（环境工程专业论文）三株轻度嗜盐聚磷菌的分离鉴定及其除磷特性分析.pdf

摘要 传统生物除磷法在处理低盐度废水时具有很大的优势，但当盐浓度过高时，会 造成微生物的质壁分离和代谢的中度抑制，使其失去降解能力。而在化工、石油、 海产品加工和养殖等行业中，外排含磷废水大多具有高盐的特点。因此分离出能耐 受高盐环境的聚磷菌，将为生物法处理高盐废水提供了可行性。 本文从运行稳定的以生活污水为碳源的污泥基础上，采用磷酸二氢钾作为唯一 磷源的培养基，进行嗜盐聚磷菌的富集、分离和筛选，获得三株既能耐受高盐度、 又能高效降解磷酸盐的聚磷菌q d p 0 1 、q d p 0 3 和q d p 0 5 。通过对三株菌的形态观察、 生理生化实验以及1 6 sr d n a 序列同源性分析可得：菌株q d p 0 1 为产碱杆菌属 ( a l c a l i q e n e ss p ) ，菌株q d p 0 3 和q d p 0 5 为肠杆菌属( e n t e r b a c t e r ss p ) ， 研究了盐度、温度、p h 、碳源种类对三株菌除磷效果的影响，总结出了三株菌 进行吸磷作用的最佳范围条件：当盐度为2 、温度为3 0 、p h 值为8 、碳源为乙 酸钠时，三株菌对磷的去除率均可达到8 0 以上。通过在s b r 反应器中厌氧好氧连 续培养实验，证明三株菌具有聚磷菌的共性，连续培养可以得到更好的除磷效果。 通过各菌株的耐盐性试验可得：三菌株的最适盐度为0 - 5 ，证明三株菌均具有较高 的耐盐性，对高盐环境中磷的去除有较高的应用价值。 关键词：高盐废水；嗜盐聚磷细菌；1 6 sr d n a 序列分析；除磷特性 a b s t r a c t c o n v e n t i o n a lb i o l o g i c a l p h o s p h o r u sr e m o v a lp r o c e s si s m o r ed o m i n a n tw h e n o p e r a t i n gu n d e ral o ws a l i n i t ye n v i r o n m e n t ，b e c a u s eh i 曲s a l i n i t yc a l lc a u s eb a c t e r i a l p l a s m o l y s i sa n dl o s so fm e t a b o l i cf u n c t i o n s b u ti ns o m ei n d u s t r i e s ，s u c ha sf e r t i l i z e r , p e t r o l e u m ，a n ds e a f o o dp r o c e s si n d u s t r ya n ds oo n , t h ew a s t e w a t e rc o n t a i n sh i g h c o n c e n t r a t i o no fs a l t a sac o n s e q u e n c ei th a sb e c o m ea ni s s u ef o rr e s e a r c ht os c r e e n i n g o f h e t e r o t r o p h i cp a o s u s i n gm o n o p o t a s s i u mp h o s p h a t ea st h es o l ep h o s p h a t es o u r c e ，t h r e es t r a i n so f h a l o p h i l i cp h o s p h a t ea c c u m u l a t i n gb a c t e r i a , d e s i g n a t e da sq d p 01 ，q d p 0 3a n dq d p 0 5 ，w e r e s e l e c t e da f t e rt h ee n r i c h m e n ta n ds e p a r a t i o no ft h eb i o l o g i c a ls l u d g ei nas t a b l yo p e r a t e d s y s t e mi nw h i c ht h ec a r b o ns o u r c ew a sd e r i v e df r o mt h ed o m e s t i cs e w a g e a c c o r d i n g t o t h em o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，p h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lt e s t sa n ds e q u e n c ea n a l y s i so f t h e16 sr d n a ，s t r a i nq d p 01w a si d e n t i f i e dt ob ea sa l c a l t q e n e ss p s t r a i