（作物遗传育种专业论文）γ氨基丁酸gaba对玉米幼苗抗逆性的效应、作用机理及调控.pdf

n b t t l l i o b a r b i t u r i ca c i d四氮唑蓝 s s a d hs u c c i n i cs e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e 琥珀酸半醛脱氢酶 t c a v p a a c e t i ca c i d z p r o p y l p e n t a n o l ca c i d 三氯乙酸 丙戊酸钠 8niii 1 3 5 6 6 6 积累机制1 2 2 2 1 1 2 1 动物中g a b a 的分布、生理功能2 2 1 1 2 2 哺乳动物中的g a b a 受体2 3 1 1 3 r 一氨基丁酸一新型的功能食品因子2 6 1 1 3 1 富含g a b a 生物制品的研制2 7 1 1 3 2 人体中g a b a 的生理功能。2 8 1 2 本研究的目的和意义2 9 2 材料与方法3 l 2 1 供试材料3 1 2 2 药品及仪器设备3 1 2 3 材料处理3 1 2 3 1 高温胁迫下玉米的处理方法3 1 2 3 2 干旱胁迫下玉米的处理方法3 1 2 4 测定方法j 3 2 2 4 1g a b a 的提取与含量的测定( z h a n ge ta l ，1 9 9 7 ) 3 2 2 4 2s o d 、p o d 和m d a 的测定3 2 2 4 2 1 磷酸缓冲液的配制3 2 2 4 2 3s o d 的测定3 3 2 4 2 4p o d 的测定3 3 2 4 2 5m d a ( 丙二醛) 的测定3 4 2 4 3 抗旱自交系的筛选方法3 4 3 试验结果3 6 3 1g a b a 提取方法的优化3 6 3 1 1 水溶性色素的去除3 6 3 1 2 比色法测定g a b a 含量3 7 3 2 高温胁迫下g a b a 对玉米幼苗生长的影响3 8 3 2 1 高温胁迫下玉米幼苗中g a b a 的含量变化趁势3 8 3 2 2 高温及g a b a 处理后玉米幼苗中g a b a 含量变化3 9 3 2 3 高温及g a b a 处理后玉米幼苗中s o d 活性的变化4 l 3 2 4 高温及g a b a 处理后玉米幼苗中p o d 活性的变化4 2 3 2 5 高温及外源施加g a b a 后玉米幼苗中m d a 含量的变化4 4 3 3 干旱条件下抑制剂对玉米幼苗中g a b a 含量的影响4 5 3 3 1 抗旱自交系的筛选结果4 5 3 3 2 干旱胁迫下玉米幼苗中g a b a 的含量变化趁势4 7 3 3 3 干早胁迫下g a d 抑制剂对玉米幼苗中g a b a 含量的影响4 8 3 3 4 干旱胁迫下s s a d h 抑制剂对玉米幼苗中g a b a 含量的影响4 9 4 讨论5 1 5 结论5 3 参考文献5 4 致谢6 7 攻读硕士学位期间发表论文情况6 8 i i 一种四碳非蛋白质氨基 ，它是作为中枢神经系 体结合及其它神经递质 要行为的调节以及多种 种植物以及植物的各个 组织和器官中。正常生长的植物中g a b a 含量变化较小，当植物受到高 温、干旱、冷害、机械刺激等逆境胁迫时会引起g a b a 的大量积累。近 年来它在逆境胁迫中的作用越来越引起人们的关注。在食品工业领域， g a b a 作为一种新型的功能食品因子已经广泛地应用于饮料、果酱、糕点、 饼干、调味料等制品中。 本文主要研究了高温胁迫下玉米幼苗中g a b a 的积累规律；高温胁 迫条件下，外源施加不同浓度g a b a 对玉米幼苗中g a b a 含量的影响， 玉米幼苗中g a b a 含量变化引起的s o d 、p o d 活性以及m d a 的含量的 变化。试验证明高温胁迫能在短时间内引起g a b a 的大量积累，通过外 源施加不同浓度的g a b a 能够提高玉米幼苗中g a b a 的含量，g a b a 的 积累提高了玉米幼苗中抗氧化酶的活性，减少了有害物质m d a 的大量积 累，对玉米幼苗抵抗高温胁迫起到积极作用。通过干旱胁迫发现，对干旱 有一定耐受能力的自交系中g a b a 含量要比对干旱敏感的自交系中高； 干旱胁迫的同时外源施加g a d 抑制剂和s s a d h 抑制剂，能够明显的改 变玉米幼苗中g a b a 的含量，内源g a b a 含量的高低决定了玉米幼苗抵 抗逆境胁迫的能力。通过试验可以得出以下三条结论： ( 1 ) 外源施加g a d 抑制剂或s s a d h 抑制剂能够调控玉米幼苗中 g a b a 的含量，玉米幼苗中g a b a 含量的高低对玉米的抗逆性起着重要 作用。 ( 2 ) 高温胁迫引起玉米幼苗中内源g a b a 含量的升高，在处理大约 3 6 小时后，玉米幼苗根中的g a b a 含量达到最大，大约为正常生长的幼 苗根中的3 倍；处理大约4 8 小时后幼苗叶片中的g a b a 含量达到最大， y 氨基丁酸( g a b a ) 对玉米抗逆性的效应、作用机理及调控 大约为正常生长的幼苗叶片中的2 5 倍； ( 3 ) 高温胁迫时，外源施加低浓度g a b a ，能够提高玉米幼苗中抗氧 化酶s o d 、p o d 的生理活性，降低有害物质m d a 的积累，对玉米幼苗 抵抗高温胁迫具有积极作用。 