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丙烯酰胺毒件控制初步研究 丙烯酰胺毒性控制初步研究 摘要 食品热加工过程中会形成丙烯酰胺，该物质具有神经毒性、基因 毒性等，对动物具有致癌性，其毒性的控制是目前国际上研究的热点。 丙烯酰胺本身是低毒的，当丙烯酰胺进入机体后经细胞色素p 4 5 02 e l 催化氧化为环氧丙酰胺，后者才是对机体产生危害的根源。加入外源 性抗氧化剂( 如维生素c 、蛋氨酸、大蒜素等) 可有效抑制丙烯酰胺 的环氧化，降低环氧丙酰胺的形成，达到控制丙烯酰胺毒性的目的。 本文以抑制丙烯酰胺的环氧化和降低其吸收为切入点，对丙烯酰胺毒 性控制作一些基础性的探索。 1 食品中美拉德反应生成丙烯酰胺的同时还会形成一些具有抗 氧化活性的物质。本论文为了研究由美拉德反应生成的抗氧化物质的 抗氧化能力与由同一反应形成的丙烯酰胺的浓度之间的关系，通过模 拟食品中葡萄糖和天门冬酰胺美拉德反应，探寻丙烯酰胺生成量和美 拉德反应产物抗氧化活性问关系。 利用反相高效液相色谱( r p h p l c ) 检测丙烯酰胺的浓度，以 d p p h 清除率、还原能力和羟基自由基清除率表征产物的抗氧化活性， 研究了p h 值、温度、时间、葡萄糖和天门冬酰胺体积比、氨基酸和 糖对美拉德反应的影响。结果表明，食品热加工过程中既会生成丙烯 ， i 酰胺又可以生成具有抗氧化活性的物质，且随着丙烯酰胺生成量的增 加，美拉德反应产物抗氧化活性也增强( 在1 2 0 和1 8 0 之间，丙 烯酰胺生成量和产物羟基清除率在一定程度上呈线性关系) ，这些抗 氧化物质有可能作为食品内源性抗氧化剂参与抑制丙烯酰胺的环氧 化，降低环氧丙酰胺的生成，从而控制丙烯酰胺的毒性。 2 模拟体外丙烯酰胺和谷胱甘肽反应，其产物可经尿液直接排 出体外，降低了丙烯酰胺的吸收，减少被氧化的丙烯酰胺浓度。通过 降低丙烯酰胺吸收的方法，为进一步控制丙烯酰胺毒性提供新的思 路。 建立了谷胱甘肽巯基反相高效液相色谱检测方法，通过巯基变化 测得丙烯酰胺和谷胱甘肽一次反应速率和二次反应速率分别为 0 0 4 9 1m i f f l 和0 0 0 0 1m m 。m i n l 。结果表明，丙烯酰胺与谷胱甘肽反 应后可以降低游离丙烯酰胺的含量，有可能在一定程度上起到降低丙 烯酰胺毒性的作用。 关键词：丙烯酰胺；美拉德反应；d p p h 清除；谷胱甘肽 丙烯酰胺毒性控制初步研究 ap r e l i m i nar y s t u d yo nt o x i c i t y c o n t r o lo fa c r y l a m i d e a bs t r a c t a c r y l a m i d e p r o d u c e di nh e a t p r o c e s s e df o o d sh a db e e nk n o w n t ob e n e u r o t o x i c ，g e n o t o x i c a n d c a r c i n o g e n i c i n a n i m a l s p r e s e n t l y , i n v e s t i g a t i o n o fi n h i b i t i n g a c r y l a m i d e - i n d u c e dt o x i c i t y h a d t r i g g e r e d w o r l d w i d ec o n c e r n i tw a sw e l lk n o w nt h a ta c r y l a m i d ec o n v e r t e di n t o g l y c i d a m i d ew a sc a t a l y z e df r o mp 4 5 02 e l nv i v o ，w h i c hp l a y e da n i m p o r t a n tr o l ei nt o x i c i t ye f f e c t s e x o g e n o u sa n t i o x i d a n t c a ni n h i b i t a c r y l a m i d et o x i c i t yb yc o n t r o l l i n ge p o x i d a t i o nt od e c r e a s et h ep r o c e s so f i t sc o n v e r s i o ni n t og l y c i d a m i d es u c ha sv i t a m i n ec ，m e t h i o n i n e ，a l l i c i n ， e t c t h e r ew a sap r e l i m i n a r ys t u d yo nr e d u c i n ga c r y l a m i d et o x i c i t yb y c o n t r o l l i n ge p o x i d a t i o na n de l i m i n a t i o no fa c r y l a