（核能科学与工程专业论文）低剂量辐射细胞旁效应早期过程及机理研究.pdf

低剂量辐射引发细胞旁效应的早期过程机理研究摘要 摘要 本论文主要讨论了低剂量a 粒子辐射引发细胞旁效应的早期过程及可能的 机理，以及高氯化钠培养环境对低剂量辐射旁效应的影响。 传统的辐射细胞旁效应分析方法由于其技术本身的特点，需要几个小时甚至 十几天后才能获得结果，因此反映了旁效应的较晚期事件，对辐射后短时间内发 生的事件却鲜有报导。y - h 2 a x 蛋白是d n a 双链断裂( d s b ) 的一个可靠标志物， 利用免疫组化方法标记该蛋白可以检测到辐射发生1 分钟时的d s b 。利用原位 d n a 双链断裂免疫标记的方法，研究结果显示低剂量的a 粒子辐射后，可以迅 速引发未辐射的细胞中产生d n a 双链断裂，辐射后3 0 分钟时损伤效应达到最 大。培养基转移实验发现受辐射细胞可以在辐射后几分钟( 最早可在2 5 分钟) 内迅速释放出导致d s b 的因子到培养基中，释放量在1 0 分钟时达到最大，说明 辐射引起的细胞旁效应可以在辐射后迅速启动，损伤信号能够通过培养基介导的 方式传递。 使用一氧化氮合成酶抑制剂l - n m m a ，以及d a f f md i a c e t a t e 处理受辐射 的培养基供体细胞，使得条件培养基的d s b 诱导能力消失，说明受辐射细胞中 产生的一氧化氮对受体细胞中损伤的产生是必需的。电子自旋共振分析以及一氧 化氮特异性荧光染料标记发现a 粒子诱导细胞中产生一氧化氮，大部分的一氧化 氮会在辐射后1 5 分钟内产生，释放到培养基中的一氧化氮与时间有相关性，其 释放方式与上述d s b 诱导因子释放的趋势具有相似性。此外，培养基转移后会 使受体细胞中产生r n s 胁迫，从而导致d n a 损伤的发生。因此低剂量辐射旁 效应早期过程的可能机理是：低剂量的a 粒子击中细胞后，刺激细胞内c 型 ( c o n s d m t i v e ) 一氧化氮合成酶活力上升，细胞迅速释放一氧化氮到培养基中充 当旁效应的细胞间信号分子，一氧化氮通过扩散或直接穿过相联结的细胞膜进入 附近的细胞，提升了未受辐射细胞中的r n s 胁迫，从而导致未受辐射细胞中产 生功蛆的断裂，即旁效应发生。 论文还进一步研究了环境因子( 氯化钠) 对辐射引起的细胞旁效应传递的影 响。使用d s b 原位旁效应分析和微核分析分别研究了短时程和较长时程的旁效 应。研究结果显示，在高氯化钠培养环境下，同样剂量( 0 2 c g y ) 的a 粒子会造 低剂量辐射引发细胞旁效应的早期过程机理研究 成更多的细胞中产生d s b 或微核，以及阳性细胞中平均d s b 断点数增加，这些 结果说明在高氯化钠环境下细胞对旁效应信号更为敏感。此外，高氯化钠环境会 影响d s b 的修复，使旁效应发生后大部分损伤细胞中的d s b 长时间存在。对高 氯化钠环境下旁效应的机理进行了初步的研究，发现其机理和正常浓度下旁效应 机理有相似性，一氧化氮在信号传递中都起到了重要的作用。上述这些结果对环 境低剂量辐射的防护以及放射性治疗可能会提供有用的线索。 关键词：低剂量辐射细胞旁效应一氧化氮氯化钠 i i 低剂量辐射引发细胞旁效应的早期过程机理研究摘要 a b s t r a c t t h em e c h a n i s mo fi n i t i a t i o np r o c e s so fl o wd o s ea - p a r t i c l ei n d u c e d b y s t a n d e r e f f e c ta n dt h ei n f l u e n c eo fh i g hs a l tt ob y s t a n d e re f f e c tw e r es t u d i e di nt h i st h e s i s t h et r a d i t i o n a lb i o l o g i c a le n d p o i n t so fb y s t a n d e re f f e c ts u c ha sc l o n a ls u r v i v a l ， m u t a t i o n ，s p e c i f i cg e n ee x p r e s s i o na n de ta 1 r e f l e c t e dt h el a t ee v e n t sw h i c hh a p p e n e d i n s e v e r a lh o u r so r d a y sp o s ti r r a d i a t i o n w i t h 加s i t uv i s u a l i z a t i o no fd n a d o u b l e - s t r a n db r e a k s ( d s b s ) ，i tw a sf o u n dt h a tt h eb y s t a n d e re f f e c tw o u l db ei n i t i a t e d i n2 - 5 r a i np o s ti r r a d i a t i o ni nt h ei r r a d i a t e dr