（食品科学专业论文）单增李斯特菌酶联免疫吸附法的研究.pdf

单增李斯特菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n s ，l m ) 是一种重要的食源性致病菌， 它与ec o l i0 1 5 7 、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌统称为最重要的四大食源性致 病菌。在l m 的众多血清型中，4 b 型是出现最多，也是最能引起人类和牲畜患 病的血清型，该菌能引起人、畜的李斯特菌病，感染后的症状主要表现为败血 症和脑膜炎。本研究旨在建立一种免疫分析方法用于样品中l m ( 血清型4 b ) 的 快速筛选。研究内容包括三个部分： ( 1 ) l m 鞭毛的制备 本研究将在2 2 和3 7 c 培养的l m ( 血清型4 b ) 通过超速离心法获得鞭毛，一 最终通过s d s p a g e 试验以及透射电镜加以证明。研究结果表明，2 2 培养的 l m 有大量鞭毛产生，而3 7 c 没有或只有一根鞭毛产生；另外，经酸解超速离 心法获得的鞭毛浓度高( 1 1m e m e ) ，纯度高，而且试验耗时短，适用于l m 鞭毛 蛋白的提取。 ( 2 ) l m 选择性培养方法的建立 本研究按f d a 法进行增菌，在一定的体系内观察金黄色葡萄球菌、志贺氏 菌以及ec o l i0 1 5 7 等三种杂菌对l m 的影响。研究结果表明，选择性培养基对 三种杂菌有一定的抑制作用；其中，b l e b ( 含吖啶黄素) 对分离菌的抑制效果 最好，其次是b l e b ( 不含吖啶黄素) 和t s b 。 ( 3 ) l m 双抗夹心e l i s a 方法的建立 用l m 及其制备的l m 鞭毛蛋白作为免疫原，得到兔抗l m 多克隆抗体及 鼠抗l m 鞭毛蛋白多克隆抗体，经1 0 周5 次免疫后，抗体效价可达1 0 6 以上。 两种多抗经纯化后免疫血清的浓度分别为9 0 8 3m e m e 和7 9 4 0m e m e 。建立了 l m 双抗夹心间接e l i s a 检测方法，通过对包被液，包被时间、底物作用时间、 酶标二抗稀释倍数以及封闭液进行优化，从而确定了双抗夹心e l i s a 法检测 l m 的最佳反应条件。研究结果表明，最佳反应条件分别为：包被液为o 0 5m o l l 碳酸盐缓冲液( p h9 6 ) ，t m b 底物显色时间为1 5r a i n ，羊抗鼠酶标二抗稀释 倍数为5 0 0 0 倍，封闭液为1 b s a ，包被条件为3 7 ，2h 。 关键词：单增李斯特菌；鞭毛；选择性培养；酶联免疫吸附试验； a b s t r a c t a bs t r a c t l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ( l m ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf o o d b o m ep a t h o g e n s ， 谢t l lt h eo t h e rt h r e eb e i n gec o l io15 7 ，s a l m o n e l l aa n ds t a p h y l o c o c c u sa u r e u s i na l l t h es e r o t y p e so fl i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ，4 bt y p ei st h em o s tc o m m o na n dc a u s e a d v e r s er e a c t i o n so fh u m a na n da n i m a l t h em a j o rs y m p t o m sc a u s e db yl mi n c l u d e s e p t i c e m i aa n dm e n i n g i t i s i no u rs t u d y , a l li m m u n o a s s a yh a db e e nd e v e l o p e df o rt h e r a p i ds c r e e n i n go fl m i nf o o ds a m p l e s o u rw o r ki n c l u d e st h r e ep a r t s ： ( 1 ) p r e p a r a t i o no ff l a f e l l i no fl i s t e r i am o n o c y t o g e n e s l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s - ( s e r o t y p e4 b ) b e i n gc u l t u