（有机化学专业论文）水溶性共轭聚合物的设计、合成与生物传感研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 中文摘要 本论文围绕水溶性共轭聚合物的设计、合成及其在化学与生物识别及传感中 的应用，开展了以下几个方面的研究工作： ( 一) 利用s u z u k 偶联反应合成了侧链带咪唑功能团的水溶性阳离子聚芴 ( c c p l ) ，用元素分析，质谱，核磁共振光谱，红外光谱，g p c 对其结构进行了 确认和表征；利用紫外与荧光光谱( u v 和f l ) 对聚合物的光物理性质进行了 表征。发展了一种新型基于c c p l 的一氧化氮( n o ) 检测方法，该体系由三部 分组成：c c p l 、二价铜离子( c u 2 + ) 和n 0 。c u 2 + 通过n c u 相互作用与聚芴结 合，通过光诱导的电子转移过程将聚芴的荧光有效的淬灭。加入n o 后，n o 将 顺磁性的c u 2 + 转变成抗磁性的c u l + ，禁止了对聚合物荧光的淬灭，聚合物c c p l 的荧光恢复。在相同的条件下，其他相关的干扰化合物，如n o b f 4 、n a n 0 2 和n a n 0 3 都不能使顺磁性的c u 2 + 转变成抗磁性的c u ，所以c c p l 的荧光也不 能恢复。此种检测方法操作简单、分析快速，可以实现在水体系中对n o 高灵敏 度和高选择性的检测。 ( 二) 设计合成了主链含有2 ，2 一联吡啶的一系列水溶性阳离子聚芴衍生物 ( p f p - p 1 3 ) ，用元素分析，质谱，核磁共振光谱，红外光谱，g p c 对化合物的结 构进行了确认和表征；利用紫外与荧光光谱( u v 和f l ) 对聚合物的光物理性 质进行了表征。其中p f p p 2 可以作为种高灵敏度和选择性的荧光探针成功实 现了在水体系中对二价铜离子( c u 2 + ) 的检测。无c u 2 + 存在时，p f p p 2 在水溶液 中发出很强的荧光；加入c u 2 + 后，p f p p 2 就会通过n c u 相互作用与c u 2 + 络和， 荧光被高效地淬灭。通过p f p - p 荧光强度的变化可实现c u 2 + 的检测。该方法具 有水相检测、简单快速、高灵敏度和选择性的优点。 ( 三) 设计合成了同时带有j 下电荷和负电荷的水溶性寡聚芴分子( o f l ) ，通 过荧光发射光谱研究了o f l 在f e ( c n ) 6 4 作用下的荧光淬灭性质以及其与荧光素 标记的d n a 之间的荧光共振能量转移( f r e t ) 性质。由于存在较强的分子间 相互作用，0 f 1 表现出同共轭聚合物相似的光吸收能力，可成倍放大荧光信号。 关键词：水溶性共轭聚合物，水溶性寡聚芴，荧光，化学与生物传感，一氧化 氮，铜离子，d n a 。 中图分类号：t p 21 2 2t p 2 1 2 3 山东师范大学硕士学位论文 d e s i g na n ds y n t h e s i so fc a t i o n i cc o n j u g a t e dp o l y e l e c t r o l ”e sa n d a b s t r a c t t h e i r a p p l i c a “o no nc h e m i c a ja db i o l o g i c a ls e n s o r s as 丽e so f w a t e r s o l u b l ec o n j u g a t e dp o l y n u o r e n e sw e r ed e s i g n e da n ds 州h e s i z e d h i 曲1 ys e n s i t i v ea l l ds e l e c t i v ec h 锄o s e l l s o r sa 1 1 db i o s e n s o r sw e r ed c v e l o p e du s i i l g t l l e s ec o n j u g a t e dp o l y m e r s 髂叩t i c a lp r o b e s t h er c s u l t sa r es u m m 州z e da sf 0 1 1 0 w s ： 1 t h ew a t 小s 0 1 u b l ec a t i o i l i cp o l y n u o r c r l e ( c c p l ) c o n t a i n i n g 也e 曲i d a z 0 1 e m o i c t i e si ns i d ec h a i nw 勰d e s i 印e da n ds y n t h e s i z e d 越t 王l ef l u o r e s c e mp r o b ef o r t u m o n ，d e t e c t i o no fi l i t r i co x i d e ( n o ) 一t l l e 鹤s a yb e l l e f i t s 丘o mt l l es e 璐i t m t yo