《中国药典》2010年版仪器分析方法应对.ppt

2019/12/17,1,中国药典2010年版新仪器分析方法应对,李志伟,2019/12/17,2,现代分析技术的应用进一步扩大,2019/12/17,3,中国药典2010年版一部新修订项目,2019/12/17,4,2010年版二部与2005年版药典主要项目收载情况比对表,2019/12/17,5,柱色谱纸色谱薄层色谱气相色谱,色谱法在2010年版药典的应用,高效液相色谱离子色谱凝胶色谱毛细管电泳,正相色谱反相色谱离子对色谱,2019/12/17,6,色谱法的应用：纸色谱,纸色谱的基本原理-分配色谱固定相-吸附在滤纸上的水移动相-展开剂样品在水和展开剂中的溶解度不同，故分配不同而达到分离。例：盐酸苯乙双胍,2019/12/17,7,色谱法的应用：薄层色谱,2010版药典（二部）采用tlc的品种数量，共435个,2019/12/17,8,色谱法的应用：气相色谱,2019/12/17,9,色谱法的应用：高效液相色谱,20世纪70年代中期，hplc仪开始出现，主要填料：10m的无定型硅胶颗粒。70年代后期，发展了反相液相色谱。80年代，hplc被广泛应用于化合物的分离，主要填料：粒径为510m球形硅胶。90年代早期，粒径为5m的高纯硅胶，即所谓的b型硅胶被发展，并成为这个行业填料的标准，这种b型硅胶含有微量的金属。90年代后期，为了满足快速分离的需求，发展了3m或3.5m的球形硅胶，其作用和性能逐渐的获得了人们的认同和接受。手性色谱柱的开发。21世纪早期，为适应超快速的分离要求，粒径小于2m的填料被开发出来，发展出了整体柱、无机和有机杂化硅胶。目前，市场上流行的分析用的hplc硅胶基质填料主要为b型硅胶。,填料发展史,2019/12/17,10,色谱法的应用：高效液相色谱,填料发展史,2019/12/17,11,色谱法的应用：高效液相色谱,2010版药典二部中色谱柱的使用情况,2019/12/17,12,色谱法的应用：高效液相色谱,2019/12/17,13,色谱法的应用：高效液相色谱,2010版药典主要修订项目1、色谱柱（1）常用色谱柱填料粒径310m（2）微径柱填料粒径约2m（uplc或uflc）硬件须匹配色谱条件可适当调整以品种正文规定条件的测定结果为准2、柱温（1）通常为室温（2）以硅胶为载体的普通色谱柱，最高使用温度不得超过60，（htlc）,2019/12/17,14,基本原理离子色谱中发生的基本过程就是离子交换，因此，离子色谱本质上就是离子交换色谱。在离子色谱的基本组成中，重要的和与其他高效液相色谱不同的就是抑制器和电导检测器，离子色谱用的泵是peek材料衬里的不锈钢泵。,色谱法的应用：离子色谱,离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸等离子型化合物的分离。,2019/12/17,15,色谱法的应用：离子色谱,阳离子交换柱山梨醇及制剂甘油果糖氯化钠注射液甘露醇及制剂利巴韦林及制剂盐酸二甲双胍及制剂苹果酸及制剂富马酸及制剂,阴离子交换柱肝素钠及制剂帕米磷酸二钠及制剂氯膦酸二钠及制剂硫酸软骨素钠及制剂,2019/12/17,16,例：离子色谱（氯膦酸二钠）,照离子色谱法（附录j）试验用阴离子交换色谱柱或效能相当），柱温30，以水为流动相a，以0.1mol/l氢氧化钾溶液为流动相b，梯度洗脱，流速为1.2ml/min。检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测。,用于氯膦酸二钠原料药的有关物质与制剂的含量测定,2019/12/17,17,固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如多糖、多肽、蛋白质、核酸等。