（环境科学专业论文）东方拟无枝酸菌hccb10007发酵组分的研究.pdf

华东师范大学硕士学位论文 摘要 方法得到了万古霉素的糖营配基；对菌渣酵母培养基进行了5 l 发酵罐的放大实 验，万古霉素发酵单位高于对照。并且进行了菌渣酵母的循环替代实验，初步研 究了万古霉素菌渣循环利用的可行性。 关键词：东方拟无枝酸菌，万古霉素，结构鉴定，发酵条件，合成培养基 华东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t v a n c o m y c i n , ag l y c o p e p t i d ea n t i b i o t i c , h a sb e e nu s e da st h ef i r s t - l i n ed r u gf o r t r e a t i n gs e r i o u sm r s ai n f e c t i o n s , a n di t sr a s c a c hi sah o tt o p i ci nt h ew o r l d w i t ht h e a p p l i c a t i o na n dt h o m u g hs t u d yo fv a n c o m y c i n , t h ea n a l y s i so fe f f e c t i v ec o m p o n e n t s a n dr e l a t e dc o m p o u n d sa r ei n c r e a s i n gm o l ea n dm 0 a t t e n t i o n d o m e s t i cv a n c o m y c i n p r o d u c th a sb e e nc o m m e c i a l i z e da l r e a d y h o w e v e ri t sr e l a t e dc o m p o u n d sh a v en o t b e e ns t u d i e dy e lw i t hv a n c o m y c i n - r e s i s t a n tb a c t e r i ah a sb e e ni n c r e a s i n g p e o p l ea r c a f r n i dt h a tv a n c o m y c i nw i l ln o te f f e c t i v ep e r s i s t e n t l y u n d e rt h i sc i r c u m s t a n c e , i ti s n e o 愁a r yt oc a r r yr e s e a r c ha n dd e v e l o p m e n to nn o v e lg l y c o p e p t i d ea n t i b i o t i c sf o r t r e a t i n gs e r i o u si n f e c t i o n s t h i sp a p e ri s a t t e m p tt oe s t a b l i s hp u r i f i c a t i o n , a n a l y s i sa n di d e n t i f i c a t i o n m e t h o d so fd o m e s t i cv a n c o m y c i nr e l a t e dc o m p o u n d s a l s os t u d i e dt h ei n f l u e n c e so f d i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n st ot h e s ec o m p o n e n t si nt h em e t a b o h t e so fs t r a i n a m y c o l a t o p s i so r i e n t a l i sh c c b l 0 0 0 7 t og a i nf e r m e n t a t i o nm e d i a w h i c ht op r o d u c t d i f f e r e n tp r o d u c t i o n , a l s ot oo p t i m i z ea n du t i l i z et h ef e r m e n t a t i o nm e d i a , t ol a yt h e g r o u n d w o r kf o rf l n t h e gs t u d i e so fg l y c o p e p t i d ea n t i b i o t i c s t 缸em a i na c h i e v e m e n t s ： ( 1 ) r e l a t e dc o m p o u n d sw e r ed e e p l ys t u d i e d , as p e c i f i cm a c r o p o r o u sa d s