f o p t i c a ls i 弘a l s 五b mc o n j u g a t e dp o l y m e r s a n d 也es i m p l i c i t yo fn u o r e s c e i l c e m e a s u r 锄e 1 1 tt e c h n i q u e s t h ea s s a yc o n t a i l l st l h 优e l e m e l l t s ：ac a t i o i l i cc o n j u g a t c d p o l y m e rc o n t a i 工l i n gi m i d a z o l em o i e t i e s ，c u 2 + i o n s ，a r i dm et a r g e tn i 砸co x i d e t h e h i 曲l yn u o r e s c 朗tc o n j u g a t e dp o l y m e rc o o r d i n a t e st oc u 2 + i o n s 血d u g l lw e a kn c u i n t e r a c t i o n s ，a n di 乜n u o r e s c e n c ei se 砺c i e n t l yq u e n c h e dv i ap h o t o i n d u c e de l e c t m n t r 锄s f e rp r o c e s s ( o 扩s t a t e ) h lt h ep r e s e n c eo fn i t r i co x i d e ，t h et r a l l s f o 彻a t i o no f t h e p a r 眦a 印e t i cc u 2 + i o ni m od i 锄a 弘e t i cc u l + i o ni n h i b i t st h eq u e n c h i n ga n dt h e r e f b r e t h en u o r e s c e n c eo ft h ec o n j u g a t ep o l y m e ri sr e c o v e r e d ( o n s t a t e ) 0 t h e rb i 0 1 0 百c a l l y r e l e v a n tr e a c t i v en j t r o g e ns p e c i e s ，s u c ha sn o b f 4 ，n a n 0 2a n dn a n 0 3d o n te x h i b “ t h en u o r e s c e n c er e c o v e r yo f c o n j u g a t e dp 0 1 y m e ri nt h es 锄ec o n d i t i o n 私1 1 i 衄co x i d e t h ec a t i o n i cc o n j u g a t e dp o l 邢e “c u 2 + c o m p l e xc a nt h u sb eu s e d 邪m ep l a t f o mt o d e t e c tn i t r i co x i d ei na q u e o u ss 0 1 u t i o nw i t hm 曲s e n s i t i v i t ya 1 1 ds e l e c t i v i 吼 2 w ed e s i 弘a 1 1 ds y i l 幽e s i z ean c ws e r i e so fw a t e r _ s o l u b l ec a t i o n i cp 0 1 y f l u o r e n e c 叩o l y m e r sc o n t a i l l j n g2 ，2 b i p y r i d y l p h e n y l e n e v i n y l e n em o i e t i e si nt l l eb a c k b o n e ( p f p p i 3 ) a m o n gt l l e m ，p f p p 2c a nb eu s e da ss e l e c t i v ea n ds e n s i t i v en u o r e s c e n t p r o b et od e t e c tc u 2 + i o n si na q u e o u sm e d i u m 1 nt h ea b s e n c eo ft h ec u 2 + i o n ，t 1 1 e p f p - p 2e x h i b i t ss t r o n gf l u o r e s c e n c ee m i s s i o ni na q u e o u ss o l u t i o n u p o na d d i n gt h e c u 2 + i o n ，t h ep f p pc o o r d i n a t e st oc u 2 + i o n