增加，利用分子生物学手段，对植物的氧化代谢进行修饰，提高植物抗 氧化胁迫的能力，进而提高对非生物逆境的抗性已成为近年来植物抗性研究的一个新的方向。 1 1 3 活性氧产生的主要部位 叶绿体，线粒体和微体中进行着剧烈的氧化代谢和电子传递，是r o s 的主要来源( 表 1 1 ) 。叶绿体能够通过m e h l e r 反应和天线色素来产生活性氧( a s a d a ，ke t 吐，1 9 8 7 ) 。r o s 的 产生因为缺c 0 2 的环境而加剧，如干旱，盐和商低温胁迫，在高光胁迫下更加严重。 在c 3 植物中，缺c 0 2 的环境会激活光呼吸途径( f o y e r , c h 2 0 0 2 ) 。这时，过氧化物酶体 的乙酸盐氧化酶会产生h 2 0 2 。作为脂肪氧化的副产物，微体中的脂类代谢也会产生h 2 0 2 。在 特殊胁迫下，线粒体中电子传递链是的o f 主要来源( m o i l e r , 1 m 2 0 0 1 ) 。另外，在胞质和内质 网中由细胞色素催化的脱毒反应也是r o s 的一个来源( u r b a n ，ee ta 1 1 9 9 7 ) 。质膜上的n a d p h 氧化酶是与哺乳动物钙依赖的n a d p h 氧化酶0 q o x s ) 的类似蛋白，人们对该酶的研究己比较 深入( l a m b ，c a n dd i x o n ，r a1 9 9 7 ；a p e l , ka n dh i r t , h 2 0 0 4 ；b a n f f ，b e ta 1 2 0 0 4 ；t e n h a k e n ， r e t a l 1 9 9 5 ；d e s i k a n ，r e t a l 1 9 9 6 ) 。它们在r o s 的信号转导中起很关键的作用。化学抑制剂 试验表明，它们可以阻碍或消弱生物和非生物胁迫下植物体内活性氧的产生( a l l a n ，a c a n d f l u h r , r 1 9 9 7 ；p e l l i n e n ，r e t a l 1 9 9 9 ；p a r k ，h - j e la 1 1 9 9 8 ；d a t ，j ee t a l 2 0 0 3 ) 。另外，哺乳动 物亚基g p 9 1 p h o x 的基因类似物也已在许多植物中报道( l a r a - o r t i z t e l a l 2 0 0 3 ；k e l l e r , te t a l 1 9 9 8 ；t o n e s ，m a e ta 1 1 9 9 8 ；g r o o m ，q j “a 1 1 9 9 6 ) ( t a b l e1 1 ) 。 除此之外，p h 依赖的细胞壁过氧化物酶，非质体中的草酸盐氧化酶和胺氧化酶也会产生 r o s ( b o l w e l l ，gp a n dw o j t a s z e k ，p 1 9 9 7 ；h u ，x e ta 1 2 0 0 3 ；w a i t e r s ，d r 2 0 0 3 ) 。尽管目前人们 的注意力主要集中在n a d p h 氧化酶及其在胞内信号转导的作用上，但线粒体，非原质体和过 氧化物酶体中产生的r o s 在外界刺激和发育中也起着重要的作用。 活性氧形成主要是指0 2 还原形成0 2 - 、h o 和h z 0 2 。另外在光合植物里，光合系统单线 态氧的形成也是相当重要的。正常生长条件下也有活性氧的产生；在某些情况下，活性氧的 产生是由于酶功能紊乱、电子传递系统紊乱或环境胁迫导致代谢功能受阻而造成的。 线粒体 3 中国农业大学博士学位论文 第一章生物体内的活性氧与清除活性氧系统 线粒体是细胞中能量代谢的主要部位，在线粒体的电子传递过程中不可避免地会发生 电子渗漏，产生活性氧。在线粒体电子传递链中活性氧的产生主要集中在复合体i 、i i i 和泛 醌等部位。 叶绿体 在叶绿体光合作用过程中极易产生活性氧。叶绿体中有三个部位会产生活性氧( e | s t n e r e f ，1 9 9 1 ) ： ( 1 ) p s i 通过m e h l e r 反应产生活性氧，这是叶绿体产生活性氧的重要来源之一。在n a d p + 供应不足时，c a l v i n 循环速率受阻，会导致p s i 的电子渗漏，产生活性氧。 ( 2 ) 正常情况下，激发态的叶绿素将其吸收的能量传递给p si i 反应中心，但是当植物处 于干旱、膜的传递系统受损、缺乏特定的营养或有污染物及除草剂等有害物质存在时，该电 子传递系统被打断时，单线态氧可能直接被激活形成三线态氧。 ( 3 ) p s i i 受光能激活后裂解2 个h 2 0 分子，放出一个0 2 分子，释放出4 个电子。在 这个位置也可能发生电子渗漏，形成0 2 一。 徽粒体 过氧化物体和乙醛酸体是一种单细胞膜的细胞器，它们除含有脂肪酸8 一氧化的酶系统外， 还含有乙醛酸循环所需的酶类( 如乙醇酸氧化酶、过氧化氢酶和各种过氧化物酶) 。乙醇酸氧 化酶将电子从己醇酸传给0 2 时会产生h 2 0 2 ( l i n d q v i s t y e t a l ，1 9 9 1 ) 。