（生理学专业论文）重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响.pdf

重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层 神经元钠通道的影响 专业：生理学 硕士生：王芳 导师：项辉副教授 摘要 海葵神经毒素( s e aa n e m o n en e u r o t o x i n ) 是由4 6 4 9 个氨基酸残基组成的 多肽，具有三个分子内二硫键。研究表明，它们能特异的结合兴奋性细胞的钠通 道受体位点3 ，阻断或减缓钠通道的失活，延长细胞的动作电位时程。而且对不同 组织的钠通道以及不同钠通道亚型作用有差异。许多海葵神经毒素能与心脏，神 经和骨骼肌的钠离子通道特异性地结合，因而它们能作为研究钠通道的工具药来 使用。值得注意的是，许多抗癫痫的药物( a n t i e p i l e p t i e d r u g s ，a e d s ) 是钠通道的阻 断剂，有的药物是作用于钠通道失活过程从而达到治疗的效果。鉴于海葵神经毒 素的药用价值和开发前景，本论文初步探讨了重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层 神经元钠通道的作用机制。 三种重组海葵神经毒素，即h k 2 a 、h k 7 a 和h k l 6 a ，具有4 7 个氨基酸残基， 来源于侧花海葵( a n t h o p l e u r i ns p ) 。利用生物信息学分析软件对三种新的海葵 神经毒素的氨基酸序列进行分析，发现与前人报道的海葵神经毒素a p c 和a f i 的同源性高，达9 5 。另外，三种海葵神经毒素之间也是高度同源的，只在三 个氨基酸位点存在突变，它们是1 4 、2 2 和2 5 位氨基酸。 本论文利用脑片膜片钳的方法研究了三种重组海葵神经毒素，即h k 2 a 、 h k 7 a 和h k l 6 a ，对s d 大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响。研究发现，三种重组 海葵神经毒素都能抑制大鼠大脑皮层神经元钠电流，而不改变钠通道最大激活电 位。就它们与钠通道的结合速度而言，h k 7 撮快，h k 2 a 较慢，h k l 6 撮慢。就 抑制程度而言，h k 7 a 最强，h k l 6 a 和h k 2 a 其次。 另一方面，h k 7 a 既能增加钠通道的延迟时间，又能降低钠通道的最大激活 电流峰值和延迟斜率；而h k 2 a 和h k l 6 a 不改变钠通道的延迟时间，对钠通道最 大激活电流峰值和延迟斜率有影响。 以上结果表明，h k 7 a 延迟钠通道失活的过程，是大鼠大脑皮层神经元钠通 道失活态阻滞剂。h k 2 a 和h k l 6 a 不影响钠通道失活，可能作用于钠通道激活过 程，是大鼠大脑皮层神经元钠通道的阻滞剂。鉴于它们对钠通道的不同作用机制， h k 2 a 和h k l 6 a 可能是潜在的抗癫痫药物。而h k 7 a 则可以作为研究钠通道失活的 工具药来开发。 总之，研究重组海葵神经毒素对钠通道的作用机制，对于阐明它们和钠离子 通道相互作用机制有重大的意义，同时也为开发钠通道工具药和抗癫痫药物提供 坚实的理论基础。 关键词：重组海葵神经毒素大脑皮层神经元钠通道脑片膜片钳 t h ee f f e c to fr e c o m b i n a n tn e u r o t c i x i n sf r o mt h es e a a n e m o n e a n t h o p l e u r as p o ns o d i u mc h a n n e li nr a t c e r e b r a lc o r t i c a ln e u r o n s m a j o r ：p h y s i o l o g y n a m e ：f a n gw a n g s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rh u ix i a n g a b s t r a c t s e aa n e m o n en e u r o t o x i n sa r eag r o u po f p o l y p e p t i d et o x i n sc o n s i s t i n go f 4 6 4 9 a m i n oa c i d sa n dt h r e ei n t r a m o l e c u l a rd i s u l f i d eb r i d g e s n e u r o t o x i nr e c e p t o rs i t e3o f s o d i u mc h a n n e l si so c c u p i e db yt h ep o l y p e p t i d et o x i n s t h et o x i n ss l o wo rb l o c k s o d i u mc h a n n e li n a c t i v a t i o na n dp r o l o n gt h ea c t i o np o t e n t i a ld u r a t i o no ne x c i t a