（食品科学专业论文）发酵干香肠生产过程中挥发性风味成分变化的研究.pdf

摘要 本论文采用同时蒸馏萃取( s d e ) 结合气质联机( g c m s ) 、以壬烷作为内标的方法，对以 戊糖片球菌、戊糖乳杆菌和肉色葡萄球菌为发酵剂进行发酵( f 组) 和自然发酵( n 组) 的两种 发酵干香肠生产过程中挥发性风味成分的变化进行定性半定量分析，取样时间在0 天( 灌肠结束) 、 1 5 天( 热烘结束) 、7 天( 发酵结束) 、1 4 天( 干燥结束) 和4 4 天( 后熟) ；同时还对挥发性风 味成分的两种重要的前体物质蛋白质和脂肪的水解和氧化情况进行了跟踪测定，主要试验结 果如下： f 组和n 组生产过程中，挥发性风味成分均主要来自添加的黑胡椒和脂类氧化。 胡椒类、醛类、烷烃类、醇类、酮类、其他类六类成分在f 组和n 组的整个生产过程中都有 检出；丽苯酚类在两组中均从发酵结束时开始检出；酸类和酯类在f 组中后熟时检出，在n 组中 分别在干燥结束和发酵结束时开始检出。 生产过程中，f 组中挥发性风味成分的总种类数在干燥结束后减少n 组中挥发性风味成分 的总种类数一直增加：f 组中挥发性风味成分总含量在发酵结束时达到最大值后减少，n 组中挥 发性风味成分总含量在干燥结束时达到最大值后减少。 生产过程中，f 组和n 组中蛋白质和脂肪的水解以及脂肪氧化在不断进行，表明风味前体物 在不断积累。热烘阶段，f 组中脂肪氧化程度高于n 组；后熟阶段，n 组中蛋白质和脂肪的水解 以及脂肪氧化的程度高于f 组。 关键词：发酵千香肠，挥发性风味成分，变化，同时蒸馏萃取，气质联机 a b s t r a c t t h ev o l a t i l ef l a v o u r c o m p o u n d s e x t r a c t e df r o m d r yf e r m e n t e d s a u s a g e w i t h 上6 p e n t o s u s , l 口：p e n t o s a c e u sa n d s t c a r n o s u sa ss t a r t e rc u l t u r e s ( g r o u pf ) a n dn a t u r a lf e r m e n t e ds a u s a g e ( g r o u pn ) w e r ea n a l y s e db ys d e g c - m s ，w i t ho c t a n ea si n t e r n a ls t a n d a r d i no r d e rt of o l l o wc h a n g e so fv l a t i l e f l a v o u rc o m p o u n d sd u r i n gp r o c e s s i n g ，s a m p l e sw e r et a k e na td a y s0 ( a f t e rs t u f f i n g ) ，1 5 ( a f t e rh o t t i n g ) ， 7 ( a f t e rf e r m e n t a t i o n ) ，1 4 ( a f t e rd r y i n 曲a n d4 4 ( a f t e rr i p e n i n g ) i na d d i t i o n ，l i p o l y s i s ，f a to x i d a t i o na n d p r o t e o l y s i sw e r e a l s oe x a m i n e d t h em a i nr e s u l t sw e r e ： t h ev o l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n d sm a i n l yd e r i v e df r o ma d d e db l a c kp i p p e r sa n dl i p i do x i d a t i o n t h e y b e l o n g e dt os e v e r a lc l a s s e so fc h e m i c a l ：p i p p e r s ，a l d e h y d e s ，a l k a n e s ，k e t o n e s ，a l c o h o l s ，o t h e r s ，p h e n o l s ， a c i d sa n de s t e r s i ng r o u pfa n dg r o u pn t h ef o r m e rs i xc l a s s e so f c o m p o a n d sc a l lb ee x a m i n e da ta 1 1t h e d a y s ，p h e n o l sc a nb ee x a m i n e d a tt h e7 t h ，1 4 t ha n d4 4 t h d a y a c i d sa n de s t e r so f g r