o r p t i v e r e s i nw a ss c r e e n e df o ri s o l a t i o np r o c e s s c o m b i n e dw i t ho t h e rm e t h o d sl i k e m e d i u m - w e 鹤o l el cm e t h o da n dh p l cp r e p a r a t i o nm e t h o d ，s e v e nc o m p o u n d sw e r e o b t a i n e df r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t ha n dc r u d ep r o d u c t f i v eo ft h e mw e r ei d e n t i f i e d , t h r o u g hm sa n dc h e m i c a la n a l y s i s ，a s ；d e m e t h y l v a n c o m y c i nb ，d e s a m i d o v a n c o m y c i n b 1a n d1 3 2 ，d e s v a n c o s a m i n y l v a n c o m y c i nb ，a g l u c o v a n c o m y c i nb a l lo ft h e ma l e a n a l o g u e so fv a n c o m y c i n a m o n gt h e m ，d e s a m i d o v a n c o m y c i nb 1a n db 2a r eap a i ro f i s o m e 陪，w h i c hr e m a i n sac e r t a i nr a t i oi ns o l v e n t , t h eo t h e rt w oc o m p o u n d sh a d m o l e c u l a rw i e ：g h ta t1 3 1 8 da n d1 4 5 9 d s t u d i e st h ep h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e s o ft h e s ec o m p o u n d s ，t h ea c t i v i t yo fa g l u c o v a n c o m y c i nbi nv i t r oi sh i g h e rt h a n v a n c o m y c i nb ( 2 ) t h ec h a n g e so fm e t a b o l i t e si nd i f f e r e n tf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s , e s p e c i a l l y t h en i t r o g e ns o u r c e s ，o fa m y c o l a t o p s i so r i e n t a l i sh c c b l 0 0 0 7w e r ee x a m e d t h r e e f e r m e n t a t i o nm e d i aw e r ef o u n dw i t hs i g n i f i c a n tc h a n g e so ny i e l da n dr a t eo f v a n c o m y c i na n do t h e rc o m p o n e n t s ：as y n t h e t i cm e d i aw i t hv a n c o m y c i np e r c e n t a g e 华东师范大学硕士学位论文 a b o v e7 0 w h i l eo t h e rc o m p o n e n t sg r e a t l yd r e a s e d ；av a n c o m y c i nh i g hp r o d u c i n g y e a s tm e d i a ；a n dam e d i at h a tc o u l dp r o d u c ed l d e c h l o r o v a n c o m y c i n t h ef i r s tt w o m e d i aw e r eo p t i m i z e df o rf u t u r ep o t e n t i a la p p l i c a t i o n d i d e c h l o m v a n e n m y c i nw a s p u r i f i e da n di d e n t i f i e d , a n di t sp r o d u c t i o nc o n d i t i o n sw a ss t u d i e d t h i sc o m p o u n d m a yb eu s e da sn e wi