e g i o na n dn o n - i r r a d i a t e dr e g i o nal i t t l e l a t e r t h er e s u l t so fm e d i u mt r a n s f e re x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h ei r r a d i a t e dc e l l s r e l e a s e dd s bi n d u c i n gf a c t o r ( s ) i n t ot h em e d i u ma s e a r l ya s 2 s m i np o s t a l p h a - p a r t i c l ei r r a d i a t i o n t h em a x i m u md s bi n d u c i n gf a c t o r ( s ) w a so b s e r v e da t 10 r a i np o s ti r r a d i a t i o na n dt h e ni td e c r e a s e d s ot h er a p i dd s bi n d u c t i o ni nt h e n o n - i r r a d i a t e dc e l l sw a si d e n t i f i e da st h ee a r l ye v e n to fb y s t a n d e re f f e c t t h ef u r t h e rs t u d yi sa b o u tt h en a t u r eo fd s bi n d u c i n gf a c t o r ( s ) w i t hn i t r i co x i d e s y n t h a s ei n h i b i t o r , l - n m m a ，o rd a f - f md i a c e t a t et r e a t m e n t , i tw a sf o u n dt h a tt h e p r o d u c t i o no fn i t r i co x i d ei nt h ei r r a d i a t e dc e l l sw a sn e c e s s a r yt ot h er e l e a s eo fd s b i n d u c i n gf a c t o r ( s ) w i t he l e c t r o n i cs p i nr e s o n a n c e ( e s r ) a n dt h es p e c i f i cf l u o r e s c e n t d y eo fn i t r i co x i d e ，i tw a so b s e r v e dt h a ta l m o s ta l ln i t r i co x i d ew a si n d u c e di n15 r a i n p o s ti r r a d i a t i o n t h er e l e a s eo f n i t r i co x i d ei n t ot h em e d i u mw a sa l s om o n i t o r e d 、析t l l e s r a n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e das i m i l a rm a n n e rt ot h a to fd s bi n d u c i n gf a c t o r ( s ) t h ee n h a n c e dr n ss t r e s sw a so b s e r v e di nt h er e c e p t o rc e l l st r e a t e d 、i t l lc o n d i t i o n e d m e d i u mc o l l e c t e df r o mi r r a d i a t e dc e l l sa t10 m i np o s ti r r a d i a t i o n h e r et h e h y p o t h e s i z e dm e c h a n i s mo fb y s t a n d e re f f e c t i n i t i a t i o nw a sp r e s e n t e dt h a tt h e a - p a r t i c l es t i m u l a t e dt h ec e i l sr e l e a s e dt h en i t r i co x i d e ，t h er e l e a s e dn i t r i co x i d ea c t i n g a st h ei n t e r c e l l u l a rs i 伊“t oa t t a c kt h ea d j a c e n tc e l l sa n dc a u s e dt h ed n ab