o u pfc a nb ee x a m i n e d a tt h e4 4 t hd a y , a c i d so f g r o u p nc a l lb ee x a m i n e da tt h e1 4 t ha n d4 4 t hd a y , e s t e r so f g r o u pn c a l lb e e x a m i n e da tt h e7 t h ，1 4 t ha n d4 4 t hd a y d u r i n gp r o c e s s i n g ，t h ek i n d so f v o l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n d so f g r o u p fi n c r e a s e df r o m6 9t o8 1 ，t h e n d e c r e a s e dt o7 8 ，t h ek i n d so f v l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n d s o f g r o u pn i n c r e a s e dg r a d u a l l yf r o m6 9t o1 0 5 d u r i n gp r o c e s s i n g ，t h ec o n t e n to f v o l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n d so fg r o u pfi n c r e a s e dt ot h em a x i m u m a tt h e7 t hd a y , t h ec o n t e n to fv o l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n d so fg r o u pni n c r e a s e dt ot h em a x i m u ma tt h e 1 4 t hd a y t h ec h a n g e so f p r o t e o l y s i si n d e x ，f a a ，a va n dp o vo f i n d i c a t e dt h a tp r o t e o l y s i s ，l i p o l y s i sa n d l i p i d o x i d a t i o nw e r eg o i n go ud u r i n gp r o c e s s i n go fg r o u pfa n dg r o u pna n dt h ef l a v o u rp r e s u b s a t a n c e sw e r e a c c u m u l a t e d d u r i n gh o t t t i n g ，l i p i do x i d a t i o no fg r o u pfw e r es i g n i f i c a n t l y f r o mt h e1 4 t hd a yt o4 4 t h d a y , p r o t e o l y s i s ，l i p o l y s i sa n dl i p i do x i d a t i o no f g r o u p nw e r e s i g n i f i c a n t l y k e yw o r d s ：d r y f e r m e n t e d s a u s a g e ，v o l a t i l ef l a v o u rc o m p o u n d s ，c h a n g e ，s d e ，g c m s i i 独创性声明 矿0 , 5 9 7 8 3 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：孑屯 时间： & ，够年f 月，7 h 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：辛屯时间：玉哗年莎月，7 日 导师签名岛 时间：c 形移年6 月 编 中国衣业大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 发酵香肠简介 第一章前言 发酵香肠是指将绞碎的肉、动物脂肪、盐、发酵剂和香辛料等混合后灌进肠衣t 在自然或人 工控制条件下，经过微生物发酵产生酸或醇，使肉的p h 值降低并经成熟干燥( 或不经成熟干 燥) 使a w 下降而制成的具有较好保藏性能和典型发酵风味特性的肉制品。它在法国、德国、意 大利等国家是一种传统的发酵食品具有工艺考究、色香浓郁、风味独特等特点，深受消费者的 欢迎【1 , 2 , 3 1 。 