m i d e 1 m a i l l a r dr e a c t i o ni nf o o d s p r o d u c e da c r y l a m i d e a n do t h e r p r o d u c t sw h i c he x h i b i t e da n t i o x i d a n ta c t i v i t y t h ea i mo ft h i ss t u d yw a s t oe s t i m a t et h ec o r r e l a t i o no fa c r y l a m i d ew i t ha n t i o x i d a n ta c t i v i t yo f i i i 浙江下商大学硕- 上论文 m a i l l a r dr e a c t i o np r o d u c t s ( m r p s ) b ya g l u c o s e a s p a r a g i n em o d e l a c r y l a m i d ei nr e a c t i o ns o l u t i o n sw a sd e t e r m i n e db yr e v e r s e dp h a s e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p h p l c ) a n t i o x i d a n t a c t i v i t y w a sc h a r a c t e r i z e db y1 ，1 - d i p h e n y - 2 一p i c r y l h y d r a z y l ( d p p h ) ， r e d u c i n gp o w e ra n dh y d r o x y l r a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t y f a c t o r s i n c l u d i n gp h ，t e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e ，t h e v o l u m er a t i oo f g l u c o s e t o - a s p a r a g i n e s ，t h es o r t so fa m i n oa c i da sw e l la ss u g a ra f f e c t i n g t h ea c r y l a m i d ef o r m a t i o nw e r et e s t e dw i t hg l u c o s e - a s p a r a g i n e sa sa m o d e l b yt h ew a y , p r o d u c t sf r o mm a i l l a r dr e a c t i o ne x h i b i t e da n t i o x i d a n t a c t i v i t y t h e r e s u l ti nt h i s p a p e rs h o w e dt h em o r ec o n c e n t r a t i o no f a c r y l a m i d e ，t h eh i g h e ra n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fm r p s ( h y d r o x y lr a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t yp r e s e n t e dg o o dc o r r e l a t i o nw i t ha c r y l a m i d et r e a t e d b e t w e e n12 0 。ca n dls o 。c ) a n t i o x i d a n ta c t i v i t yo fm r p sm a yi n h i b i t a c r y l a m i d et o x i c i t yb yp r e v e n t i n gt h ep r o c e s so fe p o x i d a t i o nf r o mp 4 5 0 2 elt od e c r e a s eg l y c i d a m i d e 2 a c r y l a m i d e g l u t a t h i o n e r e a c t i o ns i m u l a t e di nv i t r ow a s i n v e s t i g a t e d t h er e a c t i o np r o d u c t sw e r ed i r e c t l ye x c r e t e di nu r i n e ，w h i c h d e c r e a s e dt h e a b s o r p t i o n o fa c r y l a