血清碱性磷酸酶活力测定幻灯片PPT课件.ppt

血清碱性磷酸酶活力测定,(磷酸苯二钠法),1,酶活力：也称酶活性，是表示催化某一特定反应的能力。可以用在一定条件下所催化的某一特定化学速度表示。酶催化反应速度越快，酶活力升高，反之活力愈低。底物减少量或生成物增加量酶促反应速度=单位时间,2,酶的活力单位国际单位：Katal，1s转化1mol底物的酶量临床表示：Kings，如血清谷丙转氨酶活力单位，每100ml血清在37。pH=7.4的条件下与底物作用60min，生成1mol丙酮酸所需的酶量为1个活力单位酶的比活力：单位质量酶蛋白或单位体积酶制剂所含有酶活力单位数，即酶活力浓度。酶活力的测定方法1.终止测定法（定时法或终点法）2.动力学分析法（连续监测法或速率法）,3,实验目的,熟悉酶活性测定方法的一般原理掌握血清ALP测定原理与临床意义,4,实验原理,碱性磷酸酶在碱性环境中作用于磷酸苯二钠，使之水解生成酚和磷酸。酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化形成红色醌类化合物，其颜色深浅与ALP活性成正比。磷酸苯二钠+H2O苯酚+磷酸氢二钠苯酚+4-氨基安替比林红色醌亚胺衍生物,ALP,pH=10,铁氰化钾,5,实验器材和试剂：,（一）器材：5ml移液管，1ml移液管，100或200ul微量可调式移液器，721E分光光度计，1cm比色皿，37恒温水浴（二）试剂：10.1mol/L碳酸盐缓冲液(pH10.0)称取无水碳酸钠6.36g，碳酸氢钠3.36g，4-氨基安替比林1.5g，溶于800mL蒸馏水中，定容至1L。置棕色瓶中保存。220mmol/L磷酸苯二钠溶液先将500ml蒸馏水煮沸，迅速加入磷酸苯二钠2.18g(磷酸苯二钠如含2分子结晶水，则应称取2.54g)，冷却后加氯仿2ml防腐，在4冰箱保存。（用剩的溶液不应再倒回瓶中）3铁氰化钾的硼酸溶液称取铁氰化钾2.5g，硼酸17g，各自溶于蒸馏水400ml中，两液混合后，加蒸馏水至1L，置棕色瓶中避光保存(如出现蓝绿色即弃去)。4酚标准工作液（0.05mg/ml）：购买合格的二级标准品。,6,实验操作,1.取试管4支，按下表操作,2.立即混匀。在510nm波长处比色，以蒸馏水调零点，读取各管吸光度。,7,计算ALP活性=（A测定A对照）/（A标准A空白）*0.05*100(金氏单位）,8,临床意义：,血清中ALP活力测定在临床常作为肝胆疾病和骨骼疾病的临床辅助诊断指标。1血清ALP活性升高可能原因如下：肝胆疾病：阻塞性黄疸、急性或慢性黄疸性肝炎、肝癌等；骨骼疾病：由于骨的损伤或疾病使成骨细胞内所含高浓度的ALP释放进入血液中，引起血清ALP活性增高，如纤维性骨炎、成骨不全症、佝偻病、骨软化病、骨转移癌和骨折修复愈合期等。2血清ALP活性降低比较少见：主要见于呆小病、重症慢性肾炎、乳糜泻、贫血、恶病质等。,9,注意事项,目前市售的酚标准液多数为安瓿瓶，开后不能久置底物液中不应含有酚，如空白管显红色，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。加入铁氰化钾后必须迅速混匀，否则对实验结果会有影响。,10,标准曲线法,制备如下：取试管6支，分别加酚标准液(1ml=01mg)，0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4ml，各管依次加复合基质液3.1、3.05、3.0、2.9、2.8、2.7ml。混匀后37水浴保温5分钟，各管加入1.0ml碱性溶液，再加0.5铁氰化钾2.0ml，立即混匀。静置10分钟，510nm波长下比色。将以上各