由于加工条件、原料以及添加剂的不同，发酵香肠的种类也不同，根据肉馅的形状可分为粗 绞香肠和细绞香肠，根据产品的发酵程度也可分为低酸发酵香肠和高酸发酵香肠，根据发酵的方 法还可分为添加或不添加微生物发酵剂的香肠，而常用的分类方法是以产品在加工过程中失去水 分的多少为依据，水分失重率在3 0 以上的为干香肠，失重率在1 0 3 0 的为半干香肠，失重 率在1 0 以下的则为不干香肠这种分类方法虽然不很科学，但却被业内人士和消费者普遍接受 【2 ，引。 在南欧和中欧，发酵香肠的历史最为悠久。据考证。发酵香肠起源于地中海地区，那里气候 温和湿度商，有利于香肠发酵和成熟。早在2 0 0 0 多年前，罗马人就知道用碎肉加盐、糖和香 辛料制成美昧可口的香肠。且这类产品具有较长的保存期，不过当时的产品主要是通过自然发酵 和成熟干燥制成的干香肠【1 , 4 1 。世界上许多地方都是从欧洲国家引入香肠的生产方法和配方，并加 以改进。如泰式生香肠就是如此，而中式生香肠的制作很少涉及到微生物活动，主要是通过干燥储 藏进行。传统发酵香肠的生产，其发酵微生物主要来自原料肉本身及偶然从环境中混入的微生物， 产品质量不稳定，且传统的生产工艺不适应大规模工业化生产的需要“j 。随着肉品加工技术的发 展和食品冷藏工艺的出现在今天的欧洲，发酵香肠的生产已经完成了从传统的自然发酵向微生 物定向接种培育的工业化生产的转变。参与香肠发酵的微生物主要有细菌、酵母菌和霉菌。目前 生产上使用较广泛的是细菌主要是乳酸菌、微球菌和非致病性葡萄球菌。其中乳酸菌主要发酵 碳水化合物产生乳酸，微球菌和非致病性葡萄球菌则还原硝酸盐和亚硝酸盐，使香肠呈现良好色 泽，同时还降解蛋白质和脂肪，产生独特的风味【l 捌。欧洲的许多国家中。如法国、西班牙、意大 利、德国以及甸牙利等发酵香肠的生产都是国家肉类工业中最重要的和最活跃的经济活动之一 m l 。这些国家对发酵香肠的研究早在几百年前就开始了，特别是近几十年变得非常活跃。到目前 为止，关于发酵香肠的研究工作主要集中在以下两个方面：一是改进发酵香肠生产工艺的研究， 主要研究发酵香肠在发酵和成熟过程中的生化和微生物变化以及生产工艺条件对最终产品质量 的影响；二是筛选和构建具有优良性状的微生物发酵菌种1 1 , 6 , 7 1 。但在我国，到目前为止，有关发 酵香肠的研究报道还很少，只有少数学者对生产发酵香肠所用的发酵剂口“”和加工工艺 i s - g 以及 中式发酵香肠的生产口”1 等方面作了一些初步的研究和探讨。 发酵香肠具有口味鲜美、香味浓郁、无需冷藏、可即食等特点，不仅在欧美各国广为流行， 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 深受消费者青睐，也逐渐引起一些以往对发酵香肠难以接受的国家和地区的浓厚兴趣，消费群体 不断扩大成为世界各地食品新产品开发的首选对象”“。我国是一个肉类生产和消费大国随着 我国人民生活水平的提高人们迫切需要一些档次高，风味独特且具有一定保健作用的新型肉制 品，发酵香肠正好可以满足这种消费需求。因此，在西式发酵香肠的基础上，结合我国的具体情 况生产适合中国人口味的发酵香肠，发展前景广阔。 1 2 发酵香肠风味的形成 发酵香肠的风味是发酵香肠中的风味物质刺激人的味觉和嗅觉感受器而产生的一种综合感 受。风味物质包括挥发性和非挥发性的风味化合物【2 8 ”。发酵香肠特有的风味是由以下几个部分 组成的i i 0 0 1 2 e ”i ：组织酶( 蛋白酶和脂肪酶) 和微生物酶降解腊防、蛋白质、碳水化舍物形成 的风味物质：非生物直接参与的反应( 脂肪自动氧化) 产物：添加到香肠内的成分( 如盐、 香辛料等) 产生的风味。其中脂肪和蛋白质是发酵香肠的主要风味来源，提供了风味前体物一 游离脂肪酸和游离氨基酸，对风味产生直接作用。而挥发性风味成分中。大部分由脂肪氧化 分解形成，小部分由脂肪和蛋白降解产物共同反应形成或氨基酸单独降解形成。 1 2 1 碳水化合物的降解 发酵香肠的发酵过程中，乳酸菌等微生物分解碳水化合物获得自身生长繁殖的碳源，并经过 e m p 酵解途径将碳水化合物降解为乳酸等产物。赋予香肠一种酸味。在发酵香肠生产的最初3 天香肠中乳酸含量显著增加( 主要是d 型乳酸含量增加) ，随后的发酵成熟过程中乳酸含量继续 增加，但增加速度减缓然后含量保持恒定。3 天后。l 型乳酸和d 型乳酸以相近的速度增加i ”】。 一般来讲在最终产品中d 型和l 型乳酸的量几乎相等【l l 。k a g e m e i e r i ”的研究发现乳酸两种对应 异构体的比例取决于乳酸菌的种类。不同的微生物组合和发酵时间对d 型乳酸的量影响显著。清 酒乳杆菌和乳酸片球菌间的d 型乳酸产生能力没有差异，丽戊糖片球菌产生d 型乳酸的能力则 显著低于上述2 种微生物沃式葡萄球菌产生d 型乳酸的能力显著强于肉耱葡萄球菌和腐生葡萄 球菌p “。发酵香肠中，d 型乳酸含量过高会使产品产生不愉快的酸味，它的含量在3 0 6 0um o l g 的范围内，可以获得口感适宜的产品。乳酸的形成和p h 值的降低对于发酵香肠的食用品质有重 要意义。乳酸虽然没有典型的风味，香气化合物的特性，但可以提供特征性的酸味，尤其是高酸度 半干型发酵香肠中强烈的酸味的主要来源，并在某些条件下强化产品的咸味。较低的p h 值也可 以抑制产品中的蛋白分解酶和脂肪分解酶的活性而改善产品的风味 2 , 3 1 】。 