（发酵工程专业论文）红发夫酵母发酵法生物合成虾青素的研究.pdf

摘要 摘要 虾青素是一秭类胡萝卜索，因其具有着色性能及特殊的生物学功能丽在饲料、食品、 化妆品和医药等行业具有广阔的应用前景。 本文以红发夫酵母( p h a f f i a r h o d o z y m a ) a s2 1 5 5 7 为出发菌株，通过摇瓶分批发酵， 对其细胞生长及虾青素合成进行了系统的研究。以期为发酵法生物合成虾青素的代谢调 控奠定基础。同时，通过原生质体紫外线诱变和细胞的d e s 诱变，对红发夫酵母高产 虾青素菌株进行了选育。研究结果如下： 1 培养种子的适宜条件为：斜面菌种在2 5 ( 2 培养4 天；以2 环斜面种子接种于 2 5 m l 2 5 0 m l 、初始p h 6 0 的y m 液体培养基中在2 2 摇瓶培养3 6 h 。 2 高浓度葡萄糖抑制细胞生长和虾青素合成，适宜初始葡萄糖浓度为2 0 9 l 。在相 同碳源浓度下，蔗糖与葡萄糖的发酵水平相近与木糖的发酵存在较大差异。发酵至4 8 h 时，木糖的细胞浓度较低，仅为葡萄糖发酵时细胞产量的约4 7 ；但其细胞虾青素含量 可达最高值1 3 7 m g g ，是葡萄糖发酵时细胞虾青素含量的2 5 倍。 3 蛋白胨、硫酸铵、硝酸钾和硝酸钠均可作为虾青素发酵的氮源，在相同氮含量条 件下。蛋白胨最有利于细胞生长和虾青索合成。硫酸铵的适宜浓度为70 9 l 。硝酸钾浓 度对红发夫酵母生长及其虾青素合成有显著影响；低浓度硝酸钾比高浓度硝酸钾更有利 于细胞生长和虾青素合成。以较低浓度硝酸钾( o 3 9 几) 为氮源，比硫酸铵的发酵周期约 长4 8 h 。细胞生长及虾青素合成分别出现二次生长及二次合成现象，其细胞产量及虾青 素产量均比以蛋白胨为氮源提高约2 0 。 4m n 2 + 显著影响生物量及虾青素产量，当发酵培养萋中含0 1 9 几m n 2 + 、0 7 9 l m g ”、 o 2 9 lc a 2 + 时，细胞生长速度快、发酵周期可缩短约1 5 小时，细胞虾青素含量在发酵 5 7 h 时达最高值，为o 8 2 7 m g g ，是不添加实验离子时的13 倍。 5 适宜的摇瓶发酵条件为：发酵培养萋初始p h 6 0 、发酵温度2 0 2 2 。c 、接种量8 、 摇瓶装液量2 5 m l 2 5 0 m l 三角瓶。并且发酵培养基中k 矗t p 0 4 适宜浓度为1 0 2 、0 e , l 。 6 适量m n 2 + 可提高细胞的溶壁酶争d - 葡萄糖苷酶皿c3 2 1 2 1 ) 的活性，并明显改 变细胞形态。在初始发酵培养基中添加0 1 9 几m 铲+ 可促进细胞生长及虾青素合成。 摘要 7 在发酵2 4 h 时添加橙汁、菠菜汁和番茄汁，可分别使虾青索最高产量提高 7 1 1 、1 4 6 和6 2 6 。其中，以添加橙汁的效果最好。 8 制备原生质体的出发菌株预培养时间为1 6 h ，添加m n 2 + 的适宜浓度为o 8 9 l 时， 可使原生质体形成率达到6 25 7 3 6 ；通过原生质体紫外线作用2 0 s ，或细胞d e s 处 理3 0 m i n 进行菌种诱变，经初筛及摇瓶复筛获得有明显改进性状的突变株共2 6 株。采 用紫外线诱变原生质体可较大幅度提高虾青素产量，但高产稳定性较差；d e s 诱变细胞 所获得的菌株虾青索高产稳定性较好，但菌体的生长能力明显减弱。 关键词：红发夫酵母，虾青素，b d _ 葡萄糖苷酶，锰离子，增强剂，原生质体，诱变 苎鲤! a b s t r a c t a s t a x a n t h i ni sak i n do fc a r o t e n o i d d u et oi t sn a t u r a lp i g m e n t i n gp r o p e r t ya t t ds p e c i a l b i o l o g i c a lf u n c t i o n s , a s t a x a n t h i nh a sc a u s e dc o n s i d e r a b l ei n t e r e s ti nf e e d 、f o o d ，c o s m e t i ca n d p h a r m a c y p h a f f i ar h o d o z y m a ，ar e dy e a s ti sc o n s i d e r e d a sap o t e n t i a lc a n d i d a t eu s e dt o i n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f n a t u r a la s t a x a n t h i n t h i ss t u d ym a i n l ys t u d i e do nt h ea s t a x a n t h i nb i o s y n t h e s i sb yp h a f f i ar h o d o z y m aa s21 5 5 7 a si n i t i a lg r a i na n dt h eb r e e d i n go f p h a f f i ar h o d o z y m ab yt h eu l t r a v i o l e ti n d u c e dm u t a t i o no f p r o t o p l a s t sa n dd i e t h y ls u l f a t ei n d u c e