d e n t i t yf o rf u r t h e rs y n t h e t i c 嗽 ( 3 ) s y n t h e t i cm e d i aw e r eu s e dt ot h ef e r m e n t a t i o nt e s to fg e n e t i ce n g i n e e r i n g b a c t e r i ah c c b l 0 0 7 2a n dh c c b l 0 0 8 2 ，f e r m e n t a t i o nr e s u l t si sb e t t e rt h a nt h ec o n t r o l m e d i u m t oo b t a i n e dt w oa g l y c o n e so fv a n c o m y c i nf r o mf e r m e n t a t i o nm e t h o d t o e n l a r g et h ee x p e r i m e n t so fy e a s tm e d i ai n5 lf e r m e n t o r , t h ey i e l do fv a n c o m y c i ni s h i g h e rt h a nc o n t r 0 1 a n da l s od o n et h ec y c l i c a la l t e r n a t i v ee x p e r i m e n t , i n i t i a l l ys t u d y t h ef e a s i b i l i t yf o rr c - i l s co f v a n c o m y c i nw a s t er e s i d u e f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n , d e w m e dm e d i u m i v v a n c o m y c i nb ，s t r u c t u r e i d e n t i f i c a t i o n , 华东师范大学硕士学位论文 缩略语 缩写词 m 喂s a m r s e v r e u d p p b p s d a l a d - a l a d o 吐a d l a c d u a d s e t g 恤 g 归 鲥d n r p s 恻 o r i d a l r t h p l c r p h p l c 1 l c o d s i d 缩略语( 中英文全称) 英文全名 m e t h i c i l l i n - r e s i s t a n t s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s m e t h i c i l l i n r e s i s t a n t s t a p h y l o c o c c u se p i d e r m i d i s v a n c o m y c i n r e s i s t a n t e n t e r o c o c c u s f a e c i u m u r i c f i n e5 - d i p h o s p h a t e p e n i c i l l i nb m d m gp r o t e i n s d - a l a n y l - - d - a l a l i g a s e d - a l a u y l - d - l a c 切c 忙 d - a l a n y l d s e r i n e g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s g l y c o s y l t r a n s f e r a s eg e n ee g l y c o s y l t r a n s f e r a s eg e n ed n o n r i b o s o m a lp e p t i d es y n t h e t a s e v a n c o m y c i n o r i m v a n c i n d a l b a v a n c i n r e t e n t i o nt i m e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y r e v e r s e dp h a s eh i g h p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y o c t a d e c y ls i l a n e i n t e r n a ld i a m e t e r v 中文全称 耐甲氧西林金黄色葡萄 球菌 耐甲氧西林表皮葡萄球 菌 耐万古霉素肠球菌 尿苷5 二磷酸 青霉素结合蛋白 d 丙氨酰d 丙氨酸 d 丙氨酰d 乳酸 d 丙氨酰d - 丝氨酸 糖基转移酶 转糖基酶基因e 转糖基酶基因d 非核糖体肽合成酶 万古霉素 氯古霉素 道古霉素 保留时间 高效液相色谱 反相高压液相色谱 薄层色谱法 十八( 烷) 基硅烷 内径 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研 究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已 经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中作了明确说明并表示谢意 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留，使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在 解密后适用本规定 学位论文作者签名：3 。