nq d p 0 3a n d q d p 0 5w e r ei d e n t i f i e dt ob e a se n t e r b a c t e r ss p v a r y i n gs a l i n i t y , t e m p e r a t u r e ，p ha n dc a r b o ns o u r c e sw e r ei n v e s t i g a t e dt oi d e n t i f y t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp h o s p h o r u sr e m o v a l t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ：w h e ns a l i n i t y 2 ，t e m p e r a t u r e3 0 。c ，p h8 0 a n ds o d i u ma c e t a t ew a su s e da sc a r b o ns o u r c e s ，t h e r e m o v a lr a t e so ft h ep h o s p h a t eb yt h et h r e es t r a i n sw e r ea l lo v e r8 0 t h r o u g ht h e e x p e r i m e n t sa b o u ta n a e r o b i c o x i ec o n t i n u o u sc u l t i v a t i o ni ns b rr e a c t o r , t h r e es t r a i n s h a v ec o n l l n o nn a t u r eo fp a o s ，t h ep h o s p h a r er e m o v a lr a t ei sh i g h e rw h e nt h es t r a i n sw e r e a n a e r o b i c o x i cc o n t i n u o u sc u l t i v a t e d t h eo p t i m a ls a l i n i t yr a n g e so ft h r e es t r a i n sw e r e 0 - 5 s ot h et h r e es t r a i n sc a nt o l e r a n tah i g hr a n g e so fs a l i n i t y , w h i c hh a v eg r e a t a p p l i c a t i o nv a l u ef o rp h o s p h o r u sr e m o v a lo f h y p e r h a l i n ew a s t e w a t e r k e yw o r d s ：h y p e r h a l i n ew a s t e w a t e r ；h a l o p h i h cp h o s p h a t ea c c u m u l a t i n g b a c t e r i a ；1 6 sr d n a ；p h o s p h a t er e m o v a lc a p a b i l i t y 4 洲3i3咖402 洲y 第一章综述 第一章综述 1 1 高盐废水生物除磷处理研究现状 1 1 1 磷污染的危害性 水体中的氮和磷是水体富营养化的主要原因，富营养化过程是多种因素共同作 用的结果，这些因素中有一种或者几种起主导作用n 1 ，在所有营养元素中磷被认为 是引起富营养化的关键因素瞳。3 1 ，国外通常把总磷浓度超过0 0 2m g l 作为富营养化 水质标准，在我国2 0 0 2 年实施的地面水环境质量标准规定了总磷浓度超过0 2 m g l 即为富营养化水质h 1 。按照藻类对氮、磷需要的关系论，磷的需要更为重要，故 藻类的生长受磷的限制更加明显。水体中的磷作为营养物质，含量较高时会导致富 营养化，产生了大量的水生植物覆盖在水面，使水体中溶解氧量急剧减少，而水体 中的藻类不需要较多的溶解氧，所以能继续生长繁殖，继续消耗水体中的溶解氧， 使水体的整个质量下降，表现为浊度增加，色度加重，发出臭味等等。水体中的其 他生物因为缺氧而死亡，从而使水体中的生态平衡遭到破坏。以上都使水处理的难 度增加，所以在治理水体富营养化的过程中，降低水体中的含磷量是比较重要的任 务之一。 1 1 2 高盐含磷废水的来源 随着工业生产的发展，带来了越来越严重的水质污染问题，进一步) j a n 了水资 源的短缺，为了解决这一问题，人们将眼光投向了废水处理及回收利用等方面。而 沿海城市的工业以及生活污水中大多数含有盐度，甚至有的属于高盐度废水，这些 废水的总量不少，在回收利用方面具有很大的潜力，所以也被人们所重视。高盐废 水的主要来源于以下几方面哺1 1 ： ( 一) 工业废水 一些工业行业在生产过程中会排放出大量的高含盐有机废水，如腌制、印染、 化工、造纸、农药制造等行业以及石油天然气的开采。