r e a k sv a e n h a n c i n gr n s s t r e s s t h ei n f l u e n c eo fh ig ：hs a l tt ob y s t a n d e re f f e c tw a sa l s oi n v e s t i g a t e di nt h i st h e s i s w i t hi ns i t uv i s u a l i z a t i o no fd s b sa n dm i c r o n u c l e it e s t , t h es h o t - t e r ma n dr e l a t i v e i h 低剂盈辐射引发细胞旁效应的早期过程机理研究 摘要 l o n g - t e r mb y s t a n d e re f f e c tw e r ea s s e s s e dr e s p e c t i v e l y f o l l o w i n gh i g hs a l tt r e a t m e n t b e f o r el o wd o s ea - p a r t i c l ei r r a d i a t i o n ，m o r ed s bp o s i t i v ec e l l s ，m o r ed s bf o c ii n e a c hp o s i t i v ec e l lo rm o r em i c r o n u c l e iw e r eo b s e r v e dt h a nt h a ti nn o r m a l c o n c e n t r a t i o n t h eh i g hs a l ta l s ob l o c k e dt h ed s b r e p a i ra f t e ri r r a d i a t i o n t h er e s u l t s i m p l i e dt h a th i g hs a l ti n d u c e dm o r eg e n e t i cd a m a g e d c e l l sb yt h eb y s t a n d e rs i g n a la n d m o r ed a m a g ew a si n d u c e di np e rb y s t a n d e rc e l l s n i t r i co x i d ea l s oa c t e da sa n i m p o r t a n tm e d i a t o ri nt h et r a n s d u c t i o no fb y s t a n d e rs i g n a l o u rr e s u l t sm i g h tg i v e s o m eh i n t st oe n v i r o n m e n t a lr a d i o p r o t e c t i o na n dr a d i o t h e r a p y k e y w o r d s ：l o wd o s ei r r a d i a t i o n - i n d u c e db y s t a n d e re f f e c t , n i t r i co x i d e ，h i g hs a l t 低剂量辐射引发细胞旁效应早期过程及机理研究第一章 第一章综述 第一节辐射生物学的发展 1 1 辐射生物学的诞生与早期发展【l 捌 研究辐射对生物体的作用是从人类发现辐射开始的。1 8 9 5 年德国物理学家 w c r o e n t g e n 发现x 射线，标志着辐射研究的开始。x 射线能够显示人体骨骼图象， 因此被广泛用于医学诊断。1 9 0 6 年法国物理学家h e n r ib e c q u e r e l 发现天然放射性，居 里夫妇发现和分离出放射性物质p o ( 钋) 和i h ( 镭) ，从此开始了人类历史上的一个 新时代原子时代，极大地促进了辐射研究的进展。 然而，在早期的辐射研究中，由于对辐射的危害缺乏认识，导致了很多放射性工 作人员患上了放射性相关疾病。例如放射学家居里夫人被放射线损伤以致后来患上再 生障碍性贫血症。据资料不完全统计，到1 9 2 2 年，就有1 6 9 名放射工作者过早地死亡。 人类遭受最为严重的放射性危害是1 9 4 5 年的原子弹爆炸事件，以及1 9 8 6 年前苏联的 切尔诺贝利核电站泄漏事件。这些事件促使科学家对辐射的危害进行研究。自此，辐 射生物学作为一门学科迅速发展起来。 受生物学发展的限制，辐射生物学开始阶段发展缓慢。在辐射生物学发展的初期， 即上个世纪二十年代左右，人们首先提出粒子和高能电磁辐射的生物效应是生物组织 受了电离作用的反映。不久，通过细胞水平方面的研究形成了两种不同的见解：一种 认为辐射损伤是射线的直接电离作用引起的；另一种则认为辐射损伤是辐射产生的自 由基次级反应的结果。直接电离理论对当时已有的绝大多数实验结果能够给出较满意 的解释，对辐射生物学的研究起了重要的推动作用，因而被普遍接受【2 】。在随后的二 十年里，直接电离理论又有了进一步的发展。