巾岛导师签名：名今亚【司 日期： 丝i ：f 日期：丑：! ：三 华东师范大学硕士学位论文 第一章前言 1 抗生素概述 第一章前言 自2 0 世纪加年代青霉素应用于临床以来，抗生素为人类的健康事业作出 了卓越的贡献，它使人类的平均寿命延长了1 5 年以上。青霉素在临床上的奇异 疗效，激发了世界各国有关学者的研究热情。1 9 4 4 年w a k s m a n 发现了由链霉 菌产生的链霉素用于治疗细菌特别是结核杆菌引起的感染有特效。这个发现使 人们对从土壤中寻找由放线菌产生的抗生素充满了信心，此后陆续发现了氯霉 素、金霉素、土霉素、红霉素、丝裂霉素c 等，由此造就了抗生素发展的黄金 时代。 一般认为抗生素的定义应为：抗生素就是能够在低浓度下有选择地杀死或 抑制它种生物机能的微生物小分子次级代谢产物及其衍生物通常将抗生素分 为：b 内酰胺类、氨基糖苷类、大环内酯类、四环类和糖肽类。 由于抗生素的大量使用，临床上出现了耐药菌，细菌对抗菌药物的耐药性 可分为天然耐药与获得性耐药两种。细菌对抗菌药物的耐受性机制就目前研究 结果来看主要有四种：一是水解酶或钝化酶的产生，目前已分化出的钝化酶有 b 内酰胺酶、氨基糖苷类钝化酶、红霉素酯化酶等；二是抗生素的渗透障碍， 细菌发生变化，使细菌外膜上某种特异多孔蛋白发生变异，使抗生素失去进入 细菌细胞的通道；三是靶位( 如核糖体和核蛋白) 的改变；四是细菌具有一种 依赖于能量的主动运输机制，即它能够将已经进入胞内的药物泵至胞外。这就 促使药物化学家去寻找能对付耐药菌和提高疗效的药物，对已有抗生素进行结 构改造来寻找具有更好疗效的衍生物也是研究的一个主要方向【1 1 。 2 万古霉素研究概况 2 1 发展概况 万古霉素( v 猢m y d nb ) 是由美国礼莱公司( l i l l y ) 开发的糖肽类抗生 素( 图1 - 1 ) ，于1 9 5 8 年获f d a 批准上市，商品名为“稳可信( v 蛆c o c i n ) ”。 万古霉素问世初，由于很强的耳肾毒性以及青霉素和头孢菌素类抗生素的上市 使用，仅作为保留药物，治疗由少数金黄色葡萄球菌引起的严重感染性疾病， 临床使用很少。后来随着b 。内酰胺类抗生素的大量使用，由甲氧西林耐药金葡 菌( m e t h i c i l l i n r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，m r s a ) 所引起的感染逐渐流行。 华东师范大学硕士学位论文 第一章前言 1 9 8 2 年有报道称在美国大医院中，m r s a 引起的感染已由原来的2 上升到 2 0 。国内的研究表明，1 9 9 8 2 0 0 0 年，耐甲氧西林金葡菌与敏感金葡菌的比 例高达3 0 以上在这种情况下，万古霉素愈来愈受到人们的重视，对其药理 和临床疗效进行了新的评价，认为它不仅用于严重的革兰氏阳性菌感染，特别 是对其他抗感染药物耐药或疗效不好的m r s a 或耐甲氧西林表皮葡萄球菌 ( m r s e ) 及肠球菌属细菌引起的各种感染；也可以用于对b 内酰胺类抗生素 过敏患者的上述严重感染，或血液透析患者的严重革兰氏阳性球菌感染；以及 可以作为治疗难辨梭状芽孢杆菌引起的伪膜性结肠炎的首选药物或用于甲硝唑 治疗无效者1 2 1 。并被国际抗生素专家誉为“人类对付顽固性耐药菌株的最后一道 防线”和“王牌抗生素” 3 1 。万古霉素开发后近3 0 年一直是临床上应用的唯一糖 肽类抗生素。2 0 世纪舳年代中期，欧洲开始在临床上使用替考拉宁。至今为 止，只有这两个糖肽类抗生素应用于临床【4 1 。上海医药工业研究院陈代杰等人 自1 9 9 6 年与浙江医药股份有限公司新昌制药厂合作，经过长达7 年的研究开发， 于2 0 0 3 年9 月正式获得批准并成功投产上市，商品名为“来可信( l a i k e x i n ) ”。 产品质量达到和超过进口标准，具有显著的社会经济效益。今后随着我国用药 水平( 包括对临床耐药菌的临床监测和控制措施等) 、医疗水平和生活水平诸方 面的不断提高和改善，以及国内生产企业市场营销策划和运作水平的逐步提高， 相信万古霉素在今后临床应用方面将得到应有的重视和长足发展。 图1 1 万古霉素结构式 p i g 1 - 1s t r u c t u r eo f v a n e o m y c i n 2 h ：c h 3 华东师范大学硕士学位论文 第一章前言 2 2 万古霉素的作用机制和细菌产生耐药性的作用机制 2 2 1 万古霉素的作用机制 就细胞水平而言万古霉素通过干扰细菌细胞壁的合成最终使细菌细胞发生 溶解。