这些行业污染严重，污水排 放量大，且废水中含有高浓度的油类、有机酸、盐、重金属以及放射性元素。 ( 二) 直接利用海水过程中产生的废水 在水资源短缺的大环境下，沿海城市大多都开始使用直接利用海水的技术生产。 主要有：用于工业生产用水，可用于化工、印染、建材、海产品加工等行业； 用于工业冷却水，可广泛应用于纺织、钢铁、机械化工、电力等行业；城市生活 用水，主要用于冲洗道路、厕所、消防以及游泳娱乐等方面，其中以海水冲厕应用 最为广泛。 青岛大学硕：t = 学位论文 ( - - ) 其他含盐废水 沿海地区海水渗入城市下水道进入城市污水管网也会增加城市污水的盐度；大 型船舰上产生的污水；工厂在生产过程中产生的污水，为了减少排放量而使污水浓 缩，这样也导致废水中盐度及有机物的浓度增加。 在这些废水中，一般含盐量可达到1 左右，而且很多高盐废水同时含有大量的 磷污染物，使用常规的生物处理方法通常达不到较好的处理效果，所以是废水处理 领域中的技术难题。 1 1 3 高盐度对生物处理系统除磷效果的影响 国内外关于高盐条件下生物除磷的研究不多，从已有的报道来看，高盐环境下 的除磷效果并不理想。因为高盐度会对聚磷菌产生抑制，当废水的含盐量过高时， 会破坏微生物的细胞膜和菌体内的酶，抑制微生物的生长，从而使微生物不能充分的 发挥其处理作用。有研究表明，在高盐度废水的生物处理过程中，通常会出现有机物 降解速率低、出水s s 浓度高等一系列问题聃1 。i n t r a s u n g k h an 等内1 采用s b r 反应器将 进水盐度由低逐步升高，研究盐度对氮磷去除的影响。当盐度大于5 9 l 时，磷的去 除率大幅度降低，丧失除磷能力。u y g u r 等人在研究中发现，聚磷菌对高盐度环境比 硝化菌和一般异养菌更加敏感，在高盐度环境中磷的去除率明显下降。废水中含盐浓 度从0 9 l 增加到6 0 9 几时，磷酸盐的去除率从8 4 降到2 2 n 叫。 还有一些研究表明，在盐度由低到高的缓慢变化过程中，微生物能通过自身渗透 压调节机制来平衡细胞内的渗透压调节自身新陈代谢，来保护细胞内的原生质，因此 可以通过驯化耐盐微生物的方法增强含盐废水的生物处理效果_ 副。李玲玲研究发 现，在含盐环境中聚磷菌经过长期驯化，也能够适应高盐环境：当废水中含盐量低 于3 2 5g l 时，经过3 - 7h 的好氧吸磷阶段，可使出水磷酸盐浓度低于0 5 9 l ；但当 含盐量高于3 5 9 l 后，好氧吸磷速率则明显降低u 引。 为了保证城市生物处理系统的运行稳定，国家和其他职能部门都对所排放的污 水中的含盐量颁布了相关标准，即国家标准和行业标准。例如在强制性国家标准 ( g b j l 4 1 9 8 7 ) 中要求进入城市生物处理系统中的污水中盐浓度( 此处以n a c l 浓 度计算) 应当小于或者等于4 0 0 0 m g l 。 1 1 4 生物法处理高盐废水生物的可行性分析 污水处理构筑物中起主要作用的活性污泥中的常规微生物通常适应于无盐环 境，所以当外界环境中盐度忽然升高时，微生物的生长繁殖就会受到影响，通常会 抑制其生长。同时，微生物通过一段时间的适应，一般能够调节自身的渗透压，使 自身的渗透压与外界的高盐环境相平衡，或者合成相应的小分子物质，形成适应该 2 第一章综述 环境的保护层来保护自身，使其在不良环境中生长繁殖，这样的合成通常会使遗传 基因也随之改变，从而使后代均能在该环境下生存n 钔。根据这一特性，可以通过对 污泥的培养驯化，从而得出能够耐受较高盐度的菌种，使其应用于生物处理系统。 近年来，国内外很多研究人员针对高盐废水的生物处理进行了研究。处理盐度 较低的污水，可以通过直接驯化污泥使其耐受盐度冲击的方法；处理盐度较高的污 水时，由于驯化污泥中的微生物族群对盐度的耐受范围有限( 一般为3 0 5 0 l ) 1 5 - 1 7 ， 并且驯化时间长，所以对于更高盐度的污水( 含盐度在5 0 l 以上) ，选择向处理系 统中接种嗜盐或耐盐微生物是快速有效的方法。 阿联酋u a e 大学的h a m o d a 等人u 剐在1 9 9 5 年选择了完全混合式活性污泥反应 器，分别对无盐污水、含盐量为1 0 3 0 l 的污水在不同泥龄( 3 2 0 d ) 和不同有机负荷 ( c o d 。如5 2 0k gvs s d ) 的条件下进行平行对照实验，结果发现没有经过驯化的活 性污泥当受到盐度冲击时，通常会受到比较明显的抑制，但是经过一段时间的驯化， 系统的活性污泥浓度会增加，并且活性污泥中微生物种群的组成发生了显著改变， 对t o c 的去除率也可以达到9 6 以上。 国内学者在此方面也进行了相应的研究。安林等人n 町研究了盐度对二段生物接 触氧化法处理污水的影响；杨健口用s b r 法处理含油含盐发酵工业废水；梁展辉等 人乜1 1 对高盐度有机废水进行吹脱和冷却一系列预处理后，再利用s b b r ( 序批式生物 膜反应器) 系统处理，都取得了较好的效果。 除此之外，自然界高盐环境如盐场、盐湖、海洋和死海中，也广泛生存着能耐 受极高盐度的嗜盐菌。一些研究表明若将嗜盐菌接种到污水处理系统中，其去除高 盐废水中的有机物的效果较好。e s t r e l l a a s p e 等凹1 用海洋底泥接种可以有效处理海水 渔场所产生的废水。 