（发酵工程专业论文）产10hda菌株的改良及发酵调控.pdf

山东轻t 业学院硕l 学位论文 摘要 l o 一羟基一2 癸烯酸( 1 0 h y d r o x y 2 d e c e n o i ca c i d ，1 0 - h d a ) 是一种迄今为止 仅在蜂王浆中发现的不饱和脂肪酸。1 0 h d a 具有抗菌、抗溃疡作用、增强免疫力、 抗癌、抗肿瘤作用、降血脂作用。因此1 0 h d a 具有极高的医药保健价值，得到越 来越多的关注，本论文主要研究内容是通过诱变，改变出发菌株q y w 5 2 2 产量低 且不稳定的现状，并对摇瓶发酵条件进行探讨和优化，在此基础上进一步研究5 0 l 发酵罐的发酵条件。 通过比较实验，从紫外线诱变、紫外复合氯化锂诱变、亚硝酸诱变、微波诱 变四种诱变方法中，选择正突变率较高的紫外线复合氯化锂诱变作为下一步 q y w 5 2 2 原生质体诱变的主要方法。 论文研究了出发菌株q y w 5 2 2 原生质体制备的影响因素，确定了原生质体最佳 的形成条件：l 溶菌酶，1 5 蜗牛酶，i 纤维素的酶系统；渗透压稳定剂为 0 8 m o l l m g s 0 4 ；菌龄为3 0 h ：酶解温度为3 3 ；酶解时i 日j 为3 h 。 通过薄层初筛，从高渗再生培养基上共获得7 3 株较有潜力的菌株，最终选择 提高率较高的8 株突变株进行下一步复筛。摇床复筛，高效液相色谱法检测发酵液 中1 0 h d a 的含量，最终筛选出一株产量相对出发菌株提高较多的突变株 u v 9 0 s 2 9 。 对突变株u v 9 0 s 2 9 进行形态特征观察，依据真菌鉴定手册和相关书籍， 初步认为该菌属于半知菌f - j ( f u n g ii m p e r f e c t i ) 丛梗孢目( m o n i l i a l e s ) ，丛梗孢 科( m o n i l i a c e a e ) ，曲霉族( a s p e r g i l l a s e ) ，曲霉属( a s p e r g i l l u sm i c h e xf r ) ， 黄米曲霉组( 么f l a v u s o r y z a e ) 疏展曲霉( 彳e f f u s u st i r a b o s c h i ) 。 论文通过单因素实验结合正交实验对突变株u v 9 0 s 一2 9 的摇瓶发酵条件进行摸 索，确定了碳源是1 0 h d a 最主要的影响因素，其次为氮源，最后是无机盐，最佳 培养条件是：接种量为1 0 ，菌龄3 0 h ，初始p h 为6 0 ，3 0 c 、2 2 0 r m i n 摇床培养7 2 h 。 在摇瓶培养条件研究的基础上，论文还进行了5 0 l 发酵罐实验，共进行了3 批 实验，1 0 h d a 的最高产量为2 9 5 3 4 2 p g m l ，并对发酵过程各参数的变化进行了分 析。 关键词：1 0 一h d a ；原生质体诱变；菌种鉴定；h p l c v a b s t r a c t a bs t r a c t 10 h y d r o x y 一2 一d e c e n o i ca c i dw a sat y p eo fu n s a t u r a t e df a t t ya c i d ，w h i c hh a db e e n o n l yf o u n di nt h er o y a lj e l l yb yn o w 10 - h d as h o w e dr e m a r k a b l eb i o l o g i ca c t i v i t y a g a i n s tb a c t e r i u m ，u l c e r a t i o n ，c a n c e r , t u m o u r e s p e c i a l l y , 1 0 一h d ac o u l de n h a n c et h e a b i l i t yo fi m m u n i t y , a n dr e d u c et h ef a to fb l o o d a sar e s u l t ，10 一h d ah a ds k y s c r a p i n g v a l u ei nt h ed o m a i no fm e d i c a m e n ta n dh e a l t hp r o t e c t i o n s o ，i th a da t t r a c t e dm o r ea n d m o r ea t t e n t i o n t h i sp a p e rm a i n l ys t u d i e dm a n ya s p e c t s ，s u c ha s ，t h ei m p r o v e m e n to f t h ep r o d u e t i v i t yo fs t a r t i n gs t r a i nq y w 5 2 2w i t hm u t a t i o nb r e e