在发酵香肠中也会形成乙酸和少量的中间产物丙酮酸 2 1 。乙酸的含量在发酵的最初3 天增加 到最大值，并在以后的加工储存过程中保持同一水平i ”l 。d e k e t e l a e r e 等”i 和d e m e y e r l 3 3 1 发现在比 利时烟熏半干香肠中，乳酸对乙酸的摩尔比发酵后是7 ，干燥后为1 2 。在一定的d h 条件下，乙 酸含量高会使产品有一种不太纯的、更酸的风味。 碳水化合物发酵也导致低分子量化合物的释放，如双乙酰、乙醇、2 羟基丁酮、l ，3 丁二酮、 2 , 3 一丁二酮，尽管它们在发酵香肠中的量很小，但是似乎对香肠香味中的干酪味有影响 3 4 1 。m a t e o 等p q 指出一些酯类物质如丙酸乙酯、醋酸丙酯、丁酸乙酯也可能来自发酵过程。 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 1 2 2 脂肪的降解和氧化 脂肪是发酵香肠中主要组分之一，是形成发酵香肠风味成分的重要底物之一。 发酵香肠生产过程中。脂肪在脂肪酶的作用下降解产生游离脂肪酸和低级甘油酯，这些物质 既可以促进香肠的风味又可以作为底物进一步产生风味物质。 人们经过大量的研究证实干发酵香肠中三酰甘油的降解过程如下：( 1 ) z 酰甘油首先降解为 1 , 2 二酰甘油和游离脂肪酸；( 2 ) 1 ，2 二酰甘油自发地转变成l ，3 - 二酰甘油，这是因为l ，3 构象的二 酰甘油热力学稳定性更好；( 3 ) 1 ，3 - 二酰甘油进一步降解为单酰甘油和游离脂肪酸t 3 6 3 9 1 。 s t a h n k c 等1 州用木糖葡萄球菌生产干发酵香肠，在研究其成熟过程中的脂类降解时发现游 离腊肪酸组成中不饱和脂肪酸占了7 5 9 。说明不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸更易释放。在各种不 饱和e 目肪酸中，亚麻酸( 1 3 ：3 ) 、亚油酸( 1 8 ：2 ) 和棕榈酸( 1 6 ：1 ) x t 七油酸( 1 8 ：1 ) 更容易释放，而在所有 脂肪酸中，棕榈酸的释放量最少。由猪背脂三酰甘油的脂肪酸构成及其位置分布可知三酰甘油 s n l 和s n 3 位置的脂肪酸优先被发酵剂微生物脂酶水解。这一方面是由于甘油酯分子s n 2 位置的 不饱和脂肪酸因空间位阻不容易被脂酶攻击，另一方面证实发酵香肠中微生物脂酶具有s n l 和 s n 3 特异性”“。与添加发酵剂的发酵香肠相比，添加外源脂酶生产的发酵香肠，游离脂肪酸的组 成不同。z a l a c a i n 等 3 7 , 3 9 , 4 2 1 分别用胰脂酶、柱状假丝酵母脂酶和r h i z o m u c o r m i e h e i 脂酶生产干发 酵香肠时发现，游离脂肪酸中饱和脂肪酸( s f a ) 比例较高，多不饱和脂肪酸( p u f a ) 比例较低而 单不饱和脂肪酸o v i u f a ) 没有显著差别。此结果被解释为以上脂酶可能更有利于饱和脂肪酸的释 放。但是他们在研究添加曲霉属脂酶生产的发酵香肠时却发现发酵剂组、脂酶组、发酵i i + i i 酶 组在游离脂肪酸的组成上s f a 、m u f a 和p u f a 的比例无显著差异，但发酵剂+ 脂酶组比发酵剂 组或脂酶组的脂肪降解作用更强烈。 目前学术界对脂肪分解机理存在争议，有研究人员指出【4 ”，微生物脂酶对脂肪酸释放有重要 作用，乳杆菌及脂分解微球菌能分解短链脂肪酸甘油酯。k m o l l y l 4 3 l 对发酵香肠内源脂酶和微生 物脂酶的相对重要性进行研究，通过使用抗生素抑制微生物正常生长指出微生物脂酶对脂分解 作用不大，内源脂酶才是影响脂分解的关键因素。目前的研究证明，微生物脂酶和内源脂酶是影 响脂肪分解的主要因素，但两者哪一个更重要仍需进一步研究【”。 不管脂肪酸释放的机理如何，它都是重要的风味物质，短链脂肪酸( c 1 2 1 对食品风 味无明显影响【。 脂肪水解为游离脂肪酸后，经过酶和非酶反应产生大量挥发性化合物，如醇、醛、酮和羧酸 等。醛可能是来自脂肪的挥发性化合物中最有价值的成分，它们的风味阈值很低，己醛是其中最 丰富的风味物质，亚油酸自动氧化生成已醛和戊醛，癸醛、2 己醛和2 庚醛与挥发性风味关系较 大，它们的阐值在5 6 0 0 p p b ，星现新鲜味、金属味和水果味。醇是由脂肪氧化产生的醛在醇脱 氢酶的作用下产生的。甲基酮是饱和脂肪酸经e 一氧化后，由b 酮酸脱羧产生，甲基酮比同分异 构体的醛阈值要高，它们会增加芳香味、水果味和脂肪味等。另外，羟基脂肪酸内酯化及脂肪氧 化可能会产生内酯。在香肠中这些成分的含量很低，只有m p 拈, g 数量级，但由于它们的阈值很低。 除了直链脂肪烃无香味外，其他的成分对香肠的风味均有重要贡献1 2 s , 4 0 。脂肪氧化是发酵香肠风 中国农业大学硕士学位论文第一章前言 味的重要来源。b e r d a g u e 【“】对未加香辛料的发酵香肠产生的风味物质进行分析指出脂肪氧化所产 生的风味物质占总风味物质的6 0 。 1 2 。3 蛋白质的降解 发酵香肠成熟期间，在脂肪降解的同时，蛋白质也发生水解产生多肽、游离氨基酸等。