（发酵工程专业论文）生姜蛋白酶的研究.pdf

摘要 摘要 生姜蛋白酶是一种有待开发利用的新的植物蛋白酶，本文对生姜蛋白酶酶活的测定 方法、生姜蛋白酶粗酶的制备、生姜蛋白酶的稳定性及其应用进行了研究。 确定了生姜蛋白酶酶活测定方法。在酪蛋白溶液浓度为l ，反应温度为5 0 ，柠 檬酸一磷酸氢二钠缓冲液( p h 6 o ) 浓度为0 0 5 m o l l 的条件下准确反应4 m i n ，加2 m l 三 氯乙酸( 0 4 t o o l l ) 终止反应；用紫外分光光度法测定产物酪氨酸的含量。本方法 r s d = i 3 9 7 ，重复性好，可以作为生姜蛋白酶酶活的检测方法。 研究了生姜蛋白酶粗酶的提取方法，确定提取工艺为：生姜：p h 7 0 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾缓冲液( o 1 m o l l ) = 1 ：4 ，用豆浆机打成浆，在4 下放置l h ，抽滤，弃杂 质，所得清液即是生姜蛋白酶的抽提液；向抽提液中缓慢加入1 7 倍( v v ) 9 5 的工业酒 精沉淀酶蛋白，抽滤干燥后所得沉淀即为粗酶。其比活力达到1 5 5 3 6 u m g 蛋白。 研究了生姜的储存温度和方式、酶的储存温度、金属离子、巯基试剂、螯合剂、抗 氧化剂对生姜蛋白酶稳定性的影响。发现生姜在2 0 下冷冻储存6 3 d ，生姜蛋白酶的酶 活没有损失，浆状储存方式优于块状储存方式；温度对生姜蛋白酶的影响较大，生姜蛋 白酶在2 0 下保存1 4 d 没有酶活损失，而在4 与室温下分别于1 4 d 和6 d 全部失活。 c u 2 + 、2 r n 2 + 、m 矿对生姜蛋白酶的酶活具有抑制作用，抑制能力c u 2 + m d + z n 2 + ，n 矿、 m n 2 + 、c a 2 + 对生姜蛋白酶的酶活影响不大，f e e + 具有激活生姜蛋白酶的作用，较空白( 未 添加f e 2 + ) 提高了9 8 2 倍；巯基试剂对生姜蛋白酶的激活效果为半胱氨酸 巯基乙 醇 d t t 。1 0 m m o l l 的e d t a 能够使生姜蛋白酶的酶活提高1 2 6 2 。抗氧化剂异抗坏 血酸钠对生姜蛋白酶酶活具有抑制作用。 考察了生姜蛋白酶在啤酒、黄酒生产中的应用。在啤酒糖化的应用研究中，确定了 生姜蛋白酶最佳添加阶段为糖化温度升至6 3 时；当生姜蛋白酶添加量为1 0 5 9 8 u k g 原料时，辅料量为4 0 的麦汁中a 氨基氮含量为1 8 1 4 6 m g l ，基本满足酵母生长和代谢 的需求。在啤酒澄清应用的研究中，发现当生姜蛋白酶的添加量为1 3 2 u l 时，在o 保存1 0 d ，其澄清度提高了2 1 4 3 ，而啤酒的色度则降低了1 7 8 3 。在黄酒澄清应用 的研究中，发现当添加量为1 3 2 u l ，作用时间为1 h 时，黄酒的澄清度提高了5 2 6 。 关键词：生姜蛋白酶；酶活测定；提取；稳定性；应用 a b s t r a c t a b s t r a c t g i n g e rp r o t e a s ei san e wp l a n tp r o t e a s e t h em e a s u r e m e mo fe n z y m ea c t i v i t y , t h e e x t r a c t i o nm e t h o do fc r u d eg i n g e rp r o t e a s e ，t h es t a b i l i t ya n dt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s e w e r es t u d i e di nt h i sp a p e r t h em e a s u r e m e n to fe n z y m ea c t i v i t yo fp r o t e a s ef r o mg i n g e rr h i z o m ew e r ei n v e s t i g a t e d e n z y m ea c t i v i t yw a sa s s a y e du s i n gc a s e i n ( 1 i n0 0 5 m o l lc i t r i ca c i d - - d i s o d i u mh y d r o g e n p h o s p h a t eb u f f e r , p h 6 0 ) a t5 0 。