（食品科学专业论文）基于紫外光谱和还原力的复原乳检测.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 近年来，牛乳因其较高的营养价值越来越受到人们的关注，牛乳及其乳制品也受到了广大消 费者的喜爱。然而，牛乳中掺杂复原乳的乳品质量安全事件屡屡发生，严重扰乱了正常的市场秩 序。尽管农业部近日发布了巴氏杀菌乳和u h t 灭菌乳中复原乳的鉴定标准，但正式的国家 检测标准还在研究之中。 本文力求建立鲜牛乳、巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳中复原乳的检测方法，突破监管违禁添加 复原乳和不正确标识复原乳的技术瓶颈，维护消费者知情权，促进乳业健康发展。 紫外光谱方法适用于对全脂乳粉复原乳的检测。以a 值和b 值分别作为检测指标，检测掺入 复原乳的比例大于1 0 和小t - 1 0 的牛乳样品。牛乳成分含量的季节差异，引起四季复原乳检测 结果的变化。本实验分别得到了四个季节全脂复原乳的掺入比例与鲜牛乳和巴氏乳样品a 、b 值 的一元线性回归方程。最低检测限可以达到4 。同时比较了掺入不同全脂乳粉复原乳的检测结果。 经实验发现，选择不同的乳粉复原乳对巴氏乳的检测结果影响比较小。本实验对不同巴氏杀菌条 件f 复原乳检测的情况也进行比较，发现不同巴氏杀菌条件对复原乳检测的a 值影响较火，对b 值影响相对较小。紫外光谱法对新制备的u i t 乳和不同贮存条件( 4 及2 5 贮存1 5 d ) f 的u h t 乳进行复原乳检测，其最低检测限均可以达到2 0 。但是，u h t 乳的a 值与全脂奶粉的掺入比例 并不呈线性正相关。通过对b 值的分析，发现本实验方法，对掺入复原乳比例小于1 0 的u i f f 乳 样品，不具有良好的检测效果。 本论文还借鉴和改进了a o a c 的还原力检测方法，对杭州地区掺入全脂复原乳的鲜牛乳、巴 氏乳进行检测。实验结果显示，使用还原力的检测方法，对鲜牛乳和巴氏乳中的复原乳进行检测， 它们的最低检测限均可达到5 。随着掺入复原乳比例的增加，p r s 价逐渐增大。对上述数据进行 分析，p r s 价与复原乳的掺入比例罨线性正相关。对复原乳的掺入比例小于6 0 9 6 ；n 达到1 0 0 的两 种情况f 的一元线性回归方程及判定系数进行比较，可以得出结论：利用p r s 价与复原乳掺入比 例的一元线性回归方程进行复原乳检测的时候，检测掺入复原乳比例小于6 0 的样品更加准确。 关键词：复原乳，紫外光谱，还原力 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t c o wm i l ki sab i o l o g i c a l l yc o m p l e xf l u i d ，c o n s t i t u t e dm a i n l yo fw a t e r , p r o t e i n s ，l a c t o s e ，f a ta n d i n o r g a n i cc o m p o u n d s ，t h em a j o r i t yo ft h e s es u b s t a n c e sh a v i n gi m p o r t a n tn u t r i t i o n a la n dt e c h n o l o g i c a l v a l u e n o w a d a y s ，m i l ka n dd a i r yp r o d u c t sa r em o r ea n dm o r ep o p u l a ri nc h i n a h o w e v e la d u l t e r a t i o n o fr a wm i l kw i t hr e c o n s t i t u t e dm i l ki sr e l a t i v e l yc o m m o nd u et os e a s o n a lf l u c t u a t i o no ft h ea v a i l a b i l i t y o f r a wm i l ka n dt h eh i g h e rp r i c eo f m i l kc o m p a r e dt om i l kp o w d e r w h e nl e g i s l a t i o np r o h i b i t ss u c hp r a c t i c et h ed e t e c t i o no fr e c o n s t i t u t e dm i l kd e p i c t e da sf r e s hm i l k o rm i x e dw i t hf r e s hm i l k ，b e c o m e sa na n a l y t i c a lp r o b l e m t h e r e f o r e ，t h ed e v e l o p m e n to fr e l i a b l e d e t e c t i o nm e t h o d st h a tc a nb ea p p l i e dt or a wm i l lp