有文 献报道，总蛋自在成熟的1 4 1 5 天中下降了2 0 4 5 ，而非蛋白氨提高例如3 0 咀上。非蛋 白氪由游离氨基酸、核苷酸和多肽类物质组成b ”。关于微生物蛋白酶与肉中内源蛋白酶在发酵香 肠蛋白质降解中相对重要性的问题一直在争论中。有研究表明婶舢i ，香肠中蛋白质的水解反应主 要由肉中本身的蛋白酶催化，这些酶包括钙激活酶和组织蛋白酶。在多数情况下由微生物代谢产 生的酶类引起的蛋白质永解似乎不起主要作用。但也有人报道，当发酵剂中包含有水解蛋白质活 性的菌株如变形小球菌、乳杆菌和片球菌时，香肠非蛋白氮的含量可以提高h ”。 游离氨基酸和寡肽对改善香肠的滋味具有重要作用。在水溶液中，每种氨基酸和肽类有其自 己的滋味但通常其阈值较高，如谷氨酸 5 0 m g ，l ，亮氨酸2 0 0 0 m g 几时才起呈味作用。同时游 离氨基酸和寡肽还与其他成分协同作用，从而促进最终产品风味的形成。但当蛋白质水解指数高 于2 9 3 0 时，会产生令人不愉快的滋味，如苦味和金属后味”q 。 氨基酸通过美拉德反应和斯托勒克降解等反应进一步降解，产生的小分子挥发性化合物也是 干香肠风味的构成成分。支链氮基酸( 亮氮酸、异亮氨酸和缬氨酸) 、苯丙氨酸或蛋氨酸降解产生 醛、醇和酸。研究证实，2 甲基丙醛、2 - 甲基正丁醛和3 - 甲基正丁醛是干发酵香肠特征风味的组 成成分。它们分别来源于缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸的降解，它们相应的醇和酸也参与发酵香肠 风味的形成 3 , 2 s j 。 此外，这些产物之间又相互作用如酸和醇作用产生酯等，对风味均有重要贡献。 1 2 4 风味物质的其他来源 在发酵香肠加工时一般要加入胡椒、大蒜或洋葱等香辛料，这些香料会为发酵香肠提供独 特风味，胡椒可以产生萜类物质，而大蒜中的大蒜素可以转化成含有芳香味的含硫化合物及其衍 生物，此外胡椒等香辛料中锰的含量较高，可以促进乳酸菌的生长和代谢，从而刺激乳酸的生成 ”。发酵香肠中添加的食盐也是形成产品滋味的重要成分之一。另外，很多研究发现亚硝酸盐对 风味也起一定的促进作用1 2 ) 1 。 实际上，发酵香肠的风味物质来源远比这些途径复杂，各种来源的界限也不是那么清晰，它 们交织在一起共同赋予发酵香肠独特的风味，而且它们对风味的贡献依赖于原料特性、发酵剂和 加工工艺等多种因素。 1 3 肉品挥发性风味成分的提取方法和定性定量方法 1 3 1 挥发性风昧成分的分离提取 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 食品体系是一个极其复杂的体系，而食品香气中起作用的挥发性风味成分大多数又是浓度极 低的物质因此在复杂的食品体系中分离提取其挥发性风味成分是一项复杂和艰巨的工作。目 前用来分离提取肉类制品风味和芳香类物质的常用方法主要有同时蒸馏萃取法( s i m u l t a n e o u s d i s t i l l a t i o n - e x t r a c t i o nm e t h o d ，简称s d e ) 、吹扫捕集法( p u r g ea n d t r a pm e t h o d ，简称p t ) 、固 相微萃取法( s o l i d - p h a s em i c r o e x u a e t i o n ，简称s p m e ) 。其中s d e 法、p t 法应用较早，使用也 很广泛。国内外已普遍用于各种肉制品芳香成分分析中挥发性风味物质的提取过程。而s p m e 法 是一种分析检测食品风味物质的新方法，正越来越受到食品研究工作者及其他分析从业人员的普 遍关注并正在推广应用 5 0 , 5 1 , $ 2 l 。 1 3 2 挥发性风味成分的定性 目前，挥发性风味成分定性的主要方法有以下几种i s 3 s 4 1 ： ( 1 ) 与标准物的保留参数对照定性：这是色谱分析中应用最普遍的一种定性方法。在相同的 色谱条件( 柱温、柱长、柱内径、载气流速) 下，任何一种物质都有确定的保留值在一定条件 下测定各色谱峰的保留时间，与相应的标准物进行对照。便可知色谱峰代表的是何种化合物。 ( 2 ) 用参考文献提供的保留数据定性：在实际应用中，可以参考文献发表的保留数据来进行 定性。其中最有参考价值的保留数据是相对保留值和保留指数。 ( 3 ) 利用气质联机进行定性：该方法是色谱和质谱的联用技术，广泛用于挥发性风味成分的 定性分析，它一方面利用色谱柱作为高效分离手段，分离出纯的或比较纯的化台物。送入质谱； 另一方面利用质谱的高分辨定性鉴定手段，对色谱柱分离出的化合物进行定性。因此，气质联机 联用技术可以发挥气谱和质谱的各自特点，特别是联用计算机系统进行数据采集和处理以来，使 该联用系统更为方便实用。 ( 4 ) 利用检测器的选择性定性：不同类型检测器对同一物质的响应不同。可利用类型不同的 双检测器系统进行定性。如电子捕获检测器对含有强电子负性的原子或基因的化合物具有很高的 灵敏性，火焰光度检测器对硫磷化合物有高选择性和高灵敏度，热离子检测器对磷氮硫等有机化 合物有较高的选择性和灵敏度。 