（食品科学与工程专业论文）热反应虾味香精的制备.pdf

摘要 摘要 本论文旨在利用虾加工下脚料，运用生物酶解技术，通过热反应( 主要是美拉德反 应) 处理，研制风味逼真的虾味香精。 首先，对虾下脚料进行酶解。以水解度为指标，研究了5 种蛋白酶( 风味蛋白酶、 诺和蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶) 酶解虾加工下脚料的能力：在各 自适合的反应温度下，它们最适的添加量和酶解时间分别为：4 5 l p u ，g 蛋白、3 0 0 分 钟；0 0 1 3 5 万u g 蛋白、3 0 0 分钟；1 4 4 a u 儋蛋白、1 8 0 分钟；3 4 8 0 d u g 蛋白、2 4 0 分钟；o 0 5 4 、万u g 蛋白、3 0 0 分钟。在此基础上，利用响应曲面法对复合蛋白酶的酶解 能力进行了研究，确定了风味蛋白酶和碱性蛋白酶为最佳复合酶。确定其最佳酶解工艺 为：起始p h 值6 7 4 ，酶解温度4 8 3 ，底物浓度7 3 ，在此优化条件下，重复试验 3 次，原料中虾蛋白的平均水解度达2 3 1 6 。 其次，对热反应法制各虾味香精的工艺进行了研究。通过对反应产物的感官评定， 确定了制备虾味香精的基本反应原料：酶解5 小时后的虾下脚料酶解液中添加精氨酸与 丙氨酸组成的复合氨基酸；然后，着重考虑起始p h 值、反应温度、反应时间对热反应的 影响，运用单因素实验和正交实验，确定了热反应的优化工艺条件：起始d h 值7 o ，反 应温度1 1 0 ，反应时间3 0 m i n ；最后对热反应的配方进行了一定的改良，结果如下：木 糖与葡萄糖的比例为l ：4 ，精氨酸与丙氨酸的比例为2 ：1 ，以虾下脚料酶解液质量为基数， 添加硫胺素1 o ，抗坏血酸o 6 ，牛磺酸o 4 。 最后，分析了虾味香精中的挥发性风味成分。采用同时蒸馏萃取法( s d e ) 和固相 微萃取技术( s p m e ) 两种方法对产物中的挥发性风味成分进行提取，然后利用气相色谱 一质谱( g c m s ) 联用仪对其中的风味成分进行分离鉴定，总共获得9 1 种化合物，文献报 道对于虾香味贡献很大的吡嗪类化合物百分含量为：s p m e 法测得为1 2 4 7 ，s d e 法测 得1 2 6 8 ；含硫化合物为l o 0 1 ，除此之外，还有酮类、醛类、羧酸类、杂环类等化 台物，它们共同组成了风味逼真的虾味香精的香味轮廓。 关键词：热反应虾加工下脚料酶解虾味香精同时蒸馏萃取固相微萃取 江南大学硕l 学位论文 a b s t r a c t t h eo b j e c t j v eo ft b i sp a p e rw a st op r e p a r es h r i m pf l a v o r st n l et on a t u r eu s j n gt h es h r i m p o f ：f h la sr a wm a t e r j a lt h f o u 曲b i o l o 舀ce n z y m eh y d r o l y s i s 卸dt h e r n l a lf e a c t j o n s ( “s h o u l db e m a l 】a r dr e a c t i o ni nt h e o f y ) f i r s l l y t h es h r j m po f h lw a sh y d r o l y z e db yp i o t e i n a s e a c c o r d i n gt ot h es h r i m pp r o t e i n h y d m l y s i n ga b i 】i t y ( e x p r e s s e da sd e g r e eo fh y d r o l y s i s ，d h ) ，f i v ed i f 托r e n tk i n d so fp r o t e j n a s e ( f l a v o u r z y m e ，p m t a m e x ，n e u t r a s e ，舢c a l a s ea n dp a p a i n ) w e r es t u d i e d 1 1 1 e j ra p p m 埘a l e a m o u n ta n d 、耋i m ew e r eo b t a i n e da sf o l l o w sr e s p e c t i v e l y ：4 5 l p u g p r o t e i n ，3 0 0 m i n ； 0 0 1 3 5 1 0 4 u 鹰p r o t e j n ，3 0 0m i n ；1 4 4 a u g p r o t e i n ，1 8 0m i n ；3 4 8 0 d u 值p r o l e i n ，2 4 0m i n a n do 0 5 4 1 0 4 u g p m t e i n ，3 0 0m i n a l s o ，t h eh y d r o l y z i n ga b