关键词：丫氨基丁酸；玉米幼苗；高温胁迫；干旱胁迫 2 h o t - s h o c k ，d r o u g h t ，f r o z e n ，m e c h a n i c a l s t i m u l u sa n ds oo n ，g a b aw i l l i n c r e a s es u p e r f l u o u s i t sp h y s i o l o g i c a lr o l eh a sb e e np a y e dm o r ea t t e n t i o n u n d e rm u l t i f a r i o u ss t r e s s e si nr e c e n ty e a r s i nt h ef o o di n d u s t r yd o m a i n ， g a b ah a sb e e nw i d e l yu s e di nd r i n k ，j a m ，p a s t r y ，b i s c u i t ，s e a s o n e r , a n ds o o na san e w - s t y l ef u n c t i o nf o o d s t u f ff a c t o r t h i sr e s e a r c ho p e no u tt h eg a b aa c c u m u l a t er u l ew h e nm a i z es e e d l i n g u n d e rh i g h - t e m p e r a t u r es t r e s s m a i z es e e d l i n gu n d e rh i g h - t e m p e r a t u r ew h i l e i r r i g a t i n g a d d i t i o n a lg a b as o l u t i o nw i l li n c r e a s et h ec o n t e n to fm a i z e s e e d l i n g ，t h i st r a n s f o r m a t i o nc a l le v e ni n c r e a s et h ea c t i v i t yo fs o d ，p o d a n d l e s s e nt h ec o n t e n to fm d a t l l i sc h a n g er e a c t sp o s i t i v ef u n c t i o no nm a i z e s e e d l i n gr e s i s t i n gh i g h t e m p e r a t u r es t r e s s a n o t h e r r e s e a r c hf r e dd i f f e r e n t m a i z e sh a v ed i f f e r e n tc o n t e n to fg a b a ，t h ei n h i b i t o rc a nc h a n g et h ec o n t e n t o fg a b ai nm a i z es e e d l i n g ，t h ea b i l i t yo fm a i z es e e d l i n gr e s i s ta d v e r s i t y s t r e s sd e p e n do nt h ec o n t e n to fg a b a t h r e ec o n c l u s i o n sh a v ee d u c e df r o m t h i sr e s e a r c h ( 1 ) t h ee x 仃a n e o u si n h i b i t o rg a d o rs s a d hc a l lc o n t r o lt h ec o n t e n to fg a b ai n m a i z es e e d l i n g ，t h ec o n t e n to fg a b ai nm a i z es e e d l i n gd e c i d e st h ea b i l i t yo fm a i z e r e s i s t i n ga d v e r s i t y ( 2 ) h i g h - t e m p e r a t u r e s t r e s sc a ni m p r o v et h ec o n t e n to fg a b ai nm a i z e s e e d l i n g ，a b o u t3 6h o u r st h ec o n t e n to fg a b ai nf o o tc a nr e a c ht h r e