r e da t2 2 a n d3 7 ， r e s p e c t i v e l y , f l a g e l l aw e r eh a r v e s t e db yu l t r a c e n t r i f u g a t i o n t h er e s u l tw a s i d e n t i f i e d b y s d s - p a g ea n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o n m i c r o s c o p y i t s h o w e dt h a t ，厶 m o n o c y t o g e n e sp r o d u c e dal a r g en u m b e ro ff l a g e l l a a t2 2 。c ，n o n eo ro n l yo n e f l a g e l l u mw a sp r o d u c e da t3 7 c i na d d i t i o n ，h i g hp u r i t ya n dh i g hc o n c e n t r a t i o n ( 1 1 m g m l ) o ft h ef l a g e l l i nw a so b t a i n e d 诵t l lt h i sm e t h o da p a r tf r o mt i m e s a v i n g ( 2 ) d e v e l o p m e n to fs e l e c t i v ec u l t u r ef o rl m i nt h i ss t u d y , t h ee f f e c to fs t a p h y l o c o c c u sa u r e u s , s h f g e t t a ，a n de c o l io 15 7 b a c t e r i ao nl mw a so b s e r v e dw h e nf d am e t h o dw a su s e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t s e l e c t i v em e d i ah a v es o m ei n h i b i t o r ye f f e c t so nt h r e ek i n d so fb a c t e r i a b l e b ( a d d i n ga c r i d i n ef l a v i n ) i st h eb e s to n e ，f o l l o w e db yb l e bw i t h o u ta c r i d i n ef l a v i n a n d t s b ( 3 ) d e v e l o p m e n to fl md o u b l e a n t i b o d ys a n d w i c he l i s a l m o c y t o g e n e sa n df l a g e l l i nw i l lb eu s e da sa n t i g e nt oo b t a i nr a b b i ta n t i l m p o l y c l o n a la n t i b o d ya n dm o u s ea n t i - f l a g e l l i np o l y c l o n a la n t i b o d y t h r o u g h f i v e i m m u n i z a t i o n si nt e nw e e k s ，a n t i b o d yt i t e r sw i l lb eu pt o10 6o r m o r e t h e c o n c e n t r a t i o no ft h et w op u r i f i e da n t i b o d yw e r e9 0 8 3m g m la n d7 9 4 0m g m l ， r e s p e c t i v e l y t h ec o a t i n gb u f f e r , c o a t i n gt i m e ，s u b s t r a t ea c t i o nt i m e ，g o a ta n t i m o u s e i g g ：h r pd i l u t i o n ，a n db l o c k i n gl i q u i dw e r es t u d i e dt od e t e r m i n et h eo p t i m i z a t i o n c o n d i t i o nf o rd o u b l e a n t i b o d ys a n d w i c he l i s af o rd