m i d en o tt ob ec o n v e r t e di n t o g l y c i d a m i d e r e d u c i n go fa c r y l a m i d ea b s o r p t i o nw i l lp r o v i d ean e ww a y f o rc o n t r o l l i n ga c r y l a m i d et o x i c i t y ar p h p l cm e t h o dw a sd e v e l o p e df o rd e t e r m i n a t i o no fg l u t a t h i o n e s u l f h y d r y l t oo b s e r v et h e a c r y l a m i d e - g l u t a t h i o n e r e a c t i o n a n d i v 丙烯酰胺毒性控制初步研究 p s e u d o - f i r s t - o r d e r r a t ec o n s t a n t sa n ds e c o n d - o r d e rr a t ec o n s t a n t so f a c r y l a m i d ew i t hg l u t a t h i o n ew e r e0 0 4 9 1m i n 一1a n d0 0 0 0 1m m 一1 m i n 一1 r e s p e c t i v e l y i tw a ss h o w e dt h a tt h ep r o c e s so fr e a c t i o nw i l ld e c r e a s et h e c o n c e n t r a t i o no f a c r y l a m i d ef o rc o n t r o l l i n ga c r y l a m i d et o x i c i t y k e y w o r d s ：a c r y l a m i d e ；m a i l l a r dr e a c t i o n ；r a d i c a ls c a v e n g i n g ； g l u t a t h i o n e v 丙烯酰胺毒性控制初步研究 原创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得浙江工商大学或其它教 育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何 贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 虢叠型眺桁乡月同 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解浙江工商大学有关保留、使用学位论文的规定： 浙江工商大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子 文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：袒导师签名 日期： 7 1 丙烯酰胺毒性控制初步研究 1引言 1 1 国内外研究现状 2 0 0 2 年研究人员报道高温油炸食品中含有丙烯酰胺，联合国粮农组织和世 界卫生组织( f a o w h o ) 也建立了致力于丙烯酰胺研究的网站 ( h t t p ：w w w a c r v l a m i d e - f o o d o r g ) ，用于组织和监控全球范围内丙烯酰胺的研 究，美国、英国、瑞士、瑞典、新西兰、挪威、日本、爱尔兰、欧盟、比利时和 澳大利亚也建立了相应网站。各国食品界人士就食品中丙烯酰胺含量及其检测方 法、形成机理、降低其形成的途径、毒性及其代谢过程等进行了广泛且深入的研 究，期德哥尔摩大学和t h eh e a t o xp r o j e c f 课题研究组则成为研究者中的佼佼者。 1 1 1 食品中丙烯酰胺形成机理研究 s t a d l e rr h ( s t a d l e rr h ，i m r eb l a n k ，& n a t a l i av a r g a ，2 0 0 2 ) 和m o t t r a md s ( m o t t r a md s ，w e d z i c h ab l ，& d o d s o na t ，2 0 0 2 ) 以及德国的学者报道的食品 。 中丙烯酰胺形成机理，得到了食品界人士普遍认同。食物在2 0 0 以上发生褐变 时，某类氨基酸如天门冬酰胺与葡萄糖结合形成了丙烯酰胺，它是高温条件下 m a i l l a r d 反应的结果，并且是m a i l l a r d 反应的一部分。 美拉德反应包括初始阶段和a m a d o r i 或h e y n s 产物降解阶段。前者是还原 糖的羰基和氨基酸的氨基形成具有“c = n ”键的s c h i f f 碱( 张根义，2 0 0 3 ) 。具 体的反应过程见图1 1 。 