（环境科学专业论文）水环境中zno纳米颗粒对大肠杆菌的毒性及影响因素.pdf

a b s t r a c t e n 百n e e r e dn a n o p 耐i c l e sh a v eb e e nw i d e l ya p p l i e di nm a n ya r e a l so fi n d u s t i ya n d l i f e t h e ya r ei n c r e a s i n 百yr e l e a s e di n t ot h ee n v i r o l l i l l e n td u r i n gt h e i rp r o d u c t i o n ， t r a n s p o r t a t i o n ， u s ea i l d t i e a t n l e n t ， w h i c hm a y b r i n g u n c e r t a i nr i s kt om e e c o e r i r o m n e n t i nt h i sp a p e r ，t h et o x i c i t i e so fo x i d en a n o p a r t i c l e ss u c h 弱z n o ， t i 0 2 ，a 1 2 0 3 ，锄ds i 0 2t 0 西c j l l e c j i l 砌c d 以幔c d 以) w e r ei n v e s t i g a t e d ，a n dt h e l lm e e f f e c t sa i l du n d 甜y i n gm e c h a n i s m so fw a t e rc h e m i s t r y ，c o e x i s t i n gn 锄o p a n i c l e sa j l d s u 血c t a n t so nt h et o x i c 埘o fz n on a i l o p a n i c l e sw e r ed i s c u s s e d t h em a i nr e s u l t s w e r e 邪f o l l o w s ： ( 1 ) t h et o x i c i t i e sa n dm e c h a n i s m so f o x i d en a j l 叩a n i c l e ss u c ha sz n o ，t i 0 2 ，a 1 2 0 3 ， a n ds i 0 2t oe 矗w e r ee x p l o r e d n a l l o z n os h o w e dt h eh i 曲e s tt o x i c i 饥a n dt h e n n a n o - t i 0 2 ( a n a t a s e ) a n dn a n 0 一a 1 2 0 3 ，a i l dn a i l o s i 0 2a n dn a n o t i 0 2 ( m t i l e ) s h o w e d n ot o x i c i t y t h et o x i c i t yo fn a i l o z n 0w a sm a i n l y6 0 mt h er e l e a s e dz i n ci o n s ，a n dt h e t o x i c i t yo fn a n o t i 0 2 a 1 1 dn a j l o a 1 2 0 3w 嬲r e l a t e dt ot l l ec h e m i c a lo rp h y s i c a l i n t e r a c t i o nb e t w e e nn a n o p a r t i c l e sa i l db a c t e r i a lc e l l s ( 2 ) t 1 1 ei n n u e n c em e c h a n i s m so f w a t e rc h e i n i s t r ) ，o nt h et o x i c i t yo fn a n o - z n ot oe c d 厅w e r ec l a r i f i e d t h et o x i c i t yo fn a n o z n oi nc u l t u r em e d i as h o w e dt h a tm et o x i c i t y m a i n l yd 印e n d e do nt h ec o n c e i l t r a t i o no f 丘e ez i n ci o n s 锄dt h et o l e r a l l ta b i l 时o f b a c t e r i at ot h et o x i c a n t s t h ep 0 4 j - 锄dor g ；疵cc o m p l e x e si n 也em e d i ac o u l d d e c r e a l s em ec o n c 锄t r a t i o no ff - r e ez i i l ci o n s ，锄d 廿l ei s o t o n i c ( 