在这期间，提出了辐射的靶学说理论， 该理论能够对许多辐射生物效应给予定量的评价，对辐射遗传效应的理解提供了很大 的帮助，在当时受到很大的重视。 但是，随着研究工作的不断深入，出现了许多新的实验事实不能简单地用直接电 离理论予以解释。二十世纪4 0 年代，科学家的研究兴趣从辐射直接作用转到自由基的 间接作用。1 9 4 7 年t h o d a y 与r e a d 发现当氧张力在辐射组织中增高时，染色体断裂率 也增加，这与靶学说有出入。d a l e 发现酶溶剂经电离辐射所产生的自由基作用后可丧 中国科学院等离子体物理研究所博士论文 l 第一章 失其活性，但通过硫基化合物清除自由基，酶的活性不会丧失。自由基理论的提出加 速了辐射生物学的发展。 上世纪六十年代以后，随着生物学在分子水平的突破，一些现代生物技术如d n a 重组、基因探针、核苷酸和氨基酸序列分析等被广泛应用于辐射效应的研究，使辐射 生物学取得了飞速的发展。 1 2 辐射生物学的物理和化学基础砼卅 1 2 1 物理基础 辐射可以分为两大类，一类是电磁辐射，实际上是电磁波；另一类是粒子辐射， 它们是一些组成物质的基本粒子，或者是这些基本粒子构成的原子核。电磁辐射仅有 能量而无静止质量。根据频率和波长，电磁辐射又可以分为无线电波、微波、红外线、 可见光、x 射线、y 射线和紫外线；粒子辐射是一些高速运动粒子，它们既有能量又 有静止质量，如电子、质子、a 粒子、中子、负兀介子和带电重离子等。 按作用方式的不同，辐射又可分为电离辐射和非电离辐射。高速的带电粒子，如 a 粒子、p 粒子、质子等，能直接引起物质电离，属于直接电离粒子；致电离光子( x 射线和t 射线) 及中子等不带电粒子，通过与物质作用时产生的带电的次级粒子引起 物质电离，属于间接电离粒子。由直接或间接电离粒子，或两者混合组成的射线所致 辐射都称为电离辐射。电离辐射与物质有较强的相互作用。与电离辐射相反，还有一 类低能电磁辐射，如紫外线和能量低于紫外线的电磁辐射，它们与物质的相互作用较 弱，一般不能引起物质分子电离，而只能引起物质分子振动、转动或电子能级状态改 变，这就是非电离辐射。在辐射生物学中，研究较多的是电离辐射引起的生物效应。 电离辐射与物质相互作用依因子( 种类) 而异。x 射线、y 射线在0 o i - i o m e v 能量范围内主要作用过程是光电效应、康普顿效应和电子对的产生；中子与物质作用 主要是电离和激发。由于中子不带电，它与电子作用对中子能量损失较小，主要是与 原子核作用损失能量，包括弹性散射、非弹性散射和辐射俘获损失能量。带电粒子与 物质作用主要通过电离、激发过程损失能量，其次是韧致辐射。当带电粒子把部分能 量传给靶原子轨道电子，轨道电子获得足够能量克服原子核的束缚而成为自由电子， 此过程称电离；如果轨道电子获得的能量不足以摆脱原子核的束缚而从低能级跃迁到 高能级，称为激发。当快速运动的电子接近一个原子核时，受到库仑场的作用而加速， 2 低剂盘辐射引发细胞旁效应早期过程及机理研究第一章 电子脱离原来的运动轨道，这个过程会引起能量以电磁辐射的形式发射。这样产生的 电磁辐射类似于x 射线，称为韧致辐射。韧致辐射来自p 粒子及次级电子的小部分能 量转移。 带电粒子穿过物质时，不断地把能量传递给碰撞产生的次级电子而减速，最后停 止下来。由于每次碰撞损失的能量具有随机的性质，每个初始能量相同的粒子在物质 中的射程虽然相近，但有一定的变化。跟踪一个带电粒子，沿着它的径迹测量形成的 电离数( 或沉积的能量) ，可看到随着带电粒子速度的减小，带电粒子在单位路径上损 失的能量逐渐增加，在射程的末端，粒子的速度变得很低，其能量损失速率急剧增加， 从而形成一个高电离密度的峰，这个峰叫做b r a g g 峰。反映带电粒子的能量损失速率 沿径迹分布的这条曲线称b r a g g 曲线，它反映了特定辐射深部剂量分布的特征。在放 射治疗中，人们希望把受照射的恶性部位置于b r a g g 峰处，并希望峰值与射程末端以 前的“坪区的比值尽可能大，从而在肿瘤接受同样剂量条件下使其前方正常组织接 受的剂量尽量减少。 1 2 2 化学基础 电离辐射发生后，经射线能量传递，处于带电粒子径迹上的重要生物分子，被电 离和激发，可导致分子结构的改变和生物活性丧失。重要生物大分子的辐射化学改变 是一切辐射生物效应的物质基础。分子生物学研究已证明，生物大分子的结构决定它 们的功能，结构上的任何改变都将导致功能的变化，从而对细胞的增殖、变异和遗传 产生深远的影响。 以d n a 为例，辐射引起的重要结构改变是多聚核苷酸链的断裂和碱基的改变， 前者又分为单链断裂和双链断裂，后者包括嘧啶在5 - 6 位双链上的羟基过氧化、嘧啶 二聚体的形成和其它化学变化。d n a 分子的这些结构变化将产生严重的生物学后果。 在酶和蛋白质辐射效应的研究里，同样可以看到辐射所引起分子结构的变化( 不仅包 括一级结构，而且包括反映空间构型的二级和三级结构变化) 使得酶和蛋白质活性降 低或丧失联系。因此，重要生物分子的辐射化学变化是一切辐射生物效应的物质基础。 射线对生物分子的作用是随机的，但生物分子在吸收辐射能量后所形成的损伤往 往局限于分子的一定部位或者较弱的化学键上。这是由于在特定的分子结构中，能量 传递有一定的趋向和能量沉积不均匀所致。 