a s t e u r i z e dm i t k ，a n du h tm i l ki so fg r e a ti n t e r e s t i nd a i r yi n d u s t r y r e c e n t l y , m i n i s t r yo fa 鲥c u l t u r eo ft h ep e o p l e sr e p u b l i co f c h i n ap u b l i s h e dt h e s t a n d a r d “d e t e c t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no fr e c o n s t i t u t e dm i l ki np a s t e u r i z e dm i l ka n du h tm i l k ”at h e p r o d u c t i o n o fh y d r o x y m e t h y lf u r f u r a l d u r i n gh e a tt r e a t m e n t h a sb e e nu s e d a sa ni n d i c a t o ro f r e c o n s t i t u t e dm i l k b u tt h ef o r m a ln a t i o n a ls t a n d a r di ss t i l lu n d e rr e s e a r c h t h ep u r p o s eo ft h i sp a p e ri s t od e t e c ta n dq u a n t i f yt h ea d u l t e r a t i o no fr e c o n s t i t u t e dm i l ki nr a wm i l k ，p a s t e u r i z e dm i l k ，a n du h t m i l k ， u l t r av i o l e ta n dv i s i b l es p e c t r a ( 2 0 0t o9 0 0 n m ) i su s e dt od e t e r m i n et h ea d u l t e r a t i o no ff r e s hm i l k w i t hr e c o n s t i t u t e df u l lf a tm i l kp o w d e r aa n dbv a l u ea i eu s e dt od e t e c ta n dq u a n t i f ya d u l t e r a t i o n i n t h i sp a p e r , r e c o n s t i t u t e dm i l ki nr a wm i l ka n dp a s t e u r i z e dm i l ki nf o u rs e a s o n sa r ed e t e c t e dr e s p e c t i v e l y , b e c a u s eo f t h es e a s o n a le f f e c t so nm i l kc o m p o s i t i o n s r e g r e s s i o na n a l y s i so f t h er e s u l t sr e v e a l e dl i n e a r r e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h ea ( o r1 3 ) v a l u ea n dt h ep e r c e n t a g eo fr e c o n s t i t u t e dm i l ki nm i x t u r e sf r o m0 1 0 0 ( o r0 l o 1 0 o f r e c o n s t i t u t e dm i l kc o u l db ed e t e c t e di nr a wm i l ka n dp a s t e u r i z e dm i l kb ya v a l u e a n d4 o fr e c o n s t i t u t e dm i l kc o u l db ed e t e c t e di nr a wm i l ka n dp a s t e u r i z e dm i l kb ybv a l u e d i f f e r e n tk i n d so ff u l lf a tm i l kp o w d e ra r ea s oc o m p a r e di nt h i se x p e r i m e n t t h e r ea r en og r e a t d i f f e r e n c e sb e t w e e nt h er e s u l t s av a l u e so f t h ea d u l t e r a t e dm i l ku n d e rd i f f e r e n tp a s t e u r i z i n gc o