在自然界广泛存在的嗜盐微生物和耐盐微生物为高盐污水的生物处理提供了基 础和可能性。 1 1 5 嗜盐微生物的国内外研究现状 1 1 5 1 嗜盐微生物的分类 根据微生物生长对盐的需要程度可以分为三类：第一类是指能耐受一定的盐浓 度，但是在无盐环境中生长最佳的那一类微生物，称之为耐盐菌( h a l o t o l c r a n t m i c r o o r g a n i s m s ) 第二类指的是在盐度从零至饱和的环境中都能生长，但最佳生长 环境需要一定盐度的那一类特殊微生物，称之为广域嗜盐菌( h a l o v e r s a t i l em i c r o b e s ) ； 第三类指的是生长需要一定盐度，并且在一定盐度的环境中生长最佳的那一类微生 物，称为嗜盐菌( h a l o p h i l e s ) 1 。 根据嗜盐浓度的不同，嗜盐菌又可以分为轻度嗜盐菌( s l i g h th a l o p h i l e s ) ：生长 3 青岛大学硕士学位论文 最适宜n a c l 浓度为1 1 7 2 9 3 ；中度嗜盐菌( m o d e r a t e l yh a l o p h i l e s ) ：生长最适宜 n a c l 浓度为2 9 3 1 4 6 3 ；极端嗜盐菌( e x t e r m eh a l o p h i l e s ) ：生长最适宜n a c l 浓度 为1 4 6 3 3 0 4 。 嗜盐菌又称副溶血性弧菌，多数为好气化能异养，因为具有特别的膜，使其在 高盐环境下保持稳定状态。在低氧压或者厌氧环境下培养时，菌体内部物质利用光 照产生电化势，进行a t p 合成，从而满足菌体的生长代谢活动。因细胞通常含有色 素蛋白，菌体呈紫色、红色或浅褐色，大多数不运动，不产生孢子，无休眠状态， 繁殖方式为二分分裂法。嗜盐菌的种类繁多，主要根据化学分类数据、表型特征和 分子生物学数据对其进行分类。依据表型特征的不同，有嗜盐杆菌和嗜盐球菌。依 据1 6 sr r n a r d n a 的序列分析并结合其它生物学形状指标可以分为嗜盐碱球菌属 ( n a t r o n o c o c c u s ) ，嗜盐碱杆菌属( n a t r o n o b a c t e r i u m ) ，盐盒菌属( h a l o c o c c u s ) ，富 盐菌属( h a l o f e r a x ) ，盐深红菌属( h a l o r u b r u m ) ，盐杆菌属( h a l o b a c t e r i u m ) 等菌 属幽一。表1 1 列出了部分嗜盐菌和耐盐菌及其特性。 表1 1部分嗜盐菌和耐盐菌的特性m 3 菌名嗜盐浓度特性 明亮发光杆菌 3 适合生长，0 5 - 5 可以生k革兰氏阴性，兼性厌氧 肜p a r a h a e m o y t i c u s 需盐脱硫弧菌生长需要n a c l ，在含苹果酸硫革兰氏阴厌氧菌 口s a l e x i g e n s酸盐培养基上生长 盐脱氮付球菌 嗜盐 专营有机化能 p h a l o d e n it r if i c a d s 硝化球菌m o b i l i w a t s o n e t海水+ 亚硝酸盐环境革兰氏阴性无机化能型， 肠t e r r b u r y 专性好氧 欧洲亚硝酸单胞菌e u r o p a e a海水或者淡水富加n h 。和无机盐革兰氏阴性无机化能型， w i n o g r a d - s k y l 8 9 2的培养基专性好氧 海洋亚硝化球菌革兰氏阴性无机化能型， 彤o c c s d u s 专性好氧 1 1 5 2 微生物的耐盐机理 嗜盐菌能够在高盐环境中生长繁殖，是因为嗜盐菌具有特殊的生理结构以及细 胞中所含有的特殊物质使之能耐盐生长。 因为水都是从高溶质浓度的地方流向低溶质浓度的地方，在高盐环境下或者盐 胁迫下，普通微生物会因为脱水而细胞死亡，而嗜盐微生物体内会主动产生或积累 从外部获得的大量小分子物质作为内溶质来抗衡外界高渗环境，这种抵抗渗透的小 分子物质能在体内高度累积，但对生物体的正常生理功能影响很小，甚至可以忽略 4 第一章综述 不计，所以又叫做相容性物质。革兰氏阴性菌通常通过在细胞内积累大量的k + 来调 节细胞的渗透压；革兰氏阳性菌通常在细胞内积累小分子氨基酸物质来完成渗透保 护作用。嗜盐甲烷细菌、嗜盐真细菌和嗜盐真核生物的适应机制是在细胞质内积累 大量的小分子极性物质，如甘油、单糖、氨基酸及其衍生物，这些亲水性物质使细 胞质呈现溶液状，并获得较高的渗透压，从高盐环境中获取水分，并且这些物质在 细胞内能够迅速合成和降解渗透调节物质，增强了嗜盐菌适应外界高盐条件的能力 2 7 3 0 o 嗜盐菌虽然可以在高钠的环境中生长，但细胞内的n a + 浓度并不高。其细胞外 的n a + 浓度是细胞内的4 倍，而细胞内所含的k + 浓度是细胞外的1 0 0 倍左右，因此， 嗜盐菌具有吸收和浓缩k + 同时向细胞排放n r 的能力，这种生理功能是由嗜盐菌的 紫膜( p u r p l em e m b r a n e ) 提供的。嗜盐菌细胞膜上具有一些特殊的、成二维六边形 的紫色稳定特征结构，即为紫膜。