i l i t yq fm i x e de n z y m e sw e r e s t u d j e da o c o r d i n gt ot h er e a d i 伽o fs i n 舀ee n z y m e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em i x t u r eo f f l a v o u f z y m ea n d p d c a l a s ew a st h em o s te f f e c t i v ec o m b i n a t i o n t 1 1 em i x t u r co f f l a v o u r z y m ea n da l c a l a s eo nh y d f o l y s i so f l h es h r j m po f f a lw e r et h e ns t u d i e df u n h e rt h r o u 曲 r e s p o n s es u i f a c em e t h o d 0 1 0 9 y ( r s m ) t 1 l eo p t j m u mh y d r o l y s i sp a r a m e t e r sw e r ef j g u r e do u t a sf b l l o w s ：i n i t i a lp h6 7 4 ，t e m p e r a t u r e4 8 3 ，s u b s t m t e ( s h r i m pp r o t e i n ) c o n c e n t r a t i o n7 3 7 n l r i c er e p e a te x p e i i m e n t sw e r ec o n d u c t e du n d e rt h i sc o n d i t i o na n dt h ed e g r e eo fh y d i o l y s i s c o u l dr e a c h2 3 1 6 s e c o n d ly ，t h e r m a lr c a c t i o n st op r e p a r es h r j m pn a v o r sw e f es t u d i e d t h r o u g hs e n s o r y e v a l u a t i o n so nt h er e a c t i 伽p m d u c t s ，t h eb a s i cr e a c t j o nm a t e r i a l sw e r ed e t e 瑚i n e da sf o l l o w s ： a q 昏n i n ea n da l a n j n ew e r ea d d e dt ot h es h r j m po f f a lh y d i d l y t ew h i c hw e r eh y d f o l y z e df o r5 h o u r s ，i n j t j a lp h ，t e m p e r a t u r ea n dr e a c t i n gt j m ew e r et h em o s ti m p o n a n tf a c t o r sa f f e c t j n gt h e q u a l i t y o ft h e p r o d u c t s b y m o n o f a c t o r j a la n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h eo p t i m u m p a r a m e t e r so ft h e n n a lr e a c t i o nw e r eg a j n e da sf o l l o w s ：i n i t i a lp h7 0 ，t e m p e r a t u r e1 0 0 ， r e 矗c t j o nt i m e3 0 m i n l a s t ly t h ef o 加u l ao ft h e r m a lr e a c t i o nc a nb ea d j u s t e di no r d e rt o p r e p a r em o r er e a l i s t i cp m d u c t s ：a d d i n gam i x t u r eo fm o n o s a c c h a r i d e ( x y l o s ea n dg l u c o s ea n d t h er a t i oo fl h e mw a s1 ：4 ) ；a d j u s t i n gt h er a t i oo fa r g j n i n ea 玎da l a n j n et 0 2 ：1a n da d d i n g1 0 l h j a m j n ，o 6 a s c o r b j ca c i