从分子水平上讲 5 - 7 1 ，万古霉素抑制细胞壁合成第二阶段( 类脂结合) 中一 个关键的转化反应，即万古霉素结构中肽骨架与u d p - 五肽末端的d - a i a - d - a i a 末端游离羧基通过五个氢键的作用紧密结合形成一个复合物( 图1 - 2 a ) 。由于 糖肽肽聚糖前体复合物的空间立体阻碍，抑制了转糖基酶把肽聚糖前体上的二 糖转移至增长的肽聚糖链上。另外，即使在有些情况下肽聚糖链的合成能够进 行，但由于肽聚糖前体的乙酰d - a i a d - a i a 被糖肽抗生素分子包围，转肽酶的 活性被抑制。因此糖肤类抗生素是通过同时抑制细菌细胞壁生物合成中的两步 酶促反应，即转糖基作用( 肽聚糖的延伸) 和转肽作用( 肽链的交联) ，或其中 的一步，达到阻止细胞壁合成的目的，从而导致细胞死亡。 研究发现有两种作用机制加强万古霉素中肽骨架与细菌细胞壁合成过程中 的d - a i a - d a l a 的结合作用：( 1 ) 两个万古霉素分子间糖苷结构通过氢键的作 用形成二聚体，万古霉素以这种聚合体形式存在增强了结构的稳定性，同时镇 定了万古霉素中与d - a i a d - a i a 结合域( b i n d i n gp o c k e t ) 呈正确的构象 8 - “j 。( 2 ) 万古霉素结构中的亲脂部分使得抗生素位于细菌的表面，从而接近细胞壁合成 前体【垃1 3 1 。 a ：与d - a i a 旬a b 结合； b ：与p 1 8 - p l a c 结合 图1 - 2 万古霉素与肽聚糖前体结合方式 f i g 1 - 2t h ei n t e r a c t i o no f v a n c o m y c i nw i t hp e p t i d o g l y c a np r e c u r s o r s 3 华东师范大学硕士学位论文 第一章前言 2 2 2 细菌对万古霉素产生耐药性的作用机制 随着万古霉素的不断使用，各种耐药菌相继出现，尤其是近年来临床出现 m r s a 和耐药性肠球菌的频率不断提高。万古霉素通过与肽聚糖前体末端的 d - a i a - d - a i a 结合来抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，但是万古霉素耐药肠球菌产 生一种分子结构改变的细菌细胞壁肽聚糖前体【1 4 1 5 】：d - a i a - d - l a e 或 d - a i a - d s e r 。d - l a c 取代d - a i a 使得万古霉素与肽聚糖前体结合的五个氢键中 一个氢键的作用降低( 图1 2 b ) d s e t 的取代造成了构型的改变，同样降低了 与万古霉素的结合力。 临床上常见的万古霉素耐药菌为v a n a 表型。v a n a 基因簇位于长度为1 0 8 5 1 b p 的转座子t n 5 4 6 上，包含7 个基因：v a n r ，v a n s ，v a n h ，v a n a ，v a n x , v a n y 和v a n z ( 图1 3 ) ，其中v a n r 、v a n s 、v a n a 、v a n h 和v a n x 对耐药性产生是必需 的【廿l 。v a n s 和v a n r 是调节耐药基因双组分信号传导系统的成分l 垌。v a n a 似乎 是一种底物范围较广的d - a i a d x 连接酶，可催化d a l a 与其它氨基酸、脂肪 酸或羟酸连接；v a n h 是一种乳酸脱氢酶，可从丙酮酸产生乳酸；v a n x 是d ， d - - - 肽酶，负责水解正常细胞中肽聚糖末端的d - a i a d - a l a ，这就降低了 d - a i a - d - a i a 掺入到合成正常五肽前体的量，从而达到非正常五肽前体合成量相 对增加的目的。v a n x 对d - a i a - d - a i a 的催化效率是对d - a i a d l a c 的5 0 0 倍以 上，在三种酶的协同作用下，肽聚糖末端的d - a i a - d - a l a 被d - a i a d l a c 取代， 而后者与万古霉素的结合能力只有前者的1 1 0 0 0 ，从而产生了耐药性。v a n y l t t i 编码一种d ，d 羧肽酶，负责切除未被v a n x 水解的d - a i a - d - a i a ，似乎是为保 证细菌在万古霉素存在的环境中存活而产生的一种纠错机制。v a n z 以一种未知 的方式给予细菌低水平的替考拉宁耐药性【1 8 i 。图l _ 4 为由转座子t n l 5 4 6 编码的 各种与万古霉素耐药性有关的蛋白。 图l - 3 万古霉素耐药菌嘣基因簇 f i g 1 - 3t h e $ i i i i i ag e n ed n s t e r 4 华东师范大学硕士学位论文第一章前言 转座酶 解瑚k 一 涉及到万古霉素 v a e x , sv a n h 耐药性的基因有l 月a 颧函暮菇警攥瓣瘟v ；习智矗瑚雪静了唼差l 缈谤 p v a n r 为。