中困科学院等离子体物理研究所博士论文 第一章 电离辐射时，生物效应主要起源于组成生物系统的各种分子的电离。电离是一种 非选择性的过程，任何处在电离粒子径迹上的原子和分子都有可能电离。水是生命物 质的主要成分，人的许多组织的7 0 - 8 0 是水，因此水是电离辐射在机体组织里引起电 离的主要物质。射线作用于水后，引起水分子的活化和自由基的生成，水离解后的自 由基进一步又会作用于生物大分子，引起更大范围的损伤。 电离辐射直接在重要生物分子( 或细胞的其它组分) 上沉积能量并引起这些分子 的物理和化学变化叫做“直接作用 ，而电离辐射在重要生物分子周围环境的其它成分 ( 主要是水) 上沉积能量而引起重要生物分子物理和化学的变化则叫做“间接作用 ， 前者指效应和辐射能量沉积发生在同一个分子上，后者指效应和能量沉积发生在不同 的分子上。在放射生物学作用发生的早期阶段，直接作用占有重要的位置。但由于机 体和细胞中含有大量的水分，它吸收了大部分的辐射能量，因此水自由基的间接作用 也是引起损伤的重要方面。任何情况下，直接作用和间接作用都是同时存在的，它们 的相对比例取决于生命物质中的含水量，取决于在细胞这一复杂结构中生物分子相互 之间以及它们与其它分子“组装 的形式，也和辐射的l e t ( 1 i n e a r e n e r g yt r a n s f e r ) 有 关。 1 3 辐射的生物效应阳1 电离辐射与生物体相互作用而引起的生理、生化或生物学变化统称为辐射生物效 应。这里所说的“变化一是指状态的任何改变，如辐射造成生物体损伤、畸变或死亡 等。实际上，辐射生物效应是复杂多样的、双重的，辐射是一把双刃剑；它能致癌又 能治癌；能引起基因突变，同时低剂量的辐射会诱导生物机体加快对辐射诱导d n a 损伤的修复( 辐射的适应性效应) ：能破坏核酸、蛋白的结构，抑制其生物合成，引起 膜损伤，酶的失活，抑制细胞分裂甚至导致细胞及机体死亡，同时辐射也能刺激核酸、 蛋白的合成、酶活性的提高、加速细胞分裂、促进生物的生长发育并提高产量等等。 辐射生物效应的量度视其性质不同而异，例如细胞的失活数、染色体断裂数、突变率、 突变谱以及其他生物现象的表现程度等。 由于生物的多样性和复杂性，对同样辐射处理条件表现出个体差异性嘲。这涉及 到生物体对辐射的敏感性问题。在研究中，常常用生物存活率、细胞的存活数或d n a 单、双链断裂数来量度辐射的敏感性，并且发展了靶学说来描述生物存活率与剂量的 4 低剂量辐射引发细胞旁效应早期过程及机理研究第一章 关系。先前的研究表明，生物存活率随剂量增加呈指数下降，最近发现，在低剂量段 存在“反常辐射敏感性 ( h y p e rr a d i o s c n s i t i v i t y , h r s ) ，即生物存活率随剂量增加呈现 先降后升再降的趋势【6 一。 在研究电离辐射致人体遗传学损伤或损伤后的远期效应评价中，染色体畸变和微 核是常用的检测指标。很多离体和活体研究都显示高l e t 辐射在诱发染色体畸变和微 核形成方面比低l e t 辐射更加有效，并且这一过程和剂量相关。但是，对于一些非稳 定性畸变，由于随着细胞的分裂增殖而丢失，常常使检测结果产生一定误差，从而影 响辐射效应评价的准确性。 辐射的另一个重要的效应是诱发基因突变，包括点突变和大片段缺失。辐射诱发 物种突变的现象早已被人们所认知。在个体水平和人群中进行观察和定量分析辐射效 应相当困难，因此人们采用一些离体细胞实验模型来对辐射诱发的基因突变进行研究， 如突变的剂量效应和基因突变谱分析等。 辐射诱发体外细胞恶性转化是对辐射致癌进行分析研究的重要手段之一。人们建 立了若干哺乳动物细胞模型来研究辐射暴露所导致的细胞恶性转化。大量的研究显示， 辐射诱发体外细胞转化的机理涉及到基因突变、染色体畸变、遗传不稳定性、某些癌 基因激活与信号转导的失控以及p 5 3 、r b 等抑癌基因失活、细胞周期调控基因改变等 复杂的机理，这一过程相当复杂。 1 4 辐射生物学研究的新领域 随着现代生物学技术和理化实验技术的发展，辐射生物学研究在2 0 世纪九十年代 也取得了巨大发展。在近十几年的研究中，辐射生物学领域逐渐形成了三个研究热点： 1 4 1 辐射诱导的旁效应 上世纪九十年代初研究发现，一个细胞受到辐射损伤，与它相邻的未受到照射的 细胞，甚至受辐射细胞的培养液转换到其它未受照细胞群体中也能引起损伤，这就是 辐射诱导的旁效应喁】( b y s t a n d e re f f e c t s ，详见本章第二节) 。这一现象和原先认为只有 直接受到照射的细胞才能引起辐射损伤的传统观点产生了冲突，引起人们极大的关注， 促使人们关心环境中低剂量辐射长期暴露的安全性问题。 中田科学院等离子体物理研究所博士论文 5 第一章 1 4 2 辐射诱导的适应效应 预先给予受辐射样本( 如细胞) 较低剂量的辐射( 通常为x 或丫射线) ，间隔一 定时间后，再给予较高剂量的辐射，其诱导的辐射损伤比直接给予高剂量辐射诱导的 损伤要低，这种现象被称之为辐射的适应效应( a d a p t i v er e s p o n s e ) 。s a v a n t 等【9 】发现， 预先给予c 3 h 1 0 t 1 2 培养细胞2 c g y 剂量的丫射线辐照，6 小时后再以微束产生的a 粒 子辐照培养皿中的一个细胞，存活率分析显示，此时的辐射损伤下降为单纯a 粒子辐 照损伤的一半左右。