0 8 5 n a c l ，p b s ) 姐d r i c hn u t r i e n tc o n d i t i o n s ( m d ，l b ) c o u l de i l l l 觚c em et o l e r a n c ea b i l i 哆o fb a c t 耐at o t o x i c a n t s ，w h i c hb o t hm i t i g a t e dt h et o x i c i t yo fn a n o z n o t h et o x i c i t yo fw a t e r q u a l i t i e so fn a n o z n ot oec d 厅d e m o n s t i a t i 耐t h a tt l l et o x i c i t ) ro fn a l l o z n od 印e n d e d o nn o to i l l vt h ec o n c e n t r a t i o no f 丘e ez i n ci o n sb u ta l s om ec o n c e n t r a t i o no fc a 2 + o r m 9 2 + t h ei n f l u e n c em e c h a m s mw 硒d i f j 衙e n tf o rv 撕o u sw a t e rq u a l i t i e s i o n i c s t r e n g t h ，p h ，a n i o n s ，a i l dn a 叶a lo r g a i l i cm a t t e r ss u c ha sh u m i ca c i d 锄dm l v i ca c i d c o u l di n f l u e i l c et h et o x i c i t i e st h r o u 曲e 行e c t i n go nm ed i s s o l u t i o no fn a i l o - z n oa i l dt h e c o n c e i l t r a t i o no fn e ez i n ci o i l s c a 2 + o fm 孑+ a l l e v i a t e dt h et o x i c i t yv i ac o m p e t i n g w i mz n 2 + f o rt h et o x i cs i t e so fc e l l s i i i ( 3 ) t h ee 仃e c t so fc o e x i s t i n gn a i l o p a n i c l e sa t l ds u m c t a n t so nt h et o x i c i t yo f n a n o - z n ot 0ec d 矗w e r es t u d i e d n a n o t i 0 2 ( a n a t a s e ) o rn a n o a 1 2 0 3h a dn 0 i n n u e i l c eo nt h et o x i c i t yo fn a l l o - z n o s d b sc o u l dr e d u c em ec o n c e n t r a t i o no f 矗e e z n 2 + ，c a 2 + ，a i l dm 孑+ ，w h i c hi n n u e n c e dt h et o x i c i t yo fn a n o z n o t w e e n8 0h a d l i t t l ei n n u c eo nm ed i s s o l u t i o na n dt o x i c i t yo fn a j l o z n o ，a n ds a p o n i n sc o u l d c o m p l e xw i t hz i n ci o n s ，w h i c hd e c r e a s e dm eb i o a v a i l a b i l i t yo fz i n ci o n s ，a n d 廿l u s d e c r e a s e dm et o x i c i t yo fn a n o z n ot oec d 矗 k e y w o r d s ：o x i d en a i l o p a r t i c l e s ，上西c p ，f 幽缸c d 疗，w a t e rc h e m i s t 叫，t o x i c i t ) r i v 致谢 2 0 0 8 年2 0 1 2 年，我已在这里跨了四年。在这将至四年的时间里，不敢说我 收获颇丰，只能说受益匪浅。感谢我的导师朱利中教授，他的睿智、严谨、对科 学问题敏锐的洞察力、对工作的精益求精、对学生高度的责任心都值得我们敬佩 和学习。感谢朱老师这几年来对我的培养! 本论文的选题、思路都得到了朱老师 精心的指导，每次的实验计划及数据汇报，朱老师都给予了很好的建议。在毕业 论文定稿过程中，朱老师多次精心修改和点拨，使得论文最终顺利完稿。朱老师 不仅教会我们做事，还教会我们做人，他的教导令我一生受益、一生难忘! 