n d i t i o n s ( l 1 1 ：h t s t ) a r ed i f f e r e n t b yu s i n gt h i sm e t h o d ，l e v e l so fr e c o n s t i t u t e dm i l ka sl o wa s2 0 w e r e d e t e c t e di nu h tm i l k b u tt h e r ei sn ol i n e a rr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h ea ( o rb 1v a l u ea n dt h ep e r c e n t a g e o fr e c o n s t i t u t e dm i l k 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t t h i sp a p e ra l s od e v e l o p e da o a cm e t h o dt od e t e c tr e c o n s t i t u t e dm i l ki nr a wa n dp a s t e u r i z e dm i l k b yd e t e r m i n i n gt h ep r o t e i nr e d u c i n gv a l u e t h er a wm i l ka n dp a s t e u r i z e dm i l ki nh a n g z h o ua d u l t e r a t e d b yf u l lf 址m i l kp o w d e ra r ed e t e c t e d i ti sp o s s i b l et od e t e c ta n dq u a n t i f ya d d i t i o n so f5 o rm o r eo f r e c o n s t i t u t e dm i l kt or a wm i l ka n dp a s t e u r i z e dm i l k t h el i n e a rr e l a t i o n s h i p sb e t w e e nt h ep r sv a l u ea n d t h ep e r c e n t a g eo fr e c o n s t i t u t e dm i l kp e r f o r m e db e t t e ri nt h el i n e a rr a n g eo f0 - - 6 0 f o rr e c o n s t i t u t e d m i l k t h a n0 - - 1 0 0 k e y w o r d s ：r e c o n s t i t u t e dc o wm i l k ，u vs p e c t r a , p r o t e i nr e d u c i n gp o w e r 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 1 1 牛乳产业的发展 第一章绪论 牛乳富含脂肪、蛋向质、矿物质、维生素、生物酶、乳糖和水等。它不仅营养价值高，而且 还可以成为食品的功能性配料。近年来，牛乳冈其较高的营养价值越来越受到人们的关注，牛乳 及其乳制品也受到了广+ 大消费者的喜爱。目前，全国奶业发展的速度较快，奶类总产量和市场消 费每年都以2 0 以上的速度增长。随着人们膳食结构的改变，营养水平的提高，人均g d p 水平和 国民收入的增长以及农业产业结构的调整和农民收入的增加，今后我国奶业发展的空间仍然很 大。 为了延长乳品的保质期和调节生产消费的不协调，生产商采用浓缩和干燥 ：艺将牛乳中的大 部分水除去，制成了通常所说的乳粉1 “。1 9 3 0 年喷雾干燥技术发展迅速，乳制品的干燥加工实现 了大规模集约化，乳粉类产品逐渐受到了人们的青睐，乳粉类产品也成为连接奶牛牧场和最终消 费市场的重要组成部分。乳粉的贸易，以及它在进出口方面的优势也越来越得到全世界的重视。 在我国，畜牧业和奶牛业发达的地带多处于边远不发达地区，人均乳制品的消费远远落后于 乳品加工业；而乳制品的高消费区，例如上海、北京和广州等大城市，多数情况f 不是奶牛生长的 区域。从全国范围考虑，奶牛饲养业和乳品加工业逐渐不能满足人们日益逐渐增长的消费需求。 在这种情况下，复原乳在现代乳制品生产中的应用更加广泛。在我国的奶制品生产中，奶粉的生 产约占整个奶制品总产鼍的8 0 左右”j 。同时，每年中国都要从澳大利亚、新西兰和美国进口大 量的乳粉而国内的大包装全脂乳粉、各种各样的食品专用乳粉和工业乳粉也在迅猛发展。 目前，在我国，直接消费的乳粉产品呈f 降趋势。随着巴氏杀菌，超高温灭菌等技术的发展； 发酵乳制品、乳酸菌饮料和奶酪产品的生产：牛乳加l ：业的本地化趋势。以及物流运输行业的发 展，都直接影响乳粉类产品的消费】。 1 2 乳品的质量安全问题 近年来，乳品质量安全问题是一个重大的公共卫生问题，2 0 0 2 年初，乳业市场爆发了“无抗 奶”事件，光明率先打出“无抗牌”，三元立刻跟进。