st h r o u g hw e a kn c ui n t e r a c t i o n s ，a n d 山东师范大学硕士学位论文 i t sn u o r e s c e n c ei se 蚯c i e n t l yq u e n c h e db yt 1 1 ec u 2 + i o n b yt r i g g 缸n gt h ec h a n g eo f 锄i s s i o ni n t e l l s i t yo fp f p p ，i ti ss u i t a b l et o 笛s a yc u 2 + i o n si na q u e o u ss o l u t i o n 1 1 1 e 笛s a yb e n e 觚丘0 mm es e n s i t i v i t yo fo p t i c a ls i 印a l s 舶mc o n j u g a t e dp o l y i i l e r sa j l d t l l es i m p l i c i t yo fn u o r e s c e n c em e 硒u r e m e n tt e c h i l i q u e s 3 w a t e 卜s o l u b l ec a t i o n i co l i g o n u o r e n ec o n t a i n i n go n ec a r b o x y lg r o u po ns i d e c h a i n( o f 1 )w 弱s y l l m e s i z e db ys u z u l ( ic o u p l i n g 1 1 1 e p r e s e n c eo ft e n l l i n a l a m m o n i u mm o i e t i e sm dc a 而o x y l 口d u pi n c r e a s e s i n t e 肌o l e c u l a u re l e c 订o s t a t i c i n t e r a c t i o n s t h ee l e c t r o s t a t i cf o r c e sa n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n s l e a dt 0t h e f 0 n n a t i o no fp o l y i n 耐c l i k es 咖c t u r e sf o ro f1 ，w h i c ho 仃e r s i ts i 血1 a r l i g h t h a r v e s t i n ga b i l i 妙弱t l l a to fc a t i o n i cc o n j u g a t e dp o l y e l e c t r o l 弘e s t h i sc o l l e c t i v e o p t i c a lb e h a v i o rw 2 u ss t u d i e db yn u o r e s c e n c eq u e n c h i n ge x p e r i m e n t sa 1 1 df l u o r e s c e n c e r e s o n a i l c e e n e 唱y 仃锄s 矗盯 口i 也t )e x p e r i m e n t s w i t hn u o r e s c e i i l l a b e l e d d o u b l e s t m d e dd n a ( d s d n a f 1 ) k e y w o r d s ：w r a t e r - s 0 l u b l ec o n j u g a t e dp o l y m e r s ， o l i g o n u o r e n e s ， f l u o r e s c e n c e ， c h e m i c a la n db i 0 1 0 百c a ls e n s o r s ，n i t r i co x i d e ，c o p p e ri o n s ，d n a c l a s sn u m b e r ：t p 2 1 2 2t p 2 1 2 3 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其 他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名：硎成劣 字：夕形 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂撞有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权堂蕉可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用 本授权书) 学位论文作者签名：琊房谤 签字日期：2 0 0 客年4 月信同签黧。