另外，要特别感谢林道辉教授! 在我的实验以及论文写作过程中都得到了林 老师精心的指导和帮助。感谢林老师在这几年中对我的鼓励、支持和指导! 感谢课题组陈宝梁、杨坤、周文军、黄益丽等老师对我的指点和帮助! 感谢课题组各位同学在学习和生活中的陪伴，感谢他们对我的实验给予的建 议，感谢他们给予我家庭般的温暖! 感谢家人对我的支持和鼓励! 没有你们，就没有我的今天! 毕业不是结束，而是一个崭新的开始，我希望可以秉承实验室的优良传统， 继续提高和完善自己! 李梅 2 0 1 2 年3 月 写于浙大紫金港 第一章氧化物纳米颗粒对细菌的毒性效应及机理 随着纳米技术的快速发展，人工纳米材料( e n g i n e e r e dn a i l o m a t e r i a l s ) 在各 领域的应用不断呈现，包括电子产品、光学、纺织、医学仪器、化妆品、食品包 装、水处理技术、燃料电池、催化剂、杀菌剂、生物传感器和用于环境修复的试 剂【l 】。近年来，纳米产品数量逐年递增，至2 0 1 1 年3 月1 0 日，已注册的纳米产品 有1 3 1 7 种，应用最广泛的纳米材料为银，其次为碳、钛、硅、锌、金等1 2 1 。据预 测，2 0 1 6 年，全球纳米材料总产量将达到3 3 3 ，0 4 3 吨，市值2 4 亿美元【3 】。纳米材料 的广泛使用使得其以不同途径进入环境( 大气、水体、土壤) ，由于其具有颗粒 小、表面积大的特点，与其他材料相比有更大的表面活性和迁移性能，因此可能 对环境造成一定影响。自2 0 0 3 年s e r v i c e 【4 1 和b 1 1 l m f i e l 【5 】分别在s c i e n c e 和n a t u r e 上就 纳米材料生物效应问题展开探讨开始，人工合成纳米材料的环境生物毒性效应逐 渐成为国际关注的热点问题。美国化学会以及欧洲许多学术杂志纷纷发表文章， 探讨纳米材料对人类以及生态环境引起的风险问题【l ，6 。1 1 1 。以中科院赵字亮等为 首的国内课题组也率先开展了人工纳米材料的生物效应研究【1 2 。6 1 。 目前，人们已发现很多人工纳米材料对哺乳动物【1 7 2 、植物【2 2 2 4 】、藻类2 5 碰】、 甲壳类口7 ，3 3 琊】、鱼类3 2 ，3 6 。9 1 、细菌【3 3 ，4 0 m 1 等都显示出不同程度的毒性效应。细菌 在空气、水体和土壤中大量存在，在自然界物质循环和转化中起着巨大的生物降 解作用，是整个生物圈维持生态平衡不可缺少的、重要的组成部分由于细菌为 单细胞生物，结构简单，整个细胞直接与环境接触，易受环境因素影响，所以与 其他生物相比，纳米材料在环境中的释放对细菌的毒性可能是最显著的。因此， 研究纳米材料对细菌的毒性效应是纳米材料生态风险评估中的重要部分。另外， 了解纳米颗粒对细菌的致毒机理对阐明纳米颗粒的细胞毒性机理以及调控纳米 材料的生产排放都具有指导意义，可以避免给生态环境和生态安全带来潜在危 害。氧化物纳米颗粒在电子、光学、化妆品、燃料电池、催化剂、杀菌剂、环境 修复中都具有广泛应用，其生态毒性受到越来越多的关注。本章首先介绍人工纳 米材料的性质，然后重点综述氧化物纳米颗粒对水环境中细菌的毒性效应、机理 以及影响因素，最后提出目前研究中存在的问题以及本论文的研究思路。 l 纳米材料性质 纳米材料通常指至少在一个维度上尺寸小于1 0 01 1 i i l 的物质。在纳米材料的 定义范围内，纳米颗粒指至少在三个维度上的尺寸在1 1 0 0 姗间的物质【l 】。纳米 材料可以按维度、形态、成分、均匀性和团聚性进行分类。研究论文中通常将纳 米颗粒成分作为分类标准，u s e p a 【4 3 1 将合成纳米材料分为以下四类：( 1 ) 碳基材 料，通常包括富勒烯( c 6 0 ) 、单壁纳米碳管( s c n t s ) 、多壁纳米碳管( m c n t s ) ； ( 2 ) 金属基材料，如量子点、纳米金、纳米锌、纳米铝和纳米尺寸的金属氧化 物如t i 0 2 、z n o 和a 1 2 0 3 ；( 3 ) 树枝状聚合物，是由具有特定化学功能的分支单 元组成的纳米尺寸的聚合体；( 4 ) 合成物，是由纳米颗粒与其他纳米颗粒或常规 尺寸材料相结合形成的材料。 由于纳米材料的的尺寸大小介于单个原子或分子和相应常规尺寸材料之间， 材料本来的物理化学性质发生变化，表现出不同于常规尺寸材料的物理化学性 质，即纳米效应。纳米效应主要包括尺寸效应和结构效应，而它们可以导致界面 效应、量子效应和量子隧道效应【4 4 1 ，从而使得纳米材料具有常规材料所没有的一 些特殊性能，如高光催化活性、高强度和高韧性、高热膨胀系数、高比热和低熔 点、奇特的磁性和极强的吸波性等，使得纳米材料在各个领域得到广泛应用。 由于纳米颗粒尺寸远小于常规颗粒，其表面积增加，表面暴露的原子或分子 比例增加，导致颗粒表面活性基团数量增多，因此增加了纳米颗粒被生物组织吸 收和与生物组织相互作用的机会，可能对活细胞产生常规尺寸材料不能产生的有 害生物效应，从而对生态系统带来不利影响【6 】 2 氧化物纳米颗粒对细菌的毒性效应 氧化物纳米颗粒在很多领域如电子、光学、化妆品、燃料电池、催化剂、杀 菌剂、环境修复中都具有广泛应用。