da i l d0 4 t a u r i n ea c c o r d i n gt ot h em a s so fh y d m l y s a t e f i n a l l y ，v o l a t i l ec o m p o n e n t si nt h es h r j m pn a v o u r sw e r ea n a l y z e d v o l a t i l ec o m p o n e n t s w e r ee x t r a c t e db ys j m u l t a n e o u sd i s t i l l a l i o na n de x t r a c t i o n ( s d e ) m e t h o da n ds o l i dp h a s e m i c f o e x t r a c t j o n ( s p m e ) m e t h o ds e p a r a t e ly 1 1 l ee x t r a c t sw e r ej s o l a t e da n di d e n t i f i e db yg a s c h r o m a t o 黟a p h 哪a s ss p e c t r o m e t r y ( g c m s ) n i n e t y 一伽ec o m p o u n d sw e r e g a i n e dt o t a l ly n e p e r c e n t a g eo fp y r a z i n e sw h i c hw e r er e p o n e dt o c o n t r i b u t et os h r j m pa r o m ag r c a t l yw a s 1 2 4 7 ( s p m e ) a n d1 2 6 8 ( s d e ) ，a n dt h ep e r c e n t a g eo fs u l f u 卜c o n t a i n j n gc o m p o u n d sw a s l i 摘要 1 0 0 1 a p a nf f o mt h ea b o v e ，t h e r ew e r ea 】s oa l d e h y d e s ，k e t o n e s ，c a r b o x y l j ca c j d sa n d h e t e m c y c l i cc o m p o u n d s a l lo ft h e mw e r ec o m p o s e do fa f o m ao u t l i n eo ft h es h r i m pf l a v o r s c l o s e l yr e s e m b l j n gt h et a s t e ， k e y w o r d s ：l h e 瑚a lr e a c t i o n ，s h r i m po f f a l ，e n z y m eh y d m l y s i s ，s h r j m pf l a v o r s ，s d e ，s p m e i i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。、 签名：趱生日期：弦，年j 月，7 日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 0 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：盟 导师签名：雀豳 日期：。j 年j 月7 j 7 日 第一驻绪论 第一章绪论 1 1 肉味香精概述 关于肉类风味的早期研究始于本世纪5 0 年代，主要是研究肉味中的不挥发性前体 物质。5 0 年代后期至6 0 年代前期1 2 】，由于色谱和波谱技术的曰臻成熟，人们对肉味的研究 又转向其挥发性的芳香味化合物。此后2 0 年问，肉味的挥发香气中大量的化合物被鉴定 出来。已报道有约1 0 0 0 多种化合物从牛肉、鸡肉、猪肉和羊肉的挥发成分中被鉴定出来。 这些挥发成分包含了有机化合物种类的大多数，如烃类、醇类、醚类、酮类、羧酸类、 酯类、内酯类、醚类、呋喃类、吡啶类、吡嗪类、吡咯类、嗯唑类和嗯唑啉类、噻唑和 噻唑啉类、噻吩类和其他含硫和含氮化合物等t 5 】。由此可见，肉的香味不可能由单一 化合物或某一类化合物所构成。但是，一般认为【6j ，含硫化合物、杂环化合物( 包括含硫 杂环化合物) 和羰基化合物是肉香味的主要成分。 肉i 味香精是具有肉香味特征的多种香味物质的混合物，其主要作用是给相应的食品 提供肉香味，其香味效果是肉味香精中的各种香料化合物分子共同作用的结果。大约在 1 5 0 年前荷兰的l i e b i g 与瑞二仁的m a g 百就开始尝试用盐酸水解植物蛋白作为肉类风味的替 代物。现在的雀巢公司还在生产水解植物蛋白，并以m a g g i 命名。肉味香精的生产，在 我国已有2 0 年左右的历史，但纯天然肉味香精尚未大批量生产。