罂侈r签字日期：2 0 0 了年年月侈r 山东师范大学硕士学位论文 第一章前言 1 1概述 近年来共轭聚合物作为一类具有特殊光、电性质的高分子化合物受到了科学 家们的广泛关注。目前，共轭聚合物的基础研究以及实际应用探索都已成为人们 研究的热点。基于共轭聚合物的生物传感器作为一个具有广泛交叉特点的综合研 究领域，是把共轭聚合物引入生命科学研究的一个重要结合点。1 9 9 5 年s w a g e r 等人首次提出了共轭聚合物荧光信号放大效应的概念“1 ，利用荧光信号放大特性 可很大程度地提高检测灵敏度，为生物传感器的发展提供了新的传感模式“1 “。 1 9 9 9 年w l l i t c c n 等人将甲基紫连接到生物分子探针上( q u e n c h 盯- t e i l l e 卜l i 鲫d ， q t l ) 1 ，首次利用共轭聚合物的荧光信号放大性质设计了蛋白质传感器。共 轭聚合物材料不仅可以通过电子传递过程实现信号高倍放大，b a z 孤“”“等人发 现通过荧光共振能量转移( f r e t ) 也可以提高检测信号。人们利用聚合物的光 电特性，设计了多种传感体系用于检测核酸、蛋白质、生物小分子和金属离子。 经过近几年的发展，基于共轭聚合物的化学与生物传感已经成为一个新的交叉研 究领域，有望作为具有广泛应用价值的高灵敏化学与生物传感平台，广泛应用于 医疗诊断、基因突变观测、基因传输监控、环境检测以及国家安全防御等方面。 1 - 2 共轭聚合物的结构 共轭聚合物中存在着长程的兀电子共轭体系，不仅大大缩小了成键和反键能 带间的能隙( 一般为1 5 3 e v ) ，而且使两个能带增宽，能带内的轨道数增加， 轨道间能隙减小，载流子( 电子和空穴) 在能带内可以自由移动，因此同时具有 金属和半导体的光电子特性。共轭聚合物的共轭骨架允许电子或能量在整条链上 自由流动，从而具有“分子导线”功能5 。8 1 。 常见的共轭聚合物有聚乙炔、聚苯、聚对苯撑乙烯、聚对苯撑乙炔、聚噻吩、 聚吡咯、聚芴等。图1 1 给出了部分共轭聚合物的结构伸】，它们是由多个重复的 含交替单双键三键结构的单体组成。把季铵盐、羧基、磺酸基、多羟基等水溶 性基团共价连接到共轭聚合物侧链上使其具有水溶性，这样聚合物可以和生物分 子发生相互作用【i 引。常用的水溶性共轭聚合物有聚芴、聚苯乙炔、聚苯乙烯以 及它们的衍生物等。 山东师范大学硕士学位论文 聚合物 聚乙炔 聚噻吩 聚对苯撑 聚苯并噻吩 聚2 ，5 一二烷氧基苯 撑乙烯 聚芴 结构 础 饿 赫 鼠 聚合物 聚苯撑乙烯 聚吡咯 聚苯硫醚 聚二二氧六环并噻 吩 o r ，一 嘏、，一，1 梯形聚荤撑 1 一j 一。 r 茹 n 聚苯撑乙炔 图1 1 经典共轭聚合物的化学结构式 1 3 聚芴类水溶性共轭聚合物 结构 俄 饿 h k s t 厂- 、 馘 k 咄 灾鲁繁r jr 2r jr ! 图1 2聚烷基芴的f e c l 、氧化台成路线 2 0 0 2 年，b a z a n 研究小组通过s u z u k l 聚合法，率先合成了与苯共聚的阳离 蕊 山东师范大学硕士学位论文 子聚芴衍生物p 1 f 2 2 】( 图1 3 ) ，随后在此基础上合成了阳离子聚芴衍生物p 2 【2 3 】 ( 图1 4 ) 。由于这两种方法的单体分子带有氨基容易吸附到色谱柱上，所以纯化 比较困难。后来发展了一种新的合成方法克服了这一缺点( 图1 5 ) ，可以得到 纯度高的的单体和聚合物p 3 前体【2 4 】。 ，：日心：嚣器 t h f a t er p 1 图1 3 水溶性聚萄p 1 的s u z u k i 合成路线 筲+ k) 。) p 2 图1 4 永溶性聚芴p 2 的s u z u k i 合成路线 山东师范大学硕士学位论文 卧妒r p d ( p h 曲4 2 口m 眨c 0 3 t hf a t b r m e 3 n 日 日 p 3 图1 5 水溶性聚芴p 3 的s u z u k i 合成路线 b a z a n 研究小组在聚合物p 1 的基础上，合成了构象可调的水溶性聚芴p 4 【2 5 1 。 他们还合成了一系列末端带阳离子寡聚芴的枝状高分子( p a m a m ) 【2 6 ，2 7 1 ，并成 功应用与d n a 检测。由于该聚合物具有很好的光收集能力及规整的结构，在生 物传感器的研究领域具有潜在的应用价值。 4 p 4 嚣 b 一 山东师范大学硕士学位论文 王树研究小组设计合成了带呋喃基团的聚茄【2 8 1p 5 p 8 ，树枝状聚合物p 9 p 1 1 【2 9 1 ，侧链带咪唑的阳离子聚芴p 1 2 【3 0 1 ，侧链带冠醚环的聚p 1 3 【3 ，带生物素 的聚芴p 1 4 【3 2 】，侧链含有氨基和羧基的聚芴p 1 5 【3 3 1 等，并以此为基础发展了新 型的生物和化学传感器，实现了对核酸、蛋白质、生物小分子和金属离子的检测。 p 5 一p 8 h 。