t o r y c e l l s m o s ts e aa n e m o n en e u r o t o x i n sa r ek n o w nt os e l e c t i v e l yb i n dt os o d i u mc h a p e l i nn e u r o n a lc e l l s ，c a r d i a cm y o c y t e sa n ds k e l e t a lm u s c l e s t h e yh a v ed i f f e r e n t a f f i n i t i e st os o d i u mc h a n n e l si nd i f f e r e n tc h a n n e ls u b t y p e s t h et o x i n sw e r em a i n l y u s e da st o o l st or e s e a r c ht h es t r u c t u r ea n df u n e t i o no fi o nc h a n n e l s i ti sn o t a b l et h a t m a n ya n t i e p i l e p t i cd r u g s ( a e d s ) a r es o d i u mb l o c k e r s i nr e g a r d st ot h em e d i c i n a l p e r s p e c t i v eo fs e aa n e m o n en e u r o t o x i n s ，t h em e c h a n i s mo fr e c o m b i n a n ts e aa n e m o n e n e u r o t o x i n so ns o d i u mc h a n n e li nr a tc e r e b r a lc o r t i c a ln e u r o n si sp r i m a r i l ys t u d i e di n t h i sp u p e r - t h et h r e er e c o m b i n a n ts e aa n e m o n en e a r o t o x i n sf r o ma n t h o p l e u r as p ，n a m e d h k 2 a , h k 7 aa n dh k i6 a , a l ec o m p o s e do f4 7a m i n oa c i dr e s i d u e s b i o i n f o r m a t i c a n a l y s i so nt h ep o l y p e p t i d es e q u e n c e sr e v e a l e dt h a tt h e ys h a r eu pt o9 5 i d e n t i c a l r e s i d u e sw i t ht h ep r e v i o u s l yr e p o r t e dt o x i n sa p ca n da fi ，w h i l ev a r i a t i o n sb e t w e e n t h et h r e es e q u e n c e se x i s to n l yo nt h e1 4 山2 2 删a n d2 5 t l ir e s i d u e s i i i b r a i n - s l i c ep a t c h - c l a m pt e c h n i q u ew a s a p p l i e dt os t u d yt h em e c h a n i s mo f t h e s e r e c o m b i n a n tn e u r o t o x i n so ns o d i n mc h a n n e l si nt h er a tc e r e b r a lc o r t i c a ln e u r o m r e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h et h r e er e c o m b i n a n tt o x i n si n h i b i t e dt h ev o l t a g e d e p e n d e n t s o d i u mc u r r e n t si nr a tc e r e b r a lc o r t i c a ln e u r o m t h es p e e do fb i n d i n gt os o d i u m c h a n n e lf r o mq u i c kt os l o ww a sh k 7 a h k 2 aa n dh k l 6 a t h ee f f e c tl i o ms t r o n gt o w e a kw a sh k 7 a ，h k l6 aa n dh k 2 a a m o n gt h e s et o x i n s ，h k 7 ap r o l o n g e dt h ed e c a y t i m eo fs o d i u mc h a