,色谱法的应用：凝胶色谱法,2019/12/17,18,2010版药典二部采用常压凝胶色谱的品种,2019/12/17,19,2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种,2019/12/17,20,2010版药典二部采用高效凝胶色谱的品种,2019/12/17,21,2010版药典二部采用电泳法的品种,色谱法的应用：电泳及毛细管电泳法,2010版药典二部采用ce的品种,2019/12/17,22,例：毛细管电泳（抑肽酶）,sigma抑肽酶对照品毛细管电泳谱图,2019/12/17,23,例：毛细管电泳（抑肽酶）,供试品毛细管电泳谱图（杭州澳亚生物技术有限公司生产，批号：071015）,2019/12/17,24,例：毛细管电泳（抑肽酶）,2019/12/17,25,色谱法的应用：毛细管电泳,分离模式毛细管区带电泳cze胶束电动毛细管色谱mekc毛细管等电聚焦cief毛细管凝胶电泳cge毛细管电色谱cec,高分子化合物的分析手性化合物的分析,2019/12/17,26,色谱法的应用：液相色谱常用检测器,光学检测器：紫外、荧光、示差折光、蒸发光散射（通用型检测器）电化学检测器：极谱、库仑、安培电学检测器：电导、介电常数质谱检测器选择性检测器：灵敏度较高,2019/12/17,27,2010版药典二部采用检测器情况,色谱法的应用：液相色谱常用检测器,2019/12/17,28,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,优点：适用于没有特征紫外吸收或紫外吸收很弱的待测物，使用uv时灵敏度更低；无需衍生化而直接测定，避免了衍生带来的误差。可以应用有强紫外吸收的试剂，如氯仿、丙酮等。适用于组分复杂样品的分析，可以进行梯度洗脱，基线平稳。通用型检测器，只要待测物挥发性低于溶剂，即可适用。对不同物质，elsd相应因子的变化比其它检测器要小得多。对环境影响不灵敏，室温下即可操作。没有溶剂前缘峰，适用于保留时间短的物质的检测。与lc-ms的色谱条件一致，可直接进行方法转换。,2019/12/17,29,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,影响elsd响应的因素载气流速、雾化器设计与温度、流动相的组成和流速等影响雾化过程。被分析物的浓度和体积质量决定了进入光散射池的气溶胶中的颗粒的直径。被分析物的折射指数、光源发出的光的强度和波长、光电倍增管的位置等影响散射光强度。光电倍增管的灵敏度和入射光的强度决定了检测的效率，反映为实验者所观测的峰面积。,2019/12/17,30,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,2019/12/17,31,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,图硫酸核糖霉素有关物质色谱图（蒸发管温度：65，分流模式）,2019/12/17,32,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,图硫酸核糖霉素有关物质色谱图（蒸发管温度：110，不分流模式）,2019/12/17,33,色谱法的应用：蒸发光散射检测器,谨慎使用，充分优化实验条件。企业质控人员和药检所人员均需要。漂移管温度的优化：温度对响应值的影响无明显的规律性。最优温度为在流动相基本挥发的基础上，产生可接受噪音的最低温度。雾化气流速的优化：流速越大，响应值越低。最优气体流速应是在可接受噪音的基础上，产生最大检测响应值的最低气体流速。,2019/12/17,34,色谱法的应用：示差折光检测器,原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：1）对温度变化敏感2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测3）属于中等灵敏度的检测器,2019/12/17,35,色谱法的应用：示差折光检测器,山梨醇山梨醇注射液甘露醇甘露醇注射液乳果糖口服溶液,葡甲胺麦芽糖乳糖-环糊精羟丙基-环糊精,2019/12/17,36,色谱法的应用：电导检测器,原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。优点：对流动相流速和压力的改变不敏感，可用于梯度洗脱。缺点：对温度变化敏感（每升高1度，电导率增加2%-2.5%)。广泛应用于离子色谱。主要用于检测水溶性无机和有机离子。