cf o r4 m i n t h ee n z y m ec a t a l y t i cr e a c t i o nw a ss t o p p e db y a d d i t i o no f2 m lt r i c h l o r o a c e t i ca c i d ( t c a ) ( 0 4 m o l l ) ，t h ep r o d u c tt y r o s i n ew a sa s s a y e du s i n g t h eu vt h er s di s1 3 9 7 ，s ot h em e t h o dh a sab e t t e rr e p e a t a b i l i t y , i tc a nb eu s e di nt h e m e a s u r e m e mo fg i n g e rp r o t e a s ea c t i v i t y t h ee x t r a c t i o nm e t h o do fc r u d eg i n g e rp r o t e a s ew a ss t u d i e d ，a n dt h ee x t r a c t i o nt e c h n o l o g y w a sd e t e r m i n e d f r e s hd i c e dg i n g e rw a sh o m o g e n i z e dw i t h4p a r t ( w v ) c o l db u f f e r t h e m i x t u r ew a sp l a c e da t4 cf o rl hb e f o r ef i l t r a t e d ，a d d i n g1 7 t i m e s ( v v ) i n d u s t r i a la l c o h o l ( 9 5 ) t ot h ef i l t r a t es l o w l y t h ec r u d ee 1 1 z y m ew a so b t a i n e da f t e rf i l t r a t e da n dd r i e d t h ea c t i v i t yo f t h ec r u d ee n z y m ec a nr e a c ht o4 8 1 6 2 u gd r yg i n g e r t h r o u g hr e s e a r c ho ns t a b i l i t yo fg i n g e rp r o t e a s e ，i tw a sf o u n dt h a tt h ep r o t e a s ei ng i n g e r h a dn oi n a c t i v a t i o nw h e nt h eg i n g e rw a sp r e s e r v e da t - 2 0 。cf o r6 3 d ，a n da l s of o u n dt h a t p u l p o u ss t a g ew a s ab e t t e rs t o r a g em e t h o dt h a nm a s s i v es t a g e t e m p e r a t u r eh a ds i g n i f i c a n t e f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，c r u d eg i n g e rp r o t e a s eh a dn oa c t i v i t yl o s sa t 一2 04 cf o r1 4 d ，a n d m a d e r a p i di n a c t i v a t i o na t4 ca n dr o o mt e m p e r a t u r e c u 2 + 、z n 2 + 、m 9 2 + h a da ni n h i b i t o r y e f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，i n h i b i t i n ga b i l i t yw a si ns e q u e n c eo fc u e + m 9 2 + z n 2 + n a 、m n 2 + 、 c a 2 + h a dn oe f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e f e 2 十h a dt h ea c t i v a t i o ne f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，t h e p r o t e a s ea c t i v i t yh a da n i n c r e a s eo f9 8 2 t i m e st h a nt h eb l a n k s u l f h y d r y lr e a g e n t sh a dt h e a c t i v a t i o ne f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e ，a c t i v i t i o na b i l i t yw a si ns e q u e n c eo fc y s t e i n e 爹 m e r c a p t o e t h a n o l d t t e d t ac a ni n c r e a s e1 2 6 2 o f t h ea c t i v i t yt h a nt h eb l a n k s o d i u m e r y t h o r b a t eh a dt h ei n h i b i t o r ye f f e c to ng i n g