（食品科学与工程专业论文）固定化酵母酒精萃取发酵技术研究.pdf

固定化酵母酒精萃取发酵技术研究 食品科学 研究生王健指导教师袁永俊 摘要 通过利用可再生资源淀粉质原料生产的酒精来减少和替代石油这种 不可再生资源，是缓解甚至是解决目前世界所面临的能源危机的一种切实可行 的方法。然而传统发酵方式生产的酒精由于各种原因，成本一直维持在比较高 的水平，导致了利用酒精替代石油进展缓慢。 发酵生产酒精以及提高酒精产率的研究一直都在进行，每隔一段时间都有 新的工艺被采用。糖化醪浓度不高、过滤困难、间歇发酵周期长、发酵液中酵 母细胞密度低、发酵液中乙醇对酵母细胞的抑制作用，发酵速率低、发酵醪蒸 馏的能耗大等缺点一直都是研究的突破口。研究和应用新型的发酵工艺，不仅 可以节约酒精生产的成本而且可以明显地提高发酵强度。 将固定化技术和萃取发酵结合起来，是反应与分离耦合技术的典范，它能 够有效地提高乙醇发酵强度。本试验分两部分完成，前一部分为固定化发酵， 重点研究了利用海藻酸钠做为固定化载体时，固定化细胞的制备条件以及固定 化细胞的最佳发酵条件，后一部分为萃取发酵，首先研究了游离细胞发酵、固 定化细胞内部随程萃取发酵以及固定化细胞外部随程萃取发酵中，萃取剂对酵 母的毒害作用，证明固定化细胞外部随程萃取发酵是一种较为理想的发酵方 式，之后研究了固定化萃取发酵的最佳发酵条件。两部分相辅相成，前者为后 者做铺垫，后者需在前者的基础上进行。 通过单因素及正交试验，确定了固定化发酵的最佳条件： 初糖浓度1 5 ，固定化载体( 海藻酸钠) 浓度为3 ，固定化酵母颗粒填充 率5 0 ，发酵温度为3 0 ，发酵时间4 0 h 。 在固定化发酵的基础上确定了固定化萃取发酵的最佳发酵条件： 初糖浓度2 0 ，固定化载体( 海藻酸钠) 浓度为3 ，固定化酵母颗粒填充 率5 0 ，萃取剂为十二烷醇，萃取剂用量1 5 ，间歇萃取频率每8 小时一次， 发酵时间3 5 小时，温度3 0 9 c 。 在最佳发酵条件下，酒精浓度达到1 1 5 ( 2 0 。c 下) ，残糖浓度检测不出， 还原糖利用率较好，发酵效果同单纯的游离酵母发酵相比效果显著，操作较为 简单，有一定的抗菌能力且成本不高，为日后工业化发展建立了良好的基础。 关键词：固定化酵母，海藻酸钠，萃取发酵，萃取剂 r e s e a r c ho fe x t r a c t e df e r m e n t a t i o nw i t h i m m o b i l i z e dy e a s tt e c h n o l o g y f o o ds c i e n c e p o s t g r a d u a t e ：w a n gj i a n a d v i s o r ：y u a ny o n 萄u n a b s t r a c t u s i n ge t h a n o lp r o d u c e df r o mr e g e n e r a t e dr e s o u r c ea n df o o ds u p p l i e s t o s u b s t i t u t er e s o u r c ew h i c hc a n n o tb er e g e n e r a t e ds u c ha so i l ，i saa p p l i e dw a yt o r e s o l v ec u r r e n te n e r g yc r i s i s b u tb e c a u s eo fs o m er e a s o n s ，t h ee t h a n o lw h i c h p r o d u c e db yt r a d i t i o n a lm e t h o da r em o r ec o s t l y , t h e l lr e s e ti nf u e l e t h a n o l s u b s t i t u t eo i ld e v e l o ps l o w l y t h er e s e a r c ho fe t h a n o lf e r m e n t a t i o na n di m p r o v i n ge t h a n o lp r o d u c t i v i t yi s s t i l la d v a n c i n g t h en e wt e c h n i q u ec a l lb ea p p l i e de v e r yas h o r tt i m e t h el o w c o n c e n t r a t i o no ff e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u m , d i 伍c u l tf i l t r a t i o nt e c h n i q u e 1 0 n g f e r m e n t a t i o np e r i o d l o wl e v e lo fy e a s td e n s i t yi nc u l t u r em e d i u n l t h er e s t r a i nf