1 3 3 挥发性风味成分的定量 色谱定量方法已非常成熟。但由于挥发性风味成分种类多、含量低、缺少标样，迄今为止， 挥发性风味成分的定量多建立在峰面积或峰面积的比值上挥发性风味成分的定量分析方法有面 积归一法、内标法、外标法。归一法要求各成分能流出色谱柱，并在色谱图上显示色谱峰时方可 进行定量计算- 因此在实际应用中受到限制。外标法也称标准曲线法，但这种方法受到分析条件 的限制对操作者的分析技术水平要求较高。目前常用的是内标法。该方法将一定量的标准纯物 作为内标加到样品中，同时测定内标物和各成分的峰面积和相对响应值计算出各组分在样品中 的含量，因此可以消除实验操作中的误差，克服归一法的缺点，检测结果也较归一法准确。然而 同一检测器对不同物质具有不同的响应值，两个等量的不同物质出峰面积往往不相等，由于缺少 标样，到目前为止各种成分对特定检测器的相应校正因子都没有报道，故还不能以此计算决对 中国农业大学硕士学位论文 第一章前言 含量【5 3 , 5 4 1 。 1 4 发酵香肠挥发性风味成分的研究进展 在国外自从1 9 9 0 年开始。一些有关发酵香肠中挥发性风味成分的研究报道大量出现，这 些研究大多采用同时蒸馏萃取或吹扫捕集的方法从发酵香肠中分离提取出挥发性风味成分，结合 气质联机进行定性，有的也进行定量。这些研究试图寻找本国( 地) 典型发酵香肠产品中挥发性 风味成分的组成与特征性成分。或是寻找挥发性风味成分的来源及其与发酵荆、香肠配料或加工 工艺间的关系。b e r g e r 等9 ”用动态项空法研究了s a l a m i 香肠的挥发性风味成分，共鉴定出8 0 种 成分。b e r d a g u e 等l 1 采用动态顶空气质联机，以十二烷为内标对三种乳酸菌和三种葡萄球菌混 合作发酵剂生产的不加调味料的干发酵肠进行研究，鉴定出8 0 种物质，包括烃、醛、酮、醇、 羧酸、含氯化合物、呋喃、吡嗪及挥发性氨等物质。j o h a n s s o n 等【”i 采用吹扫捕集气质联机对接 种戊糖片球菌和木糖葡萄球菌的发酵肠挥发性风味成分进行分析鉴定了8 8 种物质，其中萜类 占5 2 、含硫化合物占2 0 、其它物质占2 3 。j a v i e rm a t e o 等p ”采用同时蒸馏萃取法、以壬烷 作为内标对c h o r i z o 成熟过程中的挥发性化合物变化进行研究，共鉴定出l1 5 种挥发物，发现工 业发酵肠中含量最多的风味物质包括醋酸、烯丙基一1 硫醇、二烯丙基二硫化合物、丙酸、呋喃醇 及酚类物质。同时根据香肠成熟期间挥发物比例的变化，发现大多数物质尤其是酸、醇、酯、酚、 酮和萜类物质是增加的。a m e y n i e r l ”l 采用吹扫捕集，气质联机、以壬烷作为内标对m i l a n o 色拉 米的挥发物进行研究，共定性定量出8 0 种物质其中6 0 5 来自调味料，1 8 9 来自脂类氧化， 1 1 8 来自氨基酸降解，4 9 9 来自发酵过程，并使用s n i f f i n g 嗅探检测出1 9 种气味。e d w a r d a 等 ”采用吹扫捕集，气质联机、以乙基己烷作为外标对西班牙干发酵肠挥发性风味成分分析得出， 萜类和酯类是s a e h i c h o n 发酵香肠的主要风味成分，萜类是f u c t 发酵香肠的主要风味成分，e h o r i z o 与s a c h i e h o n 相似。含有酯类，同时也含有三种硫化合物。b r u n a 等p ”对表面接种青霉的干发酵肠 的风味物质进行分析，得到8 2 种挥发性风味成分，其中有2 5 种烃、1 9 种醛、1 2 种醇、7 种萜、 6 种酸、5 种酯、5 种酮、2 种呋喃和1 种硫化合物。d i a n a a n s o r e n a ! ”i 使用同时蒸馏萃取气质联 机、以十二烷为内标对传统的西班牙干发酵香肠( c h o r i z od ep a m p l o n a ) 中的挥发性风味成分进 行分析。5 个商业品牌中的挥发性风味成分的种类和数量存在差异，共分离出1 9 3 种物质，在所有 品牌中，酸类物质是数量晟多的，达到总量的6 0 。醛类达到总量的7 7 2 1 3 9 7 l o s u n e s e n 等1 6 0 采用吹扫捕集法，气质联机、以壬烷作为内标对意大利干香肠成熟过程中的挥发性风味成分 进行了研究，共鉴定出6 8 种挥发物，其中胡椒类物质含量最大。占到总量的5 1 8 1 ，且其 在1 8 天时浓度达到最大值，而脂类氧化产物只占到挥发物总量的3 1 8 。 在国内，俞龙浩等1 采用同时蒸馏萃取法对广式香肠挥发性风味成分进行了研究，共检出 7 8 种化合物，其中酯类2 4 种。醇类7 种，醛类1 3 种酮类7 种，烷烃类6 种，酸类4 种，含n 、 s 化台物4 种，醚及环氧类3 种，它们主要来自汾酒、酱油、熟肉的香气成分以及特有的广式香 肠加工过程中的荧拉德反应。张春晖【6 2 l 利用固相微萃取技术结合气质联机对成品发酵香肠的挥发 物进行了定性分析，鉴定出3 6 种物质。主要有乙醇，2 丙酮、乙酸乙酯、乙酸、3 甲基1 丁醇、 3 - 羟基- 2 丁酮，它们的含量占到总体的7 3 9 。 