液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察.ppt

液泡系、线粒体的超活染色与观察叶绿体的分离与观察,一、实验目的,1、观察植物活细胞内液泡系的形态、数量、分布及演进过程2、观察线粒体的形态3、学习超活染色技术4、掌握叶绿体的离心方法以及离心机的使用5、观察叶绿体的形态,二、实验原理,活体染色试纸对有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法，它的目的是显示或细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下细胞形态和生理病理状态。活体染色分为体内活染和体外活染，后者又称为超活染色，是指从活的动植物体内分离出细胞或组织，用染料浸染，由于活细胞或组织内的某种结构对染料的选择性固定而着色。活体染料有很多，其中碱性染料最为适用，其中詹纳斯绿B和中性红是两种最重要的活体染料，对线粒体和液泡系的染色各有专一性。,叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液中进行，是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min条件下离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体。在室温下离心要迅速。,三、实验用品,一、材料小麦根尖，黄豆根尖，玉米黄化幼苗，洋葱鳞茎，人口腔黏膜上皮细胞，新鲜菠菜。二、试剂1、Ringer溶液氯化钠0.85g(变温动物用0.65g)氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml,2、1/3000中性红用Ringer溶液配置成1%的中性红溶液（称取中性红适量，加入Ringer溶液，稍加热，约3040度使之溶解，用滤纸过滤），装入棕色瓶中暗处保存。临用前以Ringer溶液稀释至所需浓度。3、1/5000的詹纳斯绿B用Ringer溶液配置成1%的詹纳斯绿B溶液（称取詹纳斯绿B适量，加入Ringer溶液，稍加热，约3040度使之溶解，用滤纸过滤），装入棕色瓶中暗处保存。临用前以Ringer溶液稀释至所需浓度。工作液最好现用现配。,4、0.35mol/LNacl溶液三、器材镊子，培养皿，刀片，载玻片，盖玻片，显微镜，研钵，粗天平，纱布，滴管，量筒，离心管，烧杯，组织捣碎机，普通离心机。,四、实验方法一、液泡系的超活染色与观察1.提前2-3天将小麦和黄豆培养在培养皿内潮湿的滤纸上，使其发芽，胚根长到1cm以上。2.取小麦和黄豆根尖纵切，用1/3000中性红染色5min。3.吸去染液，加一滴Ringer溶液，盖片，轻压。4.观察小麦和黄豆根尖液泡系的分布和特点。,二、线粒体的超活染色取洋葱鳞茎内表皮细胞和人口腔黏膜上皮细胞，用1/5000的詹那斯绿B染色15min(注意不可使染液干燥，必要时可再滴加几滴染液），吸去染液，加一滴Ringer液，盖片观察。,三、叶绿体的分离与观察叶绿体的分离与观察1.选取新鲜菠菜叶，洗净，除去叶脉和粗梗，称取30g于150ml0.35mol/L的Nacl溶液中，组织捣碎35min,匀浆用6层纱布过滤。2.取滤液4ml，在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。3.将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核），用少量0.35mol/L的Nacl溶液悬浮.4.取一滴叶绿体悬液，于普通光学显微镜下观察。菠菜手切片观察取新鲜菠菜叶切削一斜面置载玻片上，滴加1-2滴0.35mol/L的Nacl溶液，盖片后轻压，于普通光学显微镜下观察。,实验预期结果：,思考：,1.小麦或黄豆根尖经中性红超活染色，为什么看到生长点的细胞中液泡多，而且染色深，伸长区细胞中液泡数量变少，染色浅？,中性红是一种毒性最低的活体染色剂，是液泡系的专一染色剂，只将液泡系染成红色，在细胞处于生活状态时，细胞质及核不被染搜索色，中性红染色可能与液泡中的蛋白有关.在pH发生变化的条件下，中性红还具有转变颜色的特性：pH7.0-7.2红色；PH7.2-7.6橙色；PH7.6-8.0黄色，PH不同表明液泡中酶原颗粒的成熟度的不同，完全成熟的酶原颗粒为乳白色，不再为中性红着色.根尖细胞中先产生小型的原液泡，而且有很多。原液泡中溶解的溶质浓度高，蛋白质不成熟酸性强且液泡多故呈红色，颜色深.随着细胞的成熟，延长区中央大液泡中蛋白质较成熟，液泡逐渐增大所以颜色变浅且液泡相互融合，液泡数量变少。,2、分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置2h后再染色，比较两者着色的差异。,线粒体不会亮得那么明显.因为詹纳斯绿B染色,利用的是氧化线粒体,使得线粒体的能量表现出来。使得化学能转化成光能,让你