e rp r o t e a s e t h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei nb e e ra n d y e l l o wr i c ew i n ep r o d u c t i o nw a ss t u d i e d t h r o u g hr e s e a r c ho nt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei nb e e rs a c c h a r i f i c a t i o n ，i tw a sf o u n d t h a tt h eg i n g e rp r o t e a s ec o u l db ea d d e dw h e nt h es a c c h a r i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ew a s6 3 a n d w h e nt h ea d d i t i o ni s10 5 9 8 u k gm a t e r i a l ，t h ec o n t e n to fa - a m i n on i t r o g e nc a nr e a c ht o 181 4 6 m g l ，w h i c hc o u l dm e e tt h en e e do f y e a s t sg r o w t ha n dm e m b o l i s m t h r o u g hr e s e a r c h o nt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei nb e e rc l a r i f i c a t i o n ，i tw a sp r o v e dt h a tt h ec l a r i f i c a t i o n o f b e e rc a ni n c r e a s e 21 4 3 a n dt h eb e e rc o l o rc a nd e c r e a s e17 8 3 w h e nt h ea d d i t i o no f g i n g e rp r o t e a s ew a s1 3 2 u l t h r o u g hr e s e a r c ho nt h ea p p l i c a t i o no fg i n g e rp r o t e a s ei ny e l l o w r i c ew i n ec l a r i f i c a t i o n ，i tw a sp r o v e dt h a tt h ec l a r i f i c a t i o no fy e l l o wr i c ew i n ec a ni n c r e a s e 5 6 2 w h e nt h ea d d i t i o no fg i n g e rp r o t e a s ew a s1 3 2 u la n dt h er e a c t i o nt i m ew a slh k e y w o r d ：g i n g e rp r o t e a s e ；e n z y m ea c t i v i t ya s s a y ；e x t r a c t i o n ；s t a b i l i t y ；a p p l i c a t i o n i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 宗畸 日 期： 渺7 ? 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件扣磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 荣肖 导师签名： e l 期： 删8 f ( 第一章绪论 1 1 生姜的简介 第一章绪论 姜( z i n g i b e ro f f i c i n a l er o s c o e ) ，别名生姜、干姜、姜皮。为多年生宿根草本【l 】， 根茎肉质，肥厚，扁平，有芳香和辛辣味。原产亚洲亚热带，1 3 世纪传入非洲， 中、南美洲也有引种。我国是生姜的原产地，在我国中部、东南部至西南部各省 区广为栽培。 姜是人们日常生活中不可缺少的调味品。在我国，食姜已经有3 0 0 0 年的历史。本 经载，生姜主治伤寒、头痛，鼻塞、咳逆上气，止呕吐。伤寒论1 1 3 方中5 9 方有姜，以姜命名的有1 1 方。生姜挥发油【2 】有止泻、驱风、解热、健胃和治疗坏 血病等作用，外用可治风湿和肌肉疼痛。姜醇 3 ( g i n g e r 0 1 ) 矛1 姜烯酚( s h o g a 0 1 ) 有抗肝 毒药效，6 一姜烯酚的止咳作用不亚于双氢可代因磷酸酯。姜辣素进入人体后，能 产生一种抗氧化酶，它有很强的对付氧自由基的能力【4 】，比维生素e 还要强得多。 