6 但是，在国内外的研究中，有关发酵香肠生产过程中挥发性风味成分变化的研究还比较有限， 只有j a v i e rm a t e o 等【3 5 1 和l 0 s u n e s e n 等1 种l 报道过有关的研究工作。而国内还没有相关的文献报 道。 综上所述，本研究的目是选用适当的分离提取和分析技术，对发酵香肠生产过程中挥发性风 味成分的变化进行分析和研究以了解挥发性风味成分的来源和演变同时了解自然发酵和发酵 剂发酵香肠生产过程中挥发性风味成分变化的异同，从挥发性风味成分的角度为发酵香肠生产时 发酵剂、生产工艺及配方等的选择提供参考。为我国肉制品企业新产品的开发做出贡献，进而促 进中国肉制品深加工业的发展。 7 2 1 试验材料 第二章材料与方法 2 1 1 原料：双汇中试车间加工的法式发酵干香肠。 主要原辅料：4 号猪瘦肉、猪背膘、蔗糖、葡萄糖、食盐、亚硝酸钠、硝酸钠、黑胡椒粒， 由双汇技术中心提供。 发酵荆：冻干菌种a ：l b p e n t o s u s , p p e n t o s a c e u s ；b ：s t c a r n o s u s 。 由意大利p r o b i o t i e 公司提供。 发酵剂的复活与添加：定量称取冻干菌种a 和b ，分别加入用脱脂奶粉和葡萄糖配制的活 化液中，3 0 m i n 后稀释并用m r s 和m s a 平板记数，根据计数结果按1 0 7 c f u g - 肉馅添加 发酵剂。 加工工艺流程：原辅材料混合搅拌腌制抽真空真空充填 啪烘发酵干燥成熟包装 热烘：2 5 2 7 ，r h 6 0 左右 发酵：温度1 5 。r h 为8 5 风速0 4 r r d s 干燥成熟：温度1 3 1 4 0 风速小于0 2 - 0 3 m s ，r h 逐渐降低从8 5 到7 0 失水量达 到灌制完重量的3 5 - 3 8 ，干燥接近完成时保持温度在1 5 c ，r h 6 0 - 7 0 风速 0 4 - 0 5 m s 后熟；温度1 5 ，r h 6 0 - - - 7 0 其中发酵剂发酵干香肠( f 组) 在混合搅拌后接种发酵剂，自然发酵干香肠( n 组) 不接 种发酵剂。 2 1 2 主要试剂： 壬烷、乙醚、乙醇、石油醚、l ，l ，3 ，3 一四乙氧基丙烷、浓硫酸、无水硫酸钠、氢氧化钾、 硫代硫酸钠、碘化钾、酚酞、兰氯乙酸均是北京市化工厂分析纯试剂。 2 1 3 气体材料：高纯氨气( 纯度大于 9 9 9 9 9 ) ，由北京氨普气体公司提供。 2 2 主要仪器设备 同时蒸馏萃取装置 气相色谱，质谱联用仪 毛细管色谱柱 l i k e n s n i c k e r s o n 德国( 详见图1 ) a g i l e n t6 8 9 0 a g i l e n t5 9 7 3 型美国 h p - 5 型美国 8 中国农业大学硕士学位论文 第二章材料与方法 水活性测定仪 酸度计 自动定氮仪 紫外分光光度计 电热恒温鼓风干燥箱 电热恒温水浴锅 调温电热套 电子天平 2 3 实验内容及方法 ( 3 0 0 m x0 2 5 m m x 0 2 5 u m ) t h 2 0 0 p h s t 4 2 3 0 0 t 5 2 d h g 9 1 4 6 a h h l l - 4 型 k d m 型 b s 2 1 0 s 型 围1 同时蒸馏萃取装置示意图 f i g l s k e t c hm a po f i n s t r u m e n tf o rs d e 瑞士 上海雷磁仪器厂 瑞典 上海第三分析仪器厂 上海精宏实验设备有限公司 北京长安科学仪器厂 山东省鄄城永兴仪器厂 德国 在发酵干香肠生产过程中灌肠结束( 0 天) 、热烘结束( 1 5 天) 、发酵结束( 7 天) 、干燥结 束( 1 4 天) 、后熟( 4 4 天) 时对f 组和n 组的发酵干香肠分别进行取样，按照下面的方法分离 提取和鉴定挥发性风味成分同时对蛋白质和脂肪的水解和氧化情况及其他有关理化指标进行测 定。 2 3 1 发酵干香肠生产过程中的挥发性风昧成分的组成和变化 2 3 1 1 发酵千香肠中挥发性风味成分的分离提取 采用同时蒸馏萃取( s d e ) 法( 装置见图1 ) 分离提取发酵千香肠中的挥发性风味成分。取 搅碎的发酵干香肠1 0 0 9 ，另取4 0 m l 三重蒸馏乙醚，分别放入同时蒸馏萃取装置的样品瓶和溶剂 瓶中，再向样品瓶中加入3 5 0 m l 蒸馏水进行提取。样品瓶中加入2 0 微升2 壬烷( 溶于乙醚) 作 为内标 3 s , s 6 , “l 。样品和溶剂分别以其沸点温度加热，带有挥发性风味成分组分的水蒸气和溶剂蒸 9 中国农业大学硕士学位论文 第- - 章材料与方法 汽会聚后冷凝，两相不相溶，在同时蒸馏萃取装置的“u ”型管中分开，分别流回两侧的样品瓶 和溶剂瓶中，提取3 小时后分离乙醚相，无水硫酸钠干燥后用氮气吹扫浓缩，至体积为o 5 m l ， 供g c m s 分析眦3 5 , 5 2 s g l 。 2 3 1 2 运用g c m s 对挥发性风昧成分进行分析 使用h p 6 8 9 0 型气相色谱5 9 7 3 型质谱联用仪对提取到的挥发性风味成分进行分析。