原因主要有两方丽：一 是目前国内的消费水平还比较低，对纯天然肉味香精的要求还不是很强烈：二是匪l 内纯 天然肉味香精的生产技术还不过关，在香味和成本上都不十分理想。目前，我国已经生 产的肉味香精主要有牛肉香精、鸡肉香精、猪肉香精和海鲜香精四大类；从形态上看， 所生产的肉味香精有液体、裔状和粉状三种形态。2 0 0 4 年，我国肉味香精的生产厂有1 0 0 多家，年销售额约2 0 亿元人民币，每年以超过1 0 的速度递增，棚关食品等工业的产值 约2 0 0 0 亿人民币i ”。与其他香精相类似，肉味香精质量的好坏主要取决于所用原料的品 质和配方的合理性，我国肉i 睐香精配方大致有如下三种组成方式：第一种是由辛香料、 天然香料和合成香料调香制成：第二种是以水解动、植物蛋白为基料，添加辛香料、天 然香料和合成香料调配而成：第三种是以水解动、植物蛋白热反应产物为丛料，添加辛 香料、天然香料和合成香料调配而成。完全通过调香的方法来制备肉味香精是很困难的， 由于所用香料品种限制，调配出来的肉味香精香味单薄、口感较差。以水解动、植物蛋 白基料和调香相结合的方法生产肉味香精，其像真度也不理想。因此，对肉味香精而言， 以肉或者其下脚料，通过生物酶解技术将其中的蛋白分解为氨基酸和肽，再与还原糖等 物质发生热反应来制备是一种较好的方法，所得到的产品一般称为热反应肉味香精。 1 2 热反应肉味香精 1 2 1 热反应肉味香精的定义 江南大学硕二l 学位论文 热反应肉味香精是热反应香精的一种。热反应香精( p r o c e s s f l a v o r 或h e a l - r e a c t i o n a v o r ) 是由两种或两种以上的香味前体物质( 还原糖、氢基酸等) 在一定条件下加热 反应产生的。国际食用香料工业组织( 1 0 f i ) 对热反应香精的定义如下：热反应香精是 一种由食品原料和( 或) 允许在食品或反应香精中添加的原料加热制各的产物。在肉味 香精的制备过程中，最重要的热反应是美拉德反应。1 9 1 2 年，法国科学家美拉德发现当 甘氨酸和葡萄糖的混合液共热时会形成褐色的类黑色素，这种反应被称为美拉德反应， 而其它氨基化合物和羰基化合物之间的类似反应通常也被称为美拉德反应。 1 2 2 热反应肉昧香精的前体物质 1 2 2 1 肽类和氨基酸 氨基酸是热反应肉味香精重要的前体物质之一，不同的单体氨基酸与还原糖反应， 能够产生不同的气味，据报道1 8 j ，在1 0 0 的热反应条件下，与葡萄糖反应，半胱氨酸可 产生肉香味，蛋氨酸可产生烤过头的土豆香昧，缬氨酸可产生黑麦面包香味，脯氨酸可 产生玉米香味、焦糊蛋白香味。由于单体氨基酸价格相对比较昂贵，实际生产中一般使 用含有多种氨基酸的水解植物蛋白、水解动物蛋白以及酵母自溶物。肽类主要是在对蛋 白质水解过程中产生的，不同的水解条件，能够产生不同的肽类组合，从而导致最后产 生的气味也不样。 1 2 2 2 还原糖 还原糖可以与氨基酸发生美拉德反应，从而产生良好的气味。据报道，肉类煮过之 后，其中的核糖含量降低了，说明核糖参与了肉味的产生过程。从产生气味来看，戊糖 优于己糖，核糖优于木糖，木糖优于阿拉伯糖，而在实际的工业生产的，考虑到核糖、 木糖的价格比较昂贵，一般用的还原糖为d 一葡萄糖。葡萄糖、果糖与核糖是肉味中的主 要单糖组份，它们可以通过热降解或美拉德反应间接或直接的影响肉味风味的组成。葡 萄糖主要源于肝糖糖原的水解，是肉中含量最丰富的还原糖。核糖的含量次之，但它的 反应活性最强，因此是在加热后最不稳定的单糖。肉中的核糖主要源于核苷酸，核苷酸 降解除了形成核糖外，还可以形成核苷与游离的嘌呤碱和嘧啶碱。 1 2 2 3 硫胺素( vb 1 ) v b - 分子内含有一个噻吩基，受热后会产生噻吩及一系列含氮或含硫化合物，其中 许多化合物具有肉味。硫胺素热降解产物中的许多化合物与美拉德反应形成的化合物相 同，如2 一甲基一3 一呋喃硫醇，它对鸡肉和牛肉风味中的肉香味是很重要的，少量的硫胺素 产生的2 甲基一3 一呋喃硫醇，比核糖与半胱氨酸的p h ：5 7 的模型系统水溶液受热产生 的要多2 0 余倍。 1 2 2 4 脂类物质 在加热时，脂类的热氧化对理想肉味的形成起重要的作用，一些衍生自脂类热降解 的化合物，各自为具有“清新脂肪的”“蘑菇样”气味的醛、酮和内酯组成，赋予了 肉的风味1 9 l 。类脂物的降解产生一系列挥发物，主要反应是饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸 的氧化和降解。主要的挥发物是过氧化氢，它再通过一个烷氧基自由基中间体降解为一 2 系列挥发性香味化合物，解释了许多脂肪烃、醇、醛、酸、内酯和2 烷j # 呋喃的形成。 1 2 3 热反应肉昧香精的反应机理 1 2 3 1 氨基酸和肽的热降解 氨基酸和肽类的热降解作用需要较高的温度，这时氨基酸脱氨、脱羧，形成醛、胺 等。一些氨基酸继续反应如半胱氨酸、胱氨酸加热形成噻唑及其衍生物，半胱氨酸还生 成噻吩，这两种物质是香味的重要组成成分。b 一羟基氨基酸如丝氨酸和苏氨酸是形成 吡嗪的特征氨基酸。