,2019/12/17,37,色谱法的应用：电导检测器,帕米膦酸二钠注射液注射用帕米膦酸二钠盐酸头孢吡肟注射用盐酸头孢吡肟,氯膦酸二钠氯膦酸二钠注射液氯膦酸二钠胶囊,2019/12/17,38,色谱法的应用：质谱检测器,2019/12/17,39,色谱法的应用：质谱检测器,离子化方式：电喷雾大气压化学电离maldi,质量分析器：四级杆离子肼飞行时间磁分析器傅立叶变换离子回旋共振,方法学验证的重要工具,2019/12/17,40,简介,色谱质谱的在线联用将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。色谱质谱联用包括气相色谱质谱联用(gc-ms)和液相色谱质谱联用(lc-ms)，液质联用与气质联用互为补充，分析不同性质的化合物。,2019/12/17,41,液质联用与气质联用的区别:,气质联用仪(gc-ms)是最早商品化的联用仪器，适宜分析小分子、易挥发、热稳定、能气化的化合物；用电子轰击方式（ei）得到的谱图，可与标准谱库对比。液质联用(lc-ms)主要可解决如下几方面的问题：不挥发性化合物分析测定；极性化合物的分析测定；热不稳定化合物的分析测定；大分子量化合物（包括蛋白、多肽、多聚物等）的分析测定；没有商品化的谱库可对比查询，只能自己建库或自己解析谱图。,2019/12/17,42,2019/12/17,43,2019/12/17,44,常见术语:,质荷比:离子质量与它所带电荷(以电子电量为单位计)的比值,写作m/z.峰:质谱图中的离子信号通常称为离子峰或简称峰.离子丰度:检测器检测到的离子信号强度.基峰:在质谱图中，指定质荷比范围内强度最大的离子峰称作基峰.总离子流图；质量色谱图；准分子离子；碎片离子；多电荷离子；同位素离子,2019/12/17,45,总离子流图:,在选定的质量范围内，所有离子强度的总和对时间或扫描次数所作的图,也称tic图.,2019/12/17,46,质量色谱图,总离子流图,2019/12/17,47,准分子离子:,指与分子存在简单关系的离子，通过它可以确定分子量.液质中最常见的准分子离子峰是m+h+或m-h-.在esi中,往往生成质量大于分子量的离子如m+1,m+23,m+39,m+18.称准分子离子,表示为:m+h+,m+na+等,2019/12/17,48,碎片离子：,准分子离子经过一级或多级裂解生成的产物离子.碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。,2019/12/17,49,ephedrine,mw=165,2019/12/17,50,如何看质谱图：,(1)确定分子离子,即确定分子量氮规则：含偶数个氮原子的分子，其质量数是偶数，含奇数个氮原子的分子，其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差，凡质量差在38和1013，2125之间均不可能，则说明是碎片或杂质。,2019/12/17,51,(2)确定元素组成，即确定分子式或碎片化学式,高分辨质谱可以由分子量直接计算出化合物的元素组成从而推出分子式低分辨质谱利用元素的同位素丰度，例:,2019/12/17,52,有机质谱的特点,优点:(1)定分子量准确，其它技术无法比。(2)灵敏度高，常规10-710-8g,单离子检测可达10-12g。(3)快速，几分甚至几秒。(4)便于混合物分析，lc/ms，ms/ms对于难分离的混合物特别有效,其它技术无法胜任。(5)多功能，广泛适用于各类化合物。,2019/12/17,53,ei:电子轰击电离硬电离。ci:化学电离核心是质子转移。fd:场解吸目前基本被fab取代。fab:快原子轰击(lsims,液体二次离子质谱)。esi:电喷雾电离属最软的电离方式。适宜极性分子的分析，能分析小分子及大分子(如蛋白质分子多肽等)apci:大气压化学电离同上，更适宜做弱极性小分子。appi:大气压光喷雾电离同上，更适宜做非极性分子。maldi:基体辅助激光解吸电离。通常用于飞行时间质谱和ft-ms，特别适合蛋白质，多肽等大分子,2019/12/17,54,2019/12/17,55,电喷雾（esi）的特点,通常小分子得到m+h+,m+na+或m-h-单电荷离子，生物大分子产生多电荷离子，由于质谱仪测定质/荷比，因此质量范围只有几千质量数的质谱仪可测定质量数十几万的生物大分子。