n n e li n a c t i v a t i o n , r e d u c e dt h es o d i u mc u r r e n tp e a i 【a n dd e c r e a s e d t h ed e c a ys l o p eo fs o d i u mc h a n n e li n a c t i v a t i o n h o w e v e r , h k 2 aa n dh k l 6 ad i d n t c h a n g et h ed e c a yt i m e so fs o d i u mc h a n n e li n a c t i v a t i o n ，a n dh a de f f e c to ns o d i u m c h a n n e lc u r r e n ta n dd e c a ys l o p e t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a th k 2 a , h k t aa n dh k l 6 ah a v et h ei n h i b i t i n ge f f e c t o ns o d i u mc h a n n e li nr a tc e r e b r a lc o r t i c a ln e u r o n s , a m o n gw h i c hh k 7 ah a st h e s t r o n g e s te f f e c t ，h k 2 ah a st h ew e a k e s te f f e c t h k 7 ai n h i b i t ss o d i u mc h a n n e lt h r o u g h p r o l o n g i n gs o d i u mc h a n n e li n a c t i v a t i o n , s oi t i sas o d i u mc h a n n e li n a c t i v a t i o nb l o c k e r ； h k 2 aa n dh k l6 am a yb eh a v et h ee f f e c to nb i n d i n gt or e c e p t o rs i t ew h i c ha c to n s o d i u ma c t i v a t i o n , t h e ya l es o d i u mc h a n n e lb l o c k e r s a c c o r d i n gt ot h e i rm e c h a n i s m o fs o d i u mc h a n n e l , h k 2 aa n dh k l 6 am a yh ep o t e n t i a la n t i e p i l e p t i cd r u g s ( a e d s ) b l o c k i n gs o d i u mc h a n n e l ；a n dh k 7 as h o u l db ec o n s i d e r e dam o d e lf o rt h ed e s i g no f n e wa n ds p e c i f i cp h a r m a c o l o g i c a lt o o ld r u gs t u d y i n gs o d i u mi n a c t i v a t i o n i ns u m m a r y , t h er e c o m b m a n tp r o d u c t i o no ft h e s et o x i n si n p h y s i o l o g i c a l s t u d i e sm a yp l a yas i g n i f i c a n tr o l et or e v e a lt h es t r u c t u r e - f u n c t i o nr e l a t i o n s h i p sw i t h i n t h ep r o t e i n st h e m s e l v e sa sw e l la st h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h et o x i n sa n dt h es o d i u m c h a n n e l s a n di tw i l lp r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s eo nd e v e l o pt h et o o l so fs o d i u ma n d h o v e la e d s k e yw o r d s ：r e c o m b m a n ts e aa n e m o n e ，c e r e b r a lc o r t i c a ln e u r o n , s o d i u mc h m m e l ， b r a i n - s l i c ep a t c hc l a m p 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响王芳 导言 海葵( s e aa n e m o n e ) 是最原始的海洋动物，属于腔肠动物门( c d p k ”印r 口向) 珊瑚动物纲( a n t h o z o a ) 。