2 0 0 4 年春节刚过，阜阳爆发了震惊全国的 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 “大头娃娃”事件。2 0 0 5 ，雀巢遭遇碘超标、光明回炉奶、以及各地的“早产奶”等事件不断出 现。 屡屡发生的乳品质量安全和掺假事件，直接影响到人民群众的身体健康，严重打击了消费者 对国产乳制品的信心，导致不公平的竞争，扰乱正常的市场秩序，国内乳晶企业损失惨重，甚至 给经济发展和社会稳定造成不良影响。所以，健全乳品质量安全的法律体系，完善乳品掺假的检 测体系，对于制造商和消费者都是十分重要的。 1 3 复原乳检测的法规和标准体系 1 3 1 复原乳检测的法规体系 世界上许多国家都建立了相关的法律体系，保护消费者的权益，保障公平贸易。为保证我国 乳品的质量安全，必须从原料奶的质量抓起，加快建立健全乳品质量安全法规和标准体系，建立 健全乳品质量安全检测及检验体系。 2 0 0 0 年我国正式实施的g b 5 4 0 8 2 - 1 9 9 9 灭菌乳中，强制条款中明确规定：“以复原乳为 原料的产品虑加以标示”。2 0 0 5 年对还原奶的监管成为国家质检总局重要的- 作环节。2 0 0 5 年9 月2 0 日国务院办公厅下发z 4 号文件关于加强液态奶生产经营管理的通知强调，自2 0 0 5 年 1 0 月1 5 日起，凡在产品生产加工过程中使用“复原乳”的，不论数量多少，生产企业必须在其 产品包装上醒目标注“复原乳”，以便丁消费者做出购买选择。如在包装上不注明复原乳，则构 成对消费者的欺诈，同时对奶农的利益也造成损害。2 0 0 5 年l o 月1 日，被乳鼎行业俗称为“禁 鲜令”的强制性国家标准预包装食晶标签通则和预包装特殊膳食食品标签通则如期实施。 从国家工商管理总局获悉，2 0 0 6 年的食品安全专项整治中，还要继续把奶制品作为重点产品，严肃 查处销售掺杂使假的违法行为”2 。 1 3 2 复原乳检测的标准体系及存在的问题 国家有关管理部门认为，为了保证通知的执行更具可操作性，应该尽快制定出巴氏杀菌 乳、灭菌乳中复原乳的检测办法，建立复原乳检测的国家标准、行业标准。同时，制订出巴氏杀 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 菌乳、灭菌乳和酸牛奶热处理强度监控标准，加强对热处理强度的控制，减少加工过程造成牛乳 营养的损失，进一步提高消费市场上乳品的质量。 乳制品中是否掺有复原乳，靠眼看、手摸、口尝等感官评定，是难以分辨出来的。必须依靠 科学的检测方法和特定的检测仪器才能够进行复原乳检测。但是，从目前的情况看，只有农业部 发布了巴氏杀菌乳和u ht 灭菌乳中复原乳的鉴定标准，提出了根据糠氨酸和乳果糖在液态 乳中的含量，判定巴氏杀菌乳和u h t 灭菌乳中是否含有复原乳成分的技术路线，但此标准需要 大量试剂，检测方法复杂，测定时间氏，仪器设备要求高。目前，正式的国家复原乳检测标准还 处在研究之中。 由于复原乳检测的正式标准还在研究阶段，对市场流通的液态奶是否含有复原乳，有关部门 很难实施有效的监管，众多乳品企业只要口头上不承认自己生产的产品中含有复原乳，就能蒙混 过关。国家质监总局指出，如果不能够尽快建立准确可靠的复原乳检测国家标准，那么不执行规 定的企业将得不到及时有效的查处，诚信守法的企业将受到不公平待遇，奶农的利益将继续受到 损害。 由此可见，建立简便、准确、稳定的复原乳检测方法，填补我国复原乳检测方面的空白，突 破监管违禁添加复原乳和不正确标识复原乳的技术瓶颈，对维护消费者知情权促进乳业健康发 展将起到积极的推动作用。 1 4 复原乳检测的技术路线 在牛乳加工过程中，热处理对蛋白质的影响比较大，并且使牛乳的营养成分受到了一定程度 的破坏。牛乳的热处理程度是对乳制品进行分类的重要鉴定标准之一，也是评价乳品质量的重要 指标。所以，牛乳在n - - 过程中，各种成分所发生的变化及损失，可以作为复原乳检测的技术路 线和重要的参考指标。 1 4 1 蛋白质在乳品加工过程中的变化 牛乳蛋白质受热会发生变性，酪蛋白对热比较稳定。而乳清蛋白对热不稳定，易发生热变性。 温和的热处理不影响乳蛋白的一级结构和肽键，而是作用于二级结构和三级结构。加热产生的某 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 些变化可能导致蛋自质的凝嘲，这些变化包搔：p h 值下降、磷酸钙沉淀、乳清蛋白的变饿及其与 酪蛋白翡反瘦，笺拉德褥燮、胶束结擒变化等。 酪蛋自在牛乳p h 值达n 4 7 的时候，尝发生沉淀“i 。乳中含有4 种不同类型的酪蛋白即a ， 8m 和k 酶蛋白。正常牛乳的酪蛋白，谯低于l o o 的激发自热时，化学性质不受影响：l o o 长对闽加燕或在1 2 04 c 撩热对，发生帮分求解和脱磷酸i1 4 04 c 竣土| 耋瀑度船热对，掰芽始凝霞”。 乳清蛋囱的热稳定性总体而肓低于酪畿自，容易发生热变性和凝固。其中a 一乳自赞白的热 稳定性最蕙，s 一孚l 球蛋白殿虫清白蛋白次之，免疫球蛋窃最低”。加热3 0 m i n 时，它们的变性温 度分掰是：免疫球蛋矗7 0 e 、盘清岛蛋自7 4 c 、s 一乳球鬣白、n 一乳国蛋r 9 6 4 c 。程北温度 时间内。月希、胨组分不变性。