紫膜主要以细菌视紫质( b r ) 为代表的视黄醛蛋 白组成，作为功能稳定的光能转换器。细菌视紫质在黑暗状态下从细胞质中吸收质 子，在光照下将其排出，使细胞膜内外形成质子梯度，为细胞吸收浓缩c 和排放 n 矿、储存营养物质提供能量，从而满足嗜盐菌的正常生理需要口。 1 2 废水除磷技术 这些年来，磷元素所导致的环境污染问题日益突出，其危害性也日渐被人们认 识和重视。目前处理含磷废水，主要方法是物化除磷法以及生物除磷法。物化除磷 方法主要利用吸附、结晶、沉淀等物理化学反应，使废水中的磷转化为不溶性磷酸 盐沉淀从而达到去除的目的。虽然操作简便，容易控制，但都存在着各种问题，从 而导致单独使用物化法除磷应用上出现困难口引。在处理中低浓度废水时，生物除磷 技术相较其他除磷技术( 物理法、化学法等) 拥有运行简便、工艺简单、处理效果 好，运行方式灵活等优点，因此受到更多人们的青睐。 1 2 1 生物除磷工艺 这些年来，生物除磷技术已经发展改进成为一项非常成熟的技术，并已经逐渐 应用于污水除磷处理工艺中，目前常用于工程实践的工艺有：a 0 、a 2 0 、s b r 、 u c t 、改良型u c t 、p h o r e d o x 、b a r d e n p h o 、p h o s t r i p 以及氧化沟。 几乎所有的生物除磷系统都具有以下几个特点：需要保证厌氧区真正处于厌氧 的状态，既不存在游离态溶解氧，也不存在硝酸根等结合态的氧，需要保证厌氧区 进水中易被生物降解的有机物含量，从而使聚磷菌能够在与其它细菌争夺营养物质 中占优势地位，比如可在进水中加入初沉池污泥酸性发酵液等；通过改变污泥回流 方式及路径来避免硝酸根进入厌氧区，从而防止厌氧区发生的反硝化作用，对聚磷 5 青岛大学硕士学位论文 菌厌氧释放磷作用的竞争抑制口副。 1 2 2 生物除磷机理 在整个自然生态系统中，生物除磷过程是利用某些生物( 水生植物、微型藻类和 微生物) 的过量吸收磷的能力，通过改变这些生物的外部生存环境，使它们在自然生 态系统中处于优势地位，从而达到去除水中磷的目的。 ( 一) p a o 的除磷机理 目前国际普遍认可接受的生物除磷理论是聚磷微生物的摄放磷原理：在厌氧区 间内，聚磷菌细胞中的聚磷被水解为正磷酸盐( p 0 4 卜一p ) 释放到细胞外部，聚磷菌从 中获取能量。污水中容易被生物降解的c o d 被产酸菌和某些聚磷菌利用，酸化分解成 乙酸等低分子脂肪酸( v f a ) 或者短链脂肪酸( s c f a ) ，v f a 和s c f a 不仅适合被聚磷菌利 用，而且能够诱导激发细胞将体内积累的高能聚合磷分解，并释放出磷酸根和键能。 聚磷菌通过三磷酸腺苷( a t p ) 转换成二磷酸腺苷( a d p ) 的过程中，将所有吸收的乙酸 及部分来自糖原的碳源以聚1 3 一羟基丁酸盐( p h b ) 的形式贮存在细胞体内。合成p h b 需要的还原力主要来自于葡萄糖的代谢。葡萄糖经过e d 或者e m p 途径氧化成丙酮酸， 为p h b 合成提供部分还原力，为乙酸转化为乙酰辅酶a 的反应提供一些a t p 。丙酮酸通 过氧化脱羧基反应转化为乙酰辅酶a 和二氧化碳，反应中所释放的电子也用于p h b 合 成。有研究表明，厌氧阶段释磷越多，则好氧阶段摄磷越多，即除磷效果越好0 3 l 。 在好氧区间内，聚磷菌以氧作为最终电子受体，好氧分解贮存于体内的p h b 和外源基 质，并释放出大量能量供给聚磷菌生长繁殖，除去生长繁殖所需能量，其中一部分 能量可供聚磷菌主动吸收大量的溶解态正磷酸盐，在细胞内部合成并积累多聚磷酸 盐，聚磷菌对磷积累可达到细胞干重的6 0 o 左右，个别可达到8 胁3 。其对磷积累的 作用大大超过了聚磷菌生长所需的磷。p a o s 经历厌氧好氧环境这样的循环方式后， 底物中的磷在好氧条件下以聚磷的形式储存在细胞内部，最终通过排放富含聚磷菌 的剩余污泥从而达到除磷的目的。 厌氧条件下，当以乙酸为碳源，聚磷菌释放磷用简化的方式描述如下： c ：h 。0 。+ 0 2 ( h p 0 3 ) ( 聚磷) + h 。0 一( c 。h , o 。) 。( 贮存有机物) + p 0 。3 矿 好氧条件下，聚磷菌吸收磷用简化的方式描述如下： c 。h 。0 ：+ 0 1 6 n h + 1 2 0 2 + o 2 p 0 4 3 - o 1 6 c 。h ，n o ：+ 1 2 c 0 ：( h p 0 3 ) ( 聚俘镕) + o 4 4 0 1 - 1 - + 1 4 4 h 2 0 ( 二) d p b 的除磷机理 自从k u b a 在1 9 9 3 年从污水处理系统中发现一类具有反硝化能力的聚磷菌之后， 国内外许多研究学者开始对这类细菌的除磷机理进行了一系列的研究口5 。这些研究 表明，除了p a o s 可以在好氧环境中摄磷之外，一种兼性厌氧反硝化细菌 6 第一章综述 ( d e n i t r i f y i n gp h o s p h o t o sr e m o v i n gb a c t e r i a ，d p b ) 也能够在厌缺氧交替运行的 环境中摄磷。d p b 与p a o s 有着相似的除磷机理，在好氧状态下都可以利用氧作为其电 子受体，区别只有在无溶解氧和只存在n o x 的缺氧状态下，d p b 能够利用n o x 一作为其 电子受体，氧化细胞内的p h a ，同时将n o x - n 转变成为n 0 。