e t e c t i o no fl m o c y t o g e n e s ，t h e c o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：c o a t i n gb u f f e rw a s0 0 5m o l lp h9 6n a 2 c 0 3 一n a h c 0 3 ； s u b s t r a t ea c t i o nt i m ew a s15m i n ；g o a ta n t i - m o u s ei g g ：h r pw a sd i l u t e db y5 0 0 0 一i i a b s t r a c t t i m e s ；b l o c k i n gl i q u i dw a sl b s a ；c o a t i n gt i m ew a s3 7 。c2h k e y w o r d ：l i s t e r i am o n o c y t o g e n s ；f l a g e l l i n ；s e l e c t i v ec u l t u r e ；e l i s a ； 目录 目录 摘要i a b s t r a c t 。i i 缩略语表v i i 第一章前言1 1 1l m 概述l 1 1 1l m 生物学特征1 1 1 2l m 在食品中的污染情况3 1 1 3l m 的危害4 1 1 4l m 的检测方法4 1 2 鞭毛制备的概述6 1 3 选择性增菌方法的概述7 1 3 1 选择性增菌方法的比较7 1 3 2 平板菌落计数法8 1 4 酶联免疫方法的概述1 0 1 5 选题的目的和意义1 1 第二章鞭毛的制备1 2 2 1 材料与方法1 3 2 1 1 试剂与材料1 3 2 2 方法l3 2 2 1 菌种验证方法13 2 2 2 培养条件对l m 动力的影响1 4 2 2 3 培养条件对l m 鞭毛生长的影响1 4 2 2 4 酸解超速离心法提纯l m 鞭毛1 4 2 2 5 硫酸铵沉淀法提纯l m 鞭毛1 4 2 2 6s d s p a g e 电泳实验方法15 2 3 结果与讨论1 5 目录 2 3 1 细菌的鉴定1 5 2 3 2 鞭毛诱导结果1 6 2 3 3 不同温度下鞭毛的表达结果1 6 2 3 4 不同的提取方法的比较结果1 8 2 3 5 鞭毛蛋白样品的确定一1 9 2 3 6 讨论2 0 2 4 本章小结2 1 第三章l m 选择性培养方法的建立2 2 3 1 材料与方法2 3 3 1 1 试剂与材料2 3 3 1 2 目的菌及分离菌的活化2 3 3 1 3 非选择性增菌预试验2 4 3 1 4 选择性增菌因素对l m 检出率的影响2 4 3 2 结果与讨论2 5 3 2 1 非选择性增菌预实验结果2 5 3 2 2 选择性增菌结果2 7 3 2 3 讨论2 8 3 3 本章小结2 9 第四章l m 双抗夹心间接e l i s a 方法的建立3 0 4 1 材料与方法3l 4 1 1 试剂与材料3 1 4 1 2l m 多克隆抗体的制备和鉴定3 1 4 1 3 常规间接e l i s a 法的反应步骤3 3 4 1 4 常规双抗夹心e l i s a 间接法的反应步骤3 4 4 1 5l mi s e l i s a 各因素的优化3 5 4 2 结果与讨论3 7 4 2 1l m 多克隆抗体纯化3 7 4 2 2l m 免疫效应分析3 7 4 2 3l mi s e l i s a 各因素的确定3 8 参考文献4 6 个人介绍51 攻读硕士期间的研究成果51 缩略语表 v i i 第一章前言 第一章前言 单核细胞增生李斯特菌( l i s t e r i am o n o c y t o g e n e s ，简称为l m ) 属于李斯特 氏菌属，是一种人畜共患的病原菌。它是一种能在冷藏温度下繁殖的致病菌， 因为其细胞的苯酚水浸出物可以诱导单核细胞的生成，而获得了“单核增生细 菌”这个种名【2 】。迄今为止，除l m 外，李斯特氏菌属细菌还包括以下几种：绵 羊李斯特氏菌( 三i v a n o v i i ) 、英诺克李斯特氏茵( 三i n n o c u a ) 、威尔斯李斯特氏 菌( lw e l s h i m e r i ) 、西尔李斯特氏菌( 厶s e e l i g e r ) 、格氏李斯特氏菌( 三g r a y o 和默氏李斯特氏菌( 三m u r r a y i ) 。其中，l m 被认为是引起动物和人类李斯特病 的主要致病菌。自1 9 2 6 年m u r r y 等p j 首次在病死的兔子体内发现李斯特茵并报 道李斯特菌病以来，此病已陆续在许多国家发生，特别是近2 0 年以来，l m 引 起的食物中毒日趋严重。1 9 9 2 年，法国因食用污染的猪舌头导致李斯特菌病的 超过2 7 9 例；1 9 9 7 年，瑞典因食用污染的鲑鱼片而致病的有9 人，其中2 人死 亡 4 1 ；2 0 0 1 年，日本因食用污染的奶酪而造成李斯特菌感染的有8 6 人【5 】；与此 同时，在美国、加拿大等国由该菌造成的临床疾病和食物污染程度已大大超过 了沙门氏菌。