黄嘌呤氧化酶、尿酸氧 化酶和n a d ( p ) h 氧化酶在底物氧化过程中产生0 2 。黄嘌呤氧化酶也能在体外将黄嘌呤转变 成尿酸，同时产生o f ( f r i d o v i c hi ，1 9 7 0 ) 。 质膜 质膜上的n a d ( p ) h 氧化酶是产生0 2 的另一重要来源( v i a n e l l o a m a c r i e1 9 9 1 ) 。这种 黄素蛋白利用n a d p h 产生0 2 这些酶的功能紊乱也会产生o f ( c a k m a ki m a r s c h r e rh 1 9 8 8 ) 。拟南芥中的n a d ( p ) k 化酶a t r b o h d 和a t r b o h f j l 匾过产生0 i 参与t a b a 的反应( k w a k ， j m e ta l2 0 0 3 ) 。一种生长素激活的n a d h 氧化酶与细胞壁的酸化和细胞伸长有关( m o r r ed je t a 1 ，1 9 8 8 ) 。在植物中，类似真菌激发子激活的n a d p h 氧化酶，催化o f 的产生。这个过程与植 物病原真菌导致的过敏反应密切相关( d o k e n o h a s h i y l 9 8 8 ；d o k c n e t a l ，1 9 9 1 ) 。 细胞壁 实际上，细胞壁也是代谢进行旺盛和活性氧形成的区域。这些反应往往会与病原防御反 应相关，还有一些与与异源物质的区域化和降解有关，另外细胞壁上木质素生物合成反应中， 苯丙酸随机交联也必须有h 2 0 2 的参与( g r o s s g q1 9 8 0 ) 。而h 2 0 2 可能是由质膜上n a d h 氧 化酶催化形成，n a d h 可能是来源于细胞壁的苹果酸脱氢酶( g r o s sg g e t a l ，1 9 7 7 ) 。另外细 4 中国农业大学博士学位论文第一章生物体内的活性氧与清除活性氧系统 表1 1 植物体内r o s 产生的部位 p h o t o s y n t h e s i se ta n d p s io r c h l r e s p i r a t i o ne t m i t g l v c o l a t eo x i d a s e p e r - e x c i t e dc h l o r o p h y l lc h l - n a d p ho x i d a s cp m - f a t t ya c i d o x i d a t i o n p e r ：q 嚣4 l 墅q x i 亟s 啦壁 ：基! h i ! 曼q 圣i l 签! p e r o x i d a s e s , m n 2 + a n dn a d hc w - a m i n eo x i d a s e a p o a p o ，a p o p l a s t t 原质体；c h l ，c h l o r o p l a s t 叶绿体：c w , c e l lw a l l 细胞壁；印，e y t o s o l 细胞溶质；e t , e l e c t r o n t r a n s p o r t 电子传递；m i t ，m i t o e h o n d d a 线粒体；p e r , p e r o x i s o m c 过氧物酶体；p m ，p h s m am e m b r a n e 质膜： p s ，p h o t o s y s t e m 光合体系；v a c ，v a c u o l e 液泡 胞壁的二胺氧化酶在配的还原过程中也有活性氧的生成( v i a n e l l o a m a c r i e l 9 9 1 ：e l s t n e r e f , 1 9 9 1 ) 。 另外，生物胁追与非生物胁迫中细胞内的r o s 水平是不样的。生物胁迫激活了n a d p h 氧化酶并抑制了抗坏血酸盐过氧化物酶和过氧化氢酶。这导致了体内r o s 的积累并引发了肌 体体的防御机制。非生物胁迫使叶绿体和线粒体内产生了过量的r o s ，但由于体内r o s 清除 酶的激活，胞内的r o s 水平远低于生物胁追中的活性氧水平。 1 1 4 植物中的r o s 清除酶系统 植物中的r o s 清除酶系统主要包括超氧化物歧化酶( s o d ) ，过氧化氢酶( c a = d ， 抗坏血 酸过氧化物酶( a p x ) ，谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) ，过氧化物还原酶( p r x r ) 。这些酶系统连同 抗坏血酸和谷胱甘肽一起组成了细胞内清除0 2 _ 和h 2 0 z 的高效机制。 5 中国农业大学博士学位论文 第一章生物体内的活性氧与清除活性氧系统 1 1 4 1 超氧化物歧化酶( s o d ，s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 超氧化物歧化酶几乎存在于所有好气组织的细胞中，因此超氧化物歧化酶被认为是防止 氧化胁迫的关键酶( b e y e r w e l a l ，1 9 9 1 ；b o w l e r c e t a l ，1 9 9 2 ；s c a n d a l i a sj g1 9 9 3 ) 。