一晌蕊稳耀带i：1 a c 的脱氧# 薛。5 f 搬，礴带秘 及垄i 【) 爹，；v 矗n a 为麓睦接辂 e 古霉糍耐药性的游i每1 a 耨卧l “胤 e 鞣幂l 毒荤土蕊镕蝣j 巧对 链接酶i y y 4 # 蠛为绛螂y 麓 d 卜音j 妒妇卜8 王曩? 嘲嬲黪二，i 泛i v a n p - z 弋测 缢i 冀为薛蠢l i 露蚓 氧基酸如黟一a i a ，的羧肢蹲，；使绒1 阳壁前斜；成翘i 雩1 田霉矗0 r t ：。：。、：q 图1 4 与万古霉素耐药性有关的蛋白 f i g 1 - 4 t h er e l e v a n tp r o t e i n sr e l a t e dt ov a u c o m y c i nr e s i s l a n c e 2 3 万古霉素的生物合成机制 据研究，天然的万古霉素生物合成共有3 5 步【1 9 1 。七肽核链是由问一氯一b 一羟基酪氨酸( c i r r ) 单位、3 ，5 一二羟基苯基甘氨酸( d p g ) 单位、精氨酸、n 一甲基亮氨酸组成，在酶的催化下生成7 种非蛋白氨基酸a a - i a a - 7 ，这7 种氨基酸在非核糖体肽合成酶( n r p s ) 装配线上合成一线形的七肽，然后芳基 边链在交联酶的催化下适时地组合、交联，形成复杂的七肽骨架。 万古霉素上的两个糖基，是由列露和舶i d 编码的糖基转移酶g f f e 、g t f d 连接至糖苷配基上的【刎。g t f e 糖基转移酶对底物的特异性差，既可以利用氨基 在2 、3 、4 、或6 位的u d p 一葡萄糖类似物，也可以利用氨基在2 、3 、4 、或6 位的m p 一葡萄糖类似物。g t 仍的底物特异性也较差，既可以将v a n c o s a m i n e 连接至万古霉素的假糖苷配基上，还可以将4 - e p i - v a n c o s a m i n e 连接至q 厄的衍 生物上( 糖基化位点在2 - 脱氧的除外) 。g t 也、q 毋糖基转移酶的作用见图1 5 。 图1 5 万古霉素生物合成后期g i f l e 和g t i d 的催化反应 f i g 1 - 5t h ef i n a ls t a g e so f v a n c o m y c i nb i o s y n t h e s i sc a t a l y z e db yg t l ea n dg t f d 5 华东师范大学硕士学位论文 第一章前言 另外，利用逆向合成分析技术，对万古霉素的生物合成进行了研究，可将其 归为三个阶段【2 1 l ；( 1 ) 小分子准备：在酶的催化下生成装配过程中需要的小分子 化合物，包括非蛋白氨基酸和t d p l - e p i v a n c o s a m i n e ：( 2 ) 装配：上步准备好的 氨基酸通过腺苷化反应转换成为腺苷酸，而后与邻近肷载体蛋白( p c p ) 上的巯 基形成硫酯，p c p 之间的缩合功能域催化肽键形成。经过几个延伸过程，最后t e 域将完成的肽切下。有时过程中还会有差向异构作用：( 3 ) 装配后修饰：在这步 反应中进行氧化反应和糖基化，同时还存在n 端甲基化反应。其过程如图1 - 6 所示。 一兰一 1 | 铆且州 i l 图1 - 6 万古霉素生物合成分析 l r q g 1 - 6t h ea n a l y s i so f v a u c o m y c i nb i o s y n t h e s i s 6 百a 藜 华东师范大学硕士学位论文第一章前言 3 新型糖肽类抗生素的研究与开发 3 1 糖肽类抗生素的化学修饰 万古霉素等糖肽类抗生素对于治疗革兰氏阳性菌引起的严重感染的有效 性，以及万古霉素耐药菌株的出现，使得研究开发药效更好的新糖肽类抗生素 势在必行。万古霉素等糖肽类抗生素结构高度复杂，完全通过化学合成有很强 的挑战性阎。至今为止，大多数新的化合物是基于对糖肽类抗生素结构与生物 活性间关系的认识阻2 4 1 ( 图1 - 7 ) ，通过对天然存在的糖肽类抗生素进行半合成 获得的。新糖肽类抗生素的研发策略大体上可以分为三种： ( 1 ) 对糖肽类抗生素中的结合域进行改造 万古霉素等糖肽类结构中肽骨架上存在五个能与d - a i a - d - a i a 结合的位点。 研究者曾试图通过将七肽结构缩短、加长、将1 ，3 位上的氨基酸进行替换等方 法改变肽骨架结构，从而产生带有能与d - a l a d - a i a 以及d - a i a - d l a c 侣e 0 有 效结合的肽骨架的新化合物。不幸的是，所有这些试验的结果表明通过改变后 所得到的化合物的生物活性降低。然而通过将3 位上的天冬氨酸用疏水氨基酸 替代结果增强了万古霉素和d - a l a - d l a c 的结合，这一结果表明通过对糖肽类 抗生素中七肽结构进行改造从而产生新化合物的可能性是存在的1 2 5 l 。 ( 2 ) 改造和增加功能团 对万古霉索结合域之外的一些功能团的改造能够有效的改善其理化性质。 糖肽类抗生素分子通过形成二聚体能够增强与细菌中靶点的结合力。糖肽类抗 生素的母核构效关系图以及糖肽类抗生素分子作用位点图如图1 7 所示。