近年来，在我国吉林【6 】、广州【7 1 、杭州【羽、江门【9 j 、南平【1 0 1 等省市 的多种食品中都检测到了该菌，死亡率达3 0 以上【1 1 1 。目前，l m 与致病性ec o l i 0 1 5 7 、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌一同被w h o 列为四大食源性致病菌【1 2 1 。 1 1l m 概述 1 1 1l m 生物学特征 1 1 1 1 形态与染色 l m 为革兰氏阳性短杆菌，大小约为0 5p m x ( 1 o 2 o ) l a m ，直或稍弯，两 端钝圆，常呈v 字型排列，偶有球状、双球状。兼性厌氧、无芽胞，一般不形 成荚膜，但在营养丰富的环境中可形成荚膜，在陈旧培养物中的菌体可呈丝状 及革兰氏阴性。该菌有4 根周鞭毛和1 根端鞭毛，但周鞭毛易脱落。 1 1 1 2 培养特性 该菌营养要求不高，在2 0 2 5 培养有动力，穿刺培养2 - - 5d 可见倒立伞 状生长，肉汤培养物在显微镜下可见翻跟斗运动。该菌生长的温度范围为2 , - - 4 2 第一章前言 ( 也有报道在0 * c 能缓慢生长) ，最适培养温度为3 5 3 7 ，在p h 中性至弱 碱性( p h 9 6 ) 、氧分压略低、二氧化碳张力略高的条件下该菌生长良好，在p h 3 8 - - - 4 4 能缓慢生长，在6 5 n a c l 肉汤中生长良好。在固体培养基上，茵落初 始很小，透明，边缘整齐，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在5 7 的血平板上，菌落通常也不大，灰白色，刺种血平板培养后可产生窄小的p 溶血环。在0 6 酵母浸膏胰酪大豆琼脂( t s a y e ) 和改良m eb r i d e ( m m a ) 琼脂上， 用4 5 度角入射光照射菌落，通过解剖镜垂直观察，菌落呈兰色、灰色或兰灰色。 1 1 1 3 生化反应 该菌触酶阳性，氧化酶阴性。发酵多种糖类，产酸不产气。如发酵葡萄糖、 乳糖、水杨素、麦芽糖、鼠李糖、七叶苷、蔗糖( 迟发酵) 、山梨醇、海藻糖、 果糖。不发酵木糖、甘露醇、肌醇、阿拉伯糖、棉子糖、卫矛醇和纤维二糖。 不利用枸橼酸盐，4 0 胆汁不溶解。吲哚、硫化氢、尿素、明胶液化、硝酸盐还 原、赖氨酸、鸟氨酸均阴性。v p 、甲基红试验和精氨酸水解阳性。 1 1 1 4 血清型 根据菌体( o ) 抗原和鞭毛( h ) 抗原的不同进行划分，将单增李斯特氏菌 分成1 3 个血清型，分别是1 2 a 、1 2 b 、1 2 e 、3 a 、3 b 、3 e 、4 a 、4 b 、4 a b 、4 c 、 4 d 、4 e 和7 。在一般情况下，致病菌株的血清型为1 2 b 、i 2 c 、3 a 、3 b 、3 c 、4 a 、 1 2 a 和4 b ，后两型尤多，对人致病的血清型主要有1 2 a 、1 2 b 、4 b 。食源性李斯 特氏菌病的祸首是4 b 型【1 3 】。在美国和加拿大发生的l m 病案例中，至少7 0 的 患者是由4 b 血清型引起的【1 4 1 。在东欧、西非等国，1 2 a 是因引发疾病而报道最 多的血清型【1 5 】。李斯特菌种间的血清学关系见表1 1 。 表1 - 1 李斯特氏菌属种间血清关系 t a b l e1 - 1s e r u mr e l a t i o n s h i po f l i s t e r i as p e c i e s 菌种名称血清型 单核细胞增生性李斯特氏菌m o n o c y t o g e n e s ) 1 2 a 、1 2 b 、1 2 c 、3 a 、3 b 、3 c 、4 a 、4 b 、 4 a b 、4 e 、4 d 、4 e 和7 绵羊李斯特氏菌( 三i v a n o v i i ) 5 英诺克李斯特氏菌( 厶i r l n o c u a ) 4 a b 、6 a 、6 b 威尔斯李斯特氏菌( 上w e l s h i m e r i ) 6 a 、6 b 西尔李斯特氏菌( 上s e e l i g e r ) 1 2 b 、4 c 、4 d 、6 b 1 1 1 5 抵抗力 l m 对碱和盐都有较强的抵抗力，并且在土壤、河流及粪便中均能长期存活。 - 2 第一章前言 一般情况下，该菌可以通过6 0 - - 7 0 煮5 - - 2 0m i n 、7 0 酒精作用5r a i n 或者使 用浓度为2 5 的石炭酸和福尔马林作用2 0m i n 均可杀死此菌。此外，该菌对青 霉素、氨苄青霉素等抗生素均敏感。 1 1 2l m 在食品中的污染情况 1 1 2 1 肉及其肉制品 由于l m 在环境中存在比较广，导致畜禽因生长过程中受到诸如水源和土 壤等外界环境的影响而感染李斯特菌病。