1 2 生姜蛋白酶的简介 生姜蛋白酶是继木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等之后发现的一种新的植物蛋白酶，它 在结构和性质上与上述蛋白酶有很大的同源性，被认为是木瓜蛋白酶家族的又一新成员 【6 】 1 2 1 生姜蛋白酶的研究历史 1 9 6 8 年，m i c h i 等人首先报道了生姜蛋白酶。1 9 7 3 年，t h o m p s o n t 5 】等人从生姜根 茎中提取了生姜蛋白酶，并命名为z i n g i b a i n ，并指出它具有较高的最适温度( 6 0 ) 等特 性，因此有较好的应用前景。同年，i c k i k a w a 和r o s h i e 等 6 1 人用d e a e 一纤维素柱层析 对该酶进行了纯化，证明该酶是由两个组分( g p - 一1 、g p _ 之) 构成的，除电泳迁移率外， 两个组分在其他方面基本相同；用s e p h a d e xg 一1 0 0 测得两个组分的分子量均为2 2 5 0 0 ， 该酶结晶为六面体。1 9 7 8 年，o h t s u k i 、k o z o 等【7 j 人用卜1 0 0 生物胶过滤对该酶进行纯 化，得出该酶分子量为2 9 0 0 0 。19 9 5 年，o h t s u k i 8 】发表论文，报道了用d e a e - - s e p h a r o s e 和s e p h a d e xg 一7 5 纯化生姜蛋白酶之后，用等电聚焦电泳可将该酶分为三个组分，并 用s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳和t s k g 2 0 0 0 s w 凝胶过滤再次证明该酶分子量为2 9 0 0 0 。 同年，赵帜平桫j 等以安徽舒城的生姜为原料，采用d e a b 一纤维素d e 一5 2 和s e p h a d e x g 一7 5 纯化得两个组分，用苯酚硫酸法鉴定均为糖蛋白，并证明糖肽键型均为非o 型。 1 9 9 9 年，k y u n g i i o 等利用x 射线晶体衍射法研究了生姜蛋白酶2 1 a 精确度下的 晶体结构。发表了以下重要研究成果：( 1 ) 生姜蛋白酶一i i 是一个含有2 2 1 个氨基 酸残基的糖蛋白，在a s n 9 9 和a s n l5 6 上有两条n 型寡糖链，糖基含量占8 ，并 阐明了寡糖残基的组成及连接方式。( 2 ) 生姜蛋白酶一i i 总体结构类似于生姜蛋白 酶等其他植物巯基蛋白酶，肽链折叠成两个独立的大小差不多的结构域，两者之 望壹查堂堡主堂垡笙茎 间有一道裂隙，活性中心就位于裂隙中。( 3 ) d t t 对该酶有强烈的激活作用。( 4 ) 结 晶为四聚体，阐明了单体间的连接方式。2 0 0 2 年，代景泉【1 1 1 以莱芜生姜为原料，用 硫酸铵沉淀法对生姜蛋白酶进行粗提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质，并用 d e a e 一纤维素d e 一5 2 对该酶进行纯化，将该酶分为两个组分。 1 2 2 生姜蛋白酶的检测方法 为研究生姜蛋白酶，建立快速准确的生姜蛋白酶酶活测定方法非常有必要。但目前， 国内外还没有统一的生姜蛋白酶酶活测定的方法。 生姜蛋白酶酶活测定，一般分两个步骤：( 1 ) 酶与底物的酶促反应；( 2 ) 酶促反应后 试样中残余底物或酶解产物的测定，并据此计算酶活。 关于酶粗提物与底物的酶促反应这一步骤，张平平等【1 3 】以1 5 j 酪蛋白为底物，在 4 0 ，p h 6 0 的条件下反应1 0 m i n 后测定反应产物酪氨酸的含量。蔡海燕等【1 4 】以2 牛 血清白蛋白为底物，在6 0 。c ，p h 6 0 的条件下反应1 5 m i n 后测定底物牛血清蛋白含量。 p i t a y aa d u l y a t h a m 等【l5 j 以2 偶氮酪蛋白为底物，在3 8 。c ，p h 8 0 的条件下反应3 0 m i n 后 测定酪氨酸的含量。可见由于不同研究者所设立的生姜蛋白酶酶促反应条件不尽相同， 很难比较其效果。 关于酶促反应后试样中残余底物或酶解产物的测定，唐晓珍、蔡海燕等【1 4 , 1 6 】学者通 过考马斯亮蓝法测定底物蛋白( 酪蛋白或牛血清) 含量的变化。测定酶促反应后残余的蛋 白，试剂配制困难，操作复杂，重复性较差。郝贵霞、张平平等【1 2 , 1 3 】通过茚三酮或者是 f o l i n - 酚对产物酪氨酸进行染色，然后分别测定5 4 5 n m 和6 6 0 n m 下吸光值来测定酪氨酸 的含量。这一方法可以去除核酸以及杂蛋白对酪氨酸含量测定的影响，但是操作复杂， 不符合快速测定的要求。k o z oo h t s u k i 等【8 】直接测定酶促反应产物酪氨酸的紫外吸收来 测定酪氨酸的含量。这种测定方法简便、灵敏，可以较为快速地测定生姜蛋白酶的酶活。 鉴于目前生姜蛋白酶酶活测定方法尚不统一，有必要对酶促反应条件开展相关研 究，建立一种简便的测定方法。 1 2 3 生姜蛋白酶的提取方法 酶的提取方法有很多种，而有效的提取过程需要综合运用多种方法。为了最大限度 的提高酶的产量，将人力、材料和设备的成本降低到最低程度，酶的提取步骤应该尽量 简单。分离步骤越多，酶的收率越低，材料及动力消耗越多，成本也越高。在符合质量 的前提下，应尽可能的采取简单的提纯方法。 