在万 古霉素肽骨架的6 位上添加一个氨基糖、2 位芳香族氨基酸支链上的处于间位 上的氯都能增加万古霉素二聚体的形成。另外，对肽骨架的末端进行改造也是 一种有效的方法。将羧基进行氨基化也能增加化合物的活性。 7 华东师范大学硕士学位论文 第一章前言 ：器蹴缆竽 圈l - 7 化学改造糖肽类抗生素的母核构效关系以及糖肽类抗生素分子作用位点 f l g 1 - 7 n 咖髓咱曲1 yr e l a t i o n s h i pf o r g l y c o p e p t i d e sb yc h e m i c a lm o d i f i c a t i o n s ( 3 ) 改变糖肽类抗生素结构中的糖【捌 虽然糖肽类抗生素中的糖基位置远离万古霉素与其作用靶点的结合域，但 是塘基对糖肽类抗生素的生物活性有很重要的影响。实验表明，万古霉素和替 考拉宁无糖基糖苷的生物活性明显降低。 天然糖肽类化合物c h l o r o e r e m o m y c i n 与万古霉素相比活性增加，其肽骨架 的6 位上添加了4 - e p i - v a n c o s a m i n e ：另外，将万古霉素中的v a n c o s a m i n e 用疏 水结构取代也能使活性明显增加，这一变化有点模仿替考拉宁衍生物结构中的 亲脂侧链，同时还发现取代结构用烷基化结构比酰基化结构更为有效地增加万 古霉素活性。 3 2 第二代糖肽类抗生素的研究进展 己经进入临床研究的半合成糖肽类抗生素包括：氯古霉素( o r i t a v a n c i n ) 、 道古霉素( d a l b a v a n c i n ) 及t e l a v a n c i n 。由于其是通过研究糖肽类抗生素的构效 关系，对微生物来源的天然产物进行化学修饰而得。它们对敏感、耐药菌有明 显的体外杀菌活力，相对于万古霉素或替考拉宁具有显著的药效药代动力学特 性，作用机制也稍区别于万古霉素或替考拉宁，我们将这些半合成糖肽类抗生 素称为第二代糖肽类抗生素。例如在结构中含有疏水侧链( t e c 中也有) 有利 于糖肽类抗生素锚向细胞膜上，更接近靶目标，也可能改变膜的完整性。而环 4 上的双糖、环2 上的氯以及环6 上的糖之间的相互作用能促进抗生素二聚体 8 华东师范大学硕士学位论文第一章前言 的形成，协同结合至靶上( 图1 7 ) 这些衍生物不仅改变了它们的药效学特性， 同时也变更了它们的药物代谢动力学。特别是由于在母体上有疏水侧链，使其 拥有较高的蛋白结合能力，延长了半衰期。 ( 1 ) 氯古霉素( o r i t a v a n c i n ) 是万古霉素类似物( c h l o r o e r e m o m y c i n ， l y - 2 6 4 8 2 6 ) 的4 - 氯联苯基甲基衍生物( 见图i - 8 a ) c h l o r o e r e m o m y d n 来源 菌为n o c a r d i ao r i e n t a l i s 。其抗菌谱与万古霉素类似，而体外试验表明，其对 g r s a 、v a n b 型肠球菌和耐青霉素的肺炎链球菌比d a l 、t e l 均有更好的疗效。 虽然v a n 与o r i 对d a l a - d - a l a 和d - a i a - d l a c 的亲和力相似，因此其活力差 异在于药物与两种前体的协同作用，也可能是由于o r j 有更强的二聚化能力， 以及疏水侧链的存在，使得药物更容易结合至细胞膜上阳，2 8 l 。e l ll i h y 公司对 氯古霉素进行开射冽，现转让i n t e r m u n e 公司，如今处于期临床，它对革兰 阳性菌引起的并发性皮肤皮肤结构感染有潜在用途。 ( 2 ) 道古霉素( d a l b a v a n c i n ) 是天然糖肽类化合物a 4 0 2 9 6 的衍生物( 图 1 8 b ) ，能够用于治疗m r s a 和m r s e ( m e t h i c i l l i n - r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u s e p i d e r m i d i s ) 所引起的严重感染。体外实验表明d a l b a v a n c i n 作用为杀菌而不是 抑菌。a 4 0 9 2 6 的来源菌为n o n o m u r a e as p a t c c 3 9 7 2 7 。在第二代糖肽类抗生素 中，d a l 的活性最强，尤其是针对敏感和耐药肺炎链球菌和金葡菌有更强的活 力。由于独特的药动学特点，本品在临床中可一周一次给药1 3 0 l 。v i c u r o n 公司对 其进行开发，已经递交治疗软组织感染( s s - 1 1 s ) 的上市申请，并将寻求优先审 查，同期，治疗c r - b s i 的期临床正在进行中。在临床中治疗复杂性的皮肤、 软组织感染( s s l l ) 与导尿管引起的血液感染( c r b s i ) 疾病，药物耐受性良 好。 ( 3 ) t e l a v a n c i n o d 6 4 2 4 ) 是万古霉素的衍生物，在万古胺糖上有疏水性侧 链，在骨架上连接磷酸氨基( 见图1 8 c ) 。