et i m e sa n dt h e s h o o tn e e d4 8h o u r sr e a c h i n gt h em a x 3 y 氨基丁酸( g a b a ) 对玉米抗逆性的效应、作用机理及调控 ( 3 ) h i g h t e m p e r a t u r es t r e s sc a r le n h a n c et h ee n z y m ea c t i v i t ya n dl o w e r i n j u r a n ta c c u m u l a t i o ni nm a i z es e e d l i n g , t h i sm a k ep o s i t i v ef u n c t i o nf o rm a i z e s e e d l i n gr e s i s t i n gh i g h t e m p e r a t u r es t r e s s k e yw o r d s ：g a b a ；m a i z es e e d l i n g ；h i g h t e m p e r a t u r es t r e s s ；d r o u g h ts t r e s s 4 a b a ) 是一种广泛存在于 原核生物和真核生物中的四碳非蛋白质氮基酸，以自由态存在。g a b a 最 初是从微生物的代谢产物中发现的，在1 8 8 3 年就被人工合成，其后又做 过一些在真菌、细菌和植物中代谢的研究。到1 9 5 0 年发现在哺乳动物正 常脑内的g a b a 浓度特别高，但其生理意义不明。随后，从牛脑中提取 出一种含有未知物的溶液，能抑制螯虾牵张感受器神经元产生冲动，并对 抗乙酰胆碱对脉鼠及家兔回肠的收缩作用，经证明此提取液中起抑制作用 的组分就是g a b a 。又进而证实在哺乳动物中枢各部位，g a b a 具有普 遍抑制作用。通过离子电泳将g a b a 注射于猫皮层十字沟周围神经元， 引起超极化，其电位与刺激皮层表面所产生的抑制性突触后电位相同，并 发现电刺激小脑浦氏细胞时，第四脑室灌流液中g a b a 含量增加3 倍， 因而推测浦氏神经元释放的化学递质是g a b a 。但是，g a b a 的意义和 作用被真正确认是在1 9 7 5 年的第二届国际g a b a 专题讨论会上。在那次 会议上，o a b a 被正式确认为哺乳动物中枢的一种抑制性递质。在动物中， g a b a 具有多种功效，目前研究最多是把它作为中枢神经系统 ( c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m ，c n s ) 的一种抑制性神经递质，主要是通过与其 受体结合和神经递质的交互作用发挥其生理效应，参与了动物体内多种重 要行为的调节以及癫痫、忧郁症、焦虑症和胰岛素依赖型糖尿病等多种疾 病的发病机制，所以g a b a 是一种很好的医疗药物和和保健品原料。在 植物中，g a b a 最早在马铃薯块茎中( s t e w a r de ta 1 ，1 9 4 9 ) 发现。随后的 研究发现，当植物组织和器官受到热胁迫( m a y e re ta 1 ，1 9 9 0 ) 、冷害 ( w a l l a c ee ta 1 ，1 9 8 4 ：c h o l e w ae ta 1 ，1 9 9 6 ) 、机械刺激( r a m p u t ha n db o w n ， 1 9 9 6 ：w a l l a c ee ta 1 ，1 9 8 4 ) 、低氧( s t r e e r e ra n dt h o m p s o n ，1 9 7 2 ；t s u s h i d a a n dm u r a i ，1 9 8 7 ：a u r i s a n oe ta l 。，1 9 9 5 ) 等逆境条件，均引起了g a b a 的积累，g a b a 在逆境胁迫下的积累机制及其生理作用越来越引起人们的 关注。作为功能性食品，富含g a b a 食品的开发始于1 9 8 6 年。当时日本 农林水产省茶叶试验场首先成功开发了富含g a b a 的茶，并制成商品销 售；1 9 9 4 年，日本农林水产省中国农业试验场成功开发富含g a b a 的米 5 y - 氨基丁酸( g a b a ) 对玉米抗逆性的效应、作用机理及调控 胚芽和米糠；之后日本又相继开发出富含g a b a 的发芽糙米和乳酸菌、 酵母发酵的高g a b a 浓度的健康食品素材等。近年来，富含g a b a 食品 的研究与开发，成为国外、尤其是日本研究的热点，包括植物( 米胚芽、 米糠、绿茶、南瓜等) 、微生物( 乳酸菌、酵母) 等由来的富含g a b a 的 健康食品。 1 1 国内外研究现状 1 1 1 高等植物中的g a b a g a b a 广泛存在于藻类、真菌、鲜类、蕨类及开花植物中，它不同于 其它非蛋白质氨基酸，其分布和存在具有种群的特异性。