d i n g ，t h er e s e a r c ho f s h a k i n gf l a s kc o n d i t i o na n d5 0 lf e r m e n t o rr e s p e c t i v e l y b a s e do ns t u d i e sa n dc o m p a r i s o n s ，w eu s e du vm u t a t i o nm e t h o d ，u va n dl i c l m u t a t i o nm e t h o d m i t r o u sa c i dm u t a t i o nm e t h o da n dm i c r o w a v ei r r a d i a t i o nm e t h o dt o t r e a tw i t ht h es t a r t i n gs t r a i n a tl a s t w ec h o s eu va n dl i c lm u t a t i o na st h em a i n m e t h o dt oi n d u c et h ep r o t o p l a s to fq y w 5 2 2 b e c a u s ew ec o u l do b t a i nh i g h e r p o s i t i v e m u t a t i o nr a t i o t h ep a p e rs t u d t i e dt h ee f f e c tf a c t o r sf o rp r e p a r i n gt h ep r o t o p l a s t so fq y w 5 2 2 t h eb e s tc o n d i t i o n sf o rp r e p a r i n gp r o t o p l a s t sw e r ec o n f i r m e d t h eo p t i m a lc o m b i n e e n z y m es y s t e mc o n t a i n e d1 l y w a l l z y m e ，1 5 s n a i l a s e ，l f i b r i ne n z y m e t h eb e s t o s m o t i cs t a b i l i z e rw a so 8 m o l lm g s 0 4 t h ee x p e r i m e n tu s e dm y c e l i u ma g e d3 0h o u r s a so p e r a t e dm a t e r i a l t h eg r e a t e s tt e m p e r a t u r ea n dt i m ew e r e3 3 。ca n dt h r e eh o u r s r e s p e c t i v e l y a c c o r d i n gt of o l i u ms c r e e n i n g ，7 3s t r a i n sw e r eo b t a i n e df r o mr e g e n e r a t i o nc u l t u r e m e d i u mo fh i g ho s m o t i c a tl a s t ，8s t r a i n st h a th a dh i g h e ri m p r o v e m e n tr a t i ow e r e c h o s et oc a r r yt h r o u g hn e x ts c r e e n i n g t h ep a p e ru s e dt h es h a k i n gf l a s ka s s a yt of i l t r a t e t h es t r a i n st h a th a dt h eb e t t e ra b i l i t yo fp r o d u c t i n g10 一h d a t h ec o n t e n to f10 一h d a w a sq u a n t i f i e db yh i g hp r e s s u r el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) f i n a l l y , c o m p a r e dw i t h t h es t a r t i n gs t r a i n ，as p e c i a ls t r a i nu v 9 0 s 一2 9w a ss c r e e n e d ，i t sc o n t e n to f10 一h d ai nt h e f e m e n t a t i o nl i q u i dh a dg r e a t l yi m p r o v e d t h et h e s i so b s e r v e da p p