蛩0 0 一咬耋 _ 、v 一厂一2 c n c o o h ，f 韵乜匕 ， p f p g ”k e ，o p 5 ：m = 1 0 ，n = 0 p 6 ：m = o 7 ，n = o 3 p 7 ：m = o 5 ，n = 0 5 p 8 ：m = o 3 ，n = o 7 p 9 一p 1 1 p 1 2 p f p g 2 p 1 3 山东师范大学硕士学位论文 p 1 4p 1 5 1 4 其它几类经典水溶性共轭聚合物 近几年来，聚对苯撑乙烯类水溶性共轭聚合物p p v 和聚对苯撑乙炔类水溶 性共轭聚合物p p e 的光学性质及其在生物和化学传感器方面的应用引起了科学 家的广泛关注并且成为研究的热点。几种新型的p p v 、p p e 被陆续报道，f u j i i 研究小组合成了带羧酸根的聚对苯撑乙烯p p v l 【3 4 3 5 1 ，具有很高的发光效率和窄 的发光光谱等特点。李玉良研究小组通过h e c k 聚合反应，合成了新的阳离子聚 p p v l 对苯撑乙烯p p v 2 【3 引。t r a v a s s e j d i c 研究小组设计合成的阳离子聚对苯撑乙烯 p p v 3 m 实现了d n a 的实时检测。s w a g e r 研究小组合成了阳离子聚对苯撑乙炔 p p e l 【3 8 1 ，s c h a n z e 研究小组合成了侧链带磺酸根和碳酸根的聚对苯撑乙炔p p e 2 【3 9 ，4 0 l ，p p e 3 【4 1 ，4 2 1 。 6 p p v 2 。) b r p p v 3 太 山东师范大学硕士学位论文 p p e lp p e 2 o 鼗酱。 p 凇0 2 p p e 3 1 5 水溶性共轭聚合物的光电性质 1 9 9 5 年s w a g e r 等人首次提出了共轭聚合物荧光信号放大效应的概念，即共轭 聚合物具有“分子导线”功能，其共轭骨架允许电子或能量在整条链上自由流动。 当淬灭剂结合到聚合物链上的任何一个位点时，就会阻碍整条链上的电子或能量 流动，从而改变其荧光特性。即一个淬灭剂分子可能淬灭整条共轭聚合物链发出 的荧光，这样就产生了增强的电子传递淬灭效果。利用共轭聚合物的荧光信号放 大特性可成倍地提高检测灵敏度，为生物传感器的发展提供了新的传感模式。 c o n j u g a l e ds e g m e n t p o l y m e r 女厂试e r e n e r g y h v i e n e 叼，：二a 。n 女厂赢e r e n e r g y h v l e s 图1 6 电子传递淬灭示意图 1 6 水溶性共轭聚合物的化学与生物传感机制 生物传感器可以把生物分子的识别转变成可以测量的信号，水溶性聚合物通 心乇 留毒；l ? 、 c瞄j、 山东师范大学硕士学位论文 过与生物分子的相互作用可阻把信号放大从而可以很大程度的提高检测灵敏度。 生物和化学传感器可以通过荧光共振能量转移( h 江t ) 、电子转移或底物诱导的 构型变化这几种传感机制来检测探针分子和底物分子的相互作用。f r e t 机理作 为常用的技术手段，广泛应用在生物和化学传感器的研究中【4 3 4 7 1 。荧光共振能量 转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时，当给体分子吸收一定频率的光子后被 激发到个更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极一偶极相互作用，实 现了能量向邻近的受体分子转移，即发生能量共振能量转移。根据f 石r s t e r 能量 传递方程【4 ”，f r e t 的效率和给体的发射光谱与受体的吸收光谱的重叠程度、 给体和受体激发态偶极间的相对取向、给体和受体分子间的距离等因素有关。当 给体分子与受体分子符合以上几个条件时，激发给体分子，就可以发生从给体到 受体的荧光共振能量转移。因此，在选用共轭聚合物作为信号转导体时，要考察 聚合物的发射光谱与受体分子的吸收光谱是否具有相当程度的重叠，共轭聚合物 分子与受体分子间的相对取向、分子间的距离，以达到最好的f r e t 效率。 o c 丢硼j 凛五j = f 珊五砖a f _ 舨 图17f 6 r s t e r 能量传递方程 b a z a i l 研究小组研究报道了水溶性共轭寡聚物分子的结构、荧光能量受体的 选择等对f r e t 效率的影响。2 0 0 4 年w a i l g 等【4 9 l 提出在c c p n a - c s s d n a 这 个体系中加入d s d n a 嵌入剂溴乙锭( e b ) ( 文献 5 0 。5 2 1 报道e b 嵌入到d s d n a 碱 基对的内部，可使荧光量子产率增加) ，通过f r e t 将c c p 激发能传递到e b 上， e b 只有在加入特定序列的d n a 发生d n d n a 杂化形成d s d n a 时，才能发出 荧光。该法极大地提高了d n a 检测的选择性，w a i l g 等设计的第一种方案是： 在c c p 、无标记的s s d n a 探针和e b 混合液中加入未知目标s s d n a ，如果两条 s s d n a 是完全配对的，则会形成d n a 的双螺旋结构，e b 嵌入到d s d n a 中，静 电作用拉近了c c p s 与d s d n a e b 问的距离，激发c c p 后，通过f r e t 能量传 递到e b ，e b 发射出荧光( 图1 8 a ) ：如果加入的是不完全配对的目标则不能形 成双螺旋结构，e b 不能插入到d n a 中，因e b 为阳离子，与c c p s 有静电排斥 山东师范大学硕士学位论文 作用，给体和受体距离较远而不发生f i 也t 因而检测不到e b 的荧光( 图1 8 b ) 。 