o r m e t h a n o l0 1 1y e a s t ，l a g g a r d l yf e r m e n t a t i o na n dt r e m e n d o u se n e r g yu s ea r et h ek e yo f r e s e a r c h u s i n ga n dr e s e a r c ht h en e wt e c h n i q u ec r e d u c et h ec o s ta sw e l la s i m p r o v et h ep r o d u c t i v i t yo f f e r m e n t a t i o n c o m b i n i n gi m m o b i l i t ya n de x t r a c t i o nf e r m e n t a t i o ni st h e 留o o da p o t h e o s i so f r e a c t i o na n de x t r a c t i o nt e c h n i q u e i tc a l li m p r o v et h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t i v i t y o b v i o u s l y i nb a t c hf c r m e n t a t i o n ，f i r s t ，u s i n gt h ei m m o b i l i t yy e a s tt or e d u c et h e p o i s o nf r o me x t r a c t i o ns o l v e n t , t h e nu s i n ge x t r a c t i o nt e c h n i q u et oe l i m i n a t e 也e t r a i nf o r me t h a n o lo ny e a s t t l l i se x p e r i m e n t a t i o nd i v i d ei n t ot w os t e p s t h ef i r s ti s t h er e s e a r c ho fi m m o b i l i t yf e r m e n t a t i o n , p u te m p h a s i so nt h er e s e a r c ho ft h eb e s t f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o nw h e nu s i n gs o d i u ma l g l n a t et op r e p a r ei m m o b i l i z e dy e a s l n s e c o n di st h ee x t r a c t i o nt e c h n i q u e 。f i s t d ot h er e s e a r c ho ft o x i ca c t i o ni nf r e e c e l l ，i n s i d ef e r m e n t a t i o nw i t hi m m o b i l i z e dy e a s t , o u t s i d ef e r m e n t a t i o n 诵也 i m m o b i l i z e dy e a s t t h e np r o v i n gt h a to u t s i d ef e r m e n t a t i o nw i t hi m m o b i l i z e dy e a s t i sag o o dw a yt of e r m e n t a t i o n t h e nt h r o u g ht h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ta n d o r t h o g o n a lt e s t , g e tt h eb e s tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n t w os t e pa r ei n d i v i s i b l e ，t h e f i r s to n ei st h ef o u n d a t i o n ，a n dt h es e c o n do n ei sb a s e do nt h ef o r eo n e t h r o u g ht h es i n g l e f a c t o re x p e r i m e n ta n d o r t h o g o n a lt e s t ，g e t t h eb e s t i m m o b i l i z e df e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i n i t i a l r e d u c i n gs u g a r ：15 i