e a r a n c ec h a r a c t e ro fu v 9 0 s - 2 9 ，a c c o r d i n gt oh a n d b o o ko f f u n g ii d e n t i f i c a t i o na n do t h e rr e f e r e n c eb o o k ，t h i ss t r a i nb e l o n gt of u n g ii m p e r f e c t i , m o n i l i a l e s ，m o n i l i a c e a e ，a s p e r g i l l a s e ，a 5 p e r g i l l u sm i c h e xf r ，a f l a v u s o r y z a e ， a e f f u s u st i r a b o s c h i t h r o u g ht h es i n g l e f a c t o ra n dt h eo r t h o g o n a lt e s t ，t h ep a p e ri n v e s t i g a t e dt h e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n so fs h a k i n gf l a s k ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h ec a r b o nr e s o u r c ew a s v i 山东轻工业学院硕十学位论文 t h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r , f o l l o w e db yn i t r o g e n ，a n df i n a l l yt h es a l t s ，t h eb e s tc u l t u r i n g c o n d i t i o n sw e r ec o n f i r m t h eb e s ta m o u n to f i n o c u l a t i o nw a s10p e r c e n t ，t h eo p t i m a l s t r a i na g e d3 0h o u r s ，t h ei n i t i a lp hw a s6 0 ，t h et e m p e r a t u r ew a s3 0 ，t h es p e e do f s h a k i n gf l a s kw a s2 2 0r m i n ，t h eg r e a t e s tt i m ef o rp r o d u c i n g10 - h d a w a s7 2h o u r s o nt h eb a s i so fc o n d i t i o n sf o rs h a k i n gf l a s k ，t h ep a p e ra l s od i ds o m er e s e a r c ho n 5 0 lf e r m e n t o re x p e r i m e n t ，t h r e eg r o u p so fe x p e r i m e n t sw e r ec a r r i e do u t t h em a x i m u m o u t p u to f10 - h d aw a s2 9 5 3 4 2 9 9 m l ，t h ec h a n g e so fd i f f e r e n tp a r a m e t e r sd u r i n gt h e f e m e n t a t i o np r o c e s sw e r ea n a l y z e d k e y w o r d s ：10 一h d a ；i n d u c e dm u t a t i o no np r o t o p l a s t ；s t r a i ni d e n t i f i c a t i o n ；h p l c v i i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与浚论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名： 日期：童! 竺! 年月卫日 日期：童盟堡年月上生日 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1l o h d a 的来源 1 0 羟基2 癸烯酸( 1 0 一h y d r o x y 2 d e c e n o i ca c i d ，1 0 h d a ) 是一种不饱和脂 肪酸，迄今为止1 0 羟基2 癸烯酸仅在蜂王浆中发现，是蜂王浆中主要的活性成分， 含量仅为1 4 一- - 2 0 t 1 1 ，具有极高的医药和保健价值。