在海葵中间的口周围的触手是它捕食和防御的重要武 器。在受到外界物理的或化学的刺激时，触手上特异的刺细胞能释放各种生物活 性成分，这些活性物质主要是肽类毒素，对人和动物具有多种生理活性( 裴祖 南1 9 9 8 ；n o r t o n , 1 9 9 1 ) 。现在已经从不同海葵物种中分离出多种毒素，研究者将 来源不同的海葵毒素分为两种类型：神经毒素和溶胞素。海葵神经毒素的分子量 范围为3 5 k d 。多数毒素能特异的结合钠通道的受体位点3 ，即区s 3 s 4 的胞外环 和i ，区s 5 s 6 胞内环( 未鉴定) ，阻断或延迟快钠通道的失活，延长细胞的动 作电位时程( c o u r a u l de ta l ，1 9 7 8 ；r o g e r se ta l ，1 9 9 6 ) 。 海葵神经毒素的应用价值很大，它不仅可以作为研究离子通道的工具药， 而且，因其能增强心肌收缩作用又对心率和血压没有影响，成为研究新的抗心衰 药物的热点。值得注意的是，若干类型的癫痫，包括具有热性癫痫发作的全身性 癫痫( g e f s + ) ( w a l l a c e e ta l ，1 9 9 8 ；e s c a y ge ta l ，2 0 0 0 ) 是由于钠离子通道突变引起 的。并且，许多抗癫痫的药物( a n t i e p i l e p t i cd r u g s ，a e d s ) 是钠通道的阻断剂，有的 药物是作用于钠通道失活过程从而达到治疗的效果。因此，海葵神经毒素可能是 一种潜在的抗癫痫药物。 人们已经从中国南海的a n t h o p l e u r i ns p 海葵分离出来了四种新基因克隆的 重组海葵神经毒素n k 2 a 、h k 7 a 、h k 8 a f f t l h k l 6 a ( w a n ge ta l ，2 0 0 4 a ) 。分离的s d 大 鼠离体心房的收缩实验已经研究了它们在心肌方面的作用机制，证明了h k 7 a 使 心肌收缩时间最长，h k z a 使其心肌收缩程度最强( 王磊，2 0 0 4 b ) 。另外，在分 离的s d 乳鼠急性分离的神经元上，已经研究了它们对海马神经元钠通道的影响， 结果表明h k 7 a 对钠通道开放时间和概率的作用最明显( 王磊，2 0 0 4 b ) 。为了进 一步弄清同种海葵的同源毒素的生物学意义，阐明四种重组海葵神经毒素在神经 系统中的生理功能，为研究钠通道的工具药和抗癫痫新药开发提供理论依据，本 实验根据前人的报道，选取了作用较强的三种重组海葵神经毒素h k 7 a 、h k 2 棚 h k l 6 a ，用脑片膜片钳的方法记录它们对大鼠大脑皮层神经元钠电流的影响。 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响j 三芳 第1 章综述 鉴于海葵神经毒索对钠通道的作用以及它作为抗癫痫药物的潜力，本章分 三个方面对相关领域进行简要的论述：钠通道失活机制的研究进展：海葵神经毒 素和钠通道的作用的研究进展；阻断钠通道的抗癫痫药物研究进展。 1 1钠通道失活机制的研究进展 电压依赖型钠离子通道的快速失活对兴奋性细胞的正常电生理活性有重要 作用。失活有许多不同类型，包括快失活、慢失活和超失活，这些失活由细胞因 子或辅基所调控。快失活的机制是失活颗粒堵塞孔道的铰链盖模型，而慢失活很 大程度上是由通道孔道的重排引起的( g o l d i n ，2 0 0 3 ) 。任何失活过程的微细缺失 都能导致人类疾病，如：肌肉周期性麻痹，心室纤维性颤动和心脏q t 综合症( 延 迟心脏复极化) ，以及发生在中枢神经系统( c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m , c n s ) 中的 癫痫。 1 1 1 电压依赖型钠通道的结构及性质 1 1 1 1 钠通道的结构及性质 电压依赖型钠通道产生动作电位去极化相，在调节动物细胞的电兴奋性中起 决定性的作用。这个离子通道由一个分子量大约2 6 0 k 道尔顿的d 亚基组成，同时 连接了一个或多个辅基( f l l 、1 3 2 、1 3 3 ) f c a t t e r a l ，2 0 0 0 ) 。d 亚基由四个同源区i 一组成，每个同源区含有6 个跨膜片断s 1 - - $ 6 ，在s 5 和s 6 之间有一个发夹样的 p 环组成了通道孔道的一部分( 图1 1 ) 。p 2 亚基通过二硫键与q 亚基连接，p l 和b 3 亚基是非共价连接的，并且是互补表达的，因此，a 亚基连接b 1 或p 3 亚基。 进一步的工作提供钠通道的二维立体分子图谱( 图1 1 ) ，显示了结构特点决 定钠通道的特殊功能( c a t t e r a l ，2 0 0 1 ) 。在i 区中，四个带正电的s 4 跨膜片段 都作为电压感受器。四个区的s 5 s 6 片段和它们之间的s s l s s 2 片段( 即p 环) 一 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响：e 芳 起构成了钠离子电导的孔壁。