m m o b i l i t yc a r r i e r ( s o d i u ma l g i h a t e ) ：3 ， c o n c e n t r a t i o no fi m m o b i l i t y y e a s t ：5 0 t e m p e r a t u r e ：3 0 f e r m e n t a t i o n t i m e ：4 0 h o nt h eb a s eo ft h ei m r n o b i l i z e d f e r m e n t a t i o n ，g e tt h e b e s te x t r a c t e d f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n i n i t i a lr e d u c i n gs u g a r ：2 0 ，i m m o b i l i t yc a r r i e r ( s o d i u ma l g i n a t e ) ：3 ， c o n c e n t r a t i o no fi m m o b i l i t yy e a s t ：5 0 u s a g ea m o u n to fe x t r a c t i o n o l v e n t ：15 f r e q u e n c yo fi n t e r i me x t r a c t i o nf e r m e n t a t i o n ：8 ho n et i m e ，f e r m e n t a t i o nt i m e3 5 l l t e m p e r a t u r e3 0 o n t h eb e s t f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n c o n c e n t r a t i o n o f e t h a n 0 1 1 1 5 v v ( 2 0 1 t h e c o n c e n t r a t i o no fr e s i d u a ls u g a ri sh a r d l yd e t e c t e d r e d u c i n gs u g a ri su s e dw e l l ， c o m p a r e dw i t hf e r m e n t a t i o nw i t hf r e ey e a s t ，t h er e s u l to ff e r m e n t a t i o ni sb e t t e r , t h e o p e r a t i o ni se a s y , i th a sam e a s l l r eo fa n t i b i o s i sa n dh a sal o w e rc o s t s i ts e tag o o d b a s ef o rd e v e l o p m e n to f i n d u s t r i a l i z a t i o ni nt b ef u t u r e k e yw o r d s ： i m m o b i l i z e dy e a s t ，s o d i u ma l g i n a t e ，e x t r a c t i o nf e r m e n t a t i o n ，e x t r a c t i o n s o i v e n t 西华大学硕士学位论文 申明 本人申明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西华大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在 论文中作了明确的说明并表示谢意。 本学位论文成果是本人在西华大学读书期间在导师指导下取得的，论文成 果归西华大学所有，特此申明。 作者签名： 导师签名： 瑚扣日 硐，9 目 西华大学硕士学位论文 1 综述 1 1 酒精的用途及其在国民经济中的地位【1 l 酒精工业与农业有十分密切的联系。酒精工业从农业获得原料，农业需要 酒精来制备农药，此外，酒精工业的下脚料酒糟经过适当的处理后是良好 的饲料或肥料。酒精生产是农业原料深度加工和综合利用的一条重要途径。 酒精广泛地应用于国民经济的许多部门，例如：在食品工业中，酒精是配 制各类白酒、果酒、葡萄酒、露酒、药酒和生产食用醋酸及食用香精的主要原 料；在化学工业中，它是许多化工产品不可缺少的基础原料和溶剂，它也是生 产油漆和化妆品不可缺少的溶剂；在医药工业和医疗事业中，酒精可用来配制、 提取医药制剂和作为消毒剂；此外，在染料生产、国防工业等其它工业部门也 需要大量的酒精。随着化学工业和其他新兴工业的发展，酒精的用途将更为广 泛。 f i g 1a p p u e dr a n g eo f e t h a n o l l 2 j 图1 酒精的应用范围 西华大学硕士学位论文 1 。