已报道香气的形成是基于肽的降解而形成的一系列氨基酸，加热 一种氨基酸不会产生香味化合物。 1 2 3 2 糖的降解 在较高温度下，糖会不断失水，发生焦糖化反应，戊糖生成糠醛，已糖生成羟甲基 糠醛，进一步加热会产生呋哺衍生物、羰基化合物、醇类、脂肪烃和芳香烃类。糖降解 产生了二羰基化合物和三羰基化合物，这些化合物可与氨基酸发生s t r e c k e r 降解反应， 形成了大量的风味物质。肉中的核苷酸如肌苷单磷酸盐加热后产生5 磷酸核糖，然后脱 磷酸、脱水，形成5 甲基一4 一羟基i 吠喃酮。羟甲基呋喃酮类化合物很容易与硫化氢反应， 产生非常强烈的的肉香味。 1 2 3 3 硫胺素的降解 硫胺素的热降解产生一些重要的化合物，最主要的是4 甲基一5 ( 2 一羟乙基1 噻唑，它 进一步降解形成几种噻唑。其他含硫的主要产物为5 羟基3 巯基戊酮，它是产生脂肪族 含硫化合物、呋哺、噻吩的关键【= l 问体。h a n m a n 等分别在水中( d h = 2 3 ) 和1 ，2 丙三 醇中加热到1 3 5 对硫胺紊进行3 0 分钟的热降解，发现硫胺素在丙二醇体系中几乎没有 降解，但在水溶液体系中鉴定出了j l 种羰基化合物、呋喃、噻吩、噻唑和脂肪族含硫化 合物。 1 2 3 4 脂类物质的降解 在烹煮或烧烤肉时，挥发性香味的重要来源之一为脂类物质中不饱和酰基链的氧化 作用。不饱和脂肪酸如油酸、亚油酸等的双键，在加热过程中发生氧化反应，生成过氧 化物，继而进一步分解为能够生成很低香气闽值的酮、醛、酸等挥发性羰基化合物。在 加热过程中，肉中的沉积脂肪及组织中的磷脂同时发生热和氧化降解。在缺乏氧气的情 况下，脂类物质通过脱水、脱羧、水解、脱氢和碳一碳断裂，发生热降解。通过水解， 游离脂肪酸被释放出来。在热降解过程中，形成的其他化合物包括饱和及不饱和烃类、 b 酮酸、甲基酮、内酯和酯。 1 2 3 5 美拉德反应 还原糖与氨基酸之间的美拉德反应，是肉香味的最主要的来源。美拉德反应是食品 加热产生风味最重要的途径之一。食品中的游离氨基酸和还原糖是美拉德反应的重要参 与者。图1 1 为美拉德反应形成肉味风味化合物的路线。 江南大学硕士学位论文 一_ _ - - - 一 还原糖+ q 一氨基酸 上 n - 糖胺 逆缩醛 醛类( 乙醛) h d - f o n e 。 2 糠醛 4 - 巯基一5 甲基四氢，3 一呋喃酮 2 ，5 一二甲基一2 ，4 二羟基3 一( 2 h ) 噻吩酮 2 甲基3 一呋喃硫醉 2 糠基硫醇 2 甲基3 一( 甲硫) 呋喃 2 甲基3 ( 甲二硫) 呋喃 合物 双( 2 一甲基3 呋喃基) 二硫醚 2 糠基2 甲基3 呋喃基二硫醚 1 ，2 ，4 三硫杂环戊烷 】- ( 2 一甲基- 2 - 噻吩硫醇) 乙硫醇 1 - ( 2 一甲基- 2 一呋喃硫醇) 乙硫醇 ”h d - f o n e ：4 羟基- 5 甲基一3 ( 2 h ) 呋喃酮 ”h m f o n e ：4 ，羟基一2 ，5 二甲基3 ( 2 h ) 呋喃酮 图1 1 还原糖与氨基化合物美拉德反应形成肉味风味化合物路线 f i g u r e l - 1f o 册a t i o no fm e a tf l a v o rc o m p o u n d sb ym a j l l a r dr e a c t j o n o f r e d u c j n gs u g a r s a n da m i n e s 4 面 美拉德反应包括3 个阶段： 1 1 初级阶段。从羰氨反应到a m a d o r i 重排和h c v s 重排，此阶段无褐变，也不产生气 味，但a m a d or i 重排和 l e v s 重排的一f l 问产物是风i 睐物质的前体物质。 2 1 中期阶段。a m a d o r i 重排化合物和h e v s 重排化合物进一步降解，生产糠醛、呋喃 酮和二酮化合物，这些化合物再与胺类、氮基酸、硫化氢、硫醇类、氨、乙醛和醛类反 应，形成许多重要的风味物质。 3 1s l r e c k e r 降解。s t r c c k e r 降解反应是与美拉德反应有关的最重要的反应之一，它包 括a 氨基酸在二酮化合物的存在下脱氨、脱羧，形成比原氮基酸少一个碳原子的醛和a 一 氨基酮。这些a 一氨基酮是形成吡嗪类、嗯唑类、噻唑类等杂环化合物的重要物质。 1 2 4 热反应肉昧香精的研究历史及进展 第一项关于通过美拉德反应形成浓香味的研究报告是山w r u c k d e s c h e l 在1 9 1 4 年提 出的。在1 9 5 1 年，联合利华公司的研究人员一方面从蒸煮牛肉中分离鉴定风味物质，另 一方面分离鉴定产生牛肉风味物质的前体物质。结果表明：许多挥发性物质都是含硫化 合物和含羰基化合物，牛肉【= = l 的低分子量水溶性物质是牛肉风味的主要前体物质，这些 物质主要是氨基酸、小肽、氨基糖与还原糖。以此为依据，他们采用加热氮基酸与还原 糖等前体物质的方法来制笛热反应香精。英国化学家w o o d ( j 9 5 7 年) 和b e n d e r ( 1 9 5 8 年) 彻底研究了牛肉中的水溶性提取物【l l ”j ，这些提取物中包含肉风味前体物质。 