每一种植物的各 个部分均存在g a b a ，甚至在豆科植物的根瘤( a n t o n i we ta 1 ，1 9 7 5 ) 及 植物组织的木质部( g u i n ne ta 1 ，1 9 7 0 ) 和韧皮部( i t oe ta 1 ，1 9 7 6 ) 汁液 中都检测到g a b a 。正常生长条件下，植物组织中的g a b a 含量在0 0 3 - 2 5 um o l g f w 之间( r h o d e se ta 1 ，1 9 8 6 ：f o u g e re ta 1 ，1 9 9 1 ) ，远远超过蛋白 质氨基酸水平。 1 1 1 1 高等植物中的g a b a 的代谢 1 1 1 1 1g a b a 代谢途径 q 巍甄t o t h o 柚d i i 麓 鲥_ 吐 基錾避至薹重蝤遁l 矗：! 厂弋鼬_ 跳弘 n a d h + h +n a , d + 图1g a b a 支路 f i g 1s p u rt r a c ko fg a b a 6 量5 衄 u 并在厌氧条件下培育6 明g a b a 来源于l g l u ； s t r e e t e r 和t h o m p s o n ( 1 9 7 2 ) 给萝卜饲喂1 4 c g l u 后，叶片内有大量 1 4 c g a b a 形成，证明g a b a 来源于l g l u 的脱梭。后来一系列实验证实， 高等植物中g a b a 主要是由l g l u 经l - g l u 脱梭酶 ( g l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e ，g d c ，e c 4 1 1 1 5 ) 催化其脱羧而形成的，g a b a 在g a b a 转氨酶( g a b a t r a n s m i n a s e ，g a b a t ，e c 2 6 1 19 ) 的作用下 和a - 酮戊二酸发生转氨作用，形成玻拍酸半醛( s s a ) 和g l u ，然后s s a 被琥珀酸半醛脱氢酶( s u c c i n i cs e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，s s a d h ， e c l 2 l 1 6 ) 氧化成琥珀酸进入三羧酸循环，这三步反应构成a - 酮戊二酸氧 化成琥珀酸的支路，称为g a b a 支路( 图1 ) ( b o w n 趾s h e l p ，1 9 9 7 ) 。g a b a 支路存在于原核生物和真核生物中，在植物中该途径包括受c a 2 + c a m 调 控的谷氨酸脱羧酶和存在于线粒体中的g a b a 转氨酶、琥珀酸半醛脱氢 酶。在各种各样的生物和非生物胁迫条件下，g a b a 支路的活性迅速增加。 目前该支路的生理作用己经引起广泛关注。 植物中有两条合成和转化g a b a 途径：一条是由l g l u 脱羧酶 ( g l u t a m a t e d e c a r b o x y l a s e ，g d c ，e c 4 1 1 1 5 ) 催化其脱羧而形成的( 图2 ) ， 另一条是由多胺的降解产物转化而来的。如图2 所示，腐胺经二胺氧化酶 催化，可以形成毗咯琳、h 2 0 ：和氨；亚精胺和精胺在多胺氧化酶的作用下， 分别氧化成吡咯琳、1 ( 3 丙氨酸) 2 毗咯琳以及二氨基丙烷和h 2 0 2 。二 氨基丙烷可转化为b 丙氨酸，吡咯琳又在吡咯琳脱氢酶催化下形成g a b a ( t i b u r c i oe ta 1 ，1 9 9 7 ：b h a t n a g a re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 7 y - 氨基丁酸( g a b a ) 对玉米抗逆性的效应、作用机理及调控 图2 生成g a b a 的多胺降解途径 f i g 2p o l y a m i n ed e g r a d a t i o np a t h w a yo fg a b a 1 1 1 1 2 g a b a 代谢中几种重要的酶及其活性对g a b a 代谢的调节 谷氨酸脱羧酶( g l u t a m a t ed e c a r b o x y l a s e ，g d c ，e c 4 1 1 1 5 ，g a d ) 存在于胞浆中( s a t y ae ta 1 ，1 9 9 0 ；b r e i t k r e u ze ta 1 ，1 9 9 9 ) ，以5 磷酸吡 哆醛为辅酶，存在c a 2 + c a m 结合区域并能被其激活( l i n g e ta 1 ，1 9 9 4 ) ， 能够不可逆催化l 谷氨酸( l g l u ) 的脱羧反应。最适p n 为5 8 ( t s u s h i d a e ta 1 ，1 9 8 7 ) ，此时若外源加入c a 2 + c a m ，g a d 的活性没有什么变化； 在p h 为7 o 的条件下，g a d 的活性有所下降，若此时加入c a 2 + c a m ， 活性会有所提高( s n e d d e ne ta 1 ，1 9 9 5 ) 。该酶可被硫醇( 如：巯基乙醇、 二硫苏糖醇、半胱氨酸、对氯高汞苯甲酸和氨基尿) 抑制，不能被其它金 属( 除c a + 外) 离子激活( 蒋振晖等，2 0 0 3 ) 。