2 燃料酒精一可再生清洁能源 1 2 1 燃料酒精发展前景 能源短缺是本世纪面临的重大课题之一，普遍认为作为化石燃料之一的石 油资源将在5 0 年内枯竭，我国2 0 0 0 年开始进口原油及成品油8 8 3 2 万吨，出 口1 8 7 1 万吨，进出相抵，当年净进口石油6 9 6 1 万吨，统计当年石油消耗量2 3 亿吨，近三分之一依赖进口。而未来发展，特别是汽车进入家庭的快速发展， 对石油的需求将会大幅提高，因此石油短缺将会严重影响我国的经济发展和危 及我国的能源安全。因此通过利用可再生资源淀粉质原料所生产的酒精来 减少和替代石油这种不可再生资源，是我国经济发展及产业发展的一种战略选 择”1 ，具有广阔的前景。 1 2 2 燃料酒精发展近况 燃料酒精“。( 按照国家标准g b l 8 3 5 0 2 0 0 1 应称为变性燃料乙醇，俗称燃 料酒精) 是世界上酒精消耗的主要方式。1 9 7 3 年以后，世界上接连发生了两次 石油禁运( 西方称之谓石油危机) ，严重地影响了西方国家的石油供应。代用 燃料的研究得到了广泛的重视。酒精作为一种可能的潜在能源而身价百倍。在 汽油中添加5 2 0 无水酒精而成的汽油醇( g a s o h 0 1 ) 应运而生。由于汽油的 添加剂甲基叔丁基醚( m t b e ) 不能降解，且有致癌作用，污染环境及水源。将燃 料酒精( 无水酒精) 加1 2 于汽油或2 0 于柴油中做添加剂，既提高了汽油的辛 烷值，燃烧完全，又减少了汽车尾气中的二氧化碳等污染物，降低了大气的温 室效应。残余乙醇无毒性可生物降解。燃料酒精作为一种环境友好清洁能源的 需求将迅速增加并具有广阔的市场前景。 从1 9 0 3 年算起，酒精作为汽车燃料已经有近百年的历史了。目前，全世 界对于汽油醇的推广方兴未艾。2 0 世纪的前半期，人们给予酒精两次关注。“一 战”期间，参战双方都重视酒精的战略意义；“二战”期间，燃料酒精得到了 较大规模的推广。到了2 0 世纪五十年代，随着石油的大规模开采利用，高成 本的酒精逐渐被人们淡忘了。直至1 9 7 3 年的世界石油危机，巴西、美国率先 2 西华大学硕士学位论文 推行了“汽油醇计划”。 巴西是世界上惟一不供应纯汽油的国家。1 9 7 5 年，巴西政府在全世界首 倡“汽油醇计划”，1 9 7 7 年正式以2 0 的酒精比例在首府圣保罗实行，目前 已提高到2 5 的比例在全国推行。如今，巴西年产酒精1 0 0 0 万吨，其中9 7 用于汽车燃料。 从1 9 7 8 年至今，美国已经通过数十项法案，从能源、交通、税收、环保、 农业等方面，对汽油醇予以支持。一些盛产玉米的州也自行立法，要求在州内 必须使用汽油醇。目前，美国燃料酒精的年消费量约为5 0 0 万吨”。 根据汽车发动机的类型将酒精加入汽油有两种比例，汽油发动机的加入量 为5 至1 5 ，专用发动机的酒精比例为8 5 至1 0 0 。据美国有关部门调查， 使用汽油醇作为燃料，可明显降低汽车废气的排放，一氧化碳排放量降低2 0 至3 0 ，二氧化碳降低2 7 。从二十世纪八十年代起，德国、荷兰、加拿 大、瑞典等发达国家也开始了汽油醇的推广，到1 9 9 5 年前后，英、法、南非、 古巴、泰国等越来越多的国家也纷纷加入到这个行列中来。 2 0 0 1 年4 月2 日，我国变性燃料乙醇和车用乙醇汽油两项国家标 准正式公布，同年4 月8 日，原国家计委和国家质量监督检验总局宣布我国将 全面推广使用汽油醇。从2 0 0 2 年6 月3 0 日起，我国在河南郑州、洛阳、南阳 和黑龙江哈尔滨、肇东以及吉林、安徽部分地区开展“汽油醇”试点，并获得 成功。在上述4 省试点取得成功的基础上，国家发展改革委将试点范围扩大 到辽宁、河北、山东、江苏4 个省，2 0 0 5 年底在8 个试点省、市基本实现车用 汽油醇替代其它汽油。目前，黑龙江、吉林、河南、安徽4 省除在全省范围内 扩大试点外，还调出一些燃料酒精销售到辽宁、河北、山东、江苏等省。 1 3 酒精生产的原料 从工艺的角度来说，凡是含有可发酵性糖或含有可转化为可发酵性糖的物 质，都可以作为酒精生产的原料。但是，从经济效益的观点出发，酒精生产原 料还必需具有资源丰富，收集和运输方便，易于贮藏和加工，含有害成分少等 条件。 根据以上原则，常用的酒精生产原料可分为以下几类”。： 西华大学硕士学位论文 ( 1 ) 薯类原料：甘薯、木薯和马铃薯等； ( 2 ) 谷类原料：玉米、高梁、大米和小麦等； ( 3 ) 糖类原料：废糖蜜、甘蔗、甜菜等； ( 4 ) 野生植物原料：橡子仁，土获荃等； ( 5 ) 纤维原料：森林工业和木材加工工业的下脚料、农作物秸杆、甘蔗渣、 废甜菜丝、废纤维垃圾和废纸浆等； ( 6 ) 其他原料：亚硫酸纸浆废液、淀粉渣等。 a 薯类原料 甘薯( s w e e tp o t a t o ) 是我国酒精生产的主要原料，一般都是用的甘薯干， 鲜甘薯不易保藏，只有在收获季节才用。甘薯种植面积大，产量高；结构松脆， 易于糊化：含胶体和果胶质等粘性物质较多，发酵醪液粘度较大，甲醇的生成 量也较多。 木薯是酒精生产的好原料，分苦味木薯和甜味木薯两种，前者含氢氰酸较 多，但加工后大部分蒸发散失，故对酒精发酵和成品质量无影响。甜味木薯产 量较低，但可食用。酒精工业一般使用苦味木薯作为生产原料。 马铃薯种植面积很广，东北、西北、内蒙等地区是主要产区。马铃薯有许 多品种，分别适用于食用或工业用。