1 0 h d a 是由德国科学家d j 郎格( 1 9 2 1 ) 首次在工蜂上颚腺中发现的，美国t o w n s e n d $ l l l u c a s ( 1 9 4 0 ) 从普 通蜜蜂中提取分离出来 2 1 。日本学者佐藤道夫( 1 9 8 2 ) 也以大量数据证实，1 0 一h d a 主要分泌于工蜂的上颚腺。刚出房的工蜂上颚腺中含量极微，随着日龄的增加， 含量有增加的趋势，1 5 - - 一2 0 日龄哺育蜂的上颚腺中含量最高，2 0 日龄以后开始有 降低的趋势，1 0 h d a 含量与青年哺育蜂分泌蜂王浆有关，在蜂群大繁殖期含量极 高，而外勤蜂上颚腺中的1 0 一h d a 含量则极低【3 】。1 9 5 7 年a b u t e n a n d t 首先报导从王 浆中分离出1 0 h d a ，并且* i i h r e m b o l d 利用红外光谱的方法确定了王浆酸的结构 为1 0 羟基2 癸烯酸【4 】，b e r k e r 等【5 】经n m r 确定其为反式异构体。长期以来，国 内外学者都认为1 0 羟基一2 一癸烯酸是蜂王浆中特有的功效成分，并将其作为鉴别蜂 王浆真伪最可靠的检测方法。李全阳( 1 9 9 9 ) 等对意大利蜂幼虫体内1 0 h d a 变化 规律的研究表明，意大利工蜂、蜂王幼虫发育初期，体内含有少量的1 0 h d a 。 近年来随着蜂胶产品开发，中国学者潘建国等( 2 0 0 2 、2 0 0 4 ) 先后从蜂胶中 也成功分离出1 0 h d a ，平均含量为0 2 2 1 6 1 ，这一发现不仅填补蜂胶产品的空白， 同时也改变了传统的只有蜂王浆中才有该物质的说法。 1 210 h d a 的理化性质 1 0 h d a 是一种中链不饱和一元脂肪酸，分子式为c l o h l 8 0 3 ，分子量为1 8 6 2 5 ， 1 0 h d a 是一种白色絮状结晶或针状结晶，不易吸潮，在高温条件下易变为油状或 焦化，低温冷冻干燥时不易升华。其熔点为5 8 - - 一6 4 ，溶于甲醇、乙醇、乙醚和 氯仿，微溶于丙酮，不溶于水。对石蕊试纸显酸性，能使溴水和高锰酸钾溶液迅 速褪色，对三氯化铁不显紫色【7 1 ，结构式如下表示： h o 、 代c ooh 1 3 中链脂肪酸的生理保健功能 脂肪酸依照碳数可分为短链( s c t ) ，中链( m c t ) 与长链( l c t ) 三类。中链脂肪酸 ( m c f a ) 是指碳链长度为6 1 2 的脂肪酸，其代谢方式与常见的长链脂肪酸( l c f a ， 碳链长度 1 4 的脂肪酸) 有许多不同【8 】，如：m c f a 形成中链脂酰辅酶a ( m c 2 c o a ) 的反应发生在线粒体内，而l c 2 c o a 的形成过程在胞浆内成；m c f a 以脂肪酸的 形式直接进入线粒体，不需要肉碱棕榈酰转移酶1 ( c p t l ) 的协助【9 j ，而c p t l 是 第l 章绪论 l c c o a 进入线粒体的限速酶，其活性决定了l c f a 在细胞内的氧化水平；由于 m c f a 在细胞内能迅速进入线粒体进行氧化，因而极少会掺入到t g 中在胞浆沉积 【1 0 】 o 中链脂肪酸只有少数天然的来源，至今最好的来源就是椰子油，很多中链脂 肪酸衍生甘油酯现在得到了越来越多的应用。 中链脂质是供重症住院病人和患慢性疾病的门诊病人专用的医用营养s j j 齐i j ， m c t 是其中的一个脂肪组分，为各种患者提供营养。 m c t 优点首先是能被快速吸收，转运到肝门静脉。m c t 水解无需胰脂酶，吸 收也无需淋巴系统的参与，m c t 可以像葡萄糖那样快的速度从肠吸收，但能提供 碳水化合物两倍的能量。m c f a 一进入肝中就可以迅速被氧化，c 8 和c l o 都不需 要肉碱帮助自己穿过线粒体膜，而肉碱在那些危症病人体内可能己被耗尽。c 8 是 快速能量传递者，c l o 更有可能在被氧化前进入淋巴系统，从而分布到外周组织中， 实验发现提高c l o 的比例可以调节能量传递速度。m c t 提供快速浓缩能量的来源， 能满足一些新陈代谢速度快的患者的需要，另外，其也可以改善其他脂肪酸吸收。 m c f a 还被发现与鱼油组分协同进入免疫系统，因而特别设计含有m c t 产品 提供给免疫受抑制的患者。m c f a 不是花生四烯酸的前体，不会加重炎症反应( 花 生四烯酸衍生的前列腺素e 2 会加重烧伤和创伤者二级感染) 。因此，尽管肠道营 养剂仍在不断完善，添加诸如鱼油、精氨酸和r n a 组分，但是m c t 和含m c f a 的 重构脂质仍是这类制剂的基本成分。m c t 的理化特性决定了m c f a 体内代谢过程， m c f a 的碳链长度及制剂类型亦起着一定作用。目前，人们多把m c t 看作一种新 型的脂肪能源。由于其能被充分吸收，迅速氧化供能，体内极少积蓄以及对免疫 系统影响小等优于l c t 的特点，加之结构脂的不断改进，势必在今后临床治疗中有 着广阔的前景1 1 41 0 h d a 的生理保健功能 1 4 1 抗菌、抗炎、抗溃疡作用 1 0 h d a 是蜂王浆抗菌、抗炎、增强免疫力的重要成分已经得到国内外专家的 一致认可。