dm u t a t i o no f c e l l st h e r e s u l t sa r ea sf o l l o w s 1t h eo p t i m a li n o c u l ac u l t i v a l i e nc o n d i t i o n sa r et h a ts l a n ti n o c u l aa r ec u l t i v a t e df o r4d a y s a t2 5 a n dl i q u i di n o c u l aa r ec u l t i v a t e df o r3 6 hi n2 5 m l 2 5 0 m la ti n i t i a lp h 6 0b y2r i n g s i n o c u l a t i o na t2 2 2 h i g hc o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s ec a ni n h i b i tt h ec e l l s g r o w t ha n da s t a x a n t h i ns y n t h e s i s ， a n dt h eb e 仕e ri n i t i a lc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s ei s2 0 9 lu n d e rt h es a m ec o n c e n t r a t i o no f c a r b o ns o u r c e ，t h eh i g hc e l h l a ra s t a x a n t h i nc o n t e n tw i t hs u c r o s ea n dg l u c o s eg r ec l o s e rb u t a r ed i f f e r e n tf r o mt h a tw i t hx y l o s e t h ec e l ly i e l dw i t hx y l o s ei sl o w e r , w h i c hi so n l y4 7o f t h a tw i t hg l u c o s e ，b u tt h eh i g h e s tc e l l u l a ra s t a x a n t h i nc o n t e n tw i t hx y l o s ec a nr e a c h1 3 7 m g a t4 8 hf e r m e n t a t i o n , w h i c hi s2 5t i m e so f t h a tw i t hs h c o s e 3 p e p t o n e ，a m m o n i u ms u l f a t e ，s o d i u mn i t r a t ea n dp o t a s s i u mn i t r a t ec a nb ea l lu s e da s n i t r o g e ns o u r c eo fa s t a x a n t h i ns y n t h e s i so f p h a f f i ar h o d o z y m a u n d e rt h es a m ec o n c e n t r a t i o n o fn i t r o g e ni nm e d i a ，p e p t o n ei st h eb e s tn i t r o g e ns o u r c e , w h i c hw i l lb e n e f i tt h ec e l lg r o w t h a n da s t a x a n t h i ns y n t h e s i so fp h 蝣8e h o d o z y m a , t h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fa m m o n i u m s u l f a t ei s7 ，0 9 e 1 t h ec e l lg r o w t ha n da s t a x a n t h i ns y n t h e s i so fp h a f f i ar h o d o z y m aa r e e n h a n c e db yl o wc o n c e n t r a t i o n so fp o t a s s i u mn i t r a t e ，b u ti n h i b i t e db yh i g hc o n c e n t r a t i o n so f p o t a s s i u mn i t r a t e w h e nt h ef e r m e n t a t i o nm e d i u mc o n t a i n e do3g lo fp o t a s s i u mn i t r a t e , t h e f e r m e n t a t i o np r o c e s so fp h a f l i ar h o d o z y r a ac a na p p e a rc e l l r e g r o w t ha n da s t a x a n t h i n r e - s y n t h e s i s , t h ef e r m e n t a t i o np e r i o di sl