i y e r 等【l o 】以1 c g y 剂量的y 射线辐照正常人的肺成纤维细胞 ( 盯l 1 ) ，l 小时后吸取其上清培养液，转换到未受照细胞。4 小时后此转换培养液 的细胞再以2 c g y 或4 c g y 剂量的丫射线辐照，相应地也降低了由2 c g y 或4 c g y 辐照引 起的旁效应水平。适应效应的产生一般认为是由于激活了细胞修复机制，提高了其抗 辐射敏感性【3 0 】。对适应性效应的研究有可能会对临床放射治疗提供有益的指导。 1 4 3 辐射诱导的遗传不稳定性 遗传的稳定性保证了细胞行为的正常及细胞群体遗传的连续性，该平衡的破坏， 将扰乱细胞的正常生理过程，而使细胞向异常的方向发展。遗传不稳定性是可以传递的， 即父代细胞获得的遗传不稳定性，可以在子代表现出来，而且子代表现可能比父代更 加突出，即遗传不稳定性的延迟表达。细胞内保证遗传稳定性的因素有多种，如细胞周 期因子、d n a 修复酶、d n a 结合蛋白、蛋白激酶、抑癌基因等。可导致遗传不稳定性 的因素也有多种，包括物理、化学、生物等因素。遗传不稳定性的表现形式可以是特定 基因表达增强、基因突变、等位基因重组及出现重组热点、卫星d n a 多态性等，也可 以是染色体畸变及异常核型、受照细胞后代的突变高敏感性、细胞转化等。 早在二十世纪5 0 年代，就有实验证实，受照细胞的后代表现出细胞增殖死亡事件 ( r e p r o d u c t i v ed e a t h ) t i l 】。6 0 年代，s i n c l a i r 用x 射线照射培养的v 7 9 细胞，其后代的克 隆形成能力下降、克隆变小、细胞倍增时问延长、辐射敏感性增加、染色体总数升高、 染色体畸变率升高等。1 9 9 1 年，j b l i t t l e 实验室的研究人员对这种细胞生殖死亡事 件进行了一系列研究。他们用x 射线照射c l i o 细胞，其1 2 - 3 4 代的细胞后代表现出 低的克隆形成能力、巨细胞比例增大以及低的贴壁能力等，且有一定的量效关系【l i 】。 细胞融合实验表明【1 2 l ，受照细胞后代与正常未受照细胞杂交，其杂种细胞仍表现出低 的克隆形成能力及高比率的巨型细胞；同时，克隆形成能力越低，杂交效率越低。辐 6 低剂量辐射引发细胞旁效应早期过程及机理研究第一章 射除引起细胞致死突变的延迟表达外，还可引起非致死突变的延迟表达，如h p r t ( 次 黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶) 位点突变。f r a n k 等【1 3 】用x 射线照射v 7 9 细胞1 0 8 天 后，对p u v a ( 8 一甲氧基补骨酯素加长波段紫外线) 诱发的i - - i p r t 突变呈现高敏感现象， 这种高敏感现象从照射后第一天即出现，而单独该剂量的p u v a 不能诱发h g p r t 的 突变。用x 射线照射c h o 细胞，照射后用h a t 培养基筛选未发生突变的细胞，这些 细胞的后代均表现出高频率的h p r t 位点的自发突变，且与细胞的克隆形成率呈显著 的负相关【1 4 】。h p r t 突变与细胞克隆形成率之间的关系也意味着在细胞遗传不稳定性 的延迟表达过程中，除一些特异的基因变化外，一些细胞生长繁殖所必需的特定基因 也存在着一定的缺陷。其中染色体变异如多倍体、持续存在的畸变、末端缺失及重排 等可能起着重要作用。 辐射可引起严重的染色体畸变，且常以环形染色体、双着丝粒为主。这些非稳定 性染色体畸变一般不能随细胞分裂而传给其子代。然而最近的研究不断提示，由于遗 传不稳定性的产生及传递，可使受照细胞的后代表现出一些非稳定性畸变。1 9 9 2 年， 英国e g w r i s t 实验室【”】首先报道了用a 粒子照射小鼠骨髓干细胞后，其1 4 天的单 克隆c f u 2 a 中仍能观察到双着丝粒、环形染色体等不稳定性畸变，异常核型比例达 5 0 以上。与此同时，s a b 撕d 1 6 】也报道了用重离子照射人皮肤成纤维细胞，其非克隆 细胞后代也表现出染色体不稳定性的传递现象。该二项研究，带动了后来关于遗传不 稳定性的深入研究，而且人们开始推测，这种遗传不稳定性传递的过程，是否就意味 着细胞已经有了癌变的倾向。 遗传不稳定性的产生是细胞癌变的早期事件，遗传不稳定性传递及延迟表达的过 程就是细胞渐进性癌变的过程【1 7 】。遗传不稳定性代表了恶性细胞的总体特征，其中涉 及到基因修复、基因重组、细胞周期、癌基因、抑癌基因、信号传导等诸多方面【1 8 , 1 2 。 另外，遗传不稳定性还涉及到辐射敏感性、遗传易感性等领域。对于遗传不稳定性传 递及延迟表达的重视，说明人们正在通过这方面的研究去深入探讨癌变的本质，并以 此来解释众多的生物现象。 遗传不稳定性是辐射危害性的一个重要方面，对低剂量辐射诱导旁效应的细胞后 代进行研究，同样也能看到类似的损伤增加【1 5 2 0 】这些现象的存在，对辐射危害性的 评估产生了更加深远的影响。 