s 6 疏水跨膜片段形成了孔道宽广的内的衬里，前面 的s s l s s 2 ( 即p 环) 形成狭窄的，孔道的离子选择性外的村里。连接i i i 一区短 的胞内环通过折叠阻塞内部孔口，在一两微秒内，使钠通道失活。 图i l 电压依赖型钠通道的a 亚基二维立体分子图谱 说明亚基有四个同源区( i i v ) 组成，每个区有6 个跨膜片段。圆柱形代 表幔螺旋跨膜片段；红色表示电压感受器s 4 跨膜片段：绿色表示孔壁s 5 一s 6 跨膜片 段和s s l s s 2 ( 即p 环) ：白色圆圈表示对离子电导和选择性有重要作用的氨基酸 位点；、【，表示n 端连接糖基化位点；内有h 的黄色圆圈表示失活闸门疏水域i f m t ( 亮氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸) ，它能折叠阻塞离子电导孔道。( 引自： c a t t e r a l ，2 0 0 1 ) 1 1 2 电压依赖型钠通道的失活机制 电压依赖型钠离子通道的快速失活对兴奋性细胞的正常电生理活性有重要 作用。失活有许多不同类型，包括快失活、慢失活和超失活，这些失活由细胞因 子或辅基所调控。快失活的机制是失活颗粒堵塞孔道的球链模型，而慢失活很大 程度上是由通道孑l 道的重排引起的( g o l d i n ，2 0 0 3 ) 。 重纰海葵神经毒素对火鼠大脑皮层神经，亡钠通道的影响王芳 1 1 2 l 快失活 电压依赖型钠通道的快失活由“球链”或“绞合盖”机制产生，其机制是失活颗 粒连接停靠位点的胞质区域堵塞孔道。失活颗粒是i i i 和i v 区域胞质连接段的一部 分，它具有一个重要的区域，由四个氨基酸残基组成：异亮氨酸、苯丙氨酸、甲 硫氨酸和苏氨酸，即i f m t 。停靠位点由多个残基组成，包括：i 和区中连接4 、 5 片断的胞质连接段，区中6 片断的胞质末端。 许多最新的研究通过合成分离的多肽然后确定它们的晶体结构来研究这些 区域的性质。r o h l 等( 1 9 9 9 ) 首次描述失活颗粒的结构基于组成i 一结构域的连 接段的一个5 3 氨基酸肽。他们得出结论：i f m t 残基是门闩的重要组成部分，具 有疏水和亲水的双重性质，异亮氨酸和苏氨酸直接连接停靠位点。三项研究用突 变的短肽进一步证明了这些结果。用1 7 或3 6 残基多肽的研究表明：t 积极地参与 了失活过程。因为谷氨酰氨( q ) 代替f 使异亮氨酸和t 分离，阻碍了它们之间形成 疏水键。在1 7 残基多肽中，用甲硫氨酸( m ) 代替t 能够阻止这个残基质子受体的 作用以及它与其他氨酸形成疏水键，然而，用q 替代i 不会影响键的形成。i 和t 之间的距离与离子通道失活的能力相关。 关于停靠位点，m i y a m o t o 等( 2 0 0 1 ) 研究t i i i 和域中s 4 一s 5 连接段的结构。 他们的数据证实了半胱氨酸突变实验表明的域s 4 s 5 是一个螺旋的结果。他们 提出电压感受器( s 4 ) 的外向运动暴露t s 4 s 5 之间的疏水簇连接失活颗粒，之后， 位于1 4 8 9 的f ( f 1 4 8 9 ) 与区s 4 一s 5 之间1 3 2 9 位点的甘氨酸( a 1 3 2 9 ) 和区s 4 s 5 1 6 6 2 位点的天冬氨酸相互作用( 图1 2 ) 。这个假说与s i r o t a 等( 2 0 0 2 ) 的模型一 致，他们提出一个发夹结构先于i 刚t 和它的停靠位点作用，这个运动发生在已 经确认的由甘氨酸( g ) 和脯氨酸( p ) 组成的链周围。 a lwi 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响于芳 图1 2 钠通道失活的机制 a 钠通道失活的球链机制。钠通道中连接i 区的胞内环形成球。在通道 失活过程中，钠通道的孔道胞内口被关键残基苯丙氨酸一1 4 8 9 ( f 1 4 8 9 ) 所占据。 b 用多维n m r ( r o h le ta 1 ，1 9 9 9 ) 确定的失活i y q l o 关键片段( i f m t ) 的三维结构。 ( 引自：c a t t c r a l ，2 0 0 0 ) 1 1 2 2 慢失活 慢失活是独立的过程，不包括i 区连接片段。一种解释慢失活的假说认 为它由孔道的结构重排引起的，与钾通道c 型失活机制相似( l i ue ta l ，1 9 9 6 ) 。 然而，有关这个假说的数据相互冲突。o n g 等( 2 0 0 0 ) 证明了长时间去极化导致的 慢失活降低了孔道m 区中与孔道重排有关的半胱氨酸残基的结合力。相反， s t r u y k 和c a n n o n ( 2 0 0 2 ) 观察慢失活后到区的半胱氨酸的修饰率没有改变， 表明慢失活前后半胱氨酸具有相同修饰率。这些结果表明在慢失活的过程中，孔 道口没有关闭。 在慢失活过程中，孔道可能发生了位点的构想改变，但是这个过程中通道允 许其他区域也参与了，包括i v s 4 、i i s 5 s 6 和i i s 6 ( 图l - 1 ) 。在n a y l 4 靠近i v s 4 半胱氨酸( r 1 4 5 4 c ) 的修饰增强了慢失活。n a v l 4 通道慢失活的概率大于n a v l 5 的，这是因为它们在i i s 5 s 6 上有一个不同的氨基酸，n a v l 4 是v 7 5 4 , n a v l 5 是 1 7 5 4 。