a 一乳白蛋白含有4 条二硫键，通过二硫键与b 乳球蛋白结合。在 宰l 割最加工过程中经常发生分予出或分子溺的二硫键交糖殿应。 牛乳中一乳球蛋自的含爨接近乳清蛋囱总量的一半，两且8 一乳球燮囱加热螽又容弱发生变 化，因此b 一乳球蛋白的变化对乳制品有很大的影响。口* 乳球蛋白在加热过程中，发生如下变化。 3 0 以下的牛襄中乳球鳋彝以二聚体黪形态存在：在3 0 c l ；i 上则逐濑解离戏单体的形态。6 0 时c y s l1 9 与芳香族氨蓥黢反癍，导致天然驹8 一乳球蛋囱二聚体嘏离。程6 5 。c 班上加热对，由 于b 乳球蛋向凝聚而使相澍分子质量增大，随后电泳迁移章增加。当加热温度达7 5 c 以上时， 一s - _ s 键裂艇，产生丈餐游离巯基，形戏硫忧氢、巯纯疑等挥发性物腰，导致“蒸煮嚷“。 活性巯基是强有力的还原荆，因此加热苗的牛乳的氧化述藤电势降低，弗产生了抗氧化性。 热处理会导致乳清蛋白变性，与酪戳向发生聚合”i ，这种结合的棵魔和类型取决于牛乳热 处理的程度；这链理过程中，蛋囊质骶发生戆反应包括k 一醮蛋叁鼓参与，叛及二硫键互换反应 的发生。牛乳加热到7 0 以上时，b 乳球畿自易与x 一酪骚f 刍和a ，酪蟹自反应，然后与酪蛋白 胶柬结合。p h 值太丁6 6 时，8 一乳球蛋白与非胶束型酪蛋向部分结合。随p h 值升高，结合越小， 当p g 篮大予? ，o 薅，实嚣上绩台已经不存在了。a 一乳盎蘩是、免疫球蕉褒也与醛蛋耋l 络合，上 述反应能明鼹影响酪蛋白胶柬的特性。若牛乳热处理中酪摄自沉淀( 如等电点附近) ，则正常情 况下，沉淀中还应该含有部分发生了热变性的乳清蛋白，这一特征已经被用来评价牛乳热处理的 程度。另静，在船热过程中8 一藐塞蛋自耧k 一酪蛋鑫之瀚不发生聚合爱嶷，嚣是a 一嚣 羹蛋鑫与 b 一乳球萤囱反应，生成的簸合物可以与k 一酪蛋白反应”。 浙江大学硕士学位论文 第一章绪论 1 4 2 乳脂肪在乳品加工过程中的变化 在牛乳中，乳脂肪以微滴的形式存在直径大小为1 8ur n ，平均直径约3i xm 。脂肪球的 大小与牛乳中乳脂肪的含量有关乳脂肪含量越高，单个脂肪球平均直径也越大。加热时脂肪球 会发生凝集、脂肪结晶、，磷酸酯( 尤其是酪蛋白磷酸酯) 的水解等。 脂肪球能够在牛乳这样的水相体系中保持稳定，主要得益于脂肪球膜。而脂肪球膜主要由蛋白 质和磷脂组成，物理作用或热处理都会破坏它敏感的结构。若脂肪球膜遭受破坏，脂肪球容易受 到腊蛋白酶及解脂酶的水解作用，释放游离脂肪酸，形成不受欢迎的酸败风味或气味【1 0 1 。另外， 除了前面所提到的，b 乳球蛋白是活性巯基的主要来源外，脂肪球膜蛋自加热后也能产生部分活 性巯基“1 。活性巯基是强有力的还原剂，因此加热后的牛乳的氧化还原电势降低，并产生抗氧化 性。 甘油三酸酯占牛乳脂类总量的9 7 9 8 ，决定了乳脂肪的主要理化性质。甘油三酸酯的结构 是很复杂的，这主要是由于可以与甘油发生酯化反应的脂肪酸种类很多，而脂肪酸酯化时与甘油 的结合位点又是千变万化的。甘油三酸酯在高温( 1 2 0 c 以上) 时进行酯交换反应，该反应受二 甘油酯、单甘油酯的存在情况的影响；该温度条件下，一些极性脂肪也发生反应。 牛乳中其他的脂类还包括：甘油二酸酯、甘油一酸酯、磷脂、游离脂肪酸、胆固醇及其酯类 等。磷脂在高温条件f 会变化，部分有机磷酸酯甚至磷脂在高温下( 1 0 0 ( 2 以上) 会发生分解。 加热后牛乳中游离脂肪酸减少。据报道，游离脂肪酸加热后的平均损失量是7 2 8 c ，1 6 s 为1 3 1 ； 6 2 8 ，3 0 m i n 是1 5 6 ：8 5 ，3 0 m i n 达2 4 4 。多不饱和脂肪酸和亚油酸等必需脂肪酸，在高温 下性质稳定。 高温下牛乳中脂肪酸及其残基的双键有可能被氧化，会形成过氧化物、过氧化氢物、羰基化 合物和羟基脂肪的物质，而且如果有空气存在会加速不饱和脂肪酸和胆同醇的过氧化反应】。有 些氧化产物会严重影响乳品的风味，例如产生油腻、腥味、金属味和木屑味等异昧但这些产物 对人体健康没有不利影响。虽然只有在极端加热( 2 0 0 c 、2 0 h ) 的情况下，乳脂肪会产生对人体 有害的聚合产物，但这种极端加热强度在牛乳加【过程中不会山现。 加热还促进了一些来源于乳船肪的内酯和甲基酮的形成。牛乳受热后羟基酸会转化为内酯 后者会影响牛乳的感官特性。内酯存在于所有加热过的牛乳和乳制品中，通常情况f 它们的 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 含量很低，对乳品风味的影响轻微。另外，牛乳受热后还能形成乙醛和甲基酮等羰基化合物，它 们也会影响牛乳的风味。u h t 乳与巴氏乳相比，u h t 乳中含有更多的内酯和羰基化合物。例如， 每克乳脂肪中甲基酮的含量，在鲜牛乳、巴氏消毒牛乳和u h t 牛乳中分别是1 0 n m o l g 、1 2 n m o l g 和2 1 n m o l 幢，而在传统杀菌方法加1 ：的牛乳中更是高达1 0 4 n m n g 【1 。 乳品在贮藏过程中，乳脂肪极易发生氧化酸败。主要原因是不饱和脂肪酸的双键处被氧化。 光线，热能和过氧化物酶也能够促进乳粉的氧化。重金属，乳粉中的水分含量，原料乳的酸度等 因素，也能够影响氧化。在u i t 乳贮存的过程中，脂肪会发生自发氧化反应。