超氧化物 歧化酶能催化o i 形成h 2 0 2 和0 2 ，防f l - h o 的形成，清除活性氧的毒害作用。根据与s o d 结合 的离子的不同，可分为f es o d ，m ns o d 和( 沁z ns o d 它们分别有不同的亚细胞定位( 图1 ，1 ) 。 s o d 2 0 f + 4 h + 卜 2 h 2 0 2 + 0 2 围1 1s o d 在细胞内的亚细胞定位 过表达s o d 可提高多种植物的抗氧化胁迫的能力( b r y a nd m c k e r s i ee ta 1 ，2 0 0 0 ；d a b a r c a c fa t ，2 0 0 1 ) 1 1 4 2 过氧化氢酶( c a t ，c a t a l a s e ) 过氧化氢酶催化h ：o ：形成h 2 0 和0 2 ，在所有的好气真核生物中都存在过氧化氢酶。 过氧化氢酶对于植物忍耐氧化胁迫的能力具有十分重要的意义( w i l l e k e n se ta l ，1 9 9 4 ) 。在 过氧化物体( 微粒体) 中脂肪酸8 一氧化、乙醛酸循环( 光呼吸) 和嘌吟代谢中都会产生 h 2 0 2 ，过氧化氢酶对于清除过氧化物体( 微粒体) 中h 2 0 2 具有十分重要的作用。植物中 过氧化氢酶对光十分敏感，具有快速的转换数( h e r t w i gbe ta 1 ，1 9 9 2 ) 。这可能是血红素 吸收光能或h 2 0 2 失活的结果。c a t 基因在玉米和其它的植物中都己被克隆( s c a n d a l i a sj g 1 9 9 0 ) 。玉米中共有三种类型过氧化氨酶基因，分别命名为c a t l 、c a t 2 和c a t 3 ，它们位于 不同的染色体上( s c a n d a l i a s j g e t a l ，1 9 9 0 ) ，c a t i 和c a t 2 位于过氧化物体和胞质之中 而c a t 3 位于线粒体之中。 c a t a l a s e 2h 2 0 2 0 2 + 2 h 2 0 6 中国农业大学博士学位论文第章生物体内的活性氧与清除活性氧系统 1 1 4 3 过氧化物酶伊o d ，e e r o x i d a s e ) 除过氧化氢酶外，许多酶也能将h 2 0 2 转化为h ：o ，如过氧化物酶。拟南芥胞质中的a p x l 在强光胁迫下是叶绿体保护的一个关键酶，它的功能缺失会导致胞内许多蛋白的氧化 a v l e t o v as ，e ta 1 2 0 0 5 ) 。根据供氢体不同过氧化物酶可以分为细胞色素c 过氧化物酶( 酵母 中) ，n a d p h 过氧化物酶( e , c o l i 中) ，谷胱甘肽过氧化物酶和抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) ( 高 等动植物中) 。在植物细胞中a p x 是清除h 2 0 2 的主要酶类，根据其的定位分为：类囊体a p x 、 微体a p x 和细胞质a p x 。对胁迫下a p x 同功酶表达情况的研究分析表明，强光及m v 处理 菠菜叶片时，其细胞质a p x 的转录水平显著升高，而叶绿体及微体a p x 的表达却不受影响 ( y o s h i m u r ake t4 f ，2 0 0 0 ) ：强光及m v 处理的豌豆、玉米、拟南芥及拟南芥细胞质中的a p x 转录水平也有明显升高( s t o r o z h e n k os e t a l ，1 9 9 8 ) 。 p e r o x i d a s e 2 g s h + p u f a - 0 0 h g s s g + p u f a + 2 h 2 0 1 1 4 4 抗坏血酸 l 抗坏血酸是人类重要的营养素，在植物组织中也有广泛分布，叶绿体中含有很丰富的抗 坏血酸。抗坏血酸在植物的生长、发育分化与代谢中都具有十分重要的生理作用( f o y e rc 1 9 9 3 ) 。在氧化胁迫下，抗坏血酸还可以作为还原剂，清除自由基，降低氧化胁追带来的伤害。 f o y e r 和h a l l i w e l l 认为叶绿体中h 2 0 2 的消除是通过抗坏血酸与谷胱甘肽的氧化还原的循 环途径来完成的( f o y e r c h h a u i w e h b ，1 9 7 6 ) ，而a s a d a 最终完成了这个途径及酶的鉴定。 因此，这些循环被命名为h a l l i w e l l - a s a d a 途径。在线粒体和胞质中也存在类似的h m l i w e r a s a d a 途径( m a c k e n z i e s m e i n t o s h l ，1 9 9 9 ) ( 图1 2 ) 。单脱氢抗坏血酸具有两种再生途径一种 途径是通过单脱氢抗坏血酸还原酶，另一途径是通过脱氢抗坏血酸还原酶和谷胱甘肽，电子 供体为n a d p h 。 1 1 4 5 谷胱甘肽(