o n g e ra b o u t4 8 ht h a nt h a tw i t l la m m o n i u ms u l f a t e t h ec e l ly i e l da n da s t a x a n t h i ny i e l dc a nb ei n c r e a s e d2 0 r e s p e c t i v e l yt h a nt h a tw i t hp e p t o n e 4 i n 2 + c a na f f e c tt h ec e l lg r o w t ha n da s t a x a n t h i ns y n t h e s i ss i g n i f i c a n t l y , s u c ha s1 v l n 2 + ， m 9 2 + a n dc a 2 + u n d e rt h ec o n d i t i o no fo 1 9 lo fm n 2 + 0 7 9 lo fm 9 2 + a n d0 2 9 lo fc a 2 + a d d e di nt h em e d i a ，t h ec e l lg r o wr a p i d l y , t h ep e r i o do f f e r m e n t a t i o nc a nb cs h o r t e da b o u t15 h , a n dt h ec e l l u l a ra s t a x a n t h i nc o n t e n tg a l lr e a c h e dt h eh i g h e s to 8 2 7 m g ga t5 7 hf e r m e n t a t i o n , w h i c hi s1 3t i m e so f t h a tw i t h o u ta d d i n gm e t a li o n sa t7 2 hf e r m e n t a t i o n 5 t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa r et h a tl i q u i di n o c u l aa r ec u l t i v a t e di nf e r m e n t m e d i aw i t h1 0 - 2 0 9 lo fk 2 h p 0 4o f2 5 m l 2 5 0 m la tp h 6 0 ，2 0 2 2 。cb y8 i n o c u l a t i o no f l i q u i di n o c u l a 6 t h ep r o p e rc o n c e n t r a t i o no fm n 2 + c a ni m p r o v et h eb d g l u c o s i d a s e ( e c3 2 ，1 ，2 1 ) a c t i v i t ya n dc a u s es i g n i f i c a n t l yt h ec h a n g e so fc e l lm o r p h o l o g y t h ei n i t i a lf e r m e n tm e d i u m c o n t m n i n go 1 9 ，lo fm i l _ 计c a ni m p r o v eo b v i o u s l yt h ec e l lg r o w t ha n dt h ea s t a x a n t h i n b i o s y n t h e s i s 7 t h ea d d i t i o no fo r a n g ej u i c e , s p i n a c hj u i c ea n dt o m a t oj u i c ea t2 4 hf e r m e n t a t i o nc a n i m p r o v ea s t a x a n t h i ny i e l db y7 11 1 4 6 a n d6 2 6 r e s p e c t i v e l y t h ee f f e c to fo r a n g e j u i c ea d d i t i o ni st h eb e s t 8 t h eo p t i m a lp r o t o p l a s tf o r m a t i o nw a su n d e rt h ef o l l o w i n gc o n d i t i o n s ：t h es t a r t e r sa r e p r e c u l t i v a t e di nt h em e d i aw i t h0 s g r lo fm n 2 + f o r1 6 h ，t h ep r o t o p l a s tf o r m a t i o nr a t ew a s r e a c h e dt o6 2 5 - 7 3 6 b yt h eu l t r a v i o l e ti n d u c e dm u t a t i o no f p r o t o p l a s t sf o r2 0 sa n dd i e t h y l s u l f a t ei n d u c e dm u t a t i o no fc e l l sf o r3 0 m i n ，2 6s t r a i n sa r eo b t a i n e