电喷雾电离是最软的电离技术，通常只产生分子离子峰，因此可直接测定混合物，并可测定热不稳定的极性化合物；其易形成多电荷离子的特性可分析蛋白质和dna等生物大分子；通过调节离子源电压控制离子的碎裂（源内cid）测定化合物结构。,2019/12/17,56,大气压化学电离（apci）特点,大气压化学电离也是软电离技术，只产生单电荷峰，适合测定质量数小于2000da的弱极性的小分子化合物；适应高流量的梯度洗脱/高低水溶液变化的流动相；通过调节离子源电压控制离子的碎裂。,2019/12/17,57,2019/12/17,58,3.流动相的选择,常用的流动相为甲醇、乙腈、水和它们不同比例的混合物以及一些易挥发盐的缓冲液，如甲酸铵、乙酸铵等，还可以加入易挥发酸碱如甲酸、乙酸和氨水等调节ph值。lcms接口避免进入不挥发的缓冲液，避免含磷和氯的缓冲液，含钠和钾的成分必须lmmol/l。（盐分太高会抑制离子源的信号和堵塞喷雾针及污染仪器）含甲酸（或乙酸）2。含三氟乙酸0.5。含三乙胺l。含醋酸铵10一5mmol/l。送样前一定要摸好lc条件，能够基本分离，缓冲体系符合ms要求。,2019/12/17,59,4.流量和色谱柱的选择,不加热esi的最佳流速是150ulmin，应用4.6mm内径lc柱时要求柱后分流，目前大多采用l2.1mm内径的微柱，tis源最高允许lmlmin，建议使用200400ulminapci的最佳流速lmlmin，常规的直径4.6mm柱最合适。为了提高分析效率，常采用100mm的短柱（此时uv图上并不能获得完全分离，由于质谱定量分析时使用mrm的功能，所以不要求各组分没有完全分离）。这对于大批量定量分析可以节省大量的时间。,2019/12/17,60,目标化合物分析,（1）选择离子监测（sim）sim用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子.,2019/12/17,61,目标化合物分析,（1）选择离子监测（sim）sim用于检测已知或目标化合物，比全扫描方式能得到更高的灵敏度。这种数据采集的方式一般用在定量目标化合物之前，而且往往需要已知化合物的性质。若几种目标化合物用同样的数据采集方式监测，那么可以同时测定几种离子.,2019/12/17,62,exampleofproductionspectrum,ephedrine,mw=165,2019/12/17,63,ms/ms,2019/12/17,64,ms/ms/ms（397）,2019/12/17,65,ms/ms/ms（365）,2019/12/17,66,ms/ms/ms（195）,2019/12/17,67,应用示例,2019/12/17,68,高效液相色谱电喷雾串联质谱法测定清开灵复方中胆酸,采用hplc/ms/ms技术，从清开灵注射液中，通过分子量、二级质谱碎片信息定性测定了清开灵复方中的胆酸。直接进样实验。清开灵注射液经过初步化学处理后采用电喷雾（esi）离子源，在负离子扫描方式下，得到一极质谱图、即分子离子峰m-h-，再用二级质谱（ms/ms）扫描目标分子离子的碎片峰。再以相同的实验条件对标准品进行测定，做出其一级、二级质谱图。,2019/12/17,69,通过对样品进行分子离子峰的扫描发现m-h-的峰中有一个很强的407，根据样品处理过程以及对复方各单味药材的研究，其应该为一有机酸的负离子峰，并初步推断其为胆酸。（胆酸的分子量为408）。如图所示：通过对照样品(右)和标准品（左）的二级质谱图，发现其主要碎片峰均吻合较好。,2019/12/17,70,2019/12/17,71,2019/12/17,72,2019/12/17,73,2019/12/17,74,2019/12/17,75,2019/12/17,76,2019/12/17,77,2019/12/17,78,2019/12/17,79,2019/12/17,80,用lc-ms/ms检测硝基呋喃类代谢物,2019/12/17,81,2019/12/17,82,2019/12/17,83,1、对有毒药材和成药千里光，采用lc-ms检测其主要有毒成分阿多尼弗林碱，限定含量不得超过0.004%2、采用lc-ms检测川楝子、苦楝皮中的川楝素,2019/12/17,84,农药残留量测定法,中药中农药残留量中药材及饮片22个品种,共165批样品1、方法学由单一gc法扩大为gc、hplc、gc/ms和lc/ms2、农药品种由24种（其中有机氯9、拟除虫菊酯3和有机磷12）扩充为色谱法124种（其中有机氯和拟除虫菊57、有机磷54和氨基甲酸酯13），按色-质联用法统计则为128种。