但是从荧光光谱图( 图1 9 ) 可看出，h 也t 的效率不高，从而导致检测的灵敏 度比较低。根据f 6 r s t e r 能量传递方程，n 也t 效率低是由于供体c c p 和受体e b 的跃迁偶极的相对取向没达到最佳。为了解决这一问题，w a i l g 等在探针s s d n a 的5 末端引入了荧光素作标记，由于荧光索可围绕d n a 的5 末端自由旋转，这 样c c p 与荧光素之间，荧光素与e b 之间的偶极相对取向均得到了优化，实际 上荧光素起到了c c p 与e b 之间f r e t 桥的作用，激发c c p ，通过c c p c + ， c 一e b 的双重f r e t e b 才能发出荧光( 图1 1 0 ) 。荧光素的引入改善了从c c p 到e b 的整个能量传递过程，有效放大了c c p 到e b 的f r e t 信号，e b 发出增 幅8 倍的荧光( 图1 1 1 ) 。 图1 8 刚离子聚合物与d n a e b 体系能量转移作用示意图 w a v e l e n g t h ( n m ) 剀19 日l 离子聚合物与d n a e b 体系能域转移幽 (-n8萱ist窘ui 山东师范大学硕士学位论文 ， 穹 巴 占 蔷 c 旦 s 图1 1 0 双重f r e t 示意图 椭舢翮0 鳓e 格o7 7 w a v e i e n g t h ( n m ) 图1 1 1 阳离子聚合物与f d n 觚b 能量转移图 2 0 0 7 年b a z a l l f 5 3 】等设计合成了水溶性聚合物p l i 和p 2 i ( 图1 1 2 ) ，研究 了它们与荧光素标记的单链d n a ( s s d n a f 1 ) 的荧光共振能量转移( f r e t ) ， 发现p 2 i 的f r e t 效率远远高于p 1 i ( 图1 1 3 ) 。p 2 i 的葸取代基与聚合物主链垂 直，作为“分子缓冲器”增加了聚合物聚集态链之间的分离，从而减少了荧光素 由于光诱导的电荷转移造成的荧光淬灭，因此相比p i i 具有高的f r e t 效率。 l o 图1 1 2p 1 i 和p 2 i 的分子结构 山东师范大学硕士学位论文 穹 曼 参 是 芑 二 l 瑚循85 舯铺o 伽叫o6 劬 w a 垤i g 口1 ( n m ) 图1 1 3p 1 i 和p 2 i 与s s d n a f 1 的能量转移图 光诱导的电子转移( p e t ) 即光诱导给体的电子转移到受体上，它是与鲫 相互竞争的机制，会降低f r e t 过程中的荧光信号和总的灵敏度。p e t 机制通过 调节荧光的强度信号来进行检测，这一原理已经广泛应用与生物传感研究体系 中f 5 4 l 。如下图所示，s i m a t i o n a 是能量转移示意图，当受体的h o m o 、删o 能级在给体的轨道能级之间时，一旦激发给体，就会发生从给体到受体的能量转 移；当受体的能级不在给体轨道能级之间时，如图1 1 4s i t u a t i o nb 所示，激发给 体就可能产生光诱导的电子转移5 5 5 9 】；受体激发后将导致类似的电荷分离状态， 并伴随着空穴迁移到给体。 # 一 丢 一 | 石茸秒v ；时、 喜等茸等警z 喜喜时亡喜 告i 等首 z 苦再亡再 图1 1 4 光诱导的能量和电子转移示意图 利用底物诱导的聚合物构象变化来检测目标分子的方法也广泛应用于检测 d n a 【6 0 1 、a t p 【6 1 1 等。如以阳离子聚噻吩为探针，通过聚噻吩和带负电荷的生物 分子的静电相互作用，诱导聚噻吩的骨架共平面化，伎分子链共轭增强，吸收光 谱红移，直观表现在聚合物的颜色发生明显变化，从而检测目标生物分子的存在。 一 一 时 时 o 2 5 ， ， 山东师范大学硕士学位论文 1 7基于水溶性共轭聚合物的生物传感器 以水溶性聚合物为光能采集器，将核酸、蛋白质、生物小分子和金属离子特 异性识别信号放大，利用荧光淬灭和能量传递来进行检测的生物传感器，成为相 关研究者们广泛关注的热点。 1 7 1核酸生物传感体系 ：砝， 2 ee 揍、 饕+ 气銎4 囊：豢 山东师范大学硕士学位论文 2 0 0 5 年王树研究小组【6 3 】设计了一基于水溶性阳离子共轭聚合物的检测d n ag 一四 链体构象的生物传感体系。利用富含g 且带荧光素标记的s s d n a 和水溶性阳离 子聚芴，通过聚合物和荧光素之间f r e t 效率的变化( 图1 1 6 ) ，特异性的检测 g 一四链体构象，同时这一体系也可以用来检测k + 。没有k + 存在时s s d n a f 1 以 任意卷曲链的构象存在，s s d n a f l 与c c p 之间的静电相互作用比较弱，所以荧 光素与c c p 的距离比较远，从c c p 到荧光素的荧光共振能量转移效率不高。