其母核来源菌为a m y c o l a t o p s i s o r i e n t a l i s 。疏水性侧链的长度决定了t e l 对m r s a 和v a n a 型肠球菌的活力。 其对m r s a 、m r s e 、v a n a 型肠球菌的活力均高于v a n 和t e c ，在第二代糖 肽类抗生素中活力一般，但其机制有显著差别【3 l 】。t e l a v a n c i n 对金葡菌，肺炎链 球菌以及v a n a 型金葡菌或肠球菌的杀菌活力提高是通过干扰脂合成，同时使 细胞膜破裂，干扰细菌细胞膜的完整性。与o r i 相比，并没有直接的数据表明 t e l 增加了与细胞壁前体的结合或直接抑制糖基转移酶的合成。 由于结构中极性基团的取代，改善了药物在体内的分配，缩短了其半衰期， 但仍比v a n c o m y c i n 长，使得临床上一日一次给药成为可能。t h e r a v a n c e 公司对 其进行研究开发，现已处于治疗由革兰阳性细菌引起的c s s i s 和医院获得性肺 炎的致病菌m r s a 的期临床瞰l 。 9 华东师范大学硕士学位论文第一章前言 图1 - 8 氯古霉素c a ) 、道古霉索f b ) 和t e l a v a n c i n ( c ) 结构式 r g l - s s t r u c t u r e so f o r i l a v a u c i m bd a l l m v a n c i na n dt e l a v a n c i n 4 糖肽类抗生素提取、分离研究进展 糖肽类抗生素结构复杂，对热、酸、碱稳定性差，生产过程中易失活和分 解，且发酵液中含量较低，杂质与其性质相近。要得到高纯度的糖肽类抗生素 有效组分，往往需要较复杂的分离纯化过程，需要多种分离方法的结合。目前， 国内外应用于糖肽类抗生素提取，分离纯化的方法主要有吸附法、萃取法、离 子交换法、高效液相色谱法。下面就各种方法作一简单说明。 4 1 吸附法 吸附法在糖肽类抗生素提取分离中的作用非常重要，包括大孔吸附树脂、 载有d - a l a - d - a i a 配基的亲和介质、聚酰胺等均有良好的分离性能。 华东师范大学硕士学位论文第一章前言 4 1 1 大孔吸附树脂 糖肽类抗生素在发酵液中的含量很低，且含有大量的杂质，直接处理较困 难。而大孔吸附树脂可在发酵液中聚集产物，且滤液无需特殊处理，故广泛应 用于耱欣类抗生素粗提工艺中。文献报道1 3 3 】利用大孔树脂、离子交换树脂和低 压反相色谱纯化所得t a 2 组分，纯度大于9 5 。替考拉宁发酵液碱性过滤后回 调至p h 7 0 ，直接上大孔树脂柱，再用p h l l 的丙酮溶液洗脱，浓缩得含量约 2 8 的粗品。分离万古霉素则选用d 1 3 0 0 为吸附树脂，用p h 2 0 的酸性乙醇为 解吸液，所得洗脱液质量较好，其中万古霉素h p i c 峰面积占总积分面积的7 5 以上。抗生素a 4 1 0 3 0 1 3 4 1 和h e l v e c a r d i n sa b | 3 5 1 发酵滤液也可直接利用大孔树 脂i - i p 2 0 吸附，用4 0 乙腈洗脱，再以s e p h a d e xg - 5 0 纯化得到较纯的同系物 组分混合物。文献冈选用大孔树脂x a d - 7 直接从发酵液浓集产物a r i d i c i n s ，也 取得了很好效果。 糖肽类抗生素一般为弱极性大分子结构，用非极性大孔树脂h p 2 0 系列或 x a d 系列处理效果均较好。发酵液多在中性条件上柱，再用含有枫溶剂如丙酮、 乙醇、乙腈、甲醇等的水溶液洗脱，可去除杂质、浓缩产物。 4 1 2 亲和吸附 将能与糖肽类抗生素特异性结合的二肽d - a i a - d - a i a 或多肽通过交联反应 连接于琼脂糖、葡聚糖、纤维素、聚苯乙烯或丙烯酸系共聚物等载体，制成有 生物选择性的亲和介质p 7 l ，可有效分离纯化糖肽类抗生素。文献【删运用 s e p h a r o s e4 b d - a i a - d a l a 直接由发酵液纯化替考拉宁有效组分t - a 2 ，发酵滤液 上柱后再经碱性缓冲液解吸，即可得到纯度约9 4 的产品，收率达6 5 。文献 1 3 9 l 利用d - a l a - d - a l a c p s i l o n - a m i n o c a p r o y l s e p h a r o s e 柱提纯a 4 0 9 2 6 ，发酵液经两 次亲和吸附、解吸可得纯度大于9 8 的a 4 0 9 2 6 a 、b 复合物，收率大于5 0 糖肽类抗生素k i b d e l i n s 发酵液经大孔树脂x a d 7 吸附、解吸后直接由a f f i g e l 1 0 d - a l a d - a i a 纯化，用5 0 乙腈氨水溶液洗脱可得纯度大于9 5 的k i b d e l i n s 组分。 万古霉素、瑞斯西丁素( r i s t o c e t i n ) 等几乎所有的糖肽类抗生素对 x - d - a i a d - a l a 交联树脂均表现出高度的选择亲和性阳。亲和双水相技术体现 了糖肽类抗生素和亲和配基特异性结合的特性，又吸