矮牵牛、西红柿、烟草和 拟南芥中g a d 基因已经被克隆出来。转基因烟草表达的一种g a d 缺乏 与c a m 结合的区域( 称为g a d 。植物) ，显示出较为严重的形态学上的 畸变( 如短茎、皮层薄壁细胞不能伸长) ，这与植物体内含高水平g a b a 和低水平g l u 有关( b a u me ta 1 ，1 9 9 6 ) 。说明c a m 与g a d 结合对于调 控g a b a 和g l u 代谢是非常重要的，调节g a d 的活性对于植物正常生长 发育是必要的。 丫氨基丁酸转氨酶( g a b a t r a n s m i n a s e ，g a b a t ，e c 2 6 1 1 9 ) 可逆 催化y 氨基丁酸向琥珀酸半醛的转化，最适p h 为8 1 0 ( t s u s h i d ae ta 1 ， 山东农业大学硕士学位论文 1 9 8 7 ) 。不同来源的g a b a 转氨酶对底物的特异性有所不同，细菌、酵母 和高等植物的g a b a 转氨酶只能以g a b a 为底物；而放线菌、真菌和哺 乳动物的g a b a 转氨酶也可以以p 丙氨酸为底物；s t r e e t e r 和t h o m p s o n ( 1 9 7 2 ) 采用放射性检测方法证明，在萝卜中存在g a b a ：丙酮酸转氨酶 和g a b a ：a 酮戊二酸转氨酶，同时c a u w e n b e r g h e 和s h e l p ( 1 9 9 9 ) 用实 验证明红花烟草中也存在这两种转氨酶，表明不同来源的g a b a 转氨酶 对氨基受体的要求也不相同，细菌、酵母、真菌和哺乳动物的g a b a 转 氨酶只能以a 酮戊二酸作为氨基受体，而植物中g a b a 转氨酶可以以丙 酮酸作为氨基受体。b r e i t k r e u z 和s h e l p ( 1 9 9 5 ) 用改进后实验方法确定 g a b a t 的亚细胞位置时，发现g a b a ：丙酮酸转氨酶只分布于线粒体中， 而g a b a ：a 酮戊二酸转氨酶既分布于线粒体内又分布于细胞质内。 琥珀酸半醛脱氢酶( s u c c i n i cs e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ，s s a d h ， e e l 2 1 1 6 ) 不可逆催化琥珀酸半醛( s s a ) 向琥珀酸的转化。部分纯化酶 活性最适p h 在9 0 9 5 之间，以n a d + 或者n a d p + 为辅酶，但以n a d + 为辅酶时，该酶的活性要高些( 穆小民等，1 9 9 6 ) 。b u s c h 和f r o m m ( 1 9 9 9 ) 对拟南芥中的琥珀酸半醛脱氢酶( s s a d h i ) 进行了系统的研究，发现该 酶对s s a 具有专一性，高浓度的s s a 对酶活性有抑制作用：n a d h 对 s s a d h i 的活性也有抑制作用，随着n a d h 浓度增加，酶活性逐渐降低； a m p 、a d p 和a t pn a d + 分别与s s a d h i 相互作用的竞争性抑制剂、复 合竞争性抑制剂和非竞争性抑制剂( b u s c he ta 1 ，1 9 9 9 ) 。这些结果证明 s s a d h 位于线粒体内。该酶的基因至今没有被克隆出来。 从以上可以看出，增加g a b a 积累的可能途径有两条：一是使g a d 的活性增加，g a b a 合成加速；二是g a b a t 和s s a d h 活性减弱，g a b a 降解转化速率减慢。但影响g a b a 代谢的土要因素是g a d ，因为g a d 是一系列酶促反应的第一个关键酶，对g a b a 代谢的调控起着决定性的 作用。 除以上几种酶以外，二胺氧化酶和多胺氧化酶能够催化胞内多胺的氧 化降解，一方面调节体内的多胺水平，另一方面影响体内g a b a 的积累。 b a g n i 等( 1 9 7 8 ) 发现多胺可作为菊芋( h e l i a n t h u st u & r o s u s ) 外植体培养过 程中的氮源。p e r e z a m a d o r 和c a r b o n e l l ( 1 9 9 5 ) 指出，在多胺氧化酶和 9 y 一氨摹丁酸( g a b a ) 对玉米抗逆性的效应、作用机理及调控 吡咯琳脱氢酶等酶的催化下，植物可利用多胺进行碳和氮的再循环。二胺 氧化酶和多胺氧化酶活性的提高可促进多胺的降解，有利于g a b a 的积 累。 1 1 1 1 3g a d 基因表达对g a b a 代谢的调控 g a d m r n a 的不同表达方式和不同植物组织中的g a d 蛋白表明 g a d 活性是在转录和翻译水平上加以调控的( c h e ne ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在拟 南芥中至少存在两种不同的g a d ：其一是根中所特有的g a d l ：其二是 所有器官所具备的g a d 2 ( t u r a n oe ta 1 ，1 9 9 8 ；z i ke ta 1 ，1 9 9 8 ) 。