目前工业上广泛采用的酶的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类。 ( 1 ) 沉淀法 沉淀法是比较传统的分离纯化蛋白质的方法，目前仍在实验室内广泛使用，是提取 生姜蛋白酶的主要方法。该法所需设备简单、操作方便，在生姜蛋白酶纯化的初期，可 以迅速减少样品体积，起到浓缩的作用，便于后续的纯化，降低纯化成本；还可以尽快 将目的酶与杂质分开，提高其稳定性；通过该方法，生姜蛋白酶的收率比较高。沉淀法 2 第一章绪论 大都需要首先制备丙酮粉，以丙酮粉作为酶的来源，其制作方法为【1 3 】：将黄姜洗净、切 碎，加上5 倍( w v ) 在2 0 下预冷的丙酮，用组织捣碎机捣碎，放入布氏漏斗抽滤，再 用适量的冷丙酮抽滤洗涤3 次，将丙酮粉放入通风橱中干燥至无丙酮气味，然后用筛子 筛去粗纤维之类，装入塑料袋中真空密封，放入2 0 下冰箱中存放备用。 通常采用的沉淀剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。 目前国内研究中采用较多的沉淀法按所用沉淀剂的不同分为3 种。 有机溶剂沉淀法：张平平在制取丙酮粉后，用丙酮沉淀生姜蛋白酶，其工艺为【1 3 】： 取丙酮粉，用p h 5 、6 的缓冲液溶解，离心后取上清液，加入1 2 倍体积的丙酮，再离 心取沉淀，冷冻干燥。唐晓珍i l7 j 则直接用无水乙醇从姜汁中沉淀生姜蛋白酶，其工艺为： 用无水乙醇( - 2 0 。c ) 与姜汁配成6 0 的乙醇姜汁溶液混匀后，4 放置3 0 m i n ，。离心取 沉淀，真空中除去乙醇并冷冻干燥，即得粗酶粉。 硫酸铵沉淀法：张平平【1 3 】通过实验确定了如下提取工艺：取经丙酮沉淀获得的粗酶 粉，加入固体硫酸铵至4 0 饱和度，离心后取上清液，加入硫酸铵至6 0 0 0 的饱和度，再 离心取沉淀，透析除盐即可获得生姜蛋白酶。而代景泉【墙】确定的工艺则与之略有不同： 取丙酮粉用2 0 倍( w v ) 0 1 m o l l ，p h 8 0 的磷酸缓冲液提取，上清液加硫酸铵至4 0 饱和 度，其间控制p h 7 0 ，离心弃去沉淀，上清液继续添加硫酸铵至8 0 饱和度，离心取 沉淀，透析除盐后冷冻干燥即可。 单宁沉淀法：唐晓珍【1 6 j 用单宁沉淀法提取生姜蛋白酶，其方法为：取丙酮粉，用 p h6 0 的缓冲液溶解并浸提3 5 m i n ，然后离心，于上清液中加入单宁至0 1 2 的浓度， 离心取沉淀，冷冻干燥即可。 ( 2 ) 超滤法 2 0 0 1 年，唐晓珍【1 9 , 3 7 】首先报道了采用超滤法提取生姜蛋白酶，基本工艺如下：生姜 洗净切碎一榨汁一离心除去淀粉抽滤一超滤取浓汁一真空冷冻干燥保存。唐晓 珍通过实验得出结论：操作压力为0 0 6 m p a 时，酶活力和膜通量最好；膜通量随操作温 度、姜汁流速的提高而增加，随姜汁浓度、操作时间的增加而降低。 沉淀法仍是当今工业中常用的酶提取方法，用沉淀法提取生姜蛋白酶，步骤较为简 单，有利于减小提取时间对酶活造成的损失。但制备丙酮粉操作繁琐，消耗大量丙酮， 成本高，效率低；各种沉淀剂对生姜蛋白酶的酶活也会造成损失。超滤法所有操作均在 常温下进行，特别适用于对热敏感物质的处理，且无需任何化学试剂，具有操作简单， 效率高，成本低，无污染的优点。超滤法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制剂。 对于蛋白质溶液，一般只能得到1 0 - 5 0 的蛋白浓度，如果将超滤所得的浓汁直接进行 冷冻干燥，需耗费大量能量，采用其它方法对浓汁进行浓缩处理，也增加了成本与工作 量，不利于生姜蛋白酶的快速提取。另外，浓差极化现象也是超滤技术急需解决的重 要课题之一。 如何用最简便的提取方法来最大限度的提高酶的产量对于生姜蛋白酶的广泛的应 用具有重要的意义。 3 江南火学硕士学位论文 1 2 4 生姜蛋白酶的酶学性质 由于不同的学者在提取生姜蛋白酶时采用的生姜品种不同，提取纯化方法不同，纯 化的程度不同，因此对生姜蛋白酶酶学性质的研究也没有形成一致的结论。 张平平【l3 】等研究得到生姜蛋白酶的主要酶学性质是：以酪蛋白为底物时，其最适作 用p h 值为6 0 ，与郝桂霞报导的一致；最适温度为6 0 。c ；3 0 下保温3 0m i n ，酶活力 不变；高于7 2 酶活力迅速下降，与郝柱霞报导的在9 0 。c 仍有较高的活性不一致。温 度升高，半衰期显著减短，在6 0 、7 0 、8 0 时，该酶的半衰期分别为1 7 m i n 、1 2 m i n 和3 m i n 。d t t 、e d t a 对酶具有激活作用；对氯汞苯甲酸、氯化锌、硫酸铜等对酶有抑 制作用；氯化钙、硫酸镁、三氯化铝对酶活影响不大。张平平等还研究了几种食品试剂 对酶活力的影响，发现亚硫酸氢钠、氯化钠对酶活力有抑制作用，蔗糖对酶活力有促进 作用。a d u l y a t h a m 1 5 j 研究表明，生姜蛋白酶在5 存放4 d ，其活力损失8 0 。粗酶的半 衰期从5 。c 的2 4 - 0 1 6 d 降至3 0 的1 7 m i n 。0 2 ( w v ) 的v c 能使其稳定，在5 。c 存放1 4 d 酶活力没有损失。