i is 6 上的一个残基突变能改变n a v l 4 的慢失活，例如，用v 7 8 7 代替赖 氨酸( k ) 增强这个过程，而用v 7 8 7 代替半胱氨酸减弱这个过程。慢失活可能 涉及了孔道的重排，但是其阻止阳离子流的实际机制仍不清楚。 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响王芳 钠通道失活不限于两个动力过程。当n a v l 4 通道中1 5 2 9 位点的甘氨酸 ( a 1 5 2 9 ) 被区p 环所替代时，人们观察到甚至更慢的过程，称为超一慢失活。 虽然超一慢失活也不同于快失活，但是转入超一慢失活状态被快失活颗粒所抑 制，这可能因为外部孔腔的构想调节，从而证明了不同失活事件之间相互作用。 1 1 2 3 羧基末端的调节 虽然快失活被i i i 连接段失活颗粒所调节，但是包翥d i n a v l 5 的许多研究表 明，快失活能被离子通道羧基末端调节。n a v l 5 的快失活与n a v l 4 快失活的相比 前者较慢，在动力学上的不同归因于羧基末端区域前1 0 0 个氨基酸的不同 ( m a n t e g a z z ae ta l ，2 0 0 1 ) 。相似的，n a v l 5 失活慢于n a v l 2 也是因为羧基末端区 域的不同。这些结果与在n a v l 5 的羧基末端突变引起的o t 延长综合症破坏了快 失活的事实一致。c o r m i e r 等( 2 0 0 2 ) 用理论模型和循环二色性测量确认在n a v l 5 近端一半处羧基末端的6 个0 t 螺旋片段。远端一半处在羧基末端的缺失不影响 n a v l 5 的失活或激活，但是在近端一半处第六螺旋片段前端缺失能引起持续电流 的明显增加。他们提出包括羧基末端的第六螺旋的静电作用能调节快失活颗粒与 它的停靠位点的相互作用( c o r m i e re ta l ，2 0 0 2 ) 。 1 1 2 4b 亚基的调节 与b 亚基相互作用也能调节快失活，它的影响和机制成为那些依赖特异的 和b 亚基相互作用的基础。例如，胞内或胞外的b l 锚定到细胞膜上是加快n a v l 5 从失活状态到恢复状态所必须的( z i m m e ra n db e n n d o r f , 2 0 0 0 ) 。而胞外b l 是加快 n a v l 2 失活所必须的。最近确认的艮亚基影响并联的伐亚基。它的作用很像仁1 ， 因为它增加了非洲蟾蜍卵母细胞中的n a v l 2 、n a v l 4 和n a v l _ 3 的快变模态门控的 百分率。但是，它又很特殊，因为它增加了来源于人胚肾细胞的t s a - 2 0 1 细胞 n a v l 2 通道的持续电流。无论是艮还是p l 都加快了中国仓鼠卵巢细胞n a v l 3 通道 的失活，虽然两个亚基使电压依赖的失活向负方向转换，并减慢了从失活到恢复 状态的速率。在卵母细胞中，凡亚基也加快心肌离子通道n a v l 5 从失活到恢复状 态的速率。这个性质可能有重要的生理意义，因为b 3 是表达在心室肌和心脏的普 肯野纤维上的。总的说来，所有的结果证明b 亚基调节钠离子通道的功能是依赖 6 重组海葵神经毒索对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响王芳 于a 亚基异构重整产物和b 亚基表达的细胞类型。 确定b 亚基的作用生理学上最相关方法是通过构建基因敲除小鼠，c h e n 等 ( 2 0 0 2 ) 已经构建完成了针对髓亚基的小鼠。艮敲除小鼠的钠离子通道密度降低导 致动作电位产生的阈值增加。敲除小鼠更易癫痫发作，虽然它们在神经上的没有 任何异常。这些结果支持一种假说，b 2 亚基的存在对神经细胞膜上钠离子通道的 表达有重要的意义。 1 1 3 钠通道的异常失活 钠离子通道的突变引起人类骨骼肌、心肌和c n s 疾病，大多数的突变改变 离子通道失活的某些方面。n a v l 4 的突变引起周期性麻痹、先天性肌强直和钾 恶化的肌强直( c a n n o n ，2 0 0 0 ) ，所有的这些疾病主要是延迟肌肉放松。n a v i 5 的突变引起3 型q t 延迟，造成室性心动过速( 扭转型室性心动过速) 和b r u g a d a 综合症( b a l s e re ta l ，2 0 0 2 ) 。c n s 钠离子通道突变引起若干类型的癫痫，包括具有 热性癫痫发作的全身性癫痫( g e f s + ) ( w a l l a c ee ta l ，1 9 9 8 ；e s c a y ge ta l 2 0 0 0 ) 。 人们已经提出由突变产生的o t 延迟综合症促使钠离子通道功能的增强，而 b r u g a d a 综合症突变降低钠离子通道的功r j t ( b a l s e r , 2 0 0 2 ) 。这个假说虽然总体上正 确，但是它不能解释所有的心肌钠离子通道突变的影响。例如，无论钠离子通道 失活的延长或缩短都能引起原发性心室肌纤维性颤动。失去稳定性的失活由在i 区s 1 s 2 ( r 1 2 3 2 w ) 和i v n s 3 s 4 ( t 1 6 2 0 m ) 位点突变产生，反之，加速的失活由 在i 和i i 区之间的连接段( l s 6 7 q ) 突变产生( 图1 3 ) 。