研究表 明，同时将1 0 m mn h 4 c 1 、5 m mn h 4 n 0 3 、5 m m 谷氨酸( 或谷氨酸胺) 作为植物叶片的氮素营养，叶细胞中g a d 2 基因转录水平、g a d 2 蛋白质 的最以及g a d 2 酶活性均要比仅仅将1 0 m mk n 0 3 作为叶片生长的氮素营 养叶片的叶细胞中高( t u r a n oe ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 拟南芥中至少存在三种以上的g a d 类型。g a d s 2 5 的整个氨基酸序 列与g a d l 的相比，有7 5 8 2 是同源的，但与c a m 结合区的c 末端残 基的差异较大，氨基酸序列只有3 5 4 3 是与g a d l 同源的。拟南芥g a d 中与c a m 结合区域和矮牵牛g a d 一样是碱性的并且是疏水的，色氨酸 残基含量较高。g a d 2 与拟南芥中其它g a d s 不同之处是不具有丝氨酸、 苏氨酸和酪氨酸残基的磷化位点( s h e l pe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。两个不同矮牵牛 g d a 的c 末端区域的色氨酸残基结合c a m 蛋白的n 端或者c 端的叶状 突出部位，表明c a 2 + c a m 与g a d 结合是激活g a d 活性所必需的( y u a n e ta j ，1 9 9 8 ) 。 1 1 1 1 4 通过胞内和胞外的运输调控g a b a 的代谢 亚细胞的分室作用将g a b a 的合成与分解分开，这是调控g a b a 水 平的潜在机理。g a b a 支路涉及到的三个酶在亚细胞中的定位存在差异： g a d 存在于胞浆中，g a b a t 和s s a d h 则主要存在线粒体中( b r e i t k r e u z a n ds h e l p ，1 9 9 5 ) 。因此谷氨酸脱羧形成的g a b a 必需经过跨膜运输才能 进入线粒体中，然后再经转氨、脱氢、氧化形成的琥珀酸进入t c a 循环。 由此可以看出胞内存在运输g a b a 的载体蛋白。以g a b a 作为唯一氮源 1 0 山东农业大学硕士学位论文 的生长条件下，拟南芥生长良好，从而证明植物体中存在运输g a b a 的 载体( b r e i t k r e u z e ta 1 ，1 9 9 9 ) 。己有报道表明，氨基酸通透酶3 ( 丸垤3 ) 和脯氨酸运输载体2 ( p r o t 2 ) 能够有效地调节g a b a 的运输：另一方面， 许多能够运输g a b a 的载体，同样也能运输脯氨酸，3 氨基丙酸，牛黄 酸，甘氨酸，甜菜碱及四铵化合物。它们在一定程度上与g a b a 竞争结 合g a b a 运输载体，对g a b a 在胞内外运输起到一定的调节作用。两性 离子型g a b a 是载体运输g a b a 的最适类型，p r o t z 调节的( 1 - 1 4 c ) g a b a 运输可被脯氨酸，胆碱和甘氨酸，甜菜碱所抑制，其中最有效的抑制剂是 胆碱。目前编码运输g a b a 载体的基因没有被分离出来，但其运输载体 蛋白己经被克隆( b r e i t k r e u ze ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 a a p 3 和p r o t z 还没有在胞内外给予定位，据推理可能在质膜上。由 于a a p 3 基因在根中表达，而p r o t z 基因在所有组织都表达，并且在盐胁 迫和干早下p r o t z 基因表达加强( f i s c h e r e ta 1 ，1 9 9 8 ) ，因此在正常及水分 亏缺的条件下，g a b a 有可能经历胞内运输过程。这些运输蛋白可能调节 g a b a 的流入与流出而调节胞内g a b a 水平。胞外g a b a 可能是起因于 胞内g a b a 的涌出( c h u n g e ta 1 ，1 9 9 2 ) ，木质部汁液中可以检测到g a b a 的存在。胞内g a b a 积累可能是增加合成的结果，而胞内g a b a 减少则 是由线粒体中的酶所催化的代谢反应及胞内向胞外的运输引起的。 1 1 1 1 5 底物g l u 水平的调控 在谷氨酰胺合成长期受到限制、蛋白质合成受阻、降解加速的情况下， g a b a 水平将会上升( s a t y ae ta 1 ，1 9 9 0 ) 。c h u n g ( 1 9 9 2 ) 等和c h o l e w a 等( 1 9 9 7 ) 发现，提高g l u 水平可刺激天门冬属植物离体叶肉细胞中g a b a 的合成。用甘氨酸脱梭酶、g a b a 丙酮酸转氨酶的抑制剂氨基乙酰氰 ( a a n ) 处理烟草叶片9 0 m i n 内即有甘氨酸积累，1 4 c g l u 向g i n 转变减 少，g i n 、琥珀酸及三羧酸循环中有机酸中1 4 c 的放射活性增加 ( s c o t t t a g g e r te ta 1 ，1 9 9 9 ) 。