或氮化物从废水中排出，并 将废水中的磷以聚磷的形式吸收入细胞内而达到去除的效果m 1 。在缺氧的条件下， 表达式如下： c 。h 4 0 2 + 0 1 6 n h 。+ + o 9 6 n 0 3 - + o 2 p 0 4 3 。，o 1 6 c 。h ，n o 。+ 1 2 c 0 ：+ o 2 ( h p 0 3 ) ( 聚磷) + 1 4 0 r + 0 9 6 h 2 0 + 0 4 8 n 2 由于d p b 可在缺氧环境下除磷和反硝化，这就使除磷和反硝化两个不同的过程借 助于同一细菌在同一环境下完成，即把除磷和反硝化( 脱氮) 两个彼此独立的生物过 程合二为一，将引起水体富营养化的两大营养元素氮、磷都同时去除。但是d p b 在缺 氧状态时以硝基氮为电子受体，此时对有机物( p h a ) 利用率较低。从而导致吸磷速率 和数量都不如以氧作为电子受体的系统。目前对反硝化聚磷菌的研究还处于实验室 研究阶段，要将其利用于具体实践中还要更深层次的研究。 1 2 3 多聚磷酸盐( p o l y p ) 的研究 生物除磷的主要原理是利用聚磷菌在污水中对磷的过量吸收的过程，而对聚磷 菌本身而言，是其体内多聚磷酸盐的分解和合成的过程。长期以来，由于缺乏准确 的、灵敏的以及易操作的分析方法测定p o l y p 在生物体内的浓度，对p o l y p 方面的研 究一直被忽视。直到2 0 世纪8 0 年代，随着高效液相色谱法、核磁共振波谱法以及酶 分析法等一系列测定细胞p 勺p o l y p 方法的相继建立阻7 1 ，多聚磷酸盐的研究渐渐得到研 究者的重视，2 0 0 3 年s h o t a r o 等人在迂回螺菌中发现了多聚磷酸盐，并证明多聚磷酸 盐是由几十或者几百个正磷酸盐组成的线型聚合物啪1 。任世英等人在2 0 0 5 年研究了 不同的外界条件对菌体内多聚磷酸盐形成的影响，以及菌体生长与菌体内部多聚磷 酸盐的形成之间的关系等方面啪1 。 p o l y p 是由p o l y p 激酶( p o l y pr i n s e ，p p k ) 合成的。p p k 能够催化a t p 的末端磷酸 盐使之转移到长链聚磷酸盐上，该过程是可逆的，形成磷酸盐的线性聚合体，其长 度可达1 0 0 0 个磷酸盐甚至更长。当有过量a d p 存在时，p p k 可以反向作用形成a t p ，也 可以利用g t p 代替a t p 而形成p o l y p ，但是g t p 的效率较低，仅为a t p 效率的5 。在1 9 9 7 年，l o o s d r e c h t 研究从多种微生物内部获得了编码p p k 的基因，并把其克隆出来汹1 。 p o l y p 的聚合与解聚过程，是由p p k 和多聚磷酸盐水解酶( e x o p o l y h o s p h a t a s e s ，p p x ) 酶活性的强弱决定的，以上两种酶的活性强弱是由细胞生长所获的碳源和磷酸盐浓 度变化所调控的。有研究表明，在碳源丰富的环境条件下生长时，p o l y p 会积累，而 7 青岛大学硕士学位论文 在碳源缺乏的环境条件下生长时，p o l y p 回降解；p p k 的酶活性只有在加入过量磷酸 盐时才有所提高，而p p x 的酶活性则在磷饥饿的环境条件下迅速提高h 。 随着对聚磷菌生理生化特性的研究不断深入，有研究发现聚磷菌体内的多聚物 促使其对基质处于竞争优势。在对聚磷菌内的内聚物进行种类鉴定时一般选择采用 染色法，对聚1 3 羟基丁酸通常采用苏丹黑染色法鉴定m 2 。对于多聚磷酸盐的染色 鉴定方法通常采用a l b e r t 染色法、吕氏美蓝染色法以及d a p i ( 4 6 d i a m i d i n o 2 - p h e i l y l i n d o l e ) 染色法【4 3 j ；r e e s 等人研究采用了尼罗兰和亚甲基蓝两 种方法相结合的染色方法，对同一菌体中的两种颗粒( 多磷酸盐颗粒和聚一b 一羟基丁 酸) 进行染色【3 引，也有研究者把苏丹黑染色、d a p i 染色和荧光原位杂交三种方法相 结合用于观察同一菌体中的两种颗粒。 1 3 生物除磷系统中的主要微生物 1 3 1 不动杆菌属 不动杆菌属于最早被发现和分离出来的聚磷菌。f u h s 和c h e n 首先从能够高效除 磷的活性污泥中选用传统培养分离方法分离出了不动杆菌，并通过其研究认为，生 物除磷过程本质是通过不动杆菌属的磷代谢过程而完成的h 钔。d e i n e m a 等人对不动杆 菌进行纯种培养，碳源选择为丁酸或者戊酸。研究发现在其生长的早期阶段，菌体 能够过量摄取外界环境中的磷，在细胞内部合成多磷酸盐，其含量可占细菌干重的 1 0 一2 0 。除此之外，不动杆菌还具有在体内积累聚一b 一羟基丁酸盐和脂肪酸的能 力。b u c h a n t 在1 9 8 3 年研究考察了几种除磷效果良好的试验装置，以及南非几所污水 生物处理厂，分析其曝气池中活性污泥的组成，从而发现了不动杆菌广泛存在于活 性污泥中并易于分离，随后将分离出的不动杆菌进行纯种培养试验，结果表明不动 杆菌体内部过量合成累积的多磷酸盐的含量占细菌干重的2 5 ，而且其c a p 之比为 0 1 - 0 3 6 之间，在当时被认为不动杆菌有可能是除磷的优势菌种。