随着牛乳中溶解氧 的增加、贮存温度升高，这种反应会加剧，这种氧化作用还会破坏牛乳风味】。 1 5 复原乳检测的研究进展 目前，通过分析牛乳清蛋白含量来检测还原乳的方法主要有：传统的凝胶电泳，等电聚焦， 离子交换，疏水交互作用或反相高效液相色谱，质谱，毛细管电泳等。 通过h p l c 定量检测未变性可溶性乳清蛋白的含量，可以作为复原乳检测的指标该方法适 合对对较低热处理温度( 例如，巴氏杀菌条件) 的牛乳的检测【1 4 , i5 1 。免疫化学的方法也已经成功 应用在热变性乳清蛋白的定量分析中【l “。 毛细管电泳是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物，成为近年来发展最迅速的分离分 析方法之一。目前，毛细管电泳在牛乳热处理质量控制中的应用主要有两条技术路线：一条技术 路线是通过分离牛乳中的酪蛋白和乳清蛋白，准确检测未发生热变性的乳清蛋白含量，或者未变 性乳清蛋白酪蛋白的比例，以此检验牛乳的热处理程度。1 9 9 2 年z a n g 等报道，通过毛细管电泳 得到b 一酪蛋白a 一乳白蛋白的比值。该比值可咀作为检验鲜牛乳中掺八复原乳的检测指标，检 测限可以达到2 5 【1 7 1 。1 9 9 4 年c h e n 等，对上述方法进行改进，选用高浓度高p h 的硼酸缓冲液 ( 9 1 1 1 0 0 ) i ”】，解聚酪蛋白聚集体，建立了快速的乳蛋白分析方法，可以检验鲜牛乳中掺杂的奶 粉还原乳。1 9 9 4 年o t t e 等报道，利用非亲水性包被的石英毛细管柱和7 0 j l i i l 磷酸缓冲液( p h 2 5 ) ， 在8 m i n 内完成对主要的乳清蛋白的分离和定量分析，同时可以准确得出标准b 一乳球蛋白和a 一 乳白蛋白的回收率“。1 9 9 5 年r e c i o 等，采用高离子强度和高p h 的分离缓冲液，有效减少了蛋 白质在管壁的吸附比较准确地对不同热处理牛乳( 巴氏乳，直接和间接u h t 乳) 的乳清蛋白进 行定量分析【2 0 1 。1 9 9 5 年g r p a t e r s o n ，以及1 9 9 6 年n m k i n g h o r n ，都是选用的未亲水性包被 的石英毛细管电泳柱 2 t , 2 2 。通过使用高p h 电泳缓冲液和不同的有机改性剂，例如t w e e n2 0 ，来 6 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 调整电渗流，避免毛细管电泳梓内壁吸附蛋白质，提高了蛋白质的分离效率。另一技术路线是在 p h 4 6 ，等电点沉淀热变性的乳清蛋白和酪蛋白，定量分析热变性的乳清蛋白，达到对牛乳热处 理的质量控制。1 9 9 3 年d ej o n g 等，使用亲水性包被的毛细管柱，有效地避免了蛋白质在毛细管 柱上的吸附。同时选用含有纤维素的低p h 电泳缓冲液，有效分离出结合在酪蛋白胶束上的热变 性乳清蛋白。他们发现，与各种不同热处理情况下的牛乳相比，乳粉还原乳中的酪蛋白毛细管电 泳图谱最为特殊，包括峰形的特殊，dr 酪蛋白峰的消失和新的峰的生成。上述方法得到的精确 度和可靠性，显著高于单纯检测未变性乳清蛋白含量的方法【2 ”。1 9 9 6 年r e c i o 等通过选择最佳 的样品缓冲液和电泳缓冲液，改进了上述方法1 2 “。r e c i o 等从另一个角度，即利用高p h 和高离 子强度的缓冲液，来达到减少蛋白质在毛细管壁上吸附的目的。该方法选用的是未亲水性包被的 毛细管柱，通过选择最优毛细管电泳条件和加入内标的方法，提高了电泳迁移时间重复性和峰面 积的重复性。利用峰面积和浓度的线性关系定每分析不同热处理程度的牛乳血清白蛋白，o 乳 自蛋白，b 一乳球蛋白a 和一乳球蛋白b 【”l 。2 0 0 0 年周志伟等，参照上述方法，采用直径为5 0um 、 长6 4 5 c m 的未亲水性包被毛细管电泳柱，定量分析加热后变性的乳清蛋白与酪蛋白微粒结合的 情况。为了减少误差，他们采用校正峰面积( 峰面积与分离时间的比值) 作为牛乳蛋白的定量依 据【”l 。 2 0 0 3 年l i n 等报道，利用质谱( m a s ss p e c t r o m e t r y ) ，通过检测牛乳和地f 水中的氘和氧的 比值，可以准确得到鲜乳中掺杂奶粉的含量【2 ”。 当热处理的温度比较高的时候，几种美拉德反应的产物可以作为热处理程度的检测指标，例 如，糠氨酸，乳果糖，5 一羟甲基糠醛等。糠氨酸是糖基化蛋白质酸水解得到的一种氩基酸，通过 h p l c l 2 7 - 2 9 1 或者毛细管电泳检测【”l 。乳果糖作为检测指标通过h p l c 法蒸发光散射检测器测定 3 ”。 5 一羟甲基糠醛( 5 - 眦f ) 是m a i l l a r d 反戍的中间产物，m o r a l e s 等利用高效液相色谱法噜毛细 管电泳法测定其含量的变化。 2 0 0 5 年，我国农业部发布的行业标准n y t 9 3 9 2 0 0 5 巴氏杀菌乳和u h t 灭菌乳中复原乳 的鉴定标准中规定了根据糠氨酸和乳果糖在液态乳中的含量，判定巴氏杀菌乳和u ht 灭菌 乳中是否含有复原乳成分的技术路线1 3 。