由于氨基乙酰氰处理a a n 可抑制光呼吸中 氨的释放，因而g i n 经谷氨酸胺合成酶合成g i n 的反应减慢。g i n 的积累 可以促进g a d 对其的利用。若长时间用a a n 处理烟草叶片，则g l u 浓 度进一步增大，到达一定程度时会激活g a d 活性，从而迅速引起g a b a y - 氨基丁酸( g a b a ) 对玉米抗逆性的效应、作用机理及调控 的积累。这些实验结果表明，当作为g l u 脱羧酶的底物g l u 量增加时，一 些碳骨架会进入g a b a 支路，引起g a b a 水平升高( 氨基乙酰氰阻止光 呼吸中g l y 向s e r 转化，即氨的循环，从而使g i n 合成速率降低或者受阻， 引起g l u 的积累) 。 o b o a b a 图3g a b a 的生物和非生物胁迫调节以及在细胞内和细胞问的运输 f i g 3g a b ab i o l o g i ca n da b i o l o g i c a ls t r e s sa d j u s t m e n ta n di n t r a - c e u u l a ra n d e x t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t a t i o n 1 1 1 2 高等植物逆境条件下g a b a 的积累及其积累机制 1 1 1 2 1 多种逆境条件诱导g a b a 含量增加 在正常条件下，植物体中g a b a 含量低( 约为o 0 3 2 0 0i im o l g f w ) ( r h o d e sc ta 1 ，1 9 8 6 ： f o u g e r ee ta 1 ，1 9 9 1 ) ，但它远超过许多其它蛋白 质氨基酸的水平。n a g l o r 和t o l b e r t ( 1 9 5 6 ) 证明，缺氧条件下大麦叶片内 g a b a 含量会有大幅度增加。后来的一系列研究证明，冷害、缺氧、酸化、 干旱、机械荆激等多种胁迫处理，均能引起g a b a 水平升高( 表1 ) 。 从下表可以看出，不同的胁迫处理g a b a 增加量不一样，并且达到 最高含量时所需时间也存在很大的差别，说明不同的胁迫诱导g a b a 积 累的机制可能不同( 表1 ) 。 1 2 山东农业大学硕士学位论文 表l 不同逆境引起植物体中g a b a 含量增加( k i n 鹏心l e y ，2 0 0 0 ) t a b l e 1v a f i o u sm v e r s i t yl e a d m gt om o 聆g a b ac o n t e m 植物胁迫处理g a b a 相对于对照 达到最高含量所参考文献 的含量( )需时间处理 芦笋细胞 大豆叶片 大豆叶片 大豆叶片 芦笋细胞 萝b 叶片 茶叶片 水稻根 水稻茎 肛豆细胞 大豆叶片 芜箐叶片 番茄根 番茄叶片 番茄叶片 酸化 机械刺激 机械刺激 冷刺激( 6 ) 冷刺激( 1 0 ) 低氧处理 低氧处理 低氧处理 低氧处理 热刺激 干旱 干旱 盐胁迫 盐胁迫 真菌感染 c r a w f o r de ta 1 1 9 9 1 4 r a m p u t t l e ta 1 ，1 9 9 6 w 矾i cc ta l ，1 9 8 4 f 酊l a c ee ta i 1 9 8 4 c h o l 删ae ta 1 1 9 8 4 s 仃e e t e re ta i 。1 9 7 2 t s u s s h i d ae ta l ，1 9 8 7 a u f i s 锄oe ta l ，1 9 9 5 a u r i s 锄oe ta l ，1 9 9 5 m a y c r 髓她1 9 9 0 蚓，1 9 9 4 b o l 撕nc t8 l 1 9 9 5 b o l 撕ne ta l 。1 9 9 5 b o l a r i ne ta l ，1 9 9 5 c o o p e re ta 1 1 9 7 4 1 1 1 2 2 逆境条件下g a b a 的积累机制 c r a w f o r d 等( 1 9 9 4 ) 发现，利用芦笋叶肉细胞为材料，在其培养介质 中外源加入透膜性弱酸( 如5 m m 丁酸) ，1 5 秒钟内即出现g a b a 的积累。 说明酸处理可以激活g a d ，从而引起g a b a 水平升高。以后一系列的研 究表明，植物中的g a d 在酸性p h 值范围内活性最高，其最适p h 值为 5 8 ( s r e d d e n ，1 9 9 2 ) 。g a b a 合成时要消耗质子，p h 值升高，g a d 活性 降低，此时g a b a 转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶的活性升高，有利于g a b a 代谢顺利进行。实验证明，低氧、淹涝、酸处理和机械损伤导致g a b a 积累，均是由于降低p h 值从而激活g a d 所引起的。