另外，改变单个的残基能 起相反的效应。用组氨酸替代羧基末端y 1 9 7 5 力i 速失活，而用c 替代y 1 9 7 5 减慢 失活。相同的突变甚至引起相反的效应，在1 7 9 5 位点后插入d 即扰乱快失活增强 钠离子通道的功能，又增加慢失活降低其功能。 在c n s 中，已经确认编码b l 亚基的s c n l b 基因的一个位点突变引起 g e f s + 1 ( w a l l a c e e ta l ，1 9 9 8 ；e s c a y ge ta l ，2 0 0 0 ) ，编码n a v l 1 的n 亚基的s c n l a 基因 l o 个位点突变引起g e f s + 2 。婴儿严重肌阵挛型癫痫，最严重的形式是g e f s + ， 它是由于s c n l a 的一个等位基因功能性缺失产生，已经确认编码n a v l 2 的a 亚基 的s c n 2 a 基因的多突变能引起g e f s + 。 p l 亚基突变引起g e f s + ，其突变位点是在胞外免疫球蛋白结构域的c 1 2 1 w 。 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响乇芳 m e a d o w s 等( 2 0 0 2 ) 研究n a v l 2 和n a v l 3 通道b 1 亚基突变的影响，结果表明在超极 化电位下增加通道利用率，在高频活动下降低通道的利用率，并且，突变导致介 导蛋白和蛋白相互作用的能力丧失使通道的稳定性受到影响。这些影响与兴奋过 度的临床表征一致。 分析n a v l 3 - - 个位点突变的影响发现每个突变各有不同的结果( 图1 3 ) 。在 卵母细胞中，i i 区s 4 的t 8 7 5 m 残基突变增强大鼠n a v l 1 ( s p a m p a n a t oe t a l ，2 0 0 1 ) 和n a v l 4 ( a l e k o v e ta l ，2 0 0 1 ) 的慢失活；在i i i 区连接子的w 1 2 0 4 r 残基突变 使大鼠n a v l 1 通道的电压依赖性激活和失活向负方向转换( a l e k o v e ta l ，2 0 0 0 ) ； 在区s 4 的r 1 6 4 8 h 残基突变剧烈的加快大鼠n a v l 1 和n a v l 4 通道从失活到恢复 状态( l o s s i ne ta l ，2 0 0 2 ) 。r 1 6 4 8 h 突变同样引起t s a - 2 0 1 细胞n a v l 1 的持续电 流，而t 8 7 5 m 和w 1 2 0 4 r 突变引起持续电流轻微的增加。这些结果表明在钠离子 通道不同功能的改变能引起相似发作表型。提高钠离子通道的活性导致加快从失 活到恢复状态速度，或者产生一个更大的持续电流引起癫痫发作，这大概能产生 过度兴奋。这种现象与在表达n a v l 2 通道的转基因小鼠中，观察到边缘癫痫发作 或行为异常的小鼠伴随增大的持续电流相一致。由慢失活增强引起的钠离子通道 活性降低也能引起癫痫，这也许很令人吃惊，然而，这一结果与骨骼肌n a v l 4 通道突变的影响一致，它的突变增强慢或快失活引起周期性麻痹，事实上，大部 分突变引起的婴儿严重肌阵挛型癫痫表明了一个s c n l a 等位基因功能的缺失。 总的说来，这些结果证实了在c n s 中钠离子通道活动的平衡改变能够导致癫痫。 1 1 4 小结 失活是钠通道的基本性质，是十分重要的，因为无论是快失活还是慢失活的 微细缺失都对组织的生理功能产生重大的影响。因此，了解失活的潜在柑t c 目j 有重 要的临床意义。快失活的绞合模型得到有利数据的支持，并且未来的研究可能更 清楚的定义在这个过程中特殊分子的相互作用。另一方面，慢失活的潜在机制、 羧基末端和p 亚基的调控机制还不清楚。因为许多局部麻醉药、抗心率失常药和 抗惊厥药都能调节钠通道失活，所以更好的了解这些过程将可能鉴定或设计一些 药物来特异和有效治疗钠通道异常引起的紊乱。 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响王芳 图1 3 钠离子通道c c 和b 亚基示意图 在n a ，1 2 中，胞质连接段。绿色长方形表示快失活的重要氨基酸片断，i f m t 片 断，停靠位点：a 1 3 2 9 和n 1 6 6 2 。在n a v l 4 ，深蓝色菱形代表中影响慢失活的突 变位点( v 7 5 4 i ，v 7 8 7 k c ，r 1 4 5 4 c 和a 1 5 2 9 d ) 。浅蓝色三角形表示使引起g e f s + 的 突变位点g e f s t ( 在n a v l 1 a 亚基中，c 1 2 1 w i n t h e i n t h eb ls u b u n i ta n d t 8 7 5 m w 1 2 0 4 ra n dr 1 6 4 8 h ) 。( 引自：g o l d i n ，2 0 0 3 ) 9 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响王芳 1 2 海葵神经毒素和钠通道相互作用的研究进展 1 2 1 神经毒素与钠通道作用机制 电压依赖型钠通道是许多神经毒素的分子靶点，这些神经毒素作用于6 个或 更多不同的通道蛋白受体位点上。这些毒素分为三种类型。