卜嵇”鞑 _ 基- 还原膏( 辕蕾， 掣掣 m 图1 1美拉德反应的初始反应路线 f i g 1 - 1 t h ei n i t i a lr e a c t i o np a t h w a yo fm a i l l a r dr e a c t i o n s c h i f f 碱是美拉德反应的中介物，具有很高的反应性，经a m a d o r i 重排或 h e y n s 重排而生成a m a d o r i 产物或h e y n s 产物，再经不同的途径进行降解，从而 产生多种风味化合物和中间体。其中两条不同的反应路线导致丙烯酰胺产生。 浙江工商大学硕士论文 路线一：s c h i f f 碱经过a m a d o r i 重排生成a m a d o r i 产物，经脱水脱氨生成含 有羰基的化合物，天门冬酰胺在羰基分子存在条件下可以通过s t r e c k e r 降解脱羧 脱氨生成丙烯酰胺，这一反应机理称作s t r e c k e r 途径( w e e n e nh ，19 9 8 ) 。具体 的反应过程见图1 2 。 z _ 人c h - 一n 心+ 吣r 凡一- h 2 0 影甬 洲c e c - 一器器心 c ，h ，太j 瞄罐基化锄 o z ，吣o 口 邑冬o 群 一旨一 n h 3 + m s i h + 1 4 z c = c h c h d l 丙髓h i - ! 炉聋c - - c o k o h +忙c _ 咖+ 吼 图i - 2 在双羰基化合物的存在下通过s t r e c k e r 降解氨基酸( 天门冬酰胺，甲硫氨酸) 而生 成丙烯酰胺的反应机理 f i g 1 - 2 p r o p o s e dp a t h w a y sf o rt h ef o r m a t i o no fa e r y l a m i d et h r o u g hs t r e c k e rd e g r a d a t i o no ft h e a m i n oa c i da s p a r a g i n e si nt h ep r e s e n c eo fd i c a r b o n y lp r o d u c t sf r o mm a i l l a r dr e a c t i o ni n a s p a r a g i n e ，t h es i d ec h a i nzi s - - c h 2 c o n h 2 路线二：s c h i f f 碱通过分子内环化生成唑烷酮，脱羧后形成脱羧a m a d o r i 产 物，其c n 键在高温下断裂生成丙烯酰胺( y a y l a y a nv a ，w n o r o w s k ia ， & l o c a sc p ，2 0 0 3 ) ，此反应机理称为n 一糖苷途径。同时，s c h i f f 碱也可生成 琥珀酰亚胺，阻断丙烯酰胺产生。n 一糖苷途径是低热量反应，并且偶氮甲碱叶 拉德内翁盐比较稳定，因而较后者更易发生。具体的反应过程见图l 一3 ( y uz h a n g ， g e n y iz h a n g , & y i n gz h a n g ，2 0 0 5 ；v a r o u j a na y a y l a y a n ，a n a r z e jw n o r o w s k i ， & c a r o l i n ap e r e zl o c a s 2 0 0 3 ) 。 2 厶萨 艮 融p 义吆r o! o il 一 爵七蹦 人+ 丙烯酰胺毒性控制初步研究 h 一矿 。姒 1 r 一槔 栅旺蕞r 件 籼旺麓 n h 婶洲 。人人 o h r乃叱+ 。 ” 旷v m 。d o 。产鲁 丙螺蕞胺 n h 2 l a“下“ 威x r r 卷 r o a c - r 吖r r e 吖r + i = l o h 畦毵一 鼻氟甲碱叶挣内翁蓝 图1 3 天门冬酰胺a m a d o r i 产物脱羧形成丙烯酰胺的机理 f i g 1 - 3 m e c h a n i s mo fa c r y l a m i d ef o r m a t i o nf r o mad e c a r b o x y l a t e da m a d o r ip r o d u c to f a s p a r a g i n e r = ho r 【c h ( o h ) 】。c h 2 ( o h ) ，n = 0 3 d a v i dv z y z a k ( d a v i dv z y a z k y ，r o b e r ta s a n d e r s ，& m a r k os t o j a n o v i c ， 2 0 0 3 ) 等利用同位素标记研究丙烯酰胺形成机理，并讨论了不同羰基来源物质和 天门冬酰胺反应生成丙烯酰胺含量，具体过程见图1 4 。结果表明，羰基化合物 的链越短，产生的丙烯酰胺含量越多，其中按照生成量由大到小为乙二醛 甘油 醛 核糖 脱氧葡萄糖 d 葡萄糖。