除此之外，肉及肉制品在加工，贮藏 以及运输过程中的影响也是肉制品发生污染的主要原因。根据报道，v i t a s 等 1 6 1 对西班牙肉制品以及家禽制品进行检测，结果表明l m 的检出率分别为3 4 9 和 3 6 1 。b i r g i t t l 7 】等对肉制品进行检测，结果显示非冷藏肉制品以及冷藏肉制品 的检出率分别为9 6 和1 4 7 。在我国江苏、湖北、河南三省对肉类的检测中， 调查结果显示，生肉制品中l m 检出率为4 1 5 9 ，熟肉制品的检出率为 2 3 5 5 t 1 孓2 0 l ，而崔京辉等对北京的生肉制品的检测中发现l m 的检出率达 1 9 1 ，熟肉制品中l m 的检出率高达4 8 。 1 1 2 2 奶及其奶制品 除此之外，由于奶源容易发生发生l m 的感染，奶及奶制品发生l m 污染 的概率也会随之升高。根据报道，在西班牙，v i t a s 等【1 6 1 对生牛奶进行检测，结 果显示检出率为6 8 ；在丹麦。b i r g i t 等【1 7 】对墨西哥干乳酪中进行抽样调查， 检出l m 的概率为4 8 ；在我国江苏和北京两省市对冰淇淋的检测中，l m 的 检出率分别为2 2 1 1 8 】和7 3 1 2 1 1 。 1 1 2 3 水产品 由于水产品在加工、贮藏以及运输过程中的影响，也容易引起l m 的污染。 根据报道，西班牙对熏鲑鱼进行检测，其结果显示l m 的检出率为2 8 t m l ，丹 麦对冷藏鱼制品进行抽查，其检出率为2 l 蜊1 7 】，在我国北京、四川两省市的水 产品检测中，l m 的检出率分别为1 6 1 2 1 1 和4 2 5 t 2 2 1 。水产品中l m 的污染也与 原料、加工、运输及储存中造成的污染有关。 1 1 2 4 植物性食品 除动物性食品外，由于l m 在土壤和粪便中均可生存，使得蔬菜等植物被 污染的概率增大，特别是用作生吃的蔬菜，更容易寄生l m ，从而使生食的人患 鬟： 第章前言 病。根据报道，在丹麦，l m 在蔬菜制品中的检出率最高达到3 4 【1 7 】；加拿大 对9 2 份白菜进行检测，结果发现l m 的检出率为2 2 ；美国分别对9 2 份黄瓜 以及1 3 2 份土豆进行抽样调查，结果显示l m 的检出率分别为2 2 和2 1 2 t 2 3 j 。 我国江苏、湖北两省对蔬菜进行检验发现l m 的检出率最高达到0 9 【1 8 1 9 】，而 北京的检测结果表明蔬菜的污染率可达到1 6 2 1 1 。 1 1 3l m 的危害 单核增生李斯特氏菌是一类十分重要的人畜共患的条件致病菌，该菌可引 起人类和多种畜禽的疾病，人畜感染后的症状主要表现为脑膜炎、败血症；家 禽感染后的症状主要表现为脑膜炎、坏死性心肌炎及肝炎。对于人类，尤其是 新生儿、老年人、孕妇以及免疫功能缺陷者，发病的概率更大 2 4 , 2 5 】；其中，在婴 幼儿和免疫力比较低的人群中因l m 病致死的高达7 0 【2 6 1 。截止到目前为止， 对哺乳动物来说，当感染的细菌数量超过1 0 9 个细胞时将导致其发病，而对于导 致人类致病的细菌数量有待进一步研究【2 7 】。 1 1 4l m 的检测方法 1 1 4 1 传统的分离鉴定 传统的检测方法包括国标中的e b 增菌法和l b 增菌法，它们都是通过微生 物的分离培养、生化反应、溶血试验以及动物实验来完成的。完成这些实验所 需的实验设备要求不高、可操作性好，但检验周期长，一般需要6 7d 。对目 前的食品生产及检验过程来说，这种传统的检测方法已经无法满足食品上市和 消费前的快速检测要求。 1 1 4 2 快速检测法 1 1 4 21 免疫学检测 免疫学方法具有快速、敏感、特异、简便、结果易于判定等特点。1 9 8 8 年， b u t m a n 等【2 8 】用李斯特菌属表面抗原免疫小鼠制备了李斯特菌属特异性单克隆抗 体，并用此单抗建立e l i s a 试验，同时将其用于食品中李斯特菌属的检测；1 9 9 1 年，b h u n i a 等2 9 1 用特异性强的l m 和无毒李斯特菌( 三i n n o c u a ) 的共同表面抗 原经免疫后得到了单克隆抗体，并建立了夹心e l i s a 方法，这种方法可在前增 菌2 4h 内检出阳性结果。1 9 9 2 年，b h u n i a 等 3 0 j y n 用淋巴细胞杂交瘤技术制备 得到一株能分泌单增李斯特氏菌特异单克隆抗体的细胞株，并用此细胞株建立 第一章前言 了夹心e l i s a 方法，这种方法的优越性在于它的检测限可以达到8 1 0c f u g 。 1 9 9 4 年，g u r i a l e 等【3 l 】比较了e li s a 法和培养法( 美国f d a ) 测定食品中单核细 胞增生性李斯特菌，两者总的符合率达到8 5 6 。1 9 9 4 年，我国的杨春梅等建立 了肉制品中单增李斯特氏菌快速检测方法一免疫酶染色法，能于2 4 - - - 2 8 h 内 得到样品检测结果，检测灵敏度可以达到1 0 5c f u m l 。