往 体系中加入k + 可诱导富含g 的s s d n a 形成g 四链体结构【6 4 1 ，d n a 的这种结构 可以使d n a 大分子的空间电荷密度增加， h o ，。、，o 。，、o t ，、。l ，p h 、t c o o h ，。，“。譬。8 opo o 5 - - g g t l | g g t g t g g r r g g 了 导致g q u a n e t d n a f l 与c c p 之间 j r ，。l 、 链，：h ) n j 。 p f wk辩r0竹 w - kf r l 盯r h o n - 嘲n e 娜h i 聊t 量可f h o h 掌c t 囊c h v a r _ 槲o 伽h ， h 、， + t “n p k i ，l r c t r t b 图1 1 6g 四链体和c 检测示意图 的静电相互l 作用增强，荧光素与c c p 的之间的距离减小，我们可以检测到很高 的从c c p 到荧光素的荧光共振能量转移效率。 山东师范大学硕士学位论文 q u 甜r i 事蛔 a a d u p i e c b e b b g 剞喇嗍手| ：阵昏文粥”a ( ；g g 盯 g g i g 阿 g g 良芎 暑暑d m c ： 3 二c c c a 下c c c a a t c c c a a l c c 巧 鲥0 | 哟：3 c c c p 恻嬲a 叁g c c ! a 刮：c c 5 o n 凡- 吣：3 c c e a 叁c c c a 喜c c c 鼬崞c c c g 5 i d 眦眦：量诒蚺嗽c m t c c c a t c c 洲 图1 1 7d n a 从g 四链体到双螺旋结构转变检测示意图 在此基础上王树研究小组又发展了一种利用双重f r e t 的方法检测d n a 的 构型变化【6 5 1 。c c p 与荧光素标记的d n a g 四链体之间的静电相互作用使从c c p 到荧光素的f i 辽t 信号很强。e b 分子不会嵌入到g 一四链体结构之中。在c c p 、 荧光素标记的d n ag 一四链体结构和e b 混合液中加入和g 四链体完全配对的 s s d n a ，则会形成d n a 的双螺旋结构，这时e b 可以嵌入到d s d n a 中，荧光素 起到了c c p 与e b 之间f r e t 桥的作用。激发c c p ，通过c c p - c ，c 搴_ e b 的双重f r e t ，e b 能发出荧光( 图1 1 7 ) 。因此这个体系可以检测d n a 从g 四链 体到双螺旋结构的转变。 近年来，肽核酸( p n a ) 的研究在基因研究方面开辟了一个新的方向【6 6 一0 1 。 在p n a 中，d n a 带负电荷的磷酸链被中性的多肽链所取代，从而缺少了d n a 负电荷间的库仑斥力，使得p n 7 d n a 的结合比d n 删a 更快、更稳定且更具 特异识别性【】。与d s d n a 相比，p n ，d n a 结合物更具热稳定性，不易被核酸 酶、蛋白酶和肽酶等生物降解【7 2 - 7 4 1 。另外，溶液离子强度和p h 值对p n 。怕n a 的杂化影响较小，因而提供了一个更宽的d n a 检测平台。g a y l o r d 等【7 5 】提出了 一个以荧光素标记的p n a ( p n a c ) 为探针检测d n a 的方法( 图1 1 8 ) 。在溶 液中加入水溶性阳离子聚芴c c p 和p n a c + 探针，由于p n a c 幸不带电荷，所以 不存在c c p 与p n a c + 之间的静电相互作用，缺少了静电相互作用，c c p 与c 。 就会因距离太远而不能产生有效的f r e t 。在这一体系中加入s s d n a ，当加入与 1 4 州 嚣 毋 一蘸 山东师范大学硕士学位论文 p n a c 完全配对的s s d n a ，它随即与探针p n a 杂化得到双螺旋 s s d n 脚n a c ，c c p 通过静电相互作用与之形成复合物c c p s s d n a 侧n a c ， c c p 与c 之间距离缩短，发生有效的h 也t ，c 发射强的荧光。当加入不配对的 s s d n a ，如情况b 所示，则s s d n a 与p n a 不能杂化，仅在c c p 和s s d n a 之间 存在静电相互作用，因此c c p 与c 之间距离仍会较远而不能有效地传递能量， c 就不发射荧光。 o 0 a o o o 图1 1 8p n a c 囊为探针检测d n a 示意图 对r n a 的检测方法常用的有凝胶分析法【7 6 ，7 7 1 、表面等离子体共振技术【7 8 。8 0 1 和u v 熔解曲线分析【8 1 1 。但这些方法费时，且r n a 样品量消耗大。2 0 0 4 年l i u 等报道了一种用荧光素标记的砌妊( r n a f 1 ) 作探针，依靠c c p 与鼬妊静 电相互作用的区别来检测靶基因r n a 的新方法( 图1 1 9 ) 。