但1 9 8 5 年d e i n e m a 等人却提出了与之相对立的结论，代谢旺盛期的不动杆菌在厌氧环境下能够降解其 细胞内积累的多磷酸盐并释放出磷酸。而处于稳定生长期的老龄菌却不能显示这一 特性。 出现对立结论的原因可能是因为在生物除磷过程中，不同细菌之间存在着复杂 的相互关系，而纯种培养试验却不能反映出这些复杂关系，从而使实验结果具有一 定的局限性。为解决这个问题，c l o c t e 和s t y e n 在1 9 8 8 年研究了南非c a p et o w n j t 区 废水生物除磷处理厂的活性污泥，利用半透膜一免疫荧光组合的新方法研究了污泥中 的不动杆菌的数量以及除磷能力，研究结果表明，在曝气池内活性污泥中的所有细 菌中，不动杆菌在活性污泥的细菌组成中所占比例为7 9 9 4 8 9 9 4 ，但其实际的除 8 第一章综述 磷能力并没有相应的提高，只有3 0 3 4 8 6 。因此这两者之间没有直接联系。这进 一步说明了，在废水生物除磷处理系统中的的活性污泥组成里，除不动杆菌外，一 定还存在着具有除磷能力的其他细菌h 射。 1 3 2 气单胞菌属 气单胞菌也是重要的聚磷菌之一。b r o d is c h 和j o y n e r m 3 研究发现，气单胞菌在 活性污泥的细菌组成中占1 2 一3 6 ，并且有时在厌氧和缺氧区间所占比例比好氧区 间的比例更高。m e g n a e k 等人h 力的研究表明，气单胞菌属的细菌在废水生物除磷过程 中，能够过量摄取废水中的磷，在菌体内部形成多磷酸盐内含物，但其除磷作用不 如去除c o d 明显，即在厌氧环境下，气单胞菌可以利用某些糖和醇作为基质，生成短 链挥发性脂肪酸，从而降解污水中的有机物，而且可以进行反硝化作用。其中，嗜 水性气单胞菌( a e r o m o n a sh y d r o p h il a ) 可以将硝酸盐还原成为亚硝酸盐，而一些其 他菌种则可以使硝酸盐直接还原成氮气，达到脱氮效果。 1 3 3 假单胞菌属 假单胞茵也是具有除磷能力的细菌之一。1 9 8 5 年s u r e s h 等人“剐从运转正常的厌 氧好氧( a o ) 废水生物除磷处理系统中的曝气池的活性污泥中分离出假单胞菌属细 菌，通过纯种培养实验，研究其磷代谢性能，发现它们能够生成累积多聚磷酸盐， 其含量可达到细菌干重的3 1 ，而且假单胞菌在好氧环境下，从对数生长期到稳定 生长期的过程中，其体内的多聚磷酸盐含量也随着培养时间的延长而相应的增加， 并且在稳定生长期的前段时，多聚磷酸盐激酶( p p k ) 的增长速率是对数生长期的1 0 倍。随着时间推移，当菌体生长到稳定生长期的中后段，速率降低为对数生长期的3 倍。细胞内的多磷酸盐含量的变化趋势与p p k 的速率的变化趋势恰恰相反，可知多磷 酸盐对多磷酸盐激酶( p p k ) 有抑制作用。1 9 9 2 年周岳溪等h 钮从取自于除磷效果较好 的循序间歇式污水生物除磷处理装置中的活性污泥中分离出优势假单胞菌，研究了 优势茵假单胞菌的磷代谢生理特性，结果发现了假单胞菌同样具有厌氧释磷、好氧 吸磷的聚磷菌共性，原因在于其细胞外膜会诱导产生一种磷酸专一性孔道蛋白，这 种蛋白使其能够过量摄磷。同时研究了酸碱对其释磷吸磷的影响：在好氧环境下， 当以乙酸盐为碳源培养时，如向培养基中滴加酸，细胞内多磷酸盐会降解而释放出 磷。相反，若向培养基内滴加碱，则会产生过量摄磷的现象，而且d h n a o h 所引起的 磷摄取量相比n a h c o 。的更大。n a g a d o m i 等人h 们研究了光合细菌中的沼泽红假单胞菌 ( r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r is ) 和球形红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n a s s p h a e r o i d e s ) ，该两种菌能够同时去除废水中的c o d 、p 0 4 和h ：s ，在序批式实验处理 4 8 h 后，可以去除大约7 7 的磷。周茂洪等人嘲1 的研究也进一步表明：微好氧光照条 9 青岛人学硕士学位论文 件下沼泽红假单胞菌( r h o d o p s e u d o m o n a sp a l u s t r i s ) 对磷的摄取能力比微好氧黑暗 条件下强，在微好氧光照、并选择n a a c 或苹果酸为碳源、p h 为6 9 的条件下，可以摄 取吸收o 0 2m g m l 左右的磷。 1 3 4 产碱杆菌属 刘亚男等人啼1 1 首次分离出产检杆菌属的聚磷茵，是从以生活污水为碳源的除磷 污泥中分离出的，该菌株的除磷能力较强，经过鉴定为产碱杆菌。此菌株用于生物 强化处理时除磷率较高，经过l o d 培养之后，除磷率可达到9 0 以上，并且除磷速率 较快，对磷的平均吸收速率为1 3 8m g ( g h ) ，特别是处于“磷酸盐饥饿期”的菌 株对磷的吸收速率为1 9 2m g ( g h ) 。 1 3 5 肠杆菌属 肠杆菌属于反硝化聚磷菌( d p b ) 。