规定当巴氏杀菌乳的每l o o g 蛋白质中糠氨酸含量大于 1 2 m g 时，4 鉴定为含有复原乳。当u h t 灭菌结束后，每l o o g 蛋白质中糠氨酸含量为1 4 0 m g 1 9 0 m g 时，乳果糖含量( m g l ) 与糠氨酸含鼍( 每l o o g 蛋白质所含毫克数) 比值小于2 。利用高效液相 色谱紫外( 2 8 0 n m ) 检测器测定糠氨酸含量，通过酶法测定产生的果糖量计算牛乳中乳果糖含帚。 上述各种方法，虽然能对复原乳进行比较准确的检测，但是检测过程中往往需要大量试剂， 7 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 检测方法复杂，仪器设备要求高。本论文借鉴了m o h a m e d ，a m 等人和a o a c 的法，对掺入全脂复 原乳的鲜乳，巴氏乳和u i - i t 乳进行检测，检测方法简单、准确、稳定和重复性高，所需试剂少， 而且对仪器设备的要求低，对复原乳检测的推广和国家标准的切实实行具有积极意义。 1 9 8 9 年m o h a m e d ，a m 等人采用紫外光谱扫描的方法，对掺入不同比例全脂复原乳的牛乳的 紫外光谱进行比较，发现这些光谱在4 2 5 3 2 5 n m 和2 8 0 2 6 0 n m 的区间里有较大差异，尝试了 对鲜乳和巴氏乳中掺入的复原乳进行检测”。在该实验的基础上，本论文对春、夏、秋、冬，四 个季节的鲜牛乳分别进行分析，以保证检测方法的可行性，提高检测的准确度。分别得到了四个 季节全脂复原乳掺入比例与鲜乳复原乳和巴氏复原乳的紫外光谱检测值的一元线性回归方程。针 对近年来u h t 乳在乳品市场占有大量份额的情况，对掺入复原乳的u h t 牛乳进行了检测。同时， 本论文还讨论了掺入不同品牌全脂复原乳对检测结果的影响，不同的巴氏杀菌条件对检测结果的 影响，不同的u h t 乳贮藏温度和时间对检测结果的影响。 从简便性和检测能力出发，还可以根据乳品的还原性进行复原乳检测的方法。在这一方法中， 主要有国际酪农联盟研究的钼磷酸显色反应法和a o a c 法采用的乳蛋白质还原物质测定法【3 6 】。奶 粉的还原力因制造条件、储藏条件及储藏期间等而异：另外，牛乳的绢成也冈季节和地区不同而 异，所以上述两种方法都难以准确测定奶粉的掺入率。所以要想得到准确的推断结果，必须对杭 州地区的牛乳情况进行分析。a o a c 的蛋白一还原物质测定法，过去主要关注对掺入脱脂奶粉复原 乳的鲜乳进行检测。本实验参考并改进该方法，对掺入全脂奶粉复原乳的杭州地区鲜乳及巴氏乳 进行检测，力求寻找出还原力与复原乳掺入比例的一元线性回归方程，建立更加准确的检测方法。 1 6 本文的研究内容和目标 牛乳中掺杂复原乳的乳品掺假事件，严重扰乱正常的市场秩序。尽管农业部近日发布了巴 氏杀菌乳和u h t 灭菌乳中复原乳的鉴定标准，提出了根据糠氨酸和乳果糖在液态乳中的含量， 判定巴氏杀菌乳和uht 灭菌乳中是否含有复原乳成分的技术路线但正式的国家检测标准还在 研究之中。本文力求制定出鲜乳、巴氏杀菌乳、超高温灭菌乳中复原乳的检测方法，突破复原乳 检测的技术瓶颈，对维护消费者知情权，使关于加强液态奶生产经营管理的通知的执行更具 可操作性，促进乳业健康发展起到积极的推动作用。同时，为我国制订出巴氏杀菌乳、灭菌乳和 酸牛奶热处理强度监控标准的相关部门，提供条检测的技术路线，以达到严格控制乳品生产过 程中的熟处理强度减少牛奶营养损失，提高乳品质量的目的。 8 浙江大学硕士学位论文第一章绪论 主要研究内容有： 1 紫外光谱检测四季鲜乳中掺入的复原乳 2 紫外光谱检测四季巴氏乳中掺入的复原乳 3 不同的巴氏杀菌条件对复原乳检测的影响 4 采用不同的全脂奶粉对鲜乳和巴氏乳中掺入的复原乳检测的影响 5 紫外光谱检测u i t 乳中掺入的复原乳 6 不同贮存温度和时间对u h t 乳中掺入的复原乳检测的影响 7 还原力法检测鲜乳和巴氏乳中掺入的复原乳 9 浙江大学硕士学位论文 第二章紫外光潜分析鲜乳和复原乳 2 1 引言 第二章紫外光谱分析鲜乳和复原乳 为了实现对复原乳的检测，利用紫外扫描的方法对不同的鲜牛乳和不同的乳粉复原 乳进行分析，研究样品的图谱及数据问的差别。这对于i - 找i i ! 原乳的有效检测指标具有 重要意义，为复原乳检测提供新的思路。 2 2 研究材料与方法 2 2 1 试验材料 鲜乳样品：新鲜的牛乳分别来自杭州的牧场鲜乳样品保持4 冷藏。 奶粉样品：奶粉分别来自杭州的市场和奶粉制造厂 主要有：光明全脂乳粉，伊利全脂乳粉，国产全脂乳粉( 由杭州杭江乳品厂提供) ， 新西兰全脂乳粉等 对比的脱脂乳粉有：聚能脱脂乳粉，澳大利孤脱脂乳粉( 由杭州杭江乳品厂提供) 复原乳处理过程：奶粉复原后，4 。c 平衡1 天，使其充分复水。使用均质机，对复原乳样品进行 均质。每次测定均采用新鲜制各样品。每次测定均采用新鲜制各样品。( 冷冻 或储备试样不宜用于测定) 上述样品在实验前，将试样从容器中反复倒进倒出，充分混合均匀。 2 2 2 试剂 氨水( 2 5 ，分析纯) ：杭州民征化工厂 o 浙江大学硕士学位论文第二章紫辨光i ；! 