中田科学院等离子体物理研究所博士论文 7 第一章 第二节低剂量辐射旁效应 传统的观点认为，电离辐射的生物学效应主要是辐射对被照射细胞遗传物质如 d n a 的直接损伤所引发的，未修复或者错误修复的损伤会导致遗传性的变化。辐射防 护模型正是基于此理论，以高剂量辐射案例的数据为基础，以线性外推方式建立起来 的。 1 9 9 2 年n a g a s a w a 和l i t t l e 【s l 发现，被低剂量的a 粒子辐射的细胞群体，根据微剂 量学( m i c r o d o s e m i t r y ) 的计算，在只有0 1 1 的细胞核被粒子直接击中的情况下， 最终却检测到有2 0 - - 4 0 的细胞出现姐妹染色单体交换( s i s t e rc h r o m a t i de x c h a n g e s ， s c e ) 。根据传统的辐射损伤模型，只有被粒子直接击中的细胞核才会出现d n a 损伤， 例如s c e 。但是从实验结果推算，可引发s c e 的应答区域( r e s p o n s er e g i o n ) ( 包括了 被粒子击中的细胞质和非击中细胞) 要比实验用中国仓鼠卵巢细胞( c h o ) 的细胞核大 3 5 0 倍舯。在接下来的几年中，相关方面的研究陆续证实了这一点。x u e 等【2 1 1 用放射 性同位素5 【u s i i o d o - 2 一d e o x y u r i d i n e 标记肿瘤细胞，发现这些肿瘤细胞会产生有毒性 ( c y t o t o x i c ) l 拘旁效应。另外，m o t h e r s i u 和s e y m o u r 的培养基转移实验 2 2 1 发现：丫射线 辐射细胞后，用收集的条件培养基处理未受辐射细胞，可以使未受辐射细胞的存活率 下降。 上述研究对传统的低剂量辐射损伤模型提出了质疑，研究结果表明位于被直接击 中细胞附近的细胞，或者被条件培养基处理的正常细胞，都能对低剂量辐射产生应答。 借鉴基因治疗( g e n et h e r a p y ) 中曾经使用的旁效应的概念瞄】，即部分细胞转入的特定基 因片断会发生漂移，进入到没有转基因的细胞中，将这种低剂量辐射生物效应称为辐 射引发的旁效应( r a d i a t i o n - i n d u c e db y s t a n d e re f f e c t , r i b e ) 旁效应的发现在辐射危 害评估，辐射治疗和辐射诊断等领域具有很重要的意义。 2 1 低剂量辐射细胞旁效应概述 以下对旁效应的阐述，按照辐射种类和方式，生物学终点，旁效应对未辐射细胞 的保护作用三个方面进行。 2 1 1 不同辐射方式引发的旁效应 在旁效应的研究中，应用的辐射主要可以分为粒子型辐射( 如a 粒子) 和非粒子辐 8 低剂量辐射引发细胞旁效应早期过程及机理研究第一章 射( 如x 和1 ，射线) 。由于辐射种类的不同，研究旁效应的实验方法也不尽相同。 2 1 1 1 低剂量粒子辐射 研究粒子型辐射的旁效应主要是使用低剂量的a 粒子辐射细胞。在这种低剂量暴露 下，基于微剂量学( m i c r o d o s e m i t r y ) 计算仅有小部分细胞核会被粒子击中。通过被击 中细胞数量以及实际受损伤细胞数量两者之间的比较，可以计算出受到旁效应损伤的 细胞量。 微束装置的发明对旁效应的研究起到了很大的推动作用，微束可以将精确数目的 粒子注入到预定的细胞或细胞内的特定位点，例如细胞核或细胞质 2 4 - 2 6 。由于微束装 置在工程技术上的种种苛刻要求，很多旁效应的研究方法仍然沿袭0 【源宽束( b r o a d b e a m ) 辐射的方式。两种辐射方法各有优缺点，微束辐射虽然可以进行预定部位，预 定细胞数量的准确辐射，但辐射前需要对预定辐射部位如细胞核与细胞质进行荧光标 记，并且细胞辐射通量相对较小。宽束辐射方式较为迅速，不需要对细胞进行荧光标 记，这样可以减少细胞的损伤。 2 1 1 2 非粒子辐射 使用低传能线密度( 1 i n e a re n e r g yt r a n s f e r , l e t ) 的辐射如x 射线或丫射线等研究旁 效应，由于各个细胞都会受到辐射，因此多采取收集条件培养基处理细胞的方法。 m o t h e r s i l le t a 阱7 1 用7 射线辐射培养的上皮细胞后，收集条件培养基，与培养基受体 细胞温育，可以使未受辐射的细胞克隆存活下降，m o t h e r s i l l 认为在0 0 0 5 c g y 銎j 5 g y 的 剂量范围内，辐射会诱导细胞释放出可以导致凋亡和坏死的因子，从而影响到那些未 辐射的细胞口引。l e w i s 等用x 射线辐射人的h c l a s k i n 成纤维c g l l 杂合细胞后，收集条 件培养基处理未辐射的细胞，也增加了细胞恶性转化的概率【2 9 】。 2 1 1 3 放射性物质掺入 利用放射性物质掺入也是研究旁效应的一种方法。b i s h a y e e 等【3 0 l 利用放射性的氚 腺嘌呤( 【3 h d t h d ) 标记中国仓g v 7 9 细胞，标记细胞与非标记细胞混合共培养。3 h 所释放的b 粒子射程很短，仅仅能辐射已被放射性标记的细胞，不能作用到未标记的细 胞。对未标记细胞进行克隆存活测试，发现存活下降。