对于s d e 法制得的分析样品，取l p l 上述浓缩液注入到g c 中进行分离分析。 挥发性风味成分在h p 5 色谱柱( 3 0 m x 0 2 5 m mi d 0 2 5 p m ) 上完成分离。以氮气为载气，流 速是l m l m i n 。整个色谱运行过程中进样i = l 温度维持在2 2 0 ( 2 进样时以不分流方式进样。程序 升温条件如下：首先以3 5 加热1 0 m i n ，然后以3 c r a i n 的速率升温至1 0 0 c 保持1 0 m i n ，再以5 c r a i n 的升温速率升至2 0 0 保持1 0 m i n ，最后以1 0 c m i n 的升温速率升至终了温度2 4 0 c ，保 持1 0r a i n 。g c m s 的接口温度采用2 7 0 c 以电子轰击方式、能量为7 0 e v 进行m s 运行，压力 为1 6 5 0 v ，数据以3 0 3 0 0 a i n u 的扫描范围进行收集，通过比较挥发性风味成分的质谱数据与计算 机标准谱图库n i s t9 8 l 中的数据以及与以前文献报道过的成分相对照，对发酵千香肠中的挥发 性风味成分进行分析。半定量是将挥发性风味成分在总离子图的峰面积与内标壬烷的峰面积进行 比较，结果以“嵋等量壬l u g 干基”的形式表示。 2 3 2 发酵千香肠生产过程中的理化变化 为了更好地了解发酵干香肠的挥发性风味成分的形成和变化，对发酵干香肠加工过程中的理化 变化进行了跟踪测定，测定指标和方法如下： 2 3 2 1 发酵千番肠生产过程中的物理化学变化 水分含量的测定：g b , r r 5 0 0 9 t 3 一1 9 8 5 水分活度的测定：g b r 9 6 9 5 1 2 一1 9 8 8 d h 值的测定： g b t 9 6 9 5 5 1 9 8 8 2 3 2 2 发酵干香肠生产过程中的蛋白质水解情况 蛋白质水解指数的测定：m a f i a c a r e r i 等1 9 9 3 年方法州1 游离氨基酸的测定；氨基酸自动分析仪法 2 3 2 3 发酵千香肠生产过程中的脂肪水解和氧化情况 酸价的测定：g b t 5 0 0 9 3 7 一1 9 9 6 过氧化物值的测定：g b t 5 0 0 9 3 7 一1 9 9 6 1 0 第三章结果与分析 3 1 发酵干香肠生产过程中挥发性风昧成分的变化 为了研究发酵干香肠生产过程中挥发性风味成分的组成和变化。对于f 组和n 组发酵干香肠 在生产过程中的0 天、1 5 天、7 天、1 4 天和4 4 天时的挥发性风味成分的种类与含量，利用2 3 1 1 和2 3 1 2 中的方法进行分离、提取和鉴定然后进行分析和比较。 3 1 1f 组发酵千香肠生产过程中挥发性风味成分的变化 利用2 3 1 1 和2 _ 3 1 2 中的方法对f 组发酵干香肠在生产过程中0 天、1 5 天、7 天、1 4 天和 4 4 天时的挥发性风味成分进行分离提取和鉴定。总离子流程图分别见图2 、3 、4 、5 、6 鉴定出 的化合物明细见表l 。 i i 围2 i |l i l 卜i i 瞄3 一 l j j 圳l【li川。l“。11 图5 u 。1lj l l ，。i0 图4 i l 一n 。j j虮【 4 图6 表if 组发酵千香脯生产过程中的挥发性风昧成分明细表 t a b l e l v o l a t i l en u v o u rc o m p o u n d so f g r o u pf d u r i n gp r o c e s s i n g 喜蒿 英文名称 中文名称 0 天1 5 天7 天1 4 天4 4 天 p g 等量壬烷g 千物质 a l d e h y d e s 醛类 8 5 8h c x a n a l己醛 0 7 14 8 72 8 62 0 201 3 i i1 5i m r f u r a l糠醛 0 0 l0 0 l 0 0 l o 0 2 1 62 h c p t a n a l 庚醛 0 0 50 5 6 o 4 8 2 5l b e n z e n e a c e t a l d o h y d e 苯乙醛 0 0 50 1 8o 0 70 3 30 4 4 2 s 6 2n o n a n a l壬醛 o 2 5o 8 2o ，9 60 6 7 0 1 9 5 5 5 8t e t r a d e c a n a l十四醛 o o l00 so0 6o 0 4 0 0 3 5 82 1d e n t a d e c a n a l十五醛 0 0 20 0 5o0 80 0 60 0 7 印5 5h c x a d e c a n a l十六醛 0 3 71 1 5 3 6 01 9 02 - 6 6 6 2 7 1o c t a d e c a n a l十八醛 o0 2o 0 30 0 900 60 0 7 6 5 0 8o c t a d e c a n a l十八醛异构体 0 0 30 0 7o ，3 801 903 0 1 26 92 - h e x e n a i ，( e )2