b e n d c r 得：l 结论：褐变的形成和这些具有肉香特征的提取物是由于发生m a i l j a r d 反应的 结果。m o n o n 等人在1 9 6 0 年申请了一项专利，其中宣称从戊糖、己糖和半胱氨酸反应体 系可得到具有肉浓香味的物质，世界上笫个热加工肉味香精于2 0 世纪6 0 年代初诞生， 并实现商业化生产。随之 i 现了许多有关二号利和出版刊物，这表明了美拉德反应工业化 生产调味料的可行性。 我国的肉味香精工业是伴随精方便面：i ：业产生的。为了满足我国新兴的方便面工业 的急需，国家在“六五”科技攻关中，将肉味香精的研究与应用列入了“六五”国家科 技攻关计划，其主要成果在上世纪8 0 年代末期实现了产业化，主要采用h v p 、氨基酸和 还原糖进行热反应，产物经过调香后成为肉味香精。“八五”期问，我国以肉类蛋白作 为主要原料的肉味香精开始起步，最早的生产方法近乎于“炖肉”，但较好地借鉴了中 国传统烹调技术中肉制品的制作技术，辛香料得到了较广+ 泛的应用。到“九五”后期， 由于酶工程技术的采用，我国以肉类蛋白为起始原料的肉味香精生产技术取得了关键性 突破，鸡肉、猪肉、牛肉等动物蛋白在蛋白酶的作用下分解成肽、氨基酸等香味前体物 质，与水解植物蛋白、酵母、各利t 单体氨基酸、还原糖、辛香料等经过美拉德反应，生 成了香味浓郁、逼真的肉味香精，再用香料调和，其香味强度大大提高。用这种方法生 产肉味香精的技术获得了2 0 0 0 年国家科学技术进步二等奖，并在国内得到了很好的推 广，成为目前肉味香精生产的主流技术，其基本： 艺如图l 一2 所示1 1 “。 江南大学硕：l 学位论文 肉类蛋白 图卜2 热反应肉味香精的基本生产工艺 f i g u r e l 2t h eb a s i cp r o c e s so fp r e p a r i n gl h e r n l a lr e a c t i o nm e a i yn a v o r s 1 3 虾昧调味料的研究现状 虾是一种具有独特风味的食物，它除具有丰富的营养之外，还具有四十多种生香成 份，因此亦是一种天然的、具有保健作用的调味珍品。关于虾味的调味料主要有虾油、 虾酱、虾香料、虾调味汁、虾味酱油等。虾油是典型的发酵型虾味调味料，它选用新鲜 小虾或虾头为原料，经过5 6 个月的发酵过程，缸内为浓黑色的酱液，上面浮一层清油 时，发酵结束，过伏天后，用勺子撇起缸面浮油，此为生虾油，再将其烧煮至沸，冷却 沉淀后即为虾油1 1 4 1 8 l 。虾酱也是一种发酵型的虾味调味料，先盐渍，再进行发酵，它的 发酵时问比虾油要短，一般是一个月左右。高瑞良i 1 5 等以对虾头为原料，对对虾风味 料的提取进行了研究，他们首先利用热水对原料进行抽提，过滤得到滤液和滤渣，对滤 渣使用蛋白酶水解，得水解液，然后将热水抽提所得滤液和水解液合并，调配，干燥研 细后，即为对虾香味料。孙俊华l ”l 等以虾头为原料，运用生物酶解法对虾味酱油的制造 进行了研究，首先成曲，再进行高温发酵，淋油，最后灭酶活性，即为成品，所得虾味 酱油中游离氨基酸总量为对照酱油中的氨基酸总量的1 4 倍，其中人体8 种必需氨基酸含 量也高于对照样品。梁郁强l 】7 】对酶法水解虾头生产虾调味汁进行了研究，所得产品的感 官指标、物理指标和化学指标都较好。 综合以上所述，我们可以看到对于虾味风味料的研究只是局限在传统的发酵工艺和 生物酶解，而没有把生产肉味香精的热反应加工技术运用到其中。 1 4 本课题的立题依据和研究内容 1 4 1 立题依据 民以食为天，食以味为先。现代社会生活水平的提高、生活节奏的加快、各国饮食 文化的相互渗透以及人们饮食习惯的改变极大地促进了食品工业的发展，同时也对食品 香味提出了越来越高的要求，而食用香精则是改善食品香味、适应食品生产方式变化所 必须的原料。作为食用香精之一的肉味香精近年来取得了迅速的发展，热反应肉香风味 调味料迎合了人们对食品肉香味的喜爱；顺应了人们追求健康、营养和回归自然的时代 潮流；满足了食品生产企业在增香调味方面不断求新的需求，因而成为了调味料领域发 展极快的新型调味料。其应用范围已发展到众多食品加工领域，主要应用于方便面调 6 第一精绪论 料、鸡精、罐头、熏肉、酱肉、香肠、火腿肠、香辣酱等食品中。 现在国内对热反应生产牛肉香精和鸡肉香精f 门生产： 艺研究已经比较成熟，因此很 多香精香料公司生产的香精主要是这两种，而虾味作为大众比较喜欢的风味，对于热反 应虾味香精的研究却相对较少，关于虾味调味料的生产还是主要停留在传统的发酵工 艺、抽提以及单纯的酶解上。利用发酵： 艺生产虾味调l 球料，生产周期太长，盐含量高， 而且受到天气和地域的限制；使用虾中的抽提物直接作为虾味风味料，成本昂贵，而且 脂肪含量较高，这与现代所提倡的低脂肪食品的理念不相符合的；运用单纯生物酶解技 术所得的虾味调l 味料，它的风味总是不够饱满。针对以上的情况，本课题旨在以虾加工 下脚料为原料，运用生物酶解技术，通过热反应加】二| 二，生产虾味调味料，力求克服以上 类型调味料所出现的弊端，成本低，脂肪含量少，生产周期短，并且所产生的味道更加 饱满，更加逼真于原味，具有较强的社会意义和经济意义。 