1 0 h d a 具有多种抑菌作用，对大肠杆菌和化脓性球菌均有抗菌作用【1 1 1 。 此外，1 0 h d a 能抑制应激、结扎幽门和消炎痛性胃溃疡的形成，促进醋酸性胃溃 疡的愈合，并能抑制胃酸分泌，增强胃黏膜细胞保护作用i l2 1 。 1 4 2 增强免疫力作用 谢卓丘等( 1 9 9 0 ) 研究表明，1 0 - h d a ( i g ，1 0 0 m g k g ，7 8 d ) 能完全拮抗可的松 对小鼠炭粒廓清速率的抑制作用【l 引，并可拮抗环磷酰胺对小鼠皮肤迟发性超敏反 应的抑制作用，可促进环磷酰胺所致免疫功能，抑制小鼠的溶血素形成；而对正 常小鼠的上述免疫功能无明显影响。巫冠中( 1 9 9 1 ) 的关于1 0 h d a 对动物免疫系 统的影响的研究表明：1 0 h d a 对正常小白鼠的细胞免疫反应有明显的促进作用 2 山东轻t 业学院硕上学位论文 b 4 j 。1 0 h d a 对年老、疾病或体衰等引起的免疫功能低下有一定的防治作用。王国 燕等( 1 9 9 6 、1 9 9 7 ) 研究表明，1 0 h d a 可促进刀豆球蛋白a 诱导的t 淋巴细胞增殖 反应，可促进小鼠产生白介素2 ，可调节t 淋巴细胞参与的免疫反应。 1 0 h d a ( 5 0 ，1 0 0 m g l ) 能增强巨噬细胞的吞噬活性，在抗肿瘤和免疫调节 中起一定作用；石晶等( 1 9 9 9 ) 观察蜂王浆的提取物l o 一羟基癸烯酸( 1 0 h d a ) 对小 鼠免疫功能的影响【1 5 】。结果表明，1 0 h d a 对小鼠外周血淋巴细胞无明显影响，但 能抑制由p h a 诱导的小鼠体内淋巴细胞转化。 1 0 h d a 对小鼠免疫功能有一定的抑制作用，该抑制作用与其促进肾上腺皮质 的功能有关。 1 4 3 抗癌、抗肿瘤作用 1 0 h d a 能强壮肌体和具有强烈抑制移植性a k r 白血病、t a 3 乳腺癌、淋巴 癌及多种腹水型艾利虚癌等癌细胞生长的作用【1 6 1 1 7 1 。研究表明1 0 h d a 具有免疫 调节和抗肿瘤的作用、可促进小鼠t 淋巴细胞( t l y m p h o c y c t es u b s e t s ) 、脾白介 素2 ( i n t e r l e u k i n 2 ) 的增加【1 8 】。遗传毒理学和药理学研究结果表明：1 0 h d a 能促 进骨髓细胞分裂，促进人体外周血淋巴细胞d n a 合成，促进被p h a 激活的淋巴 细胞的转化作用，增强免疫力。实验表明：2 0 0 p g m l 浓度的1 0 h d a 对体外培养 的肺癌d 6 、艾癌细胞有一定杀伤和抑制分裂的作用，这说明1 0 h d a 有延长患癌 动物生存期的作用。1 0 h d a 与抗癌药d d p ( 顺铂) 对比，微核实验显示，即使 1 0 h d a 浓度比d d p 高1 0 倍( 1 0 0 0 p g m l ：1 0 01 a g m l ) ，但致畸作用却大大低于 d d p ，说明1 0 一h d a 毒副作用很低【1 9 j 。 1 0 h d a 对植物的花粉萌发、花粉管伸长和生殖核的有丝分裂有强烈的抑制作 用，可间接说明1 0 h d a 是蜂王浆抑制细胞分裂和抗癌的有效成分【2 。黄强等( 1 9 8 6 ) 经动物实验研究表明，1 0 羟基2 癸烯酸具有抗亚硝基脲类药物的骨髓抑制作用， 可提高骨髓增殖能力；通过建立裸小鼠人脑胶质瘤模型，对1 0 一羟基2 癸烯酸抗 肿瘤活性作了初步研究。肿瘤组织浸泡和双盲法口服治疗肿瘤的实验结果均表明 该药有明显的抗肿瘤作用【2 2 】。1 0 h d a 为高生物活性物质，可通过刺激环状- 腺磷 苷的合成，使蛋白质螺旋结构正常化，从而使受肿瘤破坏的结构正常化，因而对 癌细胞有抑制作用。 。 1 4 4 降血脂作用 研究表明1 0 h d a 对高血脂症和高胆固醇症有治疗作用，实验证明，加1 0 h d a 组中、高剂量治疗性给药及预防性给药明显降低高血脂动物模型实验性高血脂症 大鼠血液中甘油三酯( t g ) 、总胆固醇( t c ) 、p 一脂蛋白含量，同时升高高密度 脂蛋白( h d l ) 含量，说明1 0 h d a 对高血脂症具有良好的治疗和预防作用。 1 0 h d a 对胆固醇症也有治疗作用，其作用机理与亚油酸、花生四烯酸等不饱 和脂肪酸相似，对胆固醇代谢的影响表现在以下几个方面：首先是促进肝内t c 氧 第1 章绪论 化转变为胆酸，其次是抑制胆酸的肝肠循环和调整t c 在血液与其他组织中的分配 情况。高级不饱和脂肪酸胆固醇酯较饱和脂肪酸胆固醇酯容易由血管向外转运， 而起到降低血脂及胆固醇作用。实验证实了1 0 h d a 是蜂王浆治疗高血脂高胆固 醇症中的功能因子【2 3 1 。 1 51 0 h d a 的检测方法 1 0 h d a 是蜂王浆中重要的活性成分，1 0 h d a 的含量直接决定了蜂王浆的质 量的好坏，因此建立合理的1 0 h d a 分析检测体系是十分必要的。