有研究表明，肠杆菌属在聚磷过程中对硝酸 盐的利用并不完全。周康群等人障羽的研究表明，在缺氧条件下肠杆菌属的细菌也具 有较强脱氮除磷的能力，最高除磷率可以达到9 0 ，但是在放磷过程中硝酸盐会有 不同程度的回升，以上就说明外界硝酸盐的存在会抑制磷酸盐释放，具体机理方面 还需要作进一步的研究。 1 4 聚磷菌的分离与筛选技术 虽然目前可以运用分子生物学技术了解聚磷菌的生物多样性，并且可以监测聚 磷菌种群的变化，但是分离纯化出来的聚磷菌依然较少，这就使得深入研究除磷过 程中微生物学和生物化学等的机制受到限制。筛选聚磷菌，以及在厌氧好氧条件下 培养聚磷菌这两个方面是目前研究聚磷菌的重点之一。m u y i m a 认为，聚磷菌难以分 离培养的主要是因为缺乏合适的培养基啼引。s i d a t 等人在1 9 9 9 年利用传统培养技术从 活性污泥中分离出了8 0 种细菌，其中有1 7 种是具有聚磷能力的细菌嘲1 。m a s z e n a n 等 从活性污泥中分离出了两个p a o s 新种( t e t r a s p h a e r aa u s t r a l ie n sis 和 t e t r a s p h a e r aj a p o n i c a ) 瞄1 ，这两个新种属于同一种新属( t e t r a s p h a e r a ) 。h a n a d a 等人在2 0 0 2 年也从活性污泥中分离得到一种聚磷能力较好的细菌嘲1 。刘亚南等人在 2 0 0 5 年经过7 次富集、1 2 次分离及纯化过程，从运行稳定的以生活污水为碳源的活性 污泥中筛选出一株聚磷能力较强的p a o - 1 菌株，并将所获得的菌株接种到简易生物除 磷装置中测定其在实际生活污水处理除磷能力州。任世英在2 0 0 7 年从海水中富集培 养、分离纯化出单个的菌株，并以内聚物的含量鉴定为标准，最终筛选分离出了一 株属于盐单胞菌属( h a l o m o n a s ) 的变种菌株啪1 。 传统的聚磷菌分离筛选技术存在在以下缺点：没有定性的选择培养基，工作量 l o 第一章综述 较大，操作繁琐，重复率高，效率较差。主要操作方法是从活性污泥中分离纯化出 单个菌株，然后对其进行厌氧好氧的连续培养，测定各菌株的除磷效率。因此选择 适合的筛选培养基是筛选聚磷菌的关键因素。随着对聚磷菌聚磷机理的不断研究发 展，m o r o h o s h l 在2 0 0 2 年提出了蓝自斑筛选技术，该技术主要是根据聚磷菌产生碱 性磷酸激酶可以催化可溶性磷酸盐从而合成聚磷酸盐嘞1 。有研究表明在碳源丰富和 磷酸盐过量的环境条件下，碱性磷酸激酶的活性会提高。所以可以根据不同菌种在 过磷和限磷的葡萄糖m o p s 培养基中生长时碱性磷酸激酶对 x p i ( 5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 一i n d o l y p h o s p h a t e ) 分解情况不同而产生的不同色斑来 判断，有聚磷能力的细菌在过磷和限磷的培养基中都会产生蓝斑。当然聚磷菌的聚 磷能力不仅只与以上因素有关，还与其在厌氧条件下积聚p h b 的能力有关，因此在过 磷和限磷培养时均呈蓝斑的，还必须通过其他测试来判断其是否具有聚磷能力。蔡 天明等人在2 0 0 5 年利用蓝白斑的筛选，并结合聚磷酸盐染色的鉴定和好氧培养测菌 体聚磷能力这三种方法筛选出了高效聚磷菌，分别属于费氏柠檬酸杆菌和恶臭假单 胞菌，新的聚磷菌筛选技术提高了筛选方法的准确性和科学性。生物除磷技术的发 展还需要聚磷菌的筛选技术的技术支持，因此高效聚磷菌的筛选技术还需要进一步 的发展的驯。 1 5 本论文研究的目的与意义 本论文选题来源于国家自然科学基金项目( 课题编号为5 0 6 7 8 0 8 5 ，5 0 8 7 8 1 0 7 ) ， 同时本项目也是青岛大学优秀研究生学位论文培育项目( y s p y 2 0 0 9 0 14 ) 。 氮磷元素的污染是引起水体富营养化的主要原因，近年来水体富营养化日趋严 重，使许多国家和地区对氮磷的排放提出了较为严格的限制，所以污水处理厂也必 须考虑氮磷的去除以达到排放标准。脱氮除磷技术一直是污水处理领域研究的热点 和难点。 生物除磷工艺因具有处理成本低、处理效果好、操作管理方便等优点而得到广 泛的应用。目前生物除磷技术的研究内容主要集中在聚磷机理和工艺两大方面。目 前的研究热点主要是：一是采用不依靠培养的方法，利用荧光原位杂交技术( f i s h ) 和变性梯度凝胶电泳( d g g e ) 等分子学手段来研究强化生物除磷工艺e b p r ( e n h a n c e d b i o l o g i c a lp h o s p h o r u sr e m o v a l ) 系统中的微生物种群之间的结构变化；二是使用 基因工程方法研究聚磷菌内与聚磷有关的基因。但到目前为止有关生物除磷机理 的研究仍然进展不快，主要是因为：一是对生物除磷的机理还不是特别不清楚；二 是e b p r 系统的中哪些微生物种群在除磷工程中起主要作用还不是非常了解；三是筛 选分离出的聚磷菌较少，而且这些聚磷菌投加到工艺装置中还不能充分的表现出厌 氧释磷、好氧吸