疏水低分子团毒素和 较大的多肽毒素都能物理地堵塞孔道，阻止钠电导。生物碱类毒素和有关可溶性 脂质毒素通过连接膜内受体位点的变构机制改变钠通道的电压依赖性门控的性 质。相反，多肽毒素通过电压感受器连接胞外受体位点改变通道门控的性质的。 这些神经毒素对钠离子通道的作用机制可以分为三类：孔道堵塞，闸门的构象调 节，电压感受器的抑制( c e s t 6 1 ee ta l ，2 0 0 0 ) 。 1 2 1 1 孔道堵塞 t 1 x 和s t x 是孔道堵塞的经典例子，通过与钠通道的神经毒素受体位点1 相互作用起作用。它们作用于胞外孔道的早期具体模型得到毒素受体位点的分子 生物学分析的巨大支持。像图l _ 4 中列举的一样，形成孔道外部口的膜折返环的 氨基酸残基也是毒素受体位点的主要组成部分( n o d ae ta l ，1 9 8 9 ) 。这样，t 1 x 、 s t x 和p 一芋螺毒素是堵塞钠通道孔道胞外入口的直接作用的阻断剂。 1 2 1 2 构象调节 作用于钠通道的神经毒素受体位点2 和5 的脂溶性毒素是通道功能的构象调 节剂。它们结合的位点是不同于孔道或电压感受器的，而是通过间接构象的相互 作用促进钠通道的开放态。最初提出毒素作用的机制来源于脂溶性毒素诱导了钠 通道的持续激活( c a t t e r a l l ，1 9 8 0 ) 。这些研究表明这类毒素作为完全的或部分的 拮抗剂导致了钠通道的持续激活，它们的影响在数量上与构象模型相符合，这个 模型假设它们与激活态的钠通道高度亲和，因此，使构象平衡向激活态的方向转 变。其他支持这个作用机制的证据来源于这些毒素的多效性影响，有时候还改变 离子的通透性。如上面所回顾的，最近的工作表示这些毒素结合的受体位点是形 成钠通道的跨膜片段。c e s t f l e 等( 2 0 0 0 ) 提出，这些毒素即改变了同源区的跨 膜片段的相互作用又改变了靠近同源区的相互作用，从而导致了电压依赖的激活 1 0 重组海葵神经毒素对大鼠大脑皮层神经元钠通道的影响千芳 和其与失活偶联改变，甚至离子通透性的改变。 1 2 1 _ 3 电压感受器的抑制 钠通道的神经毒素受体位点3 被多种多肽毒素所占据：旺蝎毒、海葵毒素和 一些蜘蛛毒素。这些毒素减慢或阻断了钠通道的失活。a 蝎毒和海葵毒素通过与 大鼠脑钠通道e 1 6 1 3 和骨骼肌钠通道的d 1 4 2 8 的静电相互作用结合到s 3 一s 4 和i i v s 5 s 6 环( 未鉴定) 上( r o g e r s e ta l ，1 9 9 6 ) 。 有关钠通道的研究显示，蝎毒和海葵毒素( 多肽神经毒素) 已经提出了一个 新的电压感受器抑制机制，以解释毒素改变通道门控的现象( r o g e r se ta l ，1 9 9 6 ： c e s t e l ee ta l ，1 9 9 8 ) 。电压感受器是钠通道激活的原因，它与失活相偶联的部分是 跨膜片段，不易与亲水的多肽毒素结合。为了防止这个问题，这些毒素就结合到 钠通道s 4 片段的胞外末端的s 3 一s 4 环上，改变门控过程所必须的s 4 片段的跨膜 运动。这样，a 蝎毒和海葵毒素通过占据跨膜片段的内向位置特异地阻断失活， 而b 一蝎毒通过占据1 i 区s 4 片段地外向位置特异地增强钠通道的激活。来源于蜘 蛛的5 - a t r a c h o t o x i n s 好像是同样的作用方式。所有这些毒素直接改变电压感受器 的活动，因此，对通道的功能有十分特异的影响。很明显，来自于至少两种不同 门的动物，腔肠动物和节肢动物独立地进化的毒素都是通过这种机制作用于钠通 道的。 事实上，这种电压感受器抑制机制可能是所有多肽毒素作用于电压依赖性离 子通道门控的分子基础。例如，与钾通道s 3 s 4 环结合的一种狼蛛毒素，通过将 电压依赖的激活转到更正的膜电位上抑制通道的激活( s w a r t ze ta l ，1 9 9 7 ) ；与 钙通道区s 3 s 4 环结合的一种蜘蛛毒素也使激活转到更正的膜电位上( b o u r i n e t e ta l ，1 9 9 9 ) 。很有可能它们也是通过抑制电压感受器内部位置起作用的。因此 可以预计其他改变电压依赖性离子通道的多肽神经毒素也将发现它们与s 3 一s 4 环 相连，并通过电压感受器抑制机制起作用。 重组海葵神经毒素对犬鼠大脑皮层神经元钠通道的影响土芳 图l 一4 神经毒素作用位点( 引自：c e s t 6 1 ea n dc a t t e r a l l ，2 0 0 0 ) 1 2 2 海葵神经毒素电生理学的研究进展 海洋生腔肠动物海葵体内含有许多生物活性物质包括一些强效的毒素，对于 不同种海葵所含生物活性物质的研究也很多。迄今为止，己分离和定性了多种类 型的多肽和蛋白质。其中最早分离出的毒素为心脏和神经毒素，它们仍是现在关 注和研究的热点。许多海葵毒素能与心脏、神经和茸骼肌的离子通道特异性地结 合，因而成为研究离子通道的工具药。另外，还有抗病毒，细胞毒，溶血等多方面作用 ( 傅丽英，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 1a n e m o n es u l c a t a 毒素 研究较多的a n e m o n es u l c a t a 毒素( a t x ) 是从海葵a n e m o n i as u l c a t a 中分离 而获得的，在此类中又发现