其中应用较多且已表现出纳米毒性的颗粒为 t i 0 2 、z n o 、s i 0 2 、a 1 2 0 3 、c u o 和c e 0 2 等。图1 1 统计了有关典型氧化物纳米颗 粒毒性及细菌毒性文献的数量。可以看出，关于t i 0 2 和z n o 纳米颗粒毒性的文献 最多，其次为c u o 和s i 0 2 纳米颗粒，毒性研究对象主要为真核细胞生物，而关于 原核细胞生物如细菌的毒性研究相对较少。 图1 1 典型氧化物纳米颗粒毒性及细菌毒性文献统计 ( 至2 0 1 1 年1 2 月1 5 日，来自w e bo f s c i e n c e 数据库) f i g u n l la n a i y s i so ft h ei i t e r a t u 他ss t a t i s t i c so nb a c t e r i a lt o x i c i 够o f o x i d en a n o p a n i c i 鹤 ( u n t nd e c 1 5 t h ，2 0 l l ，f r o mw e bo fs c i e n c e ) 表1 1 总结了近几年内代表性文献中氧化物纳米颗粒对细菌毒性的毒性效应 及可能机理。从表1 1 中可以看出，研究者多选择大肠杆菌、枯草芽孢杆菌为细 菌代表，实验多在液体营养培养基或n a c l 溶液中进行。其中z n o 纳米颗粒的细 菌毒性研究最多。在不同研究中，z n o 纳米颗粒对细菌的毒性表现出较大差异， 如n a c l 溶液中毒性明显高于l b 液体培养基中毒性。这可能是由于液体介质改 变了z n o 纳米颗粒的性质，从而导致毒性差异。j i a l l g 等【4 5 】研究发现，在1 n a c l 溶液中，2 0m gl 。1 的s i 0 2 和a 1 2 0 3 纳米颗粒对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和荧光假 单胞菌均表现出毒性效应。对于t i 0 2 纳米颗粒，仅a d 锄s 等【4 2 】的研究发现t i 0 2 纳米颗粒对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌产生毒性，而j i a l l g 【4 5 1 和h e i n l l a a n 等【3 3 1 的研 究均未发现t i 0 2 纳米颗粒的细菌毒性效应。这可能与实验所使用的颗粒大小与 晶型有关，而文献中对此并没有讨论。实际水体中氧化物纳米颗粒对细菌的毒性 效应还未见报道。l i 等【4 6 】研究了模拟淡水中有机质对z n o 纳米颗粒细菌毒性的 影响，认为z n o 纳米颗粒毒性主要来源于游离z n 2 + ，有机质可降低锌的生物可 利用性，因而降低z n o 纳米颗粒的细菌毒性。要正确预测和评估纳米颗粒风险， 需要加强对实际水体中纳米颗粒的生态毒性研究。 器 喇 掣= ： 宙萎 0 裔 磬k 芸曹 n 一 下磐 一l n b d 一 昌n 曷 博长 划 爱掣 。划 舀糨 j 冒笞 = 胃胃 巴巴巴巴乜 甘 赳、伸警世p山 器氓半剞粗乓龌长茛 餐太粗婪餐长巾蟹!壮黢踺巾嘴长嗽州赳一懈#r爆崾黎型愚舔砷(皿啦黑螺避一$举趟翟器$举避器嗵制窿酶娶恒嵌霉最堪星旃砷温pr丽脚箍髻屋粗器婶巢麟球爆长一匠世髻镂翟黑婶o配嗽呶州 冰爆长一 划k蛊o配签遥辎端锄留翟器唧巢鼷赳一壶 村懈球副粼甓暴黑粼熏粗暴茛赳，伸巢鬃*舔0口n 。赳、忡划k恒 帚k遵最 锐钛矿相 锐钛矿金红石相 金 红石相。如果纳米颗粒致毒机理以光催化i 的s 为主导，颗粒毒性可能随着光催 化能力的增强而增强。j i 等【2 8 1 发现锐钛矿相t i 0 2 纳米颗粒对小球藻的毒性要高 于金红石相t i 0 2 毒性。但s i m o n d e c k e r s 等 6 9 】研究发现锐钛矿相和金红石相t i 0 2 纳米颗粒对细菌毒性相似。可能还存在其他毒性影响因素。 纳米颗粒形态也影响其毒性效应。s i m o n d e c k e r s 等【6 9 】发现圆形、表面电荷 呈中性或带正电荷的t i 0 2 对细菌毒性更强，可能是因为具有这种表面性质的t i 0 2 更容易吸附到细菌表面，进而损伤细胞。在实际实验体系中，由于纳米颗粒的团 聚，颗粒形态对毒性的影响可能并不显著。 9 ( 2 ) 颗粒溶解度 金属离子可能对细菌具有毒性，所以金属氧化物纳米颗粒的溶解在纳米颗粒 的毒性效应中具有重要作用。与t i o ：纳米颗粒相比，z n 0 和c u o 纳米颗粒的溶 解度相对较大，其对细菌的毒性也高于t i 0 2 纳米颗粒【33 1 。与光催化i m s 对细菌 产生的毒性相比，金属离子毒性可能更强。 对于同种纳米颗粒，颗粒溶解程度可能与其粒径大小和表面积有关，颗粒小、 比表面积大的颗粒溶解度较大。颗粒表面的曲率和粗糙度也影响着颗粒的溶解度 f 7 0 1 。b i a i l 等7 1 1 发现n a n o z n o 颗粒越小，其溶解速率越快。但f r a n k l i n 等发现 n a i l o z n o 和b u l k z n o 的溶解度相似，他们认为可能是纳米颗粒在水中的团聚影 响了其溶解度。 ( 3 ) 颗粒表面电荷 纳米颗粒的表面电荷将会影响其与细菌的相互作用。细菌通常带有负电荷， 带有正电荷的纳米颗粒和细菌间可能会有较强的静电引力，更容易造成两者的直 接接触，从而对细菌产生化学或物理损伤，对细菌生长产生抑制【4 5 ，5 1 ，5 4 。5 5 1 。另外， 颗粒表面电荷在很大程度上也决定了颗粒的团聚速率和程度。表面电荷绝对值越 小，颗粒越容易团聚，从而可能降低颗粒与细菌间的直接作用。 4 2 细菌性质 对于不同细菌，纳米颗粒的毒性效应可能有很大差异。有研究者发现革兰氏 阳性菌比革兰氏阴性菌对纳米颗粒毒性更敏感。a d a m s 等【4 2 1 发现枯草芽孢杆菌比 大肠杆菌对纳米颗粒( z n o 、t i 0 2 、s i 0 2 ) 毒性更敏感。l i 等【4 6 1 也观察到n a l l o z n o 对枯草芽孢杆菌的毒性高于大肠杆菌。r e d d y 等【4 8 1 发现i m o z n o 对金黄色葡萄 球菌的毒性要高于对大肠杆菌的毒性。他们认为可能是革兰氏阴性菌细胞壁具有 复杂的三重膜结构。但也有人认为由于革兰氏阳性菌细胞壁较厚，因此抵抗纳米 颗粒毒性的能力更强【7 2 1 。 另外，细菌是否分泌胞外多聚物( e p s ) 也影响纳米颗粒对细胞的毒性。e p s 是细胞分泌的大分子物质，主要为多糖和蛋白质。它可以吸附纳米颗粒产生的活 性氧自由基，或阻止纳米颗粒与细菌的直接接触，从而降低纳米颗粒对细菌的毒 性效应【5 6 1 。w u 等【5 3 1 发现大肠杆菌可以分泌e p s ，降低了n 觚o z n o 的毒性作用。 某些细菌对特定金属离子具有较高的耐受性。l i 等h 6 1 发现n a n 0 z n 0 对细菌毒性 主要来源于z n 2 + ，对于耐z n 2 + 毒性的恶臭假单胞菌，n a l l o z n o 的半数抑菌浓度 ( i c 5 0 值) 要高于5 0 0m gl 。 4 3 环境条件 环境条件会影响纳米颗粒和细菌的性质，从而影响纳米颗粒对细菌的毒性效 应和机理。纳米颗粒特别是氧化物纳米颗粒，进入水体后，其物理化学性质( 颗 粒大小、团聚稳定性、表面化学性质、溶解性等) 会受到光照、水体p h 、离子 成分及强度、天然有机物和共存污染物的影响。另外，细菌的生长及对毒性的抵 抗能力也会受到环境影响。 ( 1 ) 光照 对于具有光催化活性的纳米颗粒，光照可以增强纳米颗粒产生r o s 的能力。 如果r o s 是颗粒对细菌产生毒性的机理，光照应该可以增强纳米颗粒对细菌的 毒性。光照对纳米颗粒产生r o s 能力的影响可能取决于光的强度和波段。a d 锄s 等【4 2 1 发现光照( 日光灯) 可以显著增强t i 0 2 纳米颗粒对枯草芽孢杆菌的毒性。 c h o i 等【5 9 帔现日光灯照射下，t i 0 2 纳米颗粒不能对硝化反应产生抑制，而经紫 外灯照射3 0m i n 后，可以显著抑制硝化反应。 ( 2 ) p h 溶液p h 可以影响纳米颗粒的表面电荷，从而影响颗粒的团聚以及与细菌间 的作用力。对于金属氧化物纳米颗粒来说，如果水溶液中不存在易被吸附的离子， 颗粒表面电荷则由颗粒离子化所控制【7 3 1 。在低p h 条件下颗粒具有正电荷，相应 地，在高p h 条件下颗粒具有负电荷。颗粒表面净电荷为o 时的p h 值即为颗粒 等电点。p h 与等电点差值越大，颗粒表面电荷绝对值越高，颗粒越容易分散。 p h 还影响着颗粒的溶解度，从而影响金属离子对细菌的毒性效应。b i a n 等【7 1 1 研 究发现，n a n o z n o 的溶解度随溶液p h 升高而降低。 ( 3 ) 离子成分及强度 纳米颗粒所处体系中的共存离子及离子强度可能会影响金属氧化物纳米颗 粒的表面性质或溶解行为。一方面，某些共存离子可能会吸附到纳米颗粒表面， 改变颗粒表面电荷，从而影响纳米颗粒与细菌的相互作用；另一方面，某些无机 阴离子可能与纳米颗粒释放的金属离子反应，影响金属离子对细菌的毒性。目前 关于溶液中离子对纳米颗粒毒性影响的报道还很少。f e r i s 等【5 1 】认为纳米颗粒与 l l 细菌的直接接触是导致细菌损伤的主要原因，而溶液中与纳米颗粒所带电荷相同 的共存离子可以减弱颗粒与细菌的相互作用，从而降低纳米颗粒对细菌的损伤， 比如共存c a 2 + 可以降低带正电荷的n a n o z n o 对细菌的毒性。但也有研究者【7 4 _ 5 】 认为c a 2 + 、m 9 2 + 可以与有毒金属离子( 如c u 2 + 、z n 2 + ) 竞争生物体的毒性位点， 从而降低金属离子毒性。二价阳离子对金属氧化物纳米颗粒毒性的影响机理需要 进一步研究。 目前关于离子强度对纳米颗粒的影响仅限于对其团聚稳定性的影响。而离子 强度还会影响金属氧化物纳米颗粒的溶解性，进而影响颗粒毒性，因此，今后研 究中需要关注离子强度对金属氧化物纳米颗粒的毒性影响。 ( 4 ) 溶解有机质 溶解有机质可以影响氧化物纳米颗粒的表面性质以及溶解行为，从而影响纳 米颗粒或其释放的金属离子对细菌的毒性。最近一项研究指出，腐殖酸在较高 p h ( 9 o 、1 1 ) 条件下可促进n a n o z n o 溶解，在较低p h ( 1 0 、3 0 、6 o ) 下则 不能促进溶解【7 l 】。