1 4 2 研究内容 本课题拟选用五种蛋白酶对虾加工下脚料进行水解，以水解度为衡量指标，确定最 佳的单酶或者复合酶的组合，然后用所得的酶解液与其他前体物质进行热反应，通过感 官评定，确定最优的反应条件，最后对热反应产物的挥发性风味成分进行分析研究。具 体研究路线如下： ( 1 ) 确定水解虾下脚料的最佳单酶或者复合酶的组合。 ( 2 ) 最佳蛋白酶水解虾下脚料工艺条件的优化。 ( 3 ) 热反应制备虾味香精工艺的优化。 ( 4 ) 利用气棚一质潜联用议( g c m s ) ，鉴定所得虾l 味香精中挥发性风味成分。 江南大学硕士学位论文 第二章虾下脚料水解酶的选择 2 1 引言 随着养虾业和海洋甲壳动物深加工业的迅猛发展，我国东南部沿海地区产生了越来 越多的虾加工下脚料，2 0 0 1 年，仅广东省产虾量6 4 万吨。目前这些下脚料中的一部分 通过压榨、烘干加工成虾粉，产品的附加值很低，并且虾粉加工后产生的废水和废弃的 下脚料对环境造成了严重污染，而更多的下脚料则被白白扔掉【1 。现有研究表明，虾加 工下脚料中含有多种矿物质元素，尤其是钙质含量丰富，而且蛋白质含量也很高，其中 含有人体必需的8 种氨基酸，是非常优良的食物蛋白资源。因此本实验充分利用这些虾 下脚料，对其中的蛋白质进行水解，再将酶解液中的氨基酸和肽类作为热反应肉味香精 的前体物质。 蛋白质水解是把蛋白质的肽键打开，使蛋白质降解为多肽、寡肽、二肽、游离氨基 酸等。常见的蛋白质水解方法主要有化学法、微生物发酵法和蛋白酶水解法三种。这三 种方法都可以使蛋白质降解生成氨基酸，但在水解程度和水解专一性上有明显的区别。 生产肉味香精时常见的蛋白质水解方法是酸水解法，最常用的是用盐酸水解，酸水解的 优点在于：水解彻底、氨氮含量高、成本低，但用酸水解的蛋白质作原料生产的肉味香 精，最终产品肉味不是特别逼真。酵母自溶是常见的微生物发酵法水解蛋白质的实例 一酵母细胞中的蛋白质被自身的酶分解，分解后产生肽、氨基酸、核苷酸等。我国有利 用废弃啤酒酵母生产酵母提取物或各种调味料的报道| 2 “，所得产品含有多种氨基酸、维 生素、成味核苷酸，方法简单易行，经济效益良好。蛋白质的酶解是一种能有效地改善 蛋白质特性的方式。当肉作为蛋白质水解原料时，所有构成肉咪的因子都包括在内，可 以产生逼真的肉香这正是用酶解动物蛋白生产肉味香精的优势所在。肉通过酶解， 氨基酸的含量大大增加，肉分解物加热产生的肉香味是加热相同肉产生的肉香味的1 0 0 倍左右i z ”。肉类加工过程中可以产生大量的副产物，酶解这些副产物可以得到与酶解肉 相同的效果，由于价格的低廉，因此，在经济成本和技术上都是合理的。 对于虾加工下脚料的酶解，国内外都有报道，a g i l d b e r 2 s 使用a l c a i a s e 蛋白酶对虾 下脚料进行酶解一一在传统的从虾下脚料提取壳聚糖后，大量的蛋白被废弃一一 a g j l d l ) e t g s 在提取壳聚糖前，先对下脚料进行酶解，从而提取出其中的蛋白质，实验表 明没有对后续的提取壳聚糖产生影响，而且得到的蛋白质中人体必需氨基酸含量丰富， 是一种具有高营养价值的可利用蛋白【2 引。孙俊华等使用混和蛋白酶对虾壳中的蛋白进行 了酶解，所得的水解液中含有赖氨酸、精氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等五种人体必 需氨基酸。 本章是利用蛋白酶来酶解虾下脚料中的蛋白质，选择常用的五种蛋白酶对原料进行 酶解，以水解度为衡量指标，确定一种或者几种水解效率高的酶，为后期的热反应提供 第二章虾下脚料水解脯的选择 良好的前体物质。 2 2 实验材料与设备 2 2 1 实验材料 虾加工下脚料 p a p a i n ( 术瓜蛋白酶) f 1 a v o u r z y m e ( 风味蛋白酶) p r o l a m e x ( 诺和蛋白酶1 n e u i r a s e ( 中性蛋白酶) a l c a l a s e f 碱性蛋白酶) 氢氧化钠( 分析纯) 甲醛( 分析纯) 2 2 2 实验设备 3 2 0 s 型d h 计 f a l1 0 4 型数显电子天平 s h z f i l l l 循环水真空泵 d s h z 3 0 0 多用途水浴恒温振荡器 8 1 2 型磁力恒温搅拌器 电热恒温鼓风二f 燥箱 2 3 实验方法 福建省石狮市水产食品有限公司 广西南宁庞博生物工程有限公司 诺维信公司( 北京) 诺维信公司( 北京) 无锡杰能科生物工程有限公司 无锡杰能科生物工程有限公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 梅特勒一托利多仪器( 上海) 有限公司 上海天平仪器厂 河南省巩义市站街光业仪器厂 江苏太仓市实验没备厂 上海曹行无线电元件厂 宁波自动化仪表厂 2 3 1 蛋白质含量测定 称取粉碎的虾下脚料置于三角瓶t | ，加入一定浓度的氢氧化钠溶液，盖上保鲜膜。 于1 0 0 的水浴中煮沸一定时间，然后用纱布过滤，收集滤液。