r i c h a r dh s t a d l e r 等通过对天门冬酰胺与双羰基 化合物反应的研究发现g l y c o c o n j u g a t e 对丙烯酰胺的生成具有重要的作用 ( r i c h a r dh s t a d l e r , f a b i e nr o b e r t ，& s o n j ar i e d i k e r , 2 0 0 4 ) 。m i c h a e lo r a n v o 西研 究发现3 a m i n o p r o p i o n a m i d e 是形成丙烯酰胺重要的中间物质( m i c h a e l g r m a v o 西& p e t e rs c h i e b e r l e ，2 0 0 6 ) ，这与前述研究的结果具有相通性。中国农业 大学的研究人员在此基础上进行进一步研究发现a 一双羰基化合物与丙烯酰胺形 成具有高度相关性，其中甲基乙二醛与丙烯酰胺之间相关系数为0 9 3 1 ，在丙烯 酰胺的生成过程中具有重要的作用( y u a ny u a n ，g u a n g - h u az h a o ，& x i a o - s o n gh u ， 2 0 0 7 ) 。此外，a d a mb e c a l s k i 及其研究者们认为丙烯酰胺可以由甘油加热降解 产物丙烯醛反应而来，且此反应机理为富含油食品中形成丙烯酰胺的主要途径 ( a c h i mc l a u s ，g e o r gm w e i s z ，& a n d r e a ss c h i e b e r , 2 0 0 3 ) ，具体见图1 5 ( a d a m b e c a l s k i ，b e n j a m i np y l a u ，& d a v i dl e w i s ，2 0 0 3 ) 。 3 浙江工商人学硕士论文 一l f ”甚h - i f = f ”f棚。 ”建心一1 l 。妻一一世一。 ”r + 艮c l - t m器k + 撇= b yd i f f e r e n tc a r b o n y lg r o u p s g l y c e r o l 1 1 2 食品中丙烯酰胺形成影晌因素 1 1 2 1 温度 m o t t r a m 等采用等摩尔天门冬酰胺和葡萄糖加热反应，发现在1 2 0 时开始 生成丙烯酰胺，随着温度的升高，其生成量增加，至u 1 7 0 左右达到最高值，1 8 5 时生成量开始降低。瑞士研究人员也有相似的结果，在1 6 7 1 7 0 丙烯酰胺生 成量达到最高( k a t e l lf i s e l i e r , d i e g ob a z z o c c o ，& f a b i a n ag a m a - b a u m g a r t n e r , 2 0 0 5 ) 。j e r o e n 了k n o l 等研究发现在2 0 0 条件下，5m i n 时丙烯酰胺生成量最大， 1 2 0 条件下加热4 5m i n 时丙烯酰胺的生成量基本没有大的变化( j e r o e nj k n o l ， w i la m v a nl o o n ，& j o z e fp h l i n s s e n ，2 0 0 5 ) 。 日本科学家指出，马铃薯在低温( 2 4 ) 中保存，其中的淀粉部分会转变 成还原糖，进行油炸后，丙烯酰胺生成量会提高1 0 倍以上。瑞士科学家利用4 c 储藏了2 0 天的土豆与冷冻储藏的相比较，结果表明前者产生的丙烯酰胺是后者的 两倍，平均达到了16 0m g k g ( k a t e l lf i s e l i e r , a n n e t t ah a r t r n a n n ，& a l e s s a n d r o f i s c a l i n i ，2 0 0 5 ) 。 奥地利科学家研究却发现长时间和高温反而会降低咖啡豆烘烤中产生的丙 烯酰胺含量( b a g d o n a i t ek & m u r k o v i cm ，2 0 0 4 ) ，含淀粉类的样品随加热时间增 加，丙烯酰胺含量降低( e r l a n db r a t h e n & s v e i nh a l v o rk n u t s e n ，2 0 0 5 ) 。 4 丙烯酰胺毒性控制初步研究 1 1 2 2 时间 s t a d l e r 等将葡萄糖与天门冬酰胺、谷氨酰胺和蛋氨酸在1 8 0 下加热5 6 0 m i n 对比实验，结果表明天门冬酰胺产生丙烯酰胺最多，但5m i n 后随着反应时 间的增加而下降；谷氨酰胺加热1 0m i n 时丙烯酰胺含量达到最高，之后保持不 变；蛋氨酸在3 0m i n 内随加热时间延长，丙烯酰胺随之增加，后达到一个平稳 水平。 在实验室模拟烹制土豆的研究中发现，超过1 0 0 时，丙烯酰胺浓度随加热 时间的延长而增加，并在一段时间后趋于平缓。 在短时间的烹制中，食品中丙烯酰胺含量与食物的形态有关，食物表面积越 大则丙烯酰胺生成量越大，例如薯片中丙烯酰胺含量就大于薯条。但在长时问加 热中，反应达到完全时，丙烯酰胺生成量就与样本形态无关了。 1 1 2 3 羰基化合物 葡萄糖、果糖、乳糖分别与天门冬酰胺共热时均会产生丙烯酰胺，说明还原 糖的种类不是影响丙烯酰胺产生的主要因素。