在6 0 时，生姜蛋白酶的半衰期是2 3 m i n ，添加o 2 ( w v ) v c 后变 成2 4 m i n 。当温度低于5 0 时，生姜蛋白酶完全可以被v c 稳定。 1 2 5 生姜蛋白酶的应用 生姜蛋白酶在食品加工中的主要应用是肉类嫩化，果蔬汁、啤酒、葡萄酒的澄清， 动、植物蛋白的分解，焙烤食品中面团调节剂，乳制品凝固剂，化妆品添加剂等。 ( 1 ) 生姜蛋白酶在肉类嫩化中的应用 2 0 - 2 2 生姜蛋白酶是一种巯基醇蛋白酶，可分解胶原蛋白和肌动球蛋白，从而使肉嫩化， 且对胶原蛋白的分解能力要比对肌动球蛋白的分解能力高出好几倍。该酶可降解肌原纤 维，导致肌原纤维的断裂从而提高肉类的嫩度。专家们通过采用生姜蛋白酶作用于鸡肉、 牛肉、猪肉等，证明了生姜蛋白酶对肉的嫩化作用。有专家通过对酶的用量、p h 、处理 温度、处理时间的测试，确定生姜蛋白酶对牛肉嫩化的最佳工艺条件是：酶用量为0 0 6 ， p h 为7 o ，处理温度为5 0 ，处理时间为2 h ；可使牛肉嫩度达到最佳使用状态，颜色 较好，柔嫩多汁且具有良好的弹性。还有专家研究生姜蛋白酶和生姜汁对猪肉的嫩化效 果，通过测定猪肉的最大剪切力，得到的生姜蛋白酶和生姜汁对猪肉的嫩化效果都非常 显著，生姜蛋白酶的最佳用量为0 0 1 ，最佳p h 为7 o ，最佳预处理温度为3 0 ；生 姜汁对肉嫩化的作用是生姜汁中生姜蛋白酶的作用结果。 ( 2 ) 生姜蛋白酶在酒类澄清中的应用 2 3 2 5 】 唐晓珍研究表明，生姜蛋白酶能将酒中的大分子蛋白质分解为小分子多肽、氨基酸 等，从而显著提高啤酒和红葡萄酒的澄清度。对红葡萄酒的最适加入量为0 0 5 m g l ，最 佳预处理温度为2 0 3 0 。对啤酒的最适加入量为5 m g l ，最佳预处理温度为6 0 。在 酶制剂的用量上，生姜蛋白酶的用量远远小于木瓜蛋白酶的用量，具有更高的商业价值。 唐晓珍所提出的啤酒的最佳预处理温度为6 0 这一观点与啤酒储存温度相差太大， 4 第一苹绪论 生姜蛋白酶能否在啤酒储存温度下( o ) 提高啤酒的澄清度还有待进一步研究。 p ) 生姜蛋白酶在乳制品中的应用 2 6 - 2 9 】 姜汁具有凝乳的作用，我国传统食品“姜撞奶”采用姜汁作为凝乳剂，其中的凝乳因 子已被证明是生姜蛋白酶。其凝乳的机理现已证明是生姜蛋白酶将乳中酪蛋白胶粒外围 的k c a s e i n 及1 3 - c a s e i n 在c a 2 + 参与下形成网状的凝胶体。采用正交试验得到制作姜汁 凝乳的优选工艺，即姜汁添加量1 0 ，c a c l 2 添加量0 0 5 ，凝乳温度3 0 3 5 ，p h 为5 0 ，得到了口感和风味都较好的产品。生姜蛋白酶的凝乳性质使之有望成为奶酪生 产中小牛皱胃酶的替代品，以缓解日益紧张的小牛皱胃酶供应。 1 2 6 生姜蛋白酶的市场前景及有待研究的问题 ( 1 ) 市场前景 将生姜蛋白酶开发为成熟的酒类澄清剂、牛奶凝乳剂、肉质嫩化剂等新型环保安全 的食品添加剂，势必为生姜深加工带来良好的经济效益和社会效益。生姜蛋白酶与木瓜 蛋白酶既属“同族”，应具有木瓜蛋白酶的作用，因此我们可以考虑将其代替木瓜蛋白酶 应用在各种领域，拓宽应用范围，提高价值。总之，生姜蛋白酶在工业上有广阔的应用 前景。 ( 2 ) 有待研究的问题 就目前来看，对于生姜蛋白酶的研究进展并不快，一些作用机理还存在争议，工业 化生产程度还不够。 ( 1 ) 需建立一种简便、有效、统一的酶活测定方法 目前不同学者所用的生姜蛋白酶检测方法各不相同，无法对生姜蛋白酶的研究结果 进行比较和系统的总结，因此建立一种简便、有效、统一的酶活测定方法是极其必要的。 ( 2 ) 急需工业化提取生姜蛋白酶的工艺技术 虽然人们已经试验利用硫酸铵、丙酮、聚丙烯酰胺凝胶、葡聚糖凝胶、d e a e 一纤 维素、d e a e _ 一琼脂糖、电泳等层析、分离技术对生姜蛋白酶进行了分离纯化研究。但 这些技术方法存在成本高、产量低，操作繁琐等缺点，不适于工业化生产。要大规模的 利用生姜蛋白酶，应在简化生姜蛋白酶的工业化提取方法、降低提取成本等方面进行研 究。 ( 3 ) 生姜蛋白酶在酒类澄清、麦汁制备等方面的应用有待进一步研究 国内外有对木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶在酒类澄清方面的研究和报道， 生姜蛋白酶对酒类澄清方面的应用研究较少，并且主要是对啤酒与葡萄酒的研究，+ 生姜 蛋白酶在黄酒澄清中的应用研究目前尚未有报道。 在麦芽糖化过程中加入生姜蛋白酶，能否有效地解决因麦芽溶解不好或辅料量大 ( 如超过4 0 ) 时麦汁瞒基氮含量的不足的问题也有待进一步研究。 ( 4 ) 生姜蛋白酶的稳定性有待进一步的研究 由于温度、金属离子、抗氧化剂、激活剂等因素对生姜蛋白酶稳定性的影响很大， 5 江南大学硕士学位论文 限制其在工业上推广应用，如何避免上述因素对生姜蛋白酶酶活的影响，提高生姜蛋白 酶的稳定性还需要进一步研究。 本研究的目的就是探讨解决上述问题的方法。这些问题的解决，对于稳定生姜种植 面积，保证生姜产业持续高效发展，扩大生姜资源的利用途径，调节农业产业结构均具 有重要意义。可以改变长期以来我国植物蛋白酶资源长期以来主要依赖于木瓜、菠萝等 少数热带水果资源的现状。