作为酒精原料，要求用含淀粉量较高，蛋 白质含量较低的工业用马铃薯，这种马铃薯淀粉含量较高，易于加工，种植面 积不大，且每亩单产不如甘薯高，鲜马铃薯贮藏较困难。 b 谷类原料 国际上最常用的谷物原料是玉米和小麦，鉴于目前我国石油资源短缺，粮 食特别是玉米等谷物的生产过剩，因此，我国用于酒精生产的谷物主要是玉米。 玉米的化学组成如下表所示： 4 西华大学硕士学位论文 表1 玉米的化学组成( 每1 0 0 9 玉米中的含量) t a b l e 1t h e c o m p o n e n to fc o r n ( t h ec o n c e n t r a t i o np e rl o o gc o r n ) c 糖类原料 糖蜜是制糖工业的副产品。甜菜糖蜜的产量是加工甜菜量的3 5 - 5 ，甘蔗 糖蜜的产量是加工甘蔗的3 。糖蜜生产酒精不要蒸煮糖化操作，不要糖化剂， 所以工艺流程比淀粉原料简单：糖蜜的干物质浓度在8 0 以上，糖分4 5 以上， 所以糖蜜必须稀释，才能进行酒精发酵：糖蜜中含有5 - 1 2 的胶体，胶体主要是 焦糖、黑色素等组成，他们对酵母代谢有抑制作用，也是糖蜜酒精发酵起泡的 原因：糖蜜中灰分含量较高，会引起发酵率下降和设备结垢。 7 0 年代中期以来，人们开始利用甘蔗直接生产酒精。甘蔗的单产很高，平 均达6 7 吨亩，其中3 0 是梢和叶。甜菜含的糖主要是蔗糖，另外是少量的转 化糖、棉子糖、淀粉、纤维、半纤维、戊聚糖及果胶质等。 d 野生植物原料 野生植物产地分散，收集运输成本较高：淀粉含量少，纤维量高，加工成 本也就高：有些野生植物含有单宁、氢氰酸等有害物质，会影响加工土艺和成 品质量。 e 纤维原料 纤维原料是世界上贮量十分丰富的一种再生资源，包括半纤维素在内的纤 维原料是最有潜力的酒精生产原料，生物质( b i o m a s s ) 是绿色植物通过光和作 用捕集太阳能的产物，据测算年总产量高达1 5 0 0 亿吨，蕴贮着巨大的生物质 能( 6 9 1 0 ”k c a l ) 。 西华大学硕士学位论文 稻麦草、高粱杆、玉米杆、玉米芯、棉子壳、花生壳、稻壳、棉花杆等都 是农作物的纤维下脚料。我国每年秸杆产量约3 3 3 8 亿吨，其中农村作燃料 直接烧掉约2 3 亿吨，这样每年剩余卜1 5 亿吨。已知i k g 纤维素约可生产 0 2 8 l 酒精，则剩余秸杆可生产3 0 8 亿升( 2 4 0 0 万吨) 酒精，若利用率为5 0 ， 能年产1 2 0 0 万吨酒精，潜力是巨大的。 f i g 2p r o d u c e r s g o o d so f f e r m e n t a t i o na l c o h o l l 2 l 图2 发酵酒精生产原料 1 4 酒精发酵的生物化学机理 酵母菌为异养型微生物，它们能够以糖类物质为能源和碳源，在有氧或厌 氧条件下进行糖的代谢。在有氧条件下，酵母通过呼吸作用，将糖最终代谢生 成二氧化碳和水，同时产生大量a t p ，用于细胞物质的生物合成( s c p 生产过程) ： 在厌氧条件下，酵母通过酵解( e 肿) 作用，将糖降解成分子量比较小的中间代 谢产物，用作氢原子及电子的供体与受体，主要生成酒精，甘油及其它糖醇。 不同酵母菌种在糖的代谢途径方面有惊人的相似性。厌氧型的酵母是通过糖酵 解途径( g l y c o l y t i cp a t h w a y ) 完成的，此过程在细胞质中进行：好氧型的酵母经过 三羧酸循环( t r i c a r b o x y l i ca c i dc y c l e ) ，通过呼吸链彻底分解氧化，是在线粒体 内进行的。在大多数情况下，上述两条途径是酵母菌糖代谢的主要方式。然而 6 西华大学硕士学位论文 还有一条普遍存在的葡萄糖降解途径，己糖单磷酸途径，是酵母菌利用戊糖及 戊糖醇的通路，其反应在细胞质中进行。 酵母通常被认为是能进行酒精发酵的生物体，经研究表明，仅有一半以上 的酵母菌种能在厌氧条件下发酵葡萄糖。在糖的厌氧发酵中，通常是有酵母菌 通过e m p 途径生成的丙酮酸进入乙醛途径( w a y o f a c e t a l d e h y d e ) 而形成乙醇。因 此，酵母酒精发酵的总方程式为：o c 6 h 1 2 0 6 + 2 a d p + 2 p i - - - ；2 c 2 h s o h + 2 c 0 2 + 2 a t p + 2 h 2 0 1 5 目前酒精生产存在的主要问题 随着国民经济的进一步发展，整个社会对酒精的需要量会有所增长，但是， 酒精最大的需量是作为汽油的代用品，即做燃料。如果按照酒精做燃料以代替 汽油的观点来看，当前的酒精生产普遍存在以下问题。： ( 1 ) 发酵酒精成本过高，国际市场上酒精的价格要比石油贵一倍，如果 成本不降到与石油相近，则很难与石油燃料相竞争。 ( 2 ) 生产过程能耗过大，尤其是蒸煮和酒精回收过程中能耗特别高。以 玉米原料为例，生产1 l 酒精，能耗约1 4 2 3 5 1 8 8 4 0 k j ，而每1 l 酒精的燃烧热 值约为2 3 4 4 6 k j ，能量平衡值较低。如不大幅度降低能耗，则将在很大程度上 失去作为能源的价值。 ( 3 ) 酒糟处理问题是当前酒精生产面临的又一严重问题。