但是还原糖的含量对丙烯酰胺的生 成有较大影响，还原糖含量越低，经高温加工后所形成的丙烯酰胺含量越少( k o n i g r o b ，m a u r u sb i e d e r m a n n ，& s a n d r ab i e d e r m a n n b r e m ，2 0 0 3 ) 。 在超过1 6 0 时，蔗糖不会促进丙烯酰胺形成，反而会加速其分解；葡萄糖 消除作用占优势；果糖则更能促进丙烯酰胺形成。 s a n d r a ( s a n d r ab ，a n j an ，& k o n ig ，2 0 0 3 ) 等从颜色、i ：1 味、丙烯酰胺含 量三个方面进行研究得出，马铃薯应储存在4 以上，还原糖含量在0 2 - 1g k g 之间则最适合烘烤和煎炸。 1 1 2 4 氨基酸 丙烯酰胺只有在氨基酸和羰基类化合物共同存在时才可形成，二者最适摩尔 比为1 ：1 ，单独对氨基酸加热则不会产生。其中，天门冬酰胺较其它氨基酸在食 品加热过程中更易形成丙烯酰胺，其生成量是谷氨酰胺和蛋氨酸的数百倍到上千 倍，故在加工含有天门冬酰胺较多的食物时要避免高温。 e r l a n db r a t h e n 等在土豆漂烫过程中加入甘氨酸或谷氨酸盐可降低3 0 丙烯 酰胺生成量，在生面团中加入甘氨酸同样可以降低丙烯酰胺的生成( e r l a n d b r a t h e n ，a g n i e s z k ak i t a , & s v e i nh a l v o rk n u t s e n ，2 0 0 5 ) 。 5 浙江工商人学硕士论文 1 1 2 5 油脂 有报道称脂肪氧化产生的羰基化合物可促进丙烯酰胺形成，但比利时研究者 却发现油脂代谢产物甘油、单甘油酯和双甘油酯对丙烯酰胺的生成没有显著影响 ( f r 6 d & i em e s t d a g h ，b r u n od em e u l e n a e r ，& c a r l o sv a np e t e g h e l r l ，2 0 0 7 ) ，此外油 脂种类对丙烯酰胺的生成也基本没有影响( j s e w i l l i a m s ，2 0 0 5 ；t a e y m a n sd ， a s h b yj ，& b l a n ki ，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 6 水 水在美拉德反应中既是反应物，又是反应物溶剂及其迁移的载体( h a n s l i n g n e r t ，s p i r o sg r i v a s ，& m a r g a r e t h aj a g e r s t a d ，2 0 0 2 ) ，过于干燥和潮湿均不利于 反应的进行，最适宜的水份含量为1 2 1 8 。含有1 0 水份的面粉在1 6 0 加热3 0m i n 丙烯酰胺生成量是干燥面粉的1 0 倍，含有l o 水份的土豆高温烘 制后，丙烯酰胺生成量也略高于干燥样本。 k s l e u n g y 等测定了5 3 0 水份含量的样品丙烯酰胺的生成量，结果发 现随着水分含量的升高，丙烯酰胺生成量降低，水份含量在5 时生成的丙烯酰 胺的量最多( k s l e u n g y ，a l i n z ，c k t s a n g y , 2 0 0 3 ) 。 f r a n c op e d r e s c h i 等发现经水浸泡后的土豆片经油炸后丙烯酰胺含量降低，而 经热水长时间漂烫后的土豆片由于除去了大量的葡萄糖和天门冬酰胺，从而降低 了丙烯酰胺的生成量( f r a n e op e d r e s c h i ，k a r lk a a c k ，& k i tg r a n b y , 2 0 0 6 ) 。该研 究小组进一步将土豆片放于0 0 0 2g ln a c l 溶液中，2 5 ，3 0 0r p m 条件下搅拌 5m i n ，丙烯酰胺生成量降低了9 0 ( f r a n c op e d r e s c h i ，o s c a rb u s t o s ，& d o m i n g o m e r y ，2 0 0 7 ) 。 。 1 1 2 7p h 值 研究人员发现添加1 以下的柠檬酸可有效降低食品加工过程中生成的丙 烯酰胺，如果浓度大于1 ，柠檬酸味道较明显，影响了食品的风味。 f r a n c op e d r e s c h i 等( f r a n c op e d r e s c h i ，k a r lk a a c k ，& k i tg r a n b y , 2 0 0 4 ) 对比 研究水、热水和柠檬酸处理后土豆片中丙烯酰胺生成量，在1 5 0 时经柠檬酸处 理的土豆片中丙烯酰胺下降了7 0 ，经水和热水处理的样品中丙烯酰胺均有不同 程度的降低。无论哪种处理条件下，丙烯酰胺均随着加热温度的升高和时间的增 加而增加。 6 丙烯酰胺毒性控制初步研究 n a h c 0 3 和n a h s 0 3 在碱性条件下能分解残留丙烯酰胺，酒石酸也具有相同 的效果( m a y ag r a f , t h o m a sm a m r e i n ，& s t e p h a ng r a f , 2 0 0 6 ) 。