迄今为止， 1 0 h d a 见于报道的分析方法主要有：紫外分光光度法、气相色谱法( g c ) 、高效 液相色谱法( h p l c ) 、分光光度法、薄层色谱法( t l c ) 、毛细管电泳法( c e ) 等。 1 5 1 紫外分光光度法 配制1 0 9 9 m l 的标准溶液，在紫外扫描仪上由1 9 0 n m 扫至2 3 0 n m 。来确定其 最大吸收波长，得出1 0 h d a 的最大吸收波长为2 0 8 n m 。 测定标准曲线：准确称取0 0 2 0 91 0 h d a 标样，加1 3 m l 9 5 乙醇溶解，用去 离子水定容到2 0 0 m l 。分别取1 0 m l 、2 0 m l 、3 0 m l 、4 0 m l 、5 0 m l 定容到5 0 m l 。 其浓度分别为2 l - t g m l 、4 p , g m l 、6 1 a g m l 、8 u g m l 、10 t g m l ，以0 3 2 5 m l 乙醇加 去离子水定容至5 0 m l 为空白。调零，于吸收波长处，用7 5 2 紫外分光光仪测定。 精确称取o 1 5 0 9 标准样品加6 5 m l 乙醇，定容至1 0 0 0 m l 。取一定量，稀释 至5 0 m l ，于吸收波长处测定。通过标准曲线求得1 0 h d a 的含量，并测定精密度 和回收率【2 4 l 。 1 5 2 聚酰胺薄膜层析分光光度法 将蜂王浆及其制剂经前处理提取1 0 h a d ，在聚酰胺薄膜层析上点样，以石油 醚- 乙醚冰醋酸( 3 ：2 ：o 5 ) 展开，直至1 0 h d a 与其它羧酸分开，然后用罗丹明染 色，1 0 h d a 呈深红色，再经洗脱，最后用5 6 0 n m 波长测吸收度进行定量，重现 性实验r s d = 4 0 1 。 1 5 3 高效液相色谱法 h p l c 以其高分辨率，分离及重现性好的特点，使其在蜂王浆及其制剂化学成 分的分析中日益显示出重要作用。蜂王浆及其制剂经预处理后，在拟定的色谱条 件下进行h p l c 分析，定量方法有外标法和内标法，如表1 1 ： 4 山东轻工业学院硕上学位论文 表1 1采用h p l c 法测定蜂王浆及其制剂中的1 0 h d a 的定量方法和分析条件 t a b l e1 1t h eq u a n t i t a t i v em e t h o d sa n da n a l y t i c a lc o n d i t i o no fd e t e r m i n i n g10 h d ai nr o y a lj e l l y a n dp r e p a r a t i o nb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 1 5 4 气相色谱法( g c ) 蜂王浆及其制剂经前处理后再进行癸烷化或甲酯化，然后在选定的分析条件 5 第1 章绪论 下进行g c 分析，如表1 2 ： 表1 2 采用g c 法测定蜂王浆及其制剂中的1 0 h d a 的分析条件 t a b l e l 2t h ea n a l y t i c a lc o n d i t i o no f d e t e r m i n i n g1 0 一h d ai nr o y a lj e l l ya n dp r e p a r a t i o nb yg a s c h r o m o t o g r a p h y 色谱柱 内标物 m m m 十七烷酸 n h e p t a d e c a 2 x 3 n o i ca c i d 2 1 x 3 棕榈酸 h e x a d e c a n o i1 6 x 3 c a c i d 棕榈酸 h e x a d e c a n o i 1 6 x 3 2 c a c i d 棕榈酸 h e x a d e c a n o i c a c i d 癸酸 n d e c e n o i c a c i d 固定液 相体 载气温度 检测器 5 x e 6 0 c h r o m o s c l r b 2 51 7 02 5 02 5 0f i d w a w ( s o 1 0 0 ) 1 5 r 一4 0 0 1 5 o v - 2 2 5 c h r o m o s o r b w a w ( 6 0 8 0 ) 3 s e - 3 0 w a w d m c s ( 6 0 8 0 ) 3 s e 3 0 伊z w d m c s ( 6 0 - 8 0 ) 1 2 x 0 23 s e 一3 0 2 1 2 x 0 2 3 s e 3 0 2 4 00 60 51 9 52 6 02 5 0f i d 5 00 70 51 8 52 5 0 f i d 4 01 6 02 5 0f i d 2 1 0 2 6 0 2 6 0f i d 2 8 0 2 4 03 0 0f i d 6 检测器 进样口 柱 盯 g n 触m n 札 懈 n 札 觚 n 山东轻工业学院硕上学位论文 棕榈酸 h e x a d e c a n o i c a c i d 癸二酸 s e b a c i ca c i d 3 s e 3 0 w a w 2 x 3 d m c s ( 6 0 8 0 ) 10 s i l i c o n e g e s e 3 0 1 6 x 3 2c h r o m o s o r b w a w ( 6 0 8 0 ) 2 o v 一1 7 c h r o m o s o r b 1 。