孥分析鲜乳和复原乳 2 23 实验仪器 2 5 0 m i 容量瓶 m e t t l e rt o l e d rg b 2 0 4 万分之一电于天平 m e t t l e rt o l e d r3 2 0 一s 口h 计 a n k ek a 一1 0 0 0 台式离心机：上海安亭科学仪器厂 h p 一7 5 3 0 g 分光光度计：惠普上海分析仪器有限公司 d i ( s - 2 4 电热恒温水浴锅：杭卅l 蓝天化验仪器厂 k q 一2 5 0 b 型超声波清洗器：昆山市超声波仪器有限公司 d h g 一9 0 7 0 a 型微电脑智能化控制新型电热恒温鼓风干燥箱：杭州蓝天化验仪器厂 玻璃仪器气流烘干器：开封市宏兴科教仪器厂 金花牌系列移液枪：1 0 0 0u1 ，5 m l m i l k s c a n1 3 4a b 型f o s s 分析仪：杭州牛奶分析检验所提供 2 2 4 实验方法 室温下，吸取l m i 牛奶样品置于2 5 0 m l 容量瓶中，加入2 m l 的2 5 氨水，加入蒸馏水5 2 。c 定 容。5 2 c 水浴3 0 r a i n 。之后，静置玲却，待冷却至室温，取试样置于石英比色皿中，在9 0 0 n m 2 0 0 h m 波段，以0 5 n m 为间隔，对样品进行光谱扫描。蒸馏水作为参比溶液。每个样品做三个平 行。 图谱的分析 将 将 测量3 2 5 n m 和4 2 5 n m 处对应的吸光度a 。z s a m 。求两者之间的垂直距离，即儿z - 。一a 1 。， ( a 。r a 4 2 ；n m ) 1 0 2 定义为a 值。 测量2 8 0 n m 和2 6 0 n m 处对应的吸光度a z m 叩、a m 。求两者之间的垂直距离即a 。一a 。 ( a ：。a 。) 1 0 2 定义为b 值。 浙江大学硕士学位论文 第二章紫外光谱分析鲜乳和复原乳 2 2 5 统计分析方法 对实验数据用平均数标准差表示。运用s p s sf o rw i n d o w s1 1 5 版分析软件和m i c r o s o f t e x c e l 软件，对实验数据进行统计分析。显著性水平取p 0 0 5 ，极显著水平取p 0 0 1 。 2 3 实验结果与讨论 2 3 1 鲜乳与复原乳的紫外扫描图谱比较 取1 0 0 新鲜牛乳和1 0 0 全脂乳粉复原乳的样品，对它们进行紫外扫描分析。调整复原乳的 冲调比例，以保证1 0 0 全脂复原乳和1 0 0 鲜牛乳的脂肪及蛋白质的百分含量基本一致。扫描图 谱如下： j 0 0 l 鞠1 w a 垤l t n 骱s t a k l j 口。， 沁3 d 0 靠如t 沸m 鞋0 0 固2 - i1 0 0 鲜牛乳( p a wm ii k r m ) 的紫外扫描实验图谱 b 髓o 浙江大学硕士学位论文第二章紫外光谱分析鲜乳和复原乳 睁 1 霸0 蛐油 、w l e b g 亿c s n 涟 图2 - 21 0 0 复原乳( r e c o n s z i t u t e dm iik r e m ) 的紫外扫描实验图谱 g 由尉2 一l ，图2 - 2 ，得到的鲜乳和复原乳紫外扫描图谱存在两个明显差异。 第一个明显差异：两个图谱中，在4 2 5 n m 和3 2 5 n m 之间对应的垂直距离高度明显不同。复原 乳的图谱在4 2 5 n m 和3 2 5 n m 之间出现明显的坡度，对应的吸光度差值( a 。f 山。) 较大。而鲜牛 乳的图谱在4 2 5 n m 和3 2 5 n m 之间趋于直线，a a m ，一a 一。的值接近零，甚至为负数。 第二个明显差异：两个图谱在2 8 0 n m 和2 6 0n 】n 之间存在明显不同。由图2 - 1 ，可以得到，鲜 牛乳图谱在2 8 0 n m 和2 6 0 h m 之间出现一个比较小的峰，峰项在2 8 2 n m 附近，峰谷在2 6 7 n m 附近。 而复原乳的图谱中( 图2 2 ) 并没有出现这一现象。 2 3 2 不同鲜乳与复原乳样品的a 值比较 根据鲜牛乳和复原乳图谱的上述两个明显差异，以a 值和b 值作为试验指标，对样品进行检 测，得到如下数据： 浙江大学硕士学位论文 第二章紫外光谱分析鲜乳和复原乳 表2 1 鲜牛乳和复原乳的a 值比较 样品 a 值b 值 ( r m m i i k 鲜牛乳；r e m ，r e c o n s t j t u t e dm l i k 复原乳1 由表2 - 1 可以得出如下结论 i 全脂乳粉复原乳的a 值显著大于鲜牛乳的a 值。 2 全脂奶粉的冲调比例对复原乳的a 值影响比较大。随着复原乳中奶粉水的比例的增大， 其 a 值也逐渐增大。 3 脱脂乳粉复原乳的a 值普遍偏小。紫外扫描方法的a 值不适宜作为检测指标，对脱脂乳粉复 原乳或其他脂肪含量很低的牛乳样品进行检测。 1 4 浙江大学硕士学位论文第二章紫外光谱分析鲜乳和复原乳 2 3 3 掺入不同比例复原乳的牛乳紫外扫描图谱比较 为实现对复原乳具体掺入比例的检测，本实验对掺入不同比例复原乳的鲜牛乳样品( 复原乳 的脂肪及蛋白质含量与鲜牛乳保持一致) ，进行紫外扫描实验，得到的图谱如下： 图2 - 3 掺入不同比例复原乳的牛乳紫外扫描图谱 图2 - 3 是掺入不同比例复原乳的鲜牛乳紫外扫描图谱。掺入复原乳的比例分别为：o ，5 ， 1 0 ，2 0 ，4 0 ，6 0 ，8 0 ，1 0 0 。 图2 - 3 表明，样品乳中掺入复原乳的比例大于1 0 的时候，样品乳的紫外扫描图谱的坡度， 随掺入复原乳的比