但并不是所有的逆 s m 口 g 箸 l h h h h i i i i d ：墨 ：量 ：奚 锄 ；萋 铀 垦 撇 撕 m 弘 鲥 她 钮 m 姗 姗 舢 砌 瑚 脚 舢 瑚 姗 姗 枷 姗 抛 湖 啪 y 一氨基丁酸( g a b a ) 对玉米抗逆性的效应、作用机理及调控 境胁迫都是通过降低胞内p h 值，激活g a d 从而引起g a b a 水平的升高。 b a u m 等( 1 9 9 3 ) 报道矮牵牛g a d 是一种c a m 结合蛋白。l i n g 等( 1 9 9 4 ) 首次证明植物g a d 可以被c a 2 + c a m 激活。现己查明g a d s 在c 末端含 有2 2 2 5 个氨基酸残基，形成的空间结构与c a 2 + c a m 结合，从而激活g a d s ( a r a z ie ta l ，1 9 9 5 ；z i ke ta 1 ，1 9 9 5 ) 。在拟南芥中已经发现5 种g a d 基 因，每种基因表达产物均带有各自独特的c a m b d s ( s h e l pe ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 植物g a d 最适p h 为5 8 ，在p h 7 0 条件下其活性仅为最大活性的1 2 ； 若在p h 7 0 的条件下加入c a 2 + c a m ，g a d 活性可增加2 。8 倍，p h 为5 8 时则不出现该种现象；若在p h 7 0 条件下，加入c a 2 + c a m 的同时加入c a m 的拮抗剂三氟啦嗪，g a d 活性则没有变化，这些结果表明g a d 是通过 c 矛+ 信号途径而被激活的( w a y n ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 。 c a 2 喜c a 知 n 羔n 呷c o f f i h 了i 0 他 图4 胞内 c a 2 + 】和【h + 】浓度增加促进g a b a 合成 f i g 4m o r ei n t r a - c e l l u l a r 【c 矿十】a n d 【l r 】p r o m o t eg a b ac o m p o s e 由以上阐述可知不同逆境胁迫主要是通过调节胞内c a 2 + 或者胞内一 浓度这两种方式来影响胞内g a d 活性的。然而哪些因素引起c a 2 + 或矿 浓度从而影响g a d 活性，导致g a b a 水平发生变化? 两种调节方式存在 什么样关系? 就此问题k i n n e r s l e y 提出了逆境条件下g a d 双调控模型 ( k i n n e r s l e ya 。m ，2 0 0 0 ) 。 在这一模型中( 图7 ) ，将逆境条件下g a d 活性的增加分为两个阶段： 阶段i 是依赖于c a 2 + c a m 阶段，主要是通过胞内c a 2 + 水平提高g a d 活 性；阶段i i 为依赖于h + 阶段，主要是通过提高胞内h + 水平来增加g a d 活性。短时间的胁迫处理及强度较小的逆境( 如触摸、机械刺激) 主要是 1 4 山东农业大学硕士学位论文 通过阶段i 激活g a d ，引起g a b a 积累。当植物受到逆境胁迫的强度比 较大或者时间比较长时，则是通过阶段i i 激活g a d ，此时细胞质膜或液 泡膜遭到破坏，引起细胞酸化，g a d 被激活引起g a b a 含量增加。体内 稳态时，胞内c a 2 十和h + 浓度低，g a d 活性小，g a b a 生物合成处于最小 量，该状态是植物处于正常生长条件的状态。但这一模型存在许多缺陷， 很多问题未能给出满意的解释，如阶段i 与阶段i i 之间的关系及哪些因素 控制阶段i 和阶段i i ，还需提供进一步的实验证明。 另外，某些胁迫能影响g a d 底物g l u 的水平，而使g a d 活性增加， g a b a 积累。s c o t t t a g g e r t 等( 1 9 9 9 ) 报道，当作为谷氨酸脱羧酶的底物 谷氨酸量增加时，g a d 活性升高，一些碳骨架会进入g a b a 支路。 在逆境条件下植物中g a d 活性的增加是引起g a b a 含量增加的主导 因素，但是g a b a 转氨酶( g a b a t ) 以及琥珀酸半醛脱氢酶( s s a d h ) 的作用也不能忽视。实验证明，在体外g a d 和g a b a t 的活力比为1 5 2 0 ： 1 ，并且在体外g a b a - t 和s s a d h 的最适p h 值均要比g a d 的最适p h 值高( s h e l pe ta 1 ，1 9 9 5 ) 。缺氧胁迫时，可能会因为n a d 和n a d h 水平 的下降，引起s s a d h 活性的降低，导致琥珀酸半醛的积累，从而反过来 通过g a b a t 影响g a b a 的代谢。 广、 稳态+ 一阶段i + 一阶段 图5g a d 双调控模型 f i g 5t w i nr e g u l a t i o nm