对于进一步丰富生姜蛋白酶的酶学性质和以生姜为原料开发 新型的营养、保健制品均具有积极的作用或指导意义。 1 3 主要研究内容 1 生姜蛋白酶检测方法的研究 2 生姜蛋白酶提取的初步研究 3 生姜蛋白酶稳定性的研究 4 生姜蛋白酶应用的初步研究 6 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 实验仪器 第二章材料与方法 7 5 2 n 型紫外可见光分光光度计 d k z - 2 型水浴锅 s h b - 1 1 1 型循环水式多用真空泵 生姜研碎用豆浆机 垂直板电泳仪 u v p 凝胶成像系统 3 2 0 - sp h 计 m a 4 0 快速水分测定仪 2 1 2 实验试剂与原料 上海精研 上海福玛实验设备有限公司 上海预康科教仪器设备有限公司 市售 北京六一厂 英国u v p 公司 m e t t l e rt o l e d o 公司 s a r t o r i u s 公司 酪蛋白，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，三氯乙酸，柠檬酸，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾， 氢氧化钠，酪氨酸，靠马斯亮蓝g 2 5 0 ，茚三酮，碘酸钾，甘氨酸，硫酸锰，硫酸锌， 硫酸亚铁，硫酸镁，e d t a ，异抗坏血酸钠，巯基乙醇，d t t ，半胱氨酸。以上试剂均 为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；大麦芽、生姜，市售。 2 2 方法 2 2 1 生姜蛋白酶酶粉的制备方法 生姜：p h 7 0 磷酸氢二钠磷酸二氢钾缓冲液( 0 1 m o v l ) = 1 ：4 ，用豆浆机打成浆， 在4 。c 下放置1 h ，使缓冲液充分提取生姜中的蛋白酶，抽滤，弃杂质，所得清液即是生 姜蛋白酶的抽提液。向抽提液中缓慢加入1 7 倍( v v ) 的工业酒精( 9 5 ) 沉淀酶蛋白，抽滤 干燥后所得沉淀即为粗酶。 2 2 2 酶活测定方法 生姜蛋白酶活力的定义：在5 0 。c 、p h 6 0 条件下，每分钟水解酪蛋白产生l l , t g 酪氨 酸，定义为1 个蛋白酶活力单位。 本论文最终确定的酶活测定的基本方法：取试管3 支，编号1 、2 、3 ，每管内加入 1 酪蛋白l m l ，置于5 0 c 水浴中预热2 m i n ，再加入经同样预热的酶液l m l ( 酪蛋白溶 液与酶液均以0 0 5 m o l lp h 6 0 的柠檬酸- 磷酸氢二钠缓冲液配制) ，精确保温反应4 m i n 7 垩堕盔兰婴主堂篁丝奎 后，立即在每管中加入0 4 m o l l 三氯乙酸2 m l ，以终止反应，待残余蛋白质沉淀后过 滤，滤液在2 7 5 n m 下测定吸光度值。 空白试验也取试管3 支，编号( 1 ) 、( 2 ) 、( 3 ) ，测定方法同上，唯在反应之前要先加 0 4 m o l l 三氯乙酸2 m l ，使酶失活。 样品的平均o d 值减去空白的平均o d 值得到净o d 值。 由酪氨酸标准曲线，查找净o d 值所对应的酪氨酸的含量，按以下公式计算酶的比 活力( u m g 蛋白) ： 生姜蛋白酶比酶活( u m g 蛋白) = 半罴 式中：a 一测得o d 值后，查标准曲线所得的酪氨酸的含量( p g m l ) ； t 一酶促反应时间，定为4 m i n ； v 一反应液的体积，4 m l ； b 一测得o d 值后，查标准曲线所得的蛋白含量( 肛咖l ) ； v 一酶促反应所用酶液的体积，为l m l ； 1 0 0 0 1 0 0 0 1 x g m g 为便于研究生姜蛋白酶的提取效果，也有必要计算每克干姜含有的酶活力( u g - - 干姜) 。 计算公式如下： 每克干姜含有的酶活力( u 儋干姜) = 垒罟n 壬l _ 式中：a 一测得o d 值后，查标准曲线所得的酪氨酸的含量( f g m l ) ； t 一酶促反应时间，定为4 m i n ； v 一反应液的体积，4 m l ； w 一生姜水份百分含量( ) n 一稀释倍数( 1 儋) ；计算公式： 、。稀释湿酶粉所用缓冲液的体积得到的湿酶粉的质量 酶促反应所用酶液的体积所用湿酶粉的质量 0 8 0 0 0 7 o 6 0 0 j 型0 5 0 0 趟0 4 0 0 玉。o o 0 2 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 2 0 4 06 08 01 0 01 2 0 酪氨酸含量( b tg m l ) 图2 1 酪氨酸的标准曲线 f i g 2 - 1s t a n d a r dc u r v eo ft y r o s i n e 8 第二章材料与方法 2 2 3 检验酶活测定方法精密度的试验方法 。由2 2 1 所述方法制备酶粉，按照2 2 2 所述的酶活测定方法平行测定5 次酶活，计 算标准偏差s 和r s d 值，考察所确定酶活测定方法的精密度。 2 2 4 蛋白质含量测定方法 考马斯亮蓝法 3 0 l 。标准曲线见图2 2 。 