每生产1 t 酒精 要产生1 2 1 5 t 左右的酒糟。一般酒糟的b o o 值在2 5 0 0 0 3 5 0 0 0 m g l 之间。 这样高浓度的有机废液，如果不经过处理就排入自然界，那就产生极为严重的 污染。一个年产8 万吨酒精的工厂所产生的污染负荷和一个1 4 0 万人口的城市 产生的生活污水负荷相当。 酒精废糟由于量大，加上处理技术没有过关，目前已经成为了轻工业各行 业中第二个大污染源。为此，酒糟处理问题已成为制约酒精工业发展的瓶颈之 一o ( 4 ) 酒精发酵强度低的问题。发酵强度越大，同样发酵罐容积生产的酒 精就多。常规的糖蜜间歇酒精发酵，其强度只有2 9 ( l h ) 。一旦酒精有可能 7 西华大学硕士学位论文 成为燃料，则其产量要增加几倍，几十倍，建新厂的投资就很大，运转过程中 的经费也大。如果能将发酵强度提高几倍、几十倍，那么，发酵车间的投资将 大为减少，最终将对成本的降低有利。因此，酒精发酵强度的提高是当今世界 上科学家研究的一个热门课题。 。 1 。6 国内外发展现状和趋势 1 6 1 现有的发酵方法 根据发酵醪注入发酵罐的方式不同，可以将酒精发酵的方式分为间歇式、 半连续式和连续式三种u 2 1 。 ( 1 ) 间歇式发酵法 间歇式发酵法就是指全部发酵过程始终在一个发酵罐中进行。由于发酵罐 容量和工艺操作不同，在间歇工艺中，又可分为如下几种方法。 一次加满法。其优点是操作简便，易于管理，缺点是酵母用量大。 分次添加法。此法适用于糖化锅容量小，而发酵罐容量大的工厂。 连续添加法。此法适用于采用连续蒸煮、连续糖化的酒精生产工厂。连 续流加糖化醪的方式，可以在几个罐同时进行，但要注意各罐流量情况， 使符合各罐发酵速度。 分割主发酵醪法。此法适用于卫生管理较好的酒精工厂，其无菌要求较 高。此种发酵方式的优点是省去了酵母的制作。另外，由于接入的酵母 种子量大，相应的减少了酵母生长的前发酵期。山东酒精厂利用添加 0 0 0 5 浓度的甲醛处理麸曲，采用分割主发酵醪的方法进行酒精发酵， 可使发酵醪不增酸，有利于提高出酒率。 ( 2 ) 半连续发酵法 半连续发酵是指在主发酵阶段采用连续发酵，而后发酵则采用间歇发酵的 方式。半连续发酵方式的优点是省去了酵母制作，但无菌操作要求高。 ( 3 ) 连续发酵 淀粉质原料生产酒精的连续发酵，在国内外早有研究，由于杂菌污染问题 没能很好解决，所以未能普遍推广和应用。近年来，由于发酵理论研究有所进 展，尤其是在淀粉质原料生产酒精的过程中采用了连续蒸煮、连续糖化，给连 8 西华大学硕士学位论文 续发酵创造了条件，因此，连续发酵引起了人们的普遍重视，也取得了很大成 绩。 连续发酵的优点： 提高设备利用率，连续发酵法生产酒精，其生产设备始终处于发酵状态， 一般约需要2 0 天左右才洗刷，杀菌一次罐体，长的达9 0 天至1 8 0 天洗刷一次， 而间歇发酵每隔3 天，就要洗刷、杀菌一次罐体，从而省去了大量的发酵辅助 时间。另外，连续发酵过程中，m i f 液进入发酵罐后，立即处于主发酵状态， 省去了间歇发酵中的前发酵期，因此可提高设备利用2 0 以上。 提高了淀粉利用率，连续发酵无菌条件要求高，杂菌不易污染，发酵液 始终处于流动状态，促进了酵母与醪液的均匀接触，并有利于c 0 2 排除，因此 增强了酵母的发酵作用，提高出酒率。如广西桂平糖厂淀粉质原料的淀粉出酒 率可达5 6 2 以上。 省去了酵母培养工段，连续发酵工艺每隔2 0 天甚至1 8 0 天才接一次酵 母，因此，大大的减少了繁琐的酵母培养工作。特别是当前使用的t i t a a d y 搞 连续发酵，效果更明显。 便于实现自动化，当前谷物原料酒精生产中的粉碎，液化与糖化及多效 蒸馏工艺均实现连续生产和自动控制，发酵工序使用了螺旋板强制循环冷却， 冷却水自动控制，发酵罐的液位可自动控制，醪液的进出可以自动控制，这对 连续发酵的稳定提供了可靠保证。 在连续发酵过程中，微生物细胞所处的环境条件，如营养物质、产物浓度、 p h 值以及微生物细胞浓度、比生长速率等可以自始至终基本保持不变，甚至还 可以根据需妻来调节微生物细胞的生长速率，因此连续发酵的最大特点是微生 物细胞的生长速率、产物的代谢均处于恒定状态，可达到稳定、高速培养微生 物细胞或产生大量的代谢产物的目的。 1 6 2 国内外发酵新技术典范 ( 1 ) 酵母菌体再利用于间歇发酵生产 日本开发将酒精发酵液中的酵母用中空管过滤膜代替离心分离法从发酵 液中分离出，当发酵液中产物浓度为l o o g 几，每升培养液使用过滤膜面积为 9 西华大学硕士学位论文 0 0 5m 2 l 以上时，酵母菌体的再利用率越高，过滤液的滤出率也高，生产效 率相应提高，过滤后的酵母菌体再利用于间隙发酵生产酒精，能大大提高酒精 生产效率。 ( 2 ) 无蒸煮酒精发酵 第一、甘薯的无蒸煮酒精发酵 日本用兼有淀粉糖化酶生成能与酒精发酵的霉菌单独进行甘薯颗粒的无 蒸煮酒精发酵，即用菌株制成麸曲，作酒精发酵的糖化源与酵母源，添加辅酶、 防腐剂、焦亚硫酸钾，3 5 。c 发酵，最适p h 4 5 5 0 ，能得到8 3 2 的乙醇收 率。九州大学以薯干为原料的无蒸煮酒精发酵，使用根霉糖化酶代替黑曲糖化 酶，并在发酵醪中添加0 0 2 上的焦硫酸钾，以防发酵染菌，酒精收率可达9 4 。 