b l i n o v a 等发现天然水中溶解有机碳( d o c ) 可降低c u o 纳 米颗粒对甲壳类水生动物的急性毒性，但却不能降低z n 0 纳米颗粒的毒性。l i 等【4 6 l 比较了模拟淡水中单宁酸、胡敏酸、富里酸和海藻酸对n a n o z n o 细菌毒性 的影响，发现单宁酸可以络合最多的游离z n 2 + ，对n a l l o z n o 毒性的降低更显著。 有机质还可能吸附在纳米颗粒表面，改变颗粒表面电荷，从而影响颗粒与细菌的 相互作用，但目前还未见该方面的报道。 ( 5 ) 共存污染物 纳米颗粒进入水体之后，除受水体水质影响外，可能还会与共存污染物( 天 然或人工纳米颗粒、表面活性剂、有机污染物、重金属离子) 发生作用，影响纳 米颗粒对水生生物的毒性效应。有研究报道t i 0 2 纳米颗粒对a s ( i i i ) 有较强的吸 附能力，可以促进a s ( i i i ) 在鲤鱼体内的积累，另外a s ( i i i ) 在光照条件下还可以被 t i 0 2 纳米颗粒氧化为a s ( v ) ，影响a s 的毒性7 6 1 。z h u 等7 7 1 发现，t i 0 2 纳米颗粒 可以吸附高毒性的海洋防污材料t b t ( 三丁基锡) 并进入鲍鱼胚胎内，增强了 t b t 对鲍鱼胚胎的毒性。但关于共存污染物对纳米颗粒细菌毒性的影响还未见报 道。由于细菌为原核细胞，不能依靠胞饮作用吞噬纳米颗粒，因此纳米颗粒可能 不会促进共存有机污染物或者金属离子在细胞内的积累，相反可能会降低共存污 1 2 染物的生物可利用性。同时，共存污染物如其他纳米颗粒或表面活性剂可能会影 响纳米颗粒表面电荷、团聚性和溶解性等，进一步影响纳米颗粒对细菌的毒性效 应。在对污染水体中纳米颗粒进行风险评估时，应考虑共存污染物的影响。 环境条件除影响纳米颗粒性质外，还可能影响细菌性质，改变细菌对有毒物 质的耐受力。温度、p h 、水的渗透压、溶解氧水平、太阳辐射等都是影响细菌生 长的重要因素。细菌在生长不良的条件下对有毒物质的耐受力也会下降。因此， 在纳米颗粒风险评估中，环境条件对纳米颗粒细菌毒性的影响不容忽视。 5 本论文的研究目标和思路 人工纳米颗粒广泛应用并进入环境中，从而给环境生态带来了潜在风险。细 菌在环境中大量存在，是生态系统的基础。纳米颗粒对细菌的毒性效应可能影响 到整个生态系统的平衡。探明纳米颗粒对细菌的毒性效应及致毒机理可为纳米颗 粒的生态风险评估及其安全生产和应用提供理论基础和依据。 纳米颗粒对细菌的致毒机理主要取决于纳米颗粒、细菌以及环境介质的性 质。纳米颗粒性质的差异可能导致其致毒机理的不同，同一种纳米颗粒也可能存 在几种不同的致毒机理。虽然人们已经对纳米颗粒的细菌毒性进行了相关研究， 但实验大多在液体培养基中进行，由于模型生物、实验介质以及毒性指标的不同， 所得到的纳米颗粒毒性结果也存在较大差异。另外，有关纳米颗粒( 如n a n o z n o ) 对细菌的致毒机理还存在争议。 水体是纳米颗粒在环境中的主要归宿之一纳米颗粒进入水环境中后，其物 理化学性质很大程度上受到水质条件的影响。水体p h 、离子成分及强度、天然 有机物和共存污染物都会影响纳米颗粒的物理化学性质，如颗粒表面电荷、团聚 性、金属离子的溶解及生物可利用性，从而影响纳米颗粒与细菌的相互作用或者 金属离子毒性，最终影响到纳米颗粒对细菌的毒性效应。 本文以大肠杆菌为模型细菌，研究水中z n o 、t i 0 2 、a 1 2 0 3 和s i 0 2 纳米颗粒 的细菌毒性效应及机理，在此基础上探讨水化学性质、共存纳米颗粒和表面活性 剂对r m o z n o 毒性的影响及机理，试图为氧化物纳米颗粒的生态风险评估及控 制提供理论基础和数据支持。论文主要思路如图1 3 ： 水环境条件对z n o 纳米颗粒大肠杆菌毒性影响及机理 典型氧化物水化学性质对 共存污染物对 纳米颗粒对z n o 纳米颗粒z n 0 纳米颗粒 大肠杆菌的大肠杆菌毒性 大肠杆菌毒性 毒性效应及影响及机理 影响及机理 机理 1 _ i l ， 毒机 培 天 共 共 性 理 养然 存 存 效验 基水 纳 表 应证 成 成 米 面 分分 颗 活 粒 性 剂 颗 溶 粒 解 自成 氨分 纳米颗粒性质毒性效应 毒 毒 性性 影响机理 r 为纳米颗粒在水环境中的生态风险评估及控制 提供理论基础和数据支持 图1 3 本论文的研究思路 f i g u r e1 - 3r e s e a r c hu n eo ft h i sg r a d u a t i o nt h e s i s 1 4 第二章典型氧化物纳米颗粒对水中大肠杆菌的 毒性效应及机理 氧化物纳米颗粒由于具有多种良好的特殊性能，已成为当前使用最广泛的一 类纳米材料。例如，z n o 和t i o ：纳米颗粒活性高，具有屏蔽红外、紫外和杀菌 的功能，已广泛应用于防晒、功能纤维、玻璃、污水处理和光催化等产品中。在 纳米颗粒的生产、运输、使用及处理过程中，它们将不可避免地进入环境，产生 生态风险。 水体是纳米颗粒在环境中的主要归宿之一，纳米颗粒可能会与水中生物相互 作用，对水体生态造成风险。细菌是水生生态系统的重要组成部分，对有毒物质 较其他生物敏感，纳米颗粒对细菌产生毒性可能会影响水体生态系统的平衡。