o2 04 06 08 01 牛血清蛋白浓度( 1 ig m e ) 图2 2 牛血清蛋白标准曲线 f i g 2 2s t a n d a r dc u r v eo fb o v i n es e r u ma l b u m i n 2 2 5s d s p a g e 电泳方法 见文献【3 1 】。 2 2 6 酶稳定性的研究方法 ( 1 ) 生姜储存时间与储存方式对生姜蛋白酶稳定性影响的研究方法 将生姜洗净，切碎，打成浆，2 0 9 每份分装，置于- 2 0 。c 冰箱中保存。将生姜切成块， 2 0 9 每份分装后置于- 2 0 。c 冰箱中保存。每隔7 d 测定一次酶活，考察储存时间及储存方 式对生姜蛋白酶酶活的影响。酶提取方法及酶活检测方法按2 2 1 和2 2 2 所述。 ( 2 ) 温度对生姜蛋白酶稳定性影响的研究方法 将酶粉存放在室温、4 。c 、2 0 下，每隔2 d 测定一次酶活，考察储存温度对生姜 蛋白酶酶活的影响。 ( 3 ) 金属离子对生姜蛋白酶稳定性影响的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入m n s 0 4 h 2 0 ( f e s 0 4 7 h 2 0 、c a c l 、m g s 0 4 、z n 7 h 2 0 、 n a 2 s 0 4 ) ，使m n 2 + ( f e 2 + 、c a + 、m 9 2 十、z n z + 、n a + ) 浓度分别为o 、o 5 、1 、2 、5 m m o l l ， 混匀后按2 2 2 所述测定酶活，并计算抑制百分率。 9 咖 啪 鲫 珊 瑚 咖 l 0 o 0 o o 趔越装登 垩塑奎兰堡主兰篁笙茎 金属离子对蘸活性的抑制百分率- 魂= 皇壑型丝墅笔蓦鑫篓翥鬟妻掣。 ( 4 ) 巯基试剂对生姜蛋白酶稳定性影响的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入半胱氨酸( 巯基乙醇、d t t ) ，使巯基试剂浓度分别为0 、 1 0 、2 0 、3 0 、4 0 m m o l l ，混匀后按2 2 2 所述测定酶活。 ( 5 ) 螯合剂对生姜蛋白酶酶活影响的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入e d t a ，使e d t a 浓度为0 、1 0 、2 0 、3 0 、4 0 m m o l l ，混 匀后按2 2 2 所述测定酶活。 ( 6 ) 抗氧化剂对生姜蛋白酶稳定性影响的研究方法 在1 酪蛋白溶液中加入异抗坏血酸钠，使异抗坏血酸钠浓度为0 、1 、3 、5 、1 0 、 2 0 m m o l l ，混匀后按2 2 2 所述测定酶活。 2 2 7 生姜蛋白酶应用的实验方法 ( 1 ) 生姜蛋白酶在麦汁制备中添加时间的研究方法 以1 ：5 的料水比，其中辅料大米粉的用量为4 0 ，高温淀粉酶用量为0 2 m l k g 大 米粉，按以下双醪浸出糖化法糖化曲线【3 2 1 制作麦汁，分别在糖化温度为3 7 c 、5 0 。c 、 6 3 c 、7 8 c 时加入粗酶粉，每千克原料中粗酶粉的添加量为2 1 1 9 6 u ，考察生姜蛋白酶 对麦汁中0 【氨基氮含量的影响，确定最佳添加时间。 图2 3 糖化曲线 f i g 2 3m a s h i n gc u r v e ( 2 ) 生姜蛋白酶在麦汁制备中添加量的研究方法 在糖化温度为6 3 。c 时加入粗酶粉，添加量为0 、2 6 5 0 、5 2 9 9 、1 0 5 9 8 、1 5 8 9 7 、 2 1 1 9 6 u k g 原料。按图2 3 所示的糖化曲线制作麦汁，测定麦汁中的o 【氨基氮含量，确 定生姜蛋白酶粗酶粉的添加量。 1 0 墨三重型型皇查鎏 ( 3 ) a 氨基氮含量测定方法 q 一氨基氮含量测定方法采用茚三酮比色法【3 3 1 。 ( 4 ) 生姜蛋白酶在啤酒澄清中应用的实验方法 将主发酵完的啤酒过滤，在其中添加粗酶粉，添加量分别为0 1 3 2 4 9 1 u l ，于0 。c 温度下存放。在第0 、2 、4 、6 、8 、1 0 d 测定啤酒的澄清度、蛋白含量、色度以及其它 感官指标，确定生姜蛋白酶的最佳添加量。 啤酒澄清度的测定方法 2 4 】：用1 0n u l l 比色皿在6 6 0 n m 下测定其透光度。以t 6 6 0 表 示啤酒的澄清度。 蛋白含量测定方法：考马斯亮蓝法。 啤酒色度的测定方法：见g b t4 9 2 8 2 0 0 8 。 s = a 4 3 0 2 5 x n 式中：s 一啤酒的色度，单位为e b c 。 3 0 一试样在波长为4 3 0 n m ，1 0 m m 玻璃比色皿测得的吸光度。 2 5 一换算成标准比色皿的厚度，单位为i i l l n 。 n 一稀释倍数。 ( 5 ) 生姜蛋白酶在黄酒澄清中应用的实验方法 将市售散装黄酒用滤纸过滤，放入5 0 水浴中预热5 m i n ，然后在其中添加粗酶粉， 添加量分别为0 1 3 2 4 9 1 u l ，分别在0 m i n 、1 5 m i n 、3 0 m i n 、l h 、2 h 、3 h 时取样放在4 温度下保存1 d ，然后测定黄酒的澄清度以及黄酒中的蛋白含量，确定生姜蛋白酶的用量 以及作用时间。 黄酒澄清度的测定方法 3 4 】：用1 0i t i i l l 比色杯在8