在h 2 0 2 存在时， 阿魏酸脱除丙烯酰胺能力大大增加( 欧仕益，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 8 其它 d h i r a j ( d h i r a ja v & k a l i d a ss ，2 0 0 3 ) 等研究发现油炸薯条经鹰嘴豆粉糊前 后丙烯酰胺含量由14 9 0i _ t g k g 降至5 8 0i - t g & g 。s u r d y k 等研究得出产品的颜色与 丙烯酰胺形成密切相关( s u r d y kn ，r o s e nj ，& a n d e r s s o nr ，2 0 0 4 ) 。 v u r a lg 6 k m e n 等通过实验发现土豆片表面和内部丙烯酰胺量相差较大，1 9 0 条件下加热9m i n ，内部所含丙烯酰胺仅为3 7 6n g g ，而外部则高达6 4 7 6n g g ， 这主要是因为无论外部温度高达多少，内部温度不会超过1 0 3 1 0 4 ( v u r a l g 6 k m e n ，t u n 9k o r a yp a l a z o 霉, l u ，& h a m i d ez s e n y u v a ，2 0 0 6 ) 。 天门冬酰胺酶降解天门冬酰胺以及乙酰化酶将天门冬酰胺乙酰化，可控制丙 烯酰胺最终生成量；添加含巯基的化合物或紫外线将产生的丙烯酰胺破坏。不同 的加热方式对丙烯酰胺的形成有较大的影响，油炸有利于丙烯酰胺产生；微波加 热生成丙烯酰胺含量较少( sb e l g i ne r d o g d u ，t u n gk o r a y p a l a z o 霉l u ，& v u r a l g 6 k m e n ，2 0 0 7 ) ；水煮食品则不产生丙烯酰胺。 1 1 3 丙烯酰胺检测方法 丙烯酰胺是白色结晶状固体，易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮，微溶于苯，易 聚合，分子结构c h 2 = c h c o n h 2 。丙烯酰胺的检测大多从官能团如烯键、羰基、 氨基、乙烯基和酰胺基入手。美国职业安全健康管理局( o s h a ，1 9 8 0 ) 监测空 气中丙烯酰胺的微量分析方法以及饮水中丙烯酰胺的检测都采用了色谱法。由于 食品中成分复杂，样品千差万别，目前国际上公认的食品中丙烯酰胺检测方法是 美国食品药品管理局( f d a ，2 0 0 2 ) 建立的液质联用检测方法( l c m s m s ) 和 气质检测方法( g c m s ) 。无论哪种检测方法无一例外的包括以下步骤：样品均 质或磨碎，内标物的添加，样品提取，提取物去脂和蛋白质，离心分离，衍生化 或非衍生化，再用气相色谱检测或固相萃取后用液相色谱测定。 1 1 3 1 饮水中丙烯酰胺分析方法 聚丙烯酰胺具有一定的保湿性和粘合力，对悬浮的固体微粒有良好絮凝作用 而作为絮凝剂用于水处理。虽然聚丙烯酰胺用于水处理时添加量控制在百万分之 7 浙江工商大学硕土论文 几的水平，但是丙烯酰胺是聚丙烯酰胺生产的前提物质，水中会残留有未反应的 微量毒性丙烯酰胺单体。 我国水源水丙烯酰胺卫生检验标准( g b11 9 3 6 8 9 ) 采用气相色谱一电子捕 获检测法( g c e c d ) 。在强酸条件下，溴化钾一溴酸钾反应生成的溴与丙烯酰 胺的烯键加成，衍生为a ，p 一二溴丙酰胺( 2 ，3 一d b p a ) ，再利用电子捕获检测器 检测，1 0 0m l 水样的最低检测浓度为0 0 0 0 1 5m g l 。聚丙烯酰胺中残留丙烯酰 胺含量测定方法( g b1 2 0 0 5 3 8 9 ，g b1 2 0 0 5 4 8 9 ，g b1 2 0 0 5 5 8 9 ) 分别采用溴化 法、液相色谱法和气相色谱法检测丙烯酰胺含量。美国环保局规定水中丙烯酰胺 检测( m e t h o d e8 0 3 2 a ，1 9 9 6 ) 采用气相色谱一电子捕获检测法( g c e c d ) 。 1 1 3 2 空气中丙烯酰胺分析方法 生产车间空气成分较复杂，o s h a 在1 9 8 0 年用一个取样序列来完成待测空 气的捕集，取样序列由玻璃棉过滤器串联一个标准硅胶吸收管组成。为了避免玻 璃棉吸附的丙烯酰胺微粒在空气中挥发使结果偏低，抽吸1 2 0l 空气后，在现场 立刻用甲醇洗提滤器，硅胶管密封后回到实验室也用甲醇提取。提取液经填充柱 分离、氮磷检测器检定，用丙烯酰胺做内标，标准曲线法定量，检出限为0 0 0 3 8 m g m 3 。 我国规定了车间空气中丙烯酰胺卫生标准( g b11 5 2 5 8 9 ) ，采用饱和溴水 对样品进行衍生化后，电子捕获器检测，同时规定车间空气中丙烯酰胺的最高容 许浓度为0 3m g m 3 ，检测限为0 0 5g g m 3 。 1 1 3 3 食品中丙烯酰胺分析方法 英国科学试验中心( c a s t l el ，1 9 9 3 ) 用毛细管气相色谱一质谱联用技术 ( g c m s ) 检测了用于蘑菇生长的聚丙烯酰胺凝胶中丙烯酰胺单体的含量，检 出限为0 0 0 0 5m g k g 。 