目 前，已经有越来越多的研究者开始关注氧化物纳米颗粒对细菌的毒性效应。但由 于实验介质、实验方法、模型生物的不同，同种纳米颗粒可能表现出不同的毒性 效应。比如，一些研究者认为n a n o t i 0 ：对细菌没有毒性4 5 ，7 引，而另外有人发现 n a n o t i 0 2 毒性高于n a n o z n o 【4 2 1 。同时，纳米颗粒对细菌的致毒机理还不清楚。 光催化r o s 曾被认为是纳米颗粒生物毒性的主要来源【2 6 ，3 3 ，4 6 ，5 3 ，6 2 1 ，但却不能解 释黑暗条件下纳米颗粒的毒性【4 2 】。光催化活性较强的纳米颗粒如t i 0 2 的毒性可 能与r o s 相判5 6 1 。有研究者认为n a n o - z n o 或r m o c u o 可以在水中溶解，其生 物毒性主要来自溶解的金属离子【2 5 粕，3 3 ，3 5 ，4 6 ，7 引。对于金属离子不是其主要毒性来 源的纳米颗粒，纳米颗粒与细菌的直接接触可能是纳米颗粒产生毒性的前提【4 5 ， 5 5 1 。纳米颗粒性质的差异可能导致致毒机理的不同，因此表现出同等条件下生 物毒性效应的不同。 为探明氧化物纳米颗粒的致毒机理，选择应用广泛且物理化学性质差异较大 的z n 0 、t i 0 2 、a 1 2 0 3 和s i 0 2 纳米颗粒为典型氧化物纳米颗粒，以大肠杆菌( 革 兰氏阴性菌) 为模型细菌，研究不同性质氧化物纳米颗粒对细菌的毒性效应，并 初步探索和验证了其致毒机理。 1 实验部分 1 1 实验材料 z n o 、t i 0 2 ( 锐钛矿相和金红石相) 、a 1 2 0 3 、s i 0 2 纳米颗粒均购自浙江弘晟 科技材料股份有限公司，其性质见表2 1 0 表2 1 实验用纳米材料的性质( 数据由生产商提供) 1 a b l e2 一lp r o p e r t i e so ft e s t e dn a n o p a r t i c l e s ( s u p p i i e db yp r o d u c e r s ) 大肠杆菌为生活污水中筛选分离，经鉴定为西c 而p 厂f c 缸c d f f 0 1 1 1 ：h s t r 。细 菌生长培养基为l w i a b e n a n i ( l b ) 液体培养基，其成分为1l 水中l ogn a c l 、 1 0g 胰蛋白胨和5g 酵母浸粉。计数平板为l b 固体培养基，在液体培养基基础 上，1l 水中加入1 5g 琼脂粉，高温灭菌后在紫外杀菌后的超净台中倾倒平板。 1 2 纳米颗粒悬液制备 称取一定质量纳米颗粒于洁净锥形瓶中，用棉花作瓶塞，置于烘箱中1 6 0 。c 干燥灭菌3h 。冷却后，将锥形瓶置于洁净操作台上，向瓶中加入一定体积经0 2 2 岬水系滤膜过滤灭菌的超纯水，超声分散2 0m i n 。对浓度大于5 0m gl 。1 的纳 米颗粒悬液，直接称量相应纳米颗粒配制；浓度小于5 0m gl 1 的纳米颗粒悬液， 则先配制5 0 0m gl 1 的储备液，然后稀释得到所需浓度悬液。 1 3 纳米颗粒性质表征 单个或团聚态纳米颗粒在水溶液中的形态和大小用j e m 1 2 3 0 透射电镜 ( j e o ll t d ，t o k y o ，j a p a n ) 观察。用镊子夹取透射电镜用铜网浸入1 0 0m gl j 的 纳米颗粒悬液中，快速取出，室温下风干，然后将铜网置于透射电镜内直接观察。 1 6 纳米颗粒的水力学直径和z e t a 电位用纳米粒度电位分析仪( z e t a s i z e r ，n a n o z s 9 0 ， m a l v e mi n s t r u m e n t s ，u k ) 测定，测定前对纳米颗粒悬液超声分散2 0i t l i n ( 3 0 0 w ) ，悬液p h 为6 5 左右。 1 4 毒性实验 为避免水质因素干扰，毒性实验在超纯水中进行，实验时间采用3h 。将大 肠杆菌接种于l b 液体培养基，在恒温振荡器中( 1 5 0r p m ) 3 7 。c 培养1 2h 。菌 液在3 0 0 0 叩m 离心1 5r i l i n ，倾去上清液，用生理盐水( 0 8 5 n a c l ) 洗涤离心 两次，重新悬浮于生理盐水中，利用紫外可见分光光度计( u v 2 4 0 1 p c ， s h i m a d z u ，j a p 趾) 调节菌液o d 6 0 0 在1 0 左右。取lm l 菌液接种到1 0 0n 正不 同浓度的纳米颗粒悬液中，混合均匀，置于恒温振荡器中( 1 5 0 印m ) 3 7 。c 培养 3h 。实验中未进行光照处理。实验结束后，将样品混合均匀，用1 0 倍稀释法稀 释样品，涂布平板，在培养箱中3 7 。c 培养2 4h 进行菌落计数。同时设置无纳 米颗粒组空白对照。每次实验设置三组平行，重复两次。细菌死亡率( b a c t e r i a l m o n a l i t ) ，) 与无纳米颗粒对照组作参比计算。 b a c t e r i a lm o n m i t v = 型尘鳖1 0 0 ( 2 1 ) n o 1 5 纳米颗粒与细菌的直接接触 纳米颗粒与细菌的直接接触可能是纳米颗粒致毒的重要机理。