5 x 4 w a w ( 6 0 8 0 ) 4 05 0 11 9 02 5 0 5 02 0 02 6 0f i d 4 52 8 03 0 0f i d 1 5 5 气相色谱质谱连用法 采用s h i m a d z u g c m s q p l 0 0 0 ( e t c i ) 气质联用仪，对峰进行质谱解析和研 究，用b s a n ，0 双( 三甲基甲硅烷基) 乙酣胺】和t m s i ( 三甲基氯代硅烷) 以2 ：1 混合液处理试样。分析条件：2 1 m x 2 6 m m 玻璃柱；固定液1 0 s e 3 0 ：进样品温度 2 5 0 ；色谱柱温度2 0 0 ；h e 流速3 0 m l m i n ：电离电压e t 7 0 e v ，c t 2 0 0 e v ；以 异丁烷为反应气，结果由色谱确定蜂王浆主要成分1 0 h d a ，得知各峰分子量、分 子结构信息，各未知组分均为脂肪酸类化合物。 1 5 6 薄层色谱法( t l c s ) 普遍采用的是s h i m a d z uc s 9 1 0 ，c s 一9 3 0 薄层扫描仪，双波长反射锯齿形扫描。 该方法可抵消因薄层板厚薄不匀而引起的基线噪音，又能克服斑点不规则所带来 的误差。定量方法分内标法和外标法。取蜂王浆口服液用水稀释后调p h = 2 3 ， 然后用水饱和的c h 2 c 1 2 萃取，减压加收溶剂后用甲醇定容，在g f 2 5 4 硅胶板上点 样，用苯冰醋酸( 2 2 ：3 ) 系统展开后，反射锯齿扫描，k = 2 0 8 n m 、k r = 3 5 0 n m 。 实验证实，在0 5 p , g 范围内1 0 h d a 浓度与层析扫描积分值有良好的线性关系。 取1 0 - h d a 标准液进行t l c s 分析，绘制标准曲线。回归方程：y = i 6 0 1 x + o 0 6 4 ， r = 0 9 9 9 9 ，表明1 0 h d a 在1 - 8 1 t g 范围呈线性关系，稳定性实验表明，4 h 内测定 结果无明显变化。将蜂王浆用硅胶搅拌后，分散于甲醇中，直接点样作t l c s 定 量，采用硅胶g f 2 5 4 薄层预制板，以醋酸乙酯石油醚( 3 0 6 0 ) 醋酸( 8 ：2 ：o 3 ) 上行 展开，1 0 h d a 的r r = 0 6 7 ，用s h i m a d z uc s 一9 1 0 作反射锯齿扫描l s = 2 1 0 h m 、 久, r = 3 8 0 n m ，1 0 一h d a5 “g 时呈线性，用外标法计算含量。取蜂王浆冻干粉适量，经 7 第1 章绪论 氯仿搅拌提取后，作为供试液i ，点于硅胶g f 2 5 4 板上，以氯仿醋酸乙酯甲醇 ( 9 5 ：1 0 ：0 5 ) 再加滴甲酸为展开剂展开，紫外光灯下定位，九s = 2 2 5 n m 九r = 4 0 0 n m ，反 射锯齿扫描；另取蜂王浆冻干粉适量经氯仿，甲醇羧化提取后制成供试液i i 点于 硅胶g 板上，以丁酮冰醋酸水( 6 ：1 5 ：3 5 ) 为展开剂展开后，用0 c 酚硫酸试液显色， 1 0 5 加热5 m i n ，1 0 一h d a 呈紫红色斑点，扫描条件：k = 5 2 5 n m 、a , r = 7 6 0 n m ，反射 锯齿扫描，均获满意结果。 1 5 7 红外分光光度法 取蜂王浆制品适量，用氯仿溶解，加k b r 粉末，挥发干溶剂后研磨后压片， 将波长调至1 8 0 0 c m ，光透过率调至9 0 ，扫描速度3 0 0 0 c m m i n ，增益1 2 ，响 应2 s ，在1 8 0 0 - - 一1 5 5 0c m 以范围扫描，按基线法从1 7 8 0 c m 和1 5 8 0 c m 的基线两端 测定1 6 5 3 c m 。1 处吸收度，按回归方程：y l = 1 5 0 3 1 x - - 0 0 0 8 2 3 计算含量，另取样品 适量，用氯仿溶解后，用注射器取适量氯化钠液体入吸收池中，以氯仿为对照， 在上述条件下测其吸光度，按回归方程：y 2 = 0 0 7 0 6 x - - 0 0 0 9 1 计算含量1 2 5 。 1 5 8 酸度法 经实验进行酸度与1 0 h d a 含量相矢分析，发现1 0 h d a 含量与酸度存在正 相关，r = 0 3 8 1 0 ，经显著性检测，p 酵母膏 k i - 1 2 p 0 4 ，葡萄糖是影响1 0 h d a 产量最大的因素，其 次是酵母膏，最后是k h 2 p 0 4 。 