h o w e l l 等的实验【3 1 】中，利用1 2 5 i 掺, x d n a 研究非均一分布辐射的旁效应。x u e 等【2 1 1 将致死剂量1 2 5 i 掺a d n a 标记人大 肠腺癌细胞，标记和未标记细胞的混合体注射到鼠体内后，观察到未标记细胞有明显 的生长抑制现象。 中田科学院等离子体物理研究所博士论文 9 第一章 2 1 2 研究旁效应的常用生物学终点( b i o l o g i c a le n d p o i n t ) 2 1 2 1 染色体损伤或畸变 染色体损伤或畸变如姐妹染色单体交换( s c e ) 和微核( m i c r o n u c l e i ) ，早熟染色 体凝集( p c c ) 和原位荧光杂交( f i s h ) 等是研究旁效应损伤时常用的检测终点【2 0 1 。 n a g a s a w a 和l i t t l e 在未辐射的c h o 细胞中检测超过理论计算值的s c e ，d e s h p a n d e 等【3 1 】 在人的体细胞成纤维细胞中也检测到了低剂量q 粒子辐射旁效应引发的s c e 。p r i s e 等d 2 】 使用微束研究，发现在旁细胞中会有约2 - 3 倍上升的微核率和凋亡率1 3 2 】，并且这种效应 与剂量和受辐射细胞比例无关。b e l y a k o v 等p 3 分别使用猪和人的尿道上皮外植体做了 部分细胞注入高能氦离子注入，同样在旁细胞中检测到显著的微核与凋亡发生。 2 1 2 2 特定基因表达 旁效应会诱导未辐射细胞中一些特定基因表达上升，显示了从辐射细胞到非辐射 细胞的压力或胁迫信号的传递。h i c k r n a n 等口4 1 发现，低剂量a 粒子辐射细胞群体可以引 发细胞i 内p 5 3 表达上升，并且p 5 3 表达上升的细胞比例超过了受辐射细胞比例。利用 w e s t e r nb l o t t i n g 署l l 原位免疫荧光( ns t ui m m u n o f l u o r e s c e n c e ) 技术，a z z a m 3 5 1 在旁细 胞中检测到p 2 1 w 硪的表达，p 2 1 w m 是p 5 3 的下游效应子( e f f e c t o r ) ，实验中满度生长 的正常人成纤维细胞进行0 。3 c g y 的平均剂量暴露，只有大约2 的细胞核会被粒子击 中，但p 2 1 w m 表达的细胞远远超过这个比例。由于d n a 的损伤是p 5 3 p 2 1 w m 损伤反应 通路的上游事件，所以p 2 1 w m 或p 5 3 的表达意味着旁细胞中d n a 发生损伤。 2 1 2 3 基因位点突变 旁效应会引发一些基因位点的突变率上升。n a g a s a w a p 6 】研究了旁效应对c h o 细胞 的i i p r t 位点突变作用，发现低剂量范围内平均每个啦子径迹( t r a c k ) 引发的h p r t 位点 的突变率，与辐射剂量是一种超线性( h y p e r l i n e a r ) 的关系。在平均最低剂量0 8 3 c g y 的剂量下每个粒子径迹引发的突变率是本底水平的7 1 倍。z h o u j ；【3 7 - 3 8 l 利用微束装置仅 对细胞群中1 0 的细胞核注入致死剂量的2 0 个a 粒子后，发现突变率与全部细胞受到辐 射的突变率持平。 2 1 2 4 细胞转化( t r a n s f o r m a t i o n ) 为了研究旁细胞中遗传性损伤的更长时程( 1 0 n g - t e r m ) 后果，也是为了阐明组织 辐射保护的重要性，s w a n t s 等口舛进行了细胞转化的实验，证实了辐射时旁细胞所面对 的风险。实验中将培养的c 3 h 1 0 t 1 2 鼠胚胎成纤维细胞中1 0 的细胞进行c t 粒子暴露， 1 0 低剂量辐射引发细胞旁效应早期过程及机理研究 第一章 所引发的转化率接近将每个细胞都辐射相同数量粒子所引发的转化率。这个实验说明， 在一些情况下，旁细胞中所引发的突变和染色体断裂可以导致肿瘤发生。随后开展的 在不同细胞测试体系中所进行的这类实验为公共辐射的防护提供了很好的依据。 综上所述，不同的实验室利用不同的生物终点所得到的结果都表明，低剂量辐射 所造成的胁迫并不局限在直接击中的细胞。 2 1 3 旁效应对细胞的保护作用 大部分研究结果显示出旁效应对未辐射细胞的损伤作用，但有的研究却表明旁效 应对未受辐射的细胞具有保护作用。g e r a s h c h e n k o 等l 删发现当鼠上皮细胞受到高于 0 5 g ) r 的丫射线辐射后，促进了与之共培养的未受辐射细胞的生长。i y e r 等【4 1 】将培养 的人肺成纤维细胞暴露子s c g y 的a 粒子后，收集到的上清液可以促进未辐射细胞的生 长，初步的机理研究显示，条件培养基处理会增强未受辐射的细胞中a p 核酸内切酶， d n a 碱基切除酶的表达量以及促使氧化还原水平上升。m a t s u m o t o 等【4 2 】发现受到x 射 线辐射的p 5 3 缺陷型g l i o b l a s t o m a 细胞会释放出一氧化氮( n i t r i co x i d e ) 到培养基中，导 致共培养或条件