通过两种方法 对纳米颗粒与细菌的直接接触进行观察和验证。利用透射电镜直接观察纳米颗粒 与细菌的接触关系，而纳米颗粒与细菌的沉降特征可以说明颗粒是否吸附在细菌 表面，加剧细菌沉降。 1 5 1 电镜观察 纳米颗粒与细菌的直接接触用j e m 1 2 3 0 透射电镜( j e o ll t d ，t o k y o ，j a p a n ) 悬滴观察。用镊子夹取透射电镜用铜网浸入纳米颗粒与细菌混合悬液中，快速取 出，室温下风干，然后将铜网置于透射电镜内，观察纳米颗粒与细菌的接触关系。 本实验菌液浓度为o d 6 0 0 = o 5 ，根据颗粒悬液浊度选择合适的纳米颗粒浓度， n a n o z n o 为5 0 和1 0 0m gl ，n 锄o - t i 0 2 a 、n a i l o a 1 2 0 3 和n a n o s i 0 2 分别为5 0m g l 、1 0 0m gl 。1 和5 0 0m gl 。 1 5 2 纳米颗粒与细菌悬液的沉降特征 通过测定纳米颗粒与细菌悬液在6 0 0m 处吸光度随时间的变化表征其沉降 特征。将一定浓度的纳米颗粒悬液( z n o 、t i 0 2 、a 1 2 0 3 为1 0 0 和2 0 0m gl ， s i 0 2 为4 0 0 和l 0 0 0m gl d ) 超声分散2 0m i n ，取1 5m l 悬液加入1n l m lm m 的透明样品池中，然后加入1 5m l o d 6 0 0 = 1 o 的大肠杆菌悬液( 超纯水悬浮) 。 同时，相应浓度的大肠杆菌悬液和纳米颗粒悬液分别作为对照。每个样品设置3 个平行。样品在室温( 2 5 士l o c ) 下静置3 5h ，期间每5m i n 或l om i n 用u v v i s 分光光度计测定样品在6 0 0m 处的吸光度，测定时避免晃动。 1 6 颗粒与滤液毒性的区别 将配备好的纳米颗粒悬液( 每组4 个样品) 放置在恒温振荡器中于3 7 。c 振 荡1 2h ，次日将每组中2 个样品经灭菌后的抽滤瓶抽滤( 0 2 2 肛m 滤膜) 得到纳 米颗粒滤液。然后进行细菌毒性实验，比较纳米颗粒悬液与相应滤液的细菌毒性。 1 7 光催化r o s 与胞内r o s 测定 光催化r o s 和胞内r o s 的测定参考c h o i 掣6 0 1 的方法进行。利用a p f ( 氨 基荧光素) 荧光探针一一种新的r o s 指示剂( 主要对0 c l 和o h 敏感) 测定光 催化r o s 。光催化r o s 主要与o h 产生有关。向9 6 孔黑色底透酶标板中加入 l o op l 一定浓度的纳米颗粒悬液，然后加入1 0 0 “l 浓度为1 0p m 的a p f 溶液， 在室内放置3 0m i n 后用荧光酶标仪( f l o n s t a t i o ni i ，美国n d 公司) 测定样品荧 光强度。测定条件为激发波长4 8 5m ，发射波长5 1 5 姗，读数前在酶标仪上混 匀。考虑到颗粒沉降影响，以顶读数据为准。同时将不加a p f 的纳米颗粒悬液 和加a p f 的超纯水作为对照。 胞内r o s 测定利用h 2 d c f d a ( 2 ，7 二氯氢化荧光素乙二脂) 为荧光探针。 向2 0i n lo d 6 0 0 = 1 0 的大肠杆菌悬液中加入0 4i t l lh 2 d c f d a 溶液，使得悬液中 h 2 d c f d a 的最终浓度为1 0p m ，在恒温振荡器中3 7o c 培养3 0m i n ( 上载探针) ， 然后用生理盐水洗涤菌液三次，每次1 5m i n ，以去除溶液中残留的h 2 d c f d a 。 向9 6 孔黑色底透酶标板中加入1 0 0 皿一定浓度的纳米颗粒悬液，然后加入1 0 0 p l 加载探针的菌液，在振荡器中培养3h 后用荧光酶标仪测定荧光强度( 激发波 长4 8 51 1 l l l ，发射波长5 1 5 啪) 。以未经纳米颗粒处理的菌液作对照。 2 结果与讨论 2 1 纳米颗粒的物理化学性质 利用透射电镜观察了超纯水中n a n o z n o 、n a i l o t i 0 2 a 、n a n o a 1 2 0 3 和 n a n o s i 0 2 的大小和形态。由图2 1 可以看出，由于纳米颗粒分散介质为超纯水， 颗粒间结合比较紧密，尤其是n a l l o t i o ：a ，很难统计单个颗粒大小。另外， n a j l o z n o 和n a n o t i 0 2 a 的颗粒大部分为椭球形，少量为棒状。相比于前两者， n a n o a 1 2 0 3 和i m o s i 0 2 颗粒尺寸较小，均为球形。 图2 一l超纯水中n a n o - z n o 、n a n o t i 0 2 a 、n a n 伽a 1 2 0 3 和n a n o - s i 0 2 的透射电镜照片 f i g u m 2 一lt e mi m a g 骼o fn a n o - z o ，n a n 加t i 0 2 - a ，n a n 伽a 1 2 0 3 ，a n dn a n o _ s i 0 2 i nu i t r a p u r