2 0 0 1 年1 0 月德国联邦消费者健康与动物用药保护学会( b g v v ) 公布了液体食 物模拟物中丙烯酰胺液相色谱直接测定法，适用于含量在0 0 1 - 0 1m g k g 的脂肪 类食物如葵花籽油等丙烯酰胺含量检测。 2 0 0 2 年3 月瑞典斯德哥尔摩大学，丙烯酰胺溴化后用气相色谱一质谱联用技 术( g c m s ) 检测其含量，检出限0 0 3 0m g k g 。瑞典国家食品管理局( n f a ) 为增大样品分析量，建立了液相色谱串联质谱( l c m s m s ) 分析方法。世界卫 8 丙烯酰胺毒性控制初步研究 生组织( w h o ) 和联合国粮农组织( f a o ) 专家研讨会认同了这两种方法，且 认为两种方法的结果有较好的相似性，前者检出限为0 0 0 5 - 0 0 1 0m g k g ，后者为 0 0 2 0 - 4 ) 0 5 0m g k g 。f d a 食品中丙烯酰胺检测标准和d dc e n t s1 3 1 3 0 1 0 ：2 0 0 5 也规定了食品中丙烯酰胺检测方法。我国规定了食品中丙烯酰胺含量的测定方法 为气相色谱一质谱法( g b t5 0 0 9 2 0 4 2 0 0 5 ) ，采用标准加入法定量，检出限为7 g g k g 。 以下具体介绍食品中丙烯酰胺的检测步骤： ( 1 ) 样品前处理 由于食品在高温条件下易产生丙烯酰胺，此外，由丙烯酰胺单体合成的聚丙 烯酰胺用途广泛，所以毒性物质丙烯酰胺存在范围广，固态样品包括油炸类、烘 烤类、生鲜类、含淀粉类、含蛋白质类、巧克力、咖啡、糖果、大米、坚果、肉 类等，液态样品如水、高分子聚合物等，特殊样品如实验室标准样品、模拟样品、 血液制品、医用材料、尿液、化妆品、生物组织及材料、番茄生产用培养基等。 不同的样品在检测前需要进行不同的样品预处理，磨碎、烘干、打浆或溶胀，样 品暂时不用时还需要进行低温保存。 样品的提取是丙烯酰胺测定极其重要的第一步，包括水提法( e r i kv p e t e r s s o n ，j o h a nr o s o a ，& c h a r l o t t at u r n e r ，2 0 0 6 ) 、有机溶剂提取法和其它方法。 水提法通常为冷提和热提，热提采用6 0 , - - 7 0 水浴( h a n im a 1 一o m o o r ，2 0 0 5 ) ， 有机溶剂提取法有纯甲醇、甲醇水( 8 ：2 ) 、丙酮、乙醇水、正丙醇水( 4 ：1 ) 、 二氯甲烷乙醇( t h u e r r yd e l a t o u r , a d r i e n n ep e a r i s s e t ，& t i l lg o l d m a n n ，2 0 0 4 ) 等。 为了提取出高脂肪食品脂肪粒中丙烯酰胺，采用丁酮提取可以达到很好的效果。 此外，浙江大学( y uz h a n g ，y i p i n gr e n ，& h a n g m e iz h a o ，2 0 0 7 ) 采用氯化钠水溶 液提取法，避免了乳状液的产生并达到了样品提取的要求。萃取方式包括索氏提 取法( j 6 r g e nr p e d e r s e n & j i mo o l s s o n ，2 0 0 3 ) 、高压液相萃取( v y u s a ，g q u i n t a s ，& o p a r d o ，2 0 0 6 ) 、加速溶剂萃取、固相微萃取和回流萃取( j s t e p h e n e l m o r e ，g e o r g l o sk o u t s i d i s ，& a n d r e wd o d s o n ，2 0 0 5 ) 等方法。丙烯酰胺在酸性条 件下更加稳定，故0 1 乙酸水和o 1 甲酸也是比较可行的提取条件。再者，研 究人员( t g o l d m a n n ，a p e r i s s e t ，& m c b e r t h o l e t ，2 0 0 6 ) 发现碱性条件下( p h = 1 2 ) 提取，丙烯酰胺含量会升高，其原因还有待进一步的研究。为了提高提取 9 浙江工商大学硕士论文 效果，样品与溶剂的比例为1 ：5 1 ：2 0 ，通常采用l ：1 0 为最佳。提取过程中进行振 荡、高速匀浆、超声等也可相应提高提取率。当然，温度、提取时间、提取次数 等也都是影响提取率的重要因素。 ( 2 ) 添加内标物 食品中丙烯酰胺的含量本身就较低，再经样品处理往往会使测定结果更低， 采用标准加入法则可以弥补丙烯酰胺的损失，提高检测的准确性。内标物质的添 加可以在提取前也可在提取之后，需要特别注意的是在添加内标物质时要使其与 样品充分混匀，一般需要振荡数十分钟( 1 5m i n 左右) 。内标物质的选择也较多， 如2 ，3 d i b r o m o 2 m e t h y l p r o p i o n a m i d e 、b c 3 。a a 、1 3 c 1 a a 、d 3 a a 、n ，n 一二甲基 丙酰胺、丙酰胺、正十六烷、2 ，3 一d i b r o m o - n , n d i m e t h y l p r o p i o n a m i d e