第二、无蒸煮木薯淀粉生产酒精 日本开发应用根霉麸曲在气体循环式反应罐中使用生木薯淀粉为原料发 酵生产酒精，可避免发酵液中生淀粉和麸曲的沉降。使用这种罐发酵酒精，发 酵醪中酒精、浓度可达1 4 ( v v ) 以上。用根霉麸曲代替糖化酶制剂以及用生淀 粉一糖化酶一酵母系统中培养的酵母，这种气体循环式发酵罐非常适合用 含固形底物的发酵醪生产酒精。 第三、高粱无蒸煮发酵酒精 泰国用高粱经粉碎成粉末无蒸煮酒精发酵，在淀粉浓度3 0 3 5 ( w v ) 时 分别加入根霉糖化酶液、加入( 或不加入) 商品酶制剂( 纤维素酶、半纤维素酶、 木聚糖酶、果胶酶等混合物) ，发酵试验，酒精收得率达理论产量的9 2 以上。 ( 3 ) 用运动单胞菌以葡萄干生产乙醇 用运动单胞菌是利用葡萄糖、果糖、蔗糖发酵生产酒精最有前途的微生物 之一。葡萄干中转化糖含量极为丰富，加水抽提，调节p h 得到葡萄提取液， 在初糖1 7 6 利用假单孢菌酒精发酵乙醇浓度达1 6 6 ，几乎接近理论值，大 大高于用酵母发酵，且无副产物。葡萄干提取液中存在一些生理因子，对乙醇 发酵有促进作用。 ( 4 ) 管囊酵母用木糖生产酒精 美国农业部从树木分泌物中分离得到管囊酵母，能将由纤维素通过酸法或 酶法处理分解得到的木糖转化为酒精。在发酵液中需添加酵母提取物。在通气 1 0 西华大学硕士学位论文 条件下，以5 0 9 l 的木糖为底物，3 2 ( 2p h 2 5 - 4 5 发酵，木糖转变为乙醇产 率0 3 9 几木糖。发酵时添加丙酮能增加产量5 0 一7 0 。 除上述发酵技术外，国内外研究较多的发酵技术还有固定化细胞发酵技术 和萃取发酵技术等。 1 7 固定化发酵“” 1 7 1 固定化发酵发展简介 固定化酵母又叫固定化活细胞或固定化增殖细胞，是指用适当的载体材料 和科学的方法将活酵母固定在载体上，使该细胞能在适宜的条件下不断生长繁 殖，从而能促使有机物质连续地进行反应“”。 固定化活细胞即微生物菌体的固定化，是6 0 年代以来随着对固定化酶技 术的研究，应用而发展起来的一项新技术，由于在生物工程中有广泛的应用前 景，目前在应用研究上的进展已大大超前于原来的固定化酶技术。固定化酵母 应用于酒精发酵的研究开始于1 9 7 6 年，目前，此技术不仅可以将活细胞固定 起来，而且还可以使活细胞在良好的环境下生长繁殖，它甚至比固定化酶的工 艺还要好，因为它不必像固定化酶那样把酶从细胞中提取出来，并加以纯化， 所以酶活力损失少。酶在完整的细胞中是稳定的，特别是当反应需要辅助因子 的时候，固定化活细胞就更优于固定化酶，因为活细胞能再生辅助因子，固定 化后催化活性无明显的损失，操作和储存的稳定性均比固定化酶好。因此，目 前固定化活细胞在发酵技术方面已取得了普遍性和广泛性的发展“”。 1 7 2 应用机理 固定化技术的机理是利用活细胞或酶的高度密集，从而比游离状态成倍的 增长，加快反应速度，缩短工作周期，提高工作效率，在固定化活细胞载体中， 载体的表面首先接触培养液，活细胞就不断地增殖，由于载体本身具有一定的 渗透性，培养液能够渗透到载体的内部，活细胞就能够获得培养液而增殖，增 殖的活细胞不断地向外传递，由于载体内部和表面的条件有所不同，内部的活 细胞受到外界条件的干扰不多，并不断增殖向外扩散，载体内部的活细胞永远 西华大学硕士学位论文 保持着原有品质。因此，采用固定化活细胞进行发酵具有较高的抗污染能力， 一旦外界受到杂菌污染时，也能保持着原有菌种的特性，这些都是游离活细胞 所不能及的。固定化活细胞在酒精发酵生产中的应用，其技术关键是载体一定 要将大量的活细胞固定下来并使其不断地增殖，经受得住发酵过程中的翻腾和 冲击，只有这样，整个发酵过程才能顺利、连续地进行。因而，固定化的方法 和载体的选择就显得尤其重要。所以，在酵母细胞固定化过程中一定要满足以 下两个条件：l ，固定方法对细胞无损害，细胞的生物活性不能降低：2 ，所用 的载体材料机械强度高，稳定性好，不介入酶促反应，并具有一定渗透性，能 为细胞提供一个生长繁殖的良好的微环境，广州甘蔗糖业研究所选用了合成高 分子材料一，通过物理方法，包埋成型，作为固定化的载体，此载体能形成较 好的网络，且载体本身具有一定的渗透性，培养液能够渗透到载体的内部，活 细胞就能获得培养液而增殖并不断向外传递，由于载体内部的活细胞受到外界 条件的干扰不多，并不断向外繁殖，因此载体内部的活细胞始终保持着原有的 特性，而一旦外界受到杂菌感染时，里面繁殖出来的活酵母也能保持着菌种原 有的特性。另一方面，由于载体的机械性能好，载体经长时间使用后不容易破 损，不会随发酵的流动而流失，在发酵罐内始终保持有一个强大的酵母源存在。 所以采用固定化活酵母进行酒精发酵具有较高的抗杂菌能力，而这些恰恰是游 离酵母所不能及的。 1 7 3 实践效果 固定化活酵母技术的迅速发展，使传统的酒精发酵技术得到全面的革新成 为可能，其技术优点及带来的生产效益是传统技术无法相比的，广东某厂在 1 9 9 4 1 9 9 5 榨季开始应用了固定化酵母技术后，当年就取得了多产酒精1 0 0 多 吨的好成绩“。 根据实践证明，固定化活细胞在酒精生产中具有以下优点： ( 1 ) 发酵速度快而后劲强，设备利用率高 根据酒精发酵原理可知，酒精发酵速度的快慢，主要取决于发酵工艺中所 采取的酵母菌种的特性及其在发酵液中的浓度( 即酵母数) 。