1 9 9 8 年，焦新安等【3 2 】 利用单增李斯特氏菌属特异表位经免疫得到特异性单克隆抗体，并建立单抗夹 心e l i s a 方法快速检测l m 。 1 1 4 2 2 分子生物学检测 p c r 技术是最早得到应用的分子生物学检测方法，我国的王海艳掣3 3 】分别 用l m h l y 基因以及l m 属1 6 s rr n a 基因设计的两对引物建立p c r 方法检测污 染的食品，检测限为1c f u 2 5 9 。 核酸探针杂交技术的应用，使l m 的检测进入一个新的水平阶段。它是以 l m 特有的毒力基因为靶基因，从待测样品中将李斯特菌鉴别出来，v o l o k h o v 等【3 4 】利用l m 的6 种毒力蛋白基因为靶基因设计多重p c r ，从而研制出了基因 芯片检测l m ，检测水平与培养法( 美国f d a ) 相当。 实时荧光定量p c r 是在传统p c r 的基础上在反应混合物中加入荧光标记， 它能结合在双链d n a 的位置，依据循环的增加而导致荧光量的增加，可直接对靶 d n a 进行定量的检测。r o d r i g u e z l a z a r o d 掣3 5 】利用实时荧光定量p c r 技术对 水、脱脂奶和未经巴氏杀菌的全脂牛奶进行l m 的检测，经过2d 的富集可在3 h 内完成检测，检测限为6 , - 6 0c f u m l 。 1 1 423 全自动微生物分析系统检测 作为微生物检测未来的发展的方向之一，微生物的自动化检测具有操作标 准化，简便、快捷、准确率高的特点，国内外现在已有很多全自动微生物分析 系统问世，如m i c r o s c a n 系统、s e n s i t i t r e 系统、m i d d 系统、a u t o s c e p t o r 系统及 v i t e k 系统等。其中b i t e k - a m s 的微生物鉴定系统已被国际分析化学协会列为 法定分析系统。封幼玲等【3 6 】同时用v i t e k a m $ 和国际法检测l m ，两法符合率 1 0 0 。仪器法检测李斯特菌主要有两个环节，一是用常规法筛选可疑菌落，二是 仪器鉴定，前者需凭借实验人员的经验。 第一章前言 1 1 424 生物传感器检测 生物传感器是用固定化生物成分或生物体作为敏感7 - r d 牛的传感器。它的原 理是待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别，发生生物学反应，产生 的信息继而被相应的物理或化学换能器转变成可定量和可处理的电信号，再经二 次仪表放大并输出，从而得到待测物的浓度。它具有功能多样化、微型化、智能 化、集成化、成本低、灵敏度高、寿命长等特点。2 0 0 4 年，g e n g 等【3 7 】研制了一 种基于抗体的免疫生物传感器，经过l m 的富集培养后，检测时间只需2 5h ， 并且对纯培养样品的灵敏度为1 0 5c f u m l 。p a u l 等【3 8 】用l m 抗体制备的表面等 离子体免疫传感器，对食品中的l m 检测限为1 0 5c f u m l 。 1 2 鞭毛制备的概述 鞭毛是细菌菌体表面的一种细长、弯曲、呈波浪状的特殊结构，是细菌的 运动器官。它是细菌在进化过程中长期适应的结果，使细菌更好地适应环境，有 利于细菌的生存。鞭毛的化学组成主要是蛋白质，分子量约为3 0 一- 6 0k d ，抗原 性良好，可作为细菌的分类依据之一( h 抗原) ，其蛋白质是一种弹力纤维蛋白， 氨基酸的组成与骨骼肌的肌动蛋白相似【3 9 1 。 此外，细菌还可以通过鞭毛的趋化作用寻找营养物质和逃避不利环境。电镜 出现以前，人们认识鞭毛是通过鞭毛染色法。直到1 9 5 1 年，k o f f l e r 4 0 】利用电镜 观察到了鞭毛。此后，其它先进的物理化学技术也被应用于鞭毛超微结构及其 本质的深入研究中。近几年来随着分子生物学技术的广泛应用，对细菌鞭毛的 研究已经上升到分子水平，取得了一些新的进展。 1 9 3 9 年，p a t e r s o n 首次对鞭毛作了比较系统的阐述，它对l m 的血清型鉴定 具有一定的指导意义。在研究中，p a t e r s o n 首先发现了一种普通鞭毛，并将其指 定为b 抗原；接着又发现了另外三种不同的鞭毛( a 、c 、d ) 【4 1 1 。1 9 7 6 年，r o s e 报道了鞭毛的分子量以及亚单位，它们因不同种别而异。制备鞭毛的关键是要 获得鞭毛，继而通过不同方法提取得到鞭毛。在现有的方法中，免疫磁性分离 法【4 2 j 是一种非常有效的方法，它是通过对不同成分形成的细胞悬液进行分离得 到鞭毛，尤其是对特定的血细胞进行分离。在很多研究中都报道了通过使用免 疫磁性分离法而进行的免疫试验【4 3 舶】。另外，机械法凭借小磁珠所产生的剪切 第一章前言 力使细菌鞭毛脱落，进而利用差速离心法大量获得鞭毛。