检测的目标靶基因 r n a t 与r n a f l 通过t e 仃a l o 叩r e c e p t o ri n t e r a c t i o n 【7 7 ，8 3 】( t s ) 形成复合物，增 加了负电荷数，阳离子聚芴衍生物c c p 与r n a t 瓜n a f l 间静电作用相比于 r n a f l 单独存在时增强，从而缩短了c c p 与荧光素间的距离，提高了f r e t 效 率，增强了荧光素的荧光强度。r n a l 带有g a a a 四级环，57 末端用荧光素标记 ( r n a l f 1 ) ，用它作为探针，非特异性的r n a 2 4 作为靶基因。r n a l 与r n a t 形成二聚体的水平反映在f i 辽t 的效率光学信号的放大上。在3 8 0m 处激发， r i 矾a 1 f 1 1 _ 1 0 0n m ， c c p = 4 1 0 6m 时，瑚w l l f l 与r n a 2 4 的二聚化依次降 低，荧光素的荧光强度依次减少，这样就可以有效地对目标r n a 进行检测。进 一步了解控制c c p 和r n a 相_ 巨作用的机制，进一步优化c c p 的性质，在r n a 库中对r n a r n a 之间的三级相互作用可望获得实际意义上的检测。 e e 0 0 e e e e e o o 0 o o 1 7 2 a 山东师范大学硕士学位论文 蛋白质检测 p b 黾一： o c o t - r n 1 口- u o 一口 广霄：1 iu u ； 一u c 一亡 u g - 一u c c 一 一 一t - o 一6 一t 一 图1 1 9 聚合物及r n a 结构示意图 w h i t t e n 小组利用共轭聚合物的超淬灭现象，发展了一种q t l ( q u e n c h e r - t e t h e 卜l i g a l l d ) 方法来检测蛋白酶的活性【魄8 5 1 。检测原理如图1 2 0 所 示，该方法简单、快速、灵敏性高，在蛋白酶抑制剂高通量的筛选上具有重要的 意义【8 6 】。 r e c o 鲫i i 日ns 翻葶i n 附瞳l n l 番 ；拳貉。，幔一 p 印哦ks 暂如吐r a t 。 1 6 q 恤 c h t | - l( 囊 t n z y m 国 露，渤： p o l y m e rq u e n c h e d ， “b a c k g r o u n d 竹 鼢 ：， + - 。镌锄? 簟 錾8 幻口n h 图1 2 0q t l 法检测蛋白酶示意图 n oq u 詹n c h 。 ”s j g n a i 王树研究小组利用荧光比值法，设计了一种检测链酶亲合素( s t r e p t a v i d i n ) 。口-u，飞t，-guuccno ， _ = v u c v_ 一一呢- 口 r 川。叫。叫叫。“q叫u，盘ouucc口 2雕刊 ， u c e u u 一一一_ 一 山东师范大学硕士学位论文 的传感体系【3 2 】( 图1 2 1 ) 。利用水溶性阳离子聚芴c c p 和生物素化的荧光素之间 f r e t 信号的变化来检测链酶亲合素( s 唧t a v i d i n ) 。 即nw h褂 彩k宝三n 龇笋 p f p 制m 口3 + 图1 2 1s 骶p t a v i d i n 检测示意图 1 7 3生物小分子以及金属离子的检测 设计、构建化学和生物传感器检测一些重要的生物小分子以及金属离子也越 来越受到人们的关注。王树研究小组设计发展了一种通过水溶性共轭聚合物聚集 态的变化来检测草酸分子的传感体系【87 】( 图1 2 2 ) 。通过静电相互作用草酸分子 可以使聚合物形成紧凑的堆积聚集态从而导致聚合物荧光淬灭；其他链较 长的二酸分子使聚合物形成的聚集态比较松散，相应发生的荧光淬灭程度很小， 因此该体系可以成功实现对草酸的检测。2 0 0 6 年，利用阳离子聚芴的荧光淬灭 设计了一种高灵敏性的过氧化氢探针( 图1 2 3 ) ，其检测限可以达到1 51 1 m 。并 以过氧化氢作为信号转导发展了一种新型的葡萄糖传感体系【s 8 】( 图1 2 4 ) 。 山东师范大学硕士学位论文 a b 蜘h q g n 口- n o 式当黢 苎璺_ l r 。、： 一e y h o o c c o o h h o o c ，户o o h o k c d u e c e “：d o o c 、c o o hh o o d 、一，、c o o h ，n a o n i c - c 埘 u - r b 蒯 图1 2 2 草酸检测示意图 每旦陵尸 i t r o n 鐾 n u o r e s c e c e 0 u e n d h 础 n u o r c s c e n c e 图l ，2 3h 2 0 2 检测示意图 谢 6 一 在此工作的基础上，又设计合成了含肓硼酸酯保护的荧光素的水溶性共轭聚 合物，通过荧光比值的方法在血清中检测过氧化氢和葡萄糖( 图1 2 5 ) 。此方 法的p h 响应范围广，并且分子内的荧光共振能量转移( f r e t ) 受到检测缓冲 溶液离子强度的影响小，因此该方法在过氧化氢和葡萄糖的检测上具有很好的应 用前景。 1 鲰o 0鹱。托。麓。裁 山东师范大学硕士学位论文 图1 2