传统的酒精生产 是使用游离酵母技术，发酵液中的酵母浓度很容易随发酵液的流动而被冲稀， 1 2 西华大学硕士学位论文 由于酵母浓度的不稳定出现发酵速度减慢，容易感染杂菌，使生产出现酸败等 现象。应用固定化酵母技术后，由于酵母载体内存在一个密度高达2 0 亿g 的 优质酵母源不断向外繁殖高活力的酵母，使发酵液始终保持1 5 2 0 亿m 1 的酵母数，从而使发酵稳定而保持强劲活力，使发酵时间比原来缩短l o h 以上， 提高原发酵设备的利用率约3 0 ”，从而节省扩大生产能力而需增加发酵设备 的投资费用。 ( 2 ) 节省培种工段的费用，节约非生产时间 传统的酒精生产技术所需的大量游离酵母必须经过从试管逐级扩大培养， 直至酒母液的量及酵母浓度等指标达到满足生产要求时，再进入发酵工段进行 发酵生产。这个培种工段是传统发酵技术所不能缺少的。整个酒母培养过程所 需的时间短则3 - 4 天，长则一周时间，而且全过程要求严格的无菌操作”。在 实际应用上，经常因操作不慎使酒母感染杂菌，这对发酵生产将带来非常不利 的后果。而应用固定化酵母技术后，由于载体内有高达2 0 亿g 的优质活酵母 源不断向外繁殖大量酵母，从而在生产中不需要补种或换种就可连续正常地长 时间进行发酵生产。如遇上较长时间的停水、电、气或人为的不慎而染上杂菌 时，只需将装有载体的发酵罐内的发酵液抽空，用清水将发酵罐及载体表面冲 洗干净，重新投糖，发酵生产即可在短时间内恢复正常。所以在整个生产过程 中可彻底省去培种工段及其运行的费用，节约非生产时间，减少因培种工作的 不慎而带来的发酵感染杂菌的机会。 ( 3 ) 发酵抗杂菌能力强 根据生物界普遍存在的生长优势抑制劣势的原理，发酵过程中只要能够维 持高浓度酵母发酵，借助酵母的生长优势可抑制杂菌的生长，发酵的酸败就不 会发生，而传统的游离酵母酒精发酵技术的酵母浓度一般只有0 8 - 1 2 亿m 1 左右，且容易被冲稀，采用了固定化酵母技术后，由于发酵罐中始终存在一个 强大的高活性酵母源，故在正常发酵生产时，在强大的优质且稳定的酵母的生 长优势下，发酵速度快而后劲强，再加上省去培种工段，所以，感染杂菌的机 会是很微弱的。实践证明，固定化酵母比游离酵母具有更能耐酸、耐温、耐高 浓度及耐酒份等优点，从而使其抗杂菌能力更强。 ( 4 ) 提高糖份出酒率，降低单耗，节省蒸馏用汽 1 3 西华大学硕士学位论文 应用固定化酵母技术后，因节省培种过程酵母所消耗的糖份，及减少杂菌 感染机会而减少杂菌消耗的糖份，加上发酵速度快而彻底，从而降低物料的单 耗，提高了糖份的出酒率，成熟醪含酒份也随着升高，从而可节省蒸馏用汽， 降低生产成本。 ( 5 ) 操作简单方便，管理粗放o ” 由于固定化酵母发酵技术能使发酵维持在高酵母浓度的条件下进行，从而 在发酵操作上要求较为粗放简单，只要在榨季初期加入载体就可供整个榨季使 用，加上载体的保养及再生能力强，又省去培种工段，故生产过程中的水、电、 气的波动对其影响不大，其工艺操作非常稳定和简单，易于被工人们掌握。 ( 6 ) 经济效益好，明显降低生产成本 采用固定化活酵母进行连续发酵，发酵能力提高1 0 一3 0 ，可提高设备利 用率；操作简单方便，可节约人工费用；发酵快而彻底，可提高酒精产率；成 熟醪中的酒份高，可节约蒸馏用汽，降低生产成本。根据多间酒精厂生产实践 效果，以上几项效益合计，年产量2 0 0 0 t 左右的糖蜜酒精厂，采用固定化活酵 母，每榨季可增加收入6 0 万元以上“”。 1 7 4 实践经验 固定化酵母在近十年的实践应用中，逐渐为各厂家认可，并给传统的酒精 发酵带来了技术上的全面革新。为了能充分发挥其先进的优越性，在生产及应 用过程中，应注意以下几个问题： ( 1 ) 载体的大小必须适宜。太大，运输、安装等不方便；太小，载体容 易流失，并回堵塞管道，从而引起发酵异常。 ( 2 ) 载体的表面应比较光滑，以避免容易沉积的灰渣等污染物，阻碍酵 母的繁殖。 ( 3 ) 载体要具有较大的表面积，以使酵母能充分接触发酵液，利于酵母 的繁殖。 ( 4 ) 载体在发酵罐内的安装一定要有利于发酵液体的对流，发酵液通过 载体时尽量不要走短路，也不存在死角，且安装工作应比较简单方便，容易拆 洗。 1 4 西华大学硕士学位论文 ( 5 ) 发酵原料应彻底酸化、澄清，去除残留的灰分、胶体等杂质，以防 止这些杂质微粒附着在载体表面从而影响酵母的渗透力。 ( 6 ) 因固定化酵母发酵时，酵母浓度较高，故发酵罐中的发酵比游离酵母 旺盛，因而罐内聚集的c 0 2 也比较多，所以，发酵罐的c 0 2 排气管一定要比传统 法大，使c 0 。能顺利的排出，以免罐内压力太高，影响酵母发繁殖。 1 8 萃取发酵 1 8 1 随程溶剂萃取技术”1 在利用微生物或植物细胞生产有用物质的过程中，常常发现产物的生成会 抑制培养的进一步进行。一方面是因为产物本身对细胞有毒性或有抑制作用。 另一方面是因为产物的生成恶化了细胞生长的环境，如随着产物的积累，培 养液粘度升高，限制了传氧过程。还有一种情况，即产物容易被酶降解或被反 应器的搅拌剪切力破坏。在这些情况下，都希望能够随时分离产物，以免产物 抑制培养的继续进行，或培养