山东轻t 业学院硕士学位论文 3 4 6 发酵条件对1 0 h d a 产量的影响 ( 1 ) 接种量对产1 0 h d a 的影响 本实验采用了2 、3 、5 、8 、1 0 、1 5 的接种量，在相同的条件下培 养，用高效液相检测1 0 h d a 的含量，结果如表3 6 所示： 表3 6 不同接种量对u v 9 0 s 2 9 产1 0 h d a 的影响 f i g3 6t h ee f f e c to fp r o d u c i n g10 h d af o ru v 9 0 s 2 9b yd i f f e r e n ta m o u n to f s e e d 由表3 6 可知，接种量的变化对1 0 h d a 的产量并没有很大的影响，综合考虑种 子液延滞期、底物消耗速度、溶氧、次级代谢产物抑制等因素，本实验拟采用1 0 的接种量作为后期中试的最佳接种量。 ( 2 ) 种龄对1 0 一h d a 产量的影响 不同种龄的u v 9 0 s 2 9 发酵培养后，1 0 h d a 的情况如图3 2 2 所示。 o 吕 - t 、 删 攫 t 芒 q = 2 4 0 3 5 5 0 种龄( h ) 图3 2 2 不同种龄对1 0 - h d a 产量的影响 f i 9 3 2 2t h ee f f e c to fp r o d u c i n g10 - h d ab yd i f f e r e n ta g eo f s e e d 由图3 2 2 可知，种龄为3 0 h 的时候1 0 h d a 的产量最高，可达3 7 7 3 6 2 1 x g m l ，此 时的菌体处于对数生长期中期，代谢旺盛，处于快速合成阶段，发酵液中的菌丝 球小而均匀，有助于产量的提高，6 - 2 4 h 的种子液处于延滞期和对数生长期前期， 菌体生长不好，不利于产量的提高。 ( 3 ) 培养基初始p h 对10 - h d a 产量的影响 不同初始p h 条件下的1 0 h d a 产量的情况如图3 2 3 所示。 # 3 十* 变株u v 9 0 s2 9 初步镕i & 摇瓶发酵条件日f 究 口h 值 圈32 3 不i j p h 值对1 0h d a i “蛙的影响 f i 9 32 3 t h ee f f e c to f p r o d u c i n g i 0 一h d ab yd i f f e r e n tp h 由图32 3u r 知当初试d h 为60 时1 0 一h d a 郇j 产最最高，达到3 28 7 3 6 n g m l ，山此 可见微酸性的环境有利j 。1 0 一h d a 的台成，过低的p h 值和过商的p l ，均埘u v 9 0 s - 2 9 的菌体1k 有抑制作片j 。 ( 4 ) 小ir 4 培养温度与叫f i 】j 对1 0 - h d a 产量的影响 2 5 、3 0 c 、3 5 、4 0 、4 5 培养下，不同时f 叫的1 0 - l i d a 的产量如罔32 4 所示： 3 5 3 0 一 罩2 5 三2 0 埘 兰1 5 目 ：1 0 h_ 。 0 + 2 5 + 3 0 3 5 一4 5 01 22 43 6们6 07 2剐 9 6 养时间( h ) 削32 4 不删培养温度j 叫州埘1 0 h d a 产昔的影响 f i 9 32 4 t h ee f f e c to f p r o d u c i n g l o - h d ab yd i f f e r e n t t e m p e r a t u r ea n d t i m e 5 2 (1三捌to干。一 山东轻工业学院硕士学位论文 由图3 2 4 可以很清楚的看出当培养温度为3 0 的时候，产1 0 h d a 的水平最 高，其他温度均不利于1 0 一h d a 的产生，随着培养温度的提高，菌体量和1 0 一h d a 的产量均下降。另外从图中我们还可以看出当培养时间在1 2 h 以内的时候，并不 产生1 0 h a d ，此时的菌体处于延滞期，菌体并未大量生长，1 2 h 以后，1 0 一h d a 开始合成，初始产量较低。培养7 2 h 的时候1 0 h d a 的产量达到最大值，以后产 量开始下降，分析原因可能是因为随着培养时间的延长，发酵培养基中的碳源消 耗殆尽，而1 0 h d a 作为一种中链不饱和脂肪酸是可以继续被作为碳源消耗的。 同时也可能是因为产物在细胞内积累从而产生阻扼效应影响了产1 0 一h d a 酶系的 生物活性。 3 5 本章小结 ( 1 ) 通过对突变株u v 9 0 s 2 9 进行菌落形态、菌丝状态观察，初步鉴定该菌株为 半知菌f - j ( f u n g ii m p e r f e c t i ) 丛梗孢目( m o n i l i a l e s ) ，丛梗孢科( m o n i l i a c e a e ) ， 曲霉族( a s p e r g i l l a s e ) ，曲霉属( a s p e r g i l l u sm i c h e xf r ) ，黄米曲霉组 ( a f l a v u s o r y z a e ) 的疏展曲霉( 彳e