滤渣倒回三角瓶中重复 上述操作3 次，过滤后用适量去离子水冲洗滤渣。合并滤液，置于容量瓶中定容，移取 一定量滤液于凯氏烧瓶中，蒸发至近二f 后，运用微量凯氏定氮法测定。 2 3 2 虾下脚料酶解方法 虾加工下脚料一洗净一晾干一粉碎一软化一调到合适的实验条件( 底物浓度、p h 值等) 一加酶一酶解一定时问一灭酶一离心一 ! | j 得上清液 2 3 3 水解度的测定 蛋白质水解度( d h ) = ( 上清液中的氨基态氮质量样品中总氮质量) 1 0 0 2 3 4 氨基态氮含量测定 甲醛电位滴定法i 驯 2 3 5 酶活力的测定 福林一酚法1 2 3 l 2 3 6 氨基酸的测定 9 江南大学硕士学位论文 日立8 3 5 5 0 型氨基酸分析仪( 江南大学测试中心1 2 3 7 统计分析 本实验所得数据使用e x c e l 进行分析处理 2 4 结果与讨论 2 4 1 虾下脚料中蛋白质氨基酸分析 本实验所用虾下脚料，大部分为虾头虾壳，蛋白质含量占干物质的2 6 ，蛋白质中 1 7 种氨基酸组成见表2 1 ，从表中可以看出，下脚料中蛋白质含量丰富，并且在8 种人 体必需氨基酸中，除了色氨酸因为测定方法的原因，没有测出以外，其他测得的7 种必 需氨基酸中，有6 种氨基酸的含量超过1 1 0 0 9 ，因此开发利用价值非常大。 表2 1 虾下脚料中蛋白质的1 7 种氨基酸含量 t a b l e 2 1n ec o n t e n io f l 7 妯n d so fa m i n oa c i d si nt h ep m t e i no fs h r i m po f f a l s 注：“$ ”代表此氨基酸为人体必需氨基酸；总氨基酸分析图见附录1 。 2 4 2 单一酶添加量与酶解时间的确定 在食品工业中，用于水解动植物蛋白的酶种类有很多种，按其来源分为植物蛋白酶， 动物蛋白酶和微生物蛋白酶。植物蛋白酶和微生物蛋白酶，现在国内产量较大，而动物 表2 2 各种蛋白酶的特性1 2 4 】 t a b l e 2 - 2s p e c j a l t i e so fs e v e r a lp r o i e i n a s e s 1 0 m 一章虾下脚树水解酶的选择 蛋白酶则较少，并且各种酶有其各自的特点，对不i 司的底物也表现出刁i 同的特性，综合 考虑各个方面的因素，本实验选用了f l a v o u r z v m e ( 风味蛋白酶) 、p r o i a m e x ( 诺和蛋白 酶) 、n e u l r a s c ( 中性蛋白酶) 、a l c a 】a s e ( 碱性蛋白酶) 、p a d a i n ( 木瓜蛋白酶) 5 种蛋白 酶对原料进行水解。各种酶的特性见表2 2 。 2 4 2 1f i a v o u r z y m ( 风味蛋白酶) 的确定 根据表2 2 显示的风味蛋白酶特性以及在大量实验的基础上( 以下四种蛋白酶的基 本酶解参数的确定和此同) ，确定了风味蛋白酶对于虾下脚料的基本酶解条件，即起始 p h = 7 o ：反应温度t = 5 0 ；底物浓度s = 7 o 蛋白。在此条件下选择了1 5 l a p u 儋蛋 白、3 o l a p u g 蛋白、4 5 l 气p u g 蛋白、6 o l 气p u g 蛋白、7 5 l 气p u 2 蛋白五个加酶 量水平，分别酶解3 0 m i n 、6 0 m i n 、1 2 0 m i n 、1 8 0 m i n 、2 4 0 m i n 、3 0 0 m i n 、3 6 0 m i n ，实验 结果见图2 1 。 一l5 l a p u g - 卜3o l a p u g 一t 15 l p u g 01 0 ( 】2 0 03 0 0t l o o 时问( 分钟) 图2 一ld h 一时间曲线( f l a v o u r z y m e ) 6o l a p u g ? 5 l p u k 从图2 1 可以看到，随着加酶量的增加与反应时间的延长，水解度是不断增加的。 加酶量水平从3 o l a p u g 蛋白增加到4 5 l 廿u g 蛋白时，水解度增长较快，在酶解 3 0 0 m j n 时，水解度增加了大约3 个百分点，而加酶量从4 j l a p u 2 蛋白增加到 6 0 队p u g 蛋白、7 5 l p u g 蛋白时，虽然水解度也有所增加，但是增加幅度较小。酶 解时问从3 0 m i n 到3 0 0 m i n 时，水解度增长较快，而从3 0 0 m i n 到3 6 0 m i n ，水解度的变 化幅度已经很小。综合以上，确定f 1 a v o u r z y m e 的加酶量为4 5 l a p u g 蛋白，反应时间 3 0 0 m i n 。 2 4 2 2p r o t a m x ( 诺和蛋白酶) 的确定 诺和蛋白酶对于虾下脚料的基本酶解条件为：起始p h = 6 0 ；t = 5 0 ；s = 7 o 蛋白。 8 6 4 2 o 8 6 4 2 0 x 一羞 江南大学硕士学位论文 在此条件下选择了o 0 0 4 5 万u 儋蛋白、0 0 0 9 万u ，g 蛋白