寡核苷酸介导的定点诱变.ppt

寡核苷酸介导的定点诱变,盒式诱变（CassetteMutagenesis）利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列，从而达到定点突变的目的，称为盒式诱变。实施盒式诱变时，要求靶DNA插入点两侧有合适的限制酶单一切点（图45）。,盒式诱变的例子,引物诱变（PrimerMutagenesis）利用一段含有突变序列的寡核苷酸片段作为引物，经DNA复制过程合成靶DNA片段，使其子代链发生突变，称为引物诱变。引物诱变的基本操作步骤：获得单链目的基因；人工合成带突变序列的引物；制备异源双链DNA；转染宿主细胞；筛选重组体；突变基因的鉴定和回收,Kunkel诱变法（TheKunkelMutagenesisMethod）这是1985年由Kunkel等人建立的一种寡核苷酸引物诱变法，该法的操作步骤如下：将复制型的M13噬菌体转染到脱氧尿苷三磷酸酶和尿嘧啶脱糖苷酶双缺陷的E.coli（dut-，ung-）菌株中生长，使U取代T掺入到DNA链中（一般每个重组体2030个）；以此种带U的DNA链为模板，用带突变碱基的寡核苷酸引物进行复制，产生异源双链；将此异源双链转化到ung+菌株中生长，含U的模板链被破坏，从而使子代DNA链大部分（80%）含突变碱基序列,在dut+的E.coli中dUTP酶dUTPdUMP在dUTP酶缺失体中（dut-）dUTPdUMPdut：dUTPase突变，可导致E.colidUTP的量增加，当DNA复制时，可在很多应该加dTTP的位置加入dUTP。,在正常情况下，尿嘧啶-糖基化酶(ung+)可以去除掺入DNA中的尿嘧啶残基。但在ung-的菌株中，此酶失活。在大肠杆菌dut-ung-菌株中生长的M13噬菌体的单链基因组DNA中将含有20-30个尿嘧啶残基。用这些噬菌体感染ung+菌株，尿嘧啶被迅速去除，DNA链遭到破坏，感染力下降约5个数量级。此法的成功关键，是要得到好的含单链模板DNA。,这种方法得到的突变率太低，约为1-5%。主要原因是含突变位点的双链DNA，转入E.coli后，被其修复系统修复了。,快速引物诱变（QuikChangePrimerMutagenesis）这是由Stratagene公司开发的一种引物定点诱变法，该法的操作步骤如下：将带目的基因的重组体在dam+菌株中扩增，使DNA序列被dam甲基化酶所修饰；使用带突变碱基的寡核苷酸引物，在较高温度下复制子代链，形成双链突变体；用限制酶Dpn将带甲基化标记的亲代双链水解；将突变体转化宿主细胞,限制酶位点消除引物诱变（PrimerMutagenesiswithRestrictionEnzymeSiteElimination）限制酶位点消除引物诱变技术是一种利用某些限制酶不能切割由硫代磷酸核苷酸衍生物取代正常碱基所形成的DNA片段的特性，去除不含突变碱基的亲代模板链，以提高定点突变效率的技术方法。限制酶位点消除法的操作步骤是：将带突变碱基的寡核苷酸引物与重组体单链模板退火后，加入硫代磷酸核苷酸衍生物进行复制，产生具有硫代磷酸核苷酸的异源双链DNA；用特定的限制酶在此异源双链DNA上作切口，此时亲代模板链由于无硫代磷酸核苷酸