19 8 5 年，w h i t e s i d e f 4 7 】 等阐述了用机械法分离得到假单胞菌鞭毛。除此之外，酸解法通过调节p h 使鞭 毛达到等电点，从而使鞭毛从菌体表面脱落的方法。1 9 8 5 年，i b r a h i m 等1 4 8 1 利用 酸解法高效分离沙门氏菌并获得了丰富的鞭毛。 使鞭毛脱落的方法比较少，以上三种是常常用于鞭毛制备的方法。理想的 提取方法应该保证鞭毛得率高，纯度高，最大限度地保持鞭毛活性；在同样条 件下，重复性好。目前，针对l m 鞭毛制备的方法尚不完善，一是由于鞭毛脱 落后引起的杂蛋白增多，给进一步纯化带来了比较大的困难；二是鞭毛的得率 低，从而使得最终获得的鞭毛量少。 1 3 选择性增菌方法的概述 1 3 1 选择性增菌方法的比较 1 3 1 1f d a 法 取2 5m l ( 或2 5g ) 样品，液体摇匀直接加入，固体于无菌搅拌器均质器中 搅拌均匀后加至2 2 5m lb l e b 肉汤( 含o 2 5 丙酮酸钠和o 0 l 巯基乙酸钠) 中3 0 c 预增菌4h ，加入选择性试剂吖啶黄、萘啶酮酸、放线菌酮( 2 5m g l ， 3 0 培养4 4h 。 1 3 1 2 国标法 取样品2 5g ( 或2 5m l ) 加入到含有2 2 5m l l b l 增菌液的均质袋中，在搅 拌式豆浆机上连续均质1 2m i n ；或放入盛有2 2 5m ll b l 增菌液的均质杯中， 8 0 0 0 - - 一1 0 0 0 0r m i n 均质1 2m i n 。于3 0 培养2 4h ，移取0 1m l ，转种于1 0m l l b 2 增菌液内，于3 0 培养1 8 一- - 2 4h 。 1 3 1 3u s d a 法 对于肉类、家禽以及蛋制品，称取2 5g 样品加入2 2 5m lu v m 肉汤中，并 将其于灭菌搅拌均质器中搅拌2m i n 。于3 0 培养2 4h 。对于土壤样品，将2 2 5 m l u v m 肉汤加入其中并将其搅拌2m i n 。于3 0 培养2 4h 。取o 1m l 加入l o m lf b 肉汤中，并添加适当选择性试剂。于3 7 c 培养2 6h 。 第一章前言 1 3 1 4 行标法 1 3 1 4 1 前增菌 巴氏消毒乳、乳制品、冷冻水产品，冻肉及其它加工食品均应进行前增菌。 无菌操作称取2 5g 样品，加入装有2 2 5m l 改良缓冲蛋白胨水( m b p ) 的均质 杯内，高速均质1 2m i n ，制成l ：1 0 样品匀液，转入5 0 0m l 广口瓶内；液体 食品可用吸管吸取2 5m l 样品，加入装有2 2 5m l 改良缓冲蛋白胨水( m b p ) 的 广口瓶内，充分振摇制成1 ：1 0 样品匀液，于3 0 培养1 8 2 4h 。移取1m l ， 转种于1 0 0m l 增菌培养液( e b ) 内，于3 0 培养2 4h 和4 8h ，分别进行分离。 一1 3 1 4 2 直接增菌 生乳、鲜肉及未经加工处理过的样品不必经过前增菌。检验时，以无菌操 作取2 5g ( 2 5m l ) 样品，按前法所述，用2 2 5m l 增菌培养液代替改良缓冲蛋 白胨水制成1 ：1 0 样品匀液，于3 0 。c 培养2 4h 和4 8h ，分别进行分离。 1 3 1 5a o a c9 9 7 0 3 法 取2 5g ( 2 5m l ) 食品样品加入2 2 5m l 添加氯化锂的f b ( f r a s e rb r o t h ) 肉 汤中，将样品与肉汤充分混匀，有条件可使用均质机。若食品样品为粘稠液体 时，可向2 5m lf b + l i c i 中添加2 2 5m lt r i t o n x 1 0 0 。在3 0 培养2 8 2h 。 之后，按1 0 的接种量，将f b + l i c l 培养液接种到b l e b 培养基中，充分混匀 后，3 0 培养2 4 2h 。 1 3 2 平板菌落计数法 i 3 2 1 菌液的稀释 ( 1 ) 用1m l 无菌吸管或微量移液器吸取1 ：1 0 样品匀液1m l ，沿管壁缓慢注于 盛有9m l 稀释液的无菌试管中( 注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面) ， 振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成l ：1 0 0 的菌液。 ( 2 ) 按上述操作规程，制备l o 倍系列稀释菌液。每递增稀释一次，换用一次lm l 无菌吸管或吸头。 ( 3 ) 根据对样品污染状况的估计，选择2 - - 3 个适宜稀释度的菌液，在进行1 0 倍 递增稀释时，每个稀释度分别吸取lm l 样品匀液加入两个无菌平皿内，并 用涂布棒将菌液涂匀。同时分别取lm l 稀释液加人两个无菌平皿作空白对 第一章前言 照。 ( 4 ) 及时将1 5 - 2 0m l 冷却至4 6 c 的平板计数琼脂培养基( 可放置于4 6 1 恒温水浴箱中保温) 倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。 