3、测定方法分两个层次：一为色谱法（gc、hplc）方法包括样品前处理（提取、净化）、色谱测定、色谱验证和质谱确证二为色-质联机法（gc/ms、lc/ms）方法包括样品前处理（提取、净化）、色-质联机测定,2019/12/17,85,农药分析质谱图及色谱图,53种农药混合标准品gc/ms总离子流图,2019/12/17,86,74种农药混合标准品lc/ms/ms总离子流图,2019/12/17,87,15种有机氯类农药对照品溶液色谱图-ecd,2019/12/17,88,19种有机磷类农药对照品溶液色谱图fpd,2019/12/17,89,中药指纹图谱,色谱指纹图谱确实能够反映中药内在质量的整体变化情况和质量的均一程度本质上是药典色谱技术在应用上的延伸控制产品批与批间的稳定切实可行。2005版收载高效液相色谱特征图谱1项2010版收载高效液相色谱特征图谱11项，指纹图谱11项使整体性控制中药质量的方法学和实际应用方面有了大幅度的提高，确保中药质量的均一稳定,2019/12/17,90,中药指纹图谱,中成药收载指纹图谱6项，特征图谱2项。采用指纹图谱检测的品种桂枝茯苓胶囊天舒胶囊复方丹参滴丸注射用双黄连腰痛宁胶囊诺迪康胶囊采用特征图谱检测的品种乌灵胶囊百令胶囊,2019/12/17,91,注射用双黄连指纹图谱,2019/12/17,92,注射用双黄连药材、提取物、成品的相关性,2019/12/17,93,hplc指纹图谱hplc指纹图谱上的10个峰均得到了明确的指认，指认的峰面积之和已占总峰面积的89%。,肿节风,2019/12/17,94,乌灵胶囊样品色谱图,2019/12/17,95,本版药典用于计算两个图谱相似程度的计算机软件为国家药典委员会发行的中药色谱指纹图谱相似度评价系统,2019/12/17,96,例：中药中问题的解决,1手性流动相添加剂解决了积雪草总苷等的同分异构体色谱分离难题2指纹图谱的控制保证了茵陈从基原、生产工艺,提取物及制剂的质量3有关物质的控制完善了薄荷脑的质量标准,2019/12/17,97,1手性流动相添加剂解决了积雪草总苷等的同分异构体色谱分离难题,积雪草苷羟基积雪草苷多对乌苏烷型和齐墩果烷型结构异构的同分异构体,主要成分,原标准存在问题,含量测定方法为紫外分光光度法，专属性较差hplc采用常规流动相，羟基积雪草苷难以与其同分异构体分离,解决方案,加入手性流动相添加剂-环糊精，实现积雪草苷、羟基积雪草苷多成分同系统定量,困扰已久的难题,2019/12/17,98,积雪草总苷标准特征图谱,羟基积雪草苷,积雪草苷,羟基积雪草苷（medecassoside）c48h78o20,积雪草苷b（asiaticosideb）c48h78o20,2019/12/17,99,2指纹图谱的控制保证了茵陈从基原、生产工艺到提取物及制剂的质量,“绵茵陈”及“茵陈蒿”性状完全不同有效成分差异较大,药材基原划分,药材质量控制,以具利胆作用的绿原酸和对羟基苯乙酮为指标建立绵茵陈的多成分含量测定药材质量标准大幅提高,提取物质量控制,对茵陈提取物进行深入透彻的研究比较不同提取方法的指纹图谱，提出最优的提取工艺从根本保证了该提取物质量的稳定可控,2019/12/17,100,绿原酸,指纹图谱及多成分含量测定等项目的建立，全面控制茵陈提取物质量,茵陈提取物的对照指纹图谱,茵栀黄注射液指纹图谱的11个共有峰的来源,2019/12/17,101,有关物质的控制完善了薄荷脑的质量标准,采用gc-ms对其中三个主要的杂质峰进行归属阐明其化学结构,薄荷脑中杂质归属,全面的方法学考察,对三个杂质峰进行全面的考察专属性试验稳定性试验,全面反映提取物质量,有关物质的检查含量测定重金属及有害元素的检查溶解性、熔点、比旋度,薄荷脑有关物质测定的气相色谱图,薄荷脑溶液的总离子流图,isopulegol,cyclohexanol,cyclohexanol,2019/12/17,102,icp技术用于微量和痕量金属测定,icp质谱法：以等离子体为离子源的质谱型元素分析方法。用于痕量到微量的元素分析，尤其适用于痕量重金属测定。icp光谱法：以等离子体为激发光源的原子发射