1 3 2 2 培养 琼脂凝固后，将平板翻转，3 6 1 培养4 8 2h 。 1 3 2 3 菌落计数 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌 落数量。菌落计数以菌落形成单位( c f u ) 表示。 选取菌落数在3 0 3 0 0c f u 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低 于3 0c f u 的平板记录具体菌落数，大于3 0 0c f u 的可记录为多不可计。每个稀 释度的菌落数应采用两个平板的平均数。 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生 长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中 菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2 ，代表一个平板菌落数。 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌 落计数。 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落 数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克( 或毫升) 中菌落总数 结果。 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按公式( 1 1 ) 计算： n = y c ( n 1 + 0 1 n 2 ) d 公式( 1 1 ) 式中： n 一样品中菌落数； c 一平板( 含适宜范围菌落数的平板) 菌落数之和； i l l 二第一个适宜稀释度平板上的菌落数； 1 1 2 一第二个适宜稀释度平板上的菌落数； d 一稀释因子( 第一稀释度) 。 若所有稀释度的平板上菌落数均大于3 0 0 ，则对稀释度最高的平板进行计 数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。 黪 京7 第一章前言 若所有稀释度的平板茵落数均小于3 0c f u ，则应按稀释度最低的平均菌落 数乘以稀释倍数计算。 若所有稀释度( 包括液体样品原液) 平板均无菌落生长，则以小于1 乘以 最低稀释倍数计算。 若所有稀释度的平板菌落数均不在3 0 3 0 0c f u 之间，其中一部分小于3 0 c f u 或大于3 0 0c f u 时，则以最接近3 0 或3 0 0c f u 的平均菌落数乘以稀释倍 数计算。 1 3 2 5 点样法与涂布法的比较 与涂布法不同之处有两点，一是点样法整个体系应控制在1m l ，即：将o 1 m l 的菌液与0 9m l 的稀释液进行混合，按这种稀释方式稀释到所需稀释的的 倍数。二是点样计数，即：倾注平皿后，将平皿划分为四个区域，每个区域即 为一个稀释度，并在此区域内加入同一稀释度的菌液1 0 此，加三次，经培养后 取其平均值即可确定菌落数。 1 4 酶联免疫方法的概述 e l i s a 法也称作酶联免疫吸附试验法，是7 0 年代初由v a nw e e m a n ， s c h u r r s 、e n g v a l l 、p e r l m a n 等相继提出的。其基本原理是在一定的载体上，酶 标记抗原或抗体与对应的抗体或抗原形成具有免疫活性的酶结合物，通过酶底 物的作用，可以发生颜色反应使酶催化底物进行水解，并通过颜色的深浅来判 断样品中相应抗原或抗体的含量。最后，用e l i s a 检测仪进行定量测定。常见 e l i s a 方法有三种，分别是竞争法、间接法和双抗夹心法。用于抗原抗体的测 定。 竞争e l i s a 法常用于检n d , 分子抗原或半抗原。其原理是标本中的抗原和 一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合。该方法可分为直接竞争e l i s a 法和间 接竞争e l i s a 法，前者根据标本中抗原量含量愈多，结合在固相上的酶标抗原 愈少从而导致显色愈浅的原理进行操作。例如，对小分子激素、药物等e l i s a 测 定多用此法。后者则根据将标本与抗体一起加入到固相抗原中进行竞争结合， 洗涤后再加入酶标抗抗体的原理进行。 一般情况下，间接e l i s a 法适用于检测抗体，如丙型肝炎病毒抗体、梅毒 螺旋体抗体以及人免疫缺陷病毒抗体等。该方法测定的抗体仅仅是抗体的i g g 第一章前言 类，对i g m 以及i g a 类的检测并没有涉及，并且容易因受到样品中多种物质的 干扰而导致假阳性反应。 双抗夹心e l i s a 法是检测大分子抗原常用的方法，适用于多个抗原决定簇 的大分子蛋白