dw h i c hh a v et h ep r o p e r t y o f i m p r o v e m e n tb yi n i t i a ls e c o n ds c r e e n t h ea s t a x a n t h i ny i e l dc a nb ei n c r e a s e dl a r g e l yb yt h e u l t r a v i o l e ti n d u c e dm u t a t i o no f p r o t o p l a s t sb u tw i l lb en o ts t e a d y t h ea s t a x a n t h i ny i e l dc a nb e m g ha n ds t e a d yb yd i e t h y ls u r f a t ei n d u c e dm u t a t i o no fc e l l sb u tt h ea b i l i t yo fc e l lg r o w t hw i l l b ee v i d e n t l yw e a k k e y w o r d s ：p h a f f i ar 抽幽z l a s t a x a n t h i n p 廿g i u c o s i d a s e ，m a n g a n e s e ，p r o m o t e r ， p r o t o p i a s t ，i n d u o e dm u r a t i o n 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题耳：丝垫壁璺鐾监墨皇垃金盛墅丛堕壁垒 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 色) ，保密期至年月日为止。 学生签名：笙壁整 导师签名：丝兰互曼 ：卜年p 月，3 目 第一章绪论 第一章绪论 1 1 引言 类胡萝n 素( c a r o t e n o i d s ) 是含有多个共轭双键的萜烯基团类化合物。颜色以黄、橙和 红色为主。类胡萝h 索一般可分为两类：胡萝p 素( c a i 肼e n e s ) 和叶黄素( x a n t h o p h y n s ) 。前 者以b 胡萝h 素( d c a r o t e 鹏) 为代表，仅含碳、氢两种元素；后者是前者的含氧衍生物， 以黄体素( 1 u t e i n ) 、角黄素( c a n t h a x 蜘t l l i n ) 和虾青素( a s t a x a n t h i n ) 为主要代表【1 1 。几种常见类 胡萝h 素的结构如图1 1 所示。 类胡萝h 素是生物学上极重要的化合物，广泛存在于植物界所有进行光合作用的细 胞组织中，也存在于一些细菌、真菌、藻类及动物( 尤其是鱼类、鸟类) 和无脊椎动物 ( 如虾、蟹) 之中。到目前为i e ，已有7 0 0 多种类胡萝h 素被分离鉴定出来。其中黄体 索、紫黄素( v i o l a x a n t h i n ) 和新黄质( n e o x a a t h i n ) 是绿叶中主要的类胡萝h 素；而岩藻黄素 ( f u c o x a n t h i n ) 是海藻类生物所特有的天然类胡萝卜素( 2 1 。 类胡萝p 素能赋予各种生物绚丽的色彩；可作为动物重要的营养素；作为光合作用 的辅助色素，它能参与执行光能传递和物质转化、抗光敏化作用、淬灭自由基等重要的 生理生态功能，而且还能保护生物体免受不利环境因素的伤害i ”。 现己投产的类胡萝卜素主要有：b 胡萝b 素、角黄素、黄体素、玉米黄素、虾青素、 阿朴p 胡萝 素( 印。一b c a r o t e l l e ) 等f 4 j 。其中大多数为化学合成品，目前生物台成还无法 与化学合成相竞争。随着现代生物技术的发展与应用，类胡萝h 素的生物合成将逐渐实 现商业化。 1 2 虾青素 1 2 1 虾青素的结构及理化性质 虾青素( a s t a x a n t h j n ) ，又名虾黄质、虾黄素或龙虾壳色素，属于x a n t h o p h y l l s 类。化 学名称为3 ，3 一二羟基- 4 ，4 - 二酮基一p ，p - 胡萝卜素，分子式c 4 0 h 5 2 0 4 ，分子量为5 9 68 6 ，熔 点为2 1 6 c 扪。虾青素广泛存在于生物界中，特别是存在于水产动物如虾、蟹、鱼和鸟 类羽毛中。虾青素具有水不溶性和亲脂性，易溶于二硫化碳、砒啶、苯和氯仿等有机溶 剂；室温下在部分有机溶剂中的溶解度为：3 0 9 l ( 二氯甲烷) 、l o g l ( 氯仿) 、os g l ( 二甲基亚砜) 、o s # l ( 乙腈) 、o 2 9 r l ( 丙酮) ；在不同溶剂中有不同的最大吸收波长， 第一章绪论 如在氯仿、丙酮、甲醇中最大吸收波长分别为4 8 9 n m 、4 8 0 n m 、4 7 2 n m 。 0 缱生j u r l t l n 0 1 ) 几氯薯菇虹囊b 耵t o t n ) 哥稿虹囊c l r e o - e n ) 图l - l 几种常见类胡萝h 紊的化学结构 f 砘1 - 1c h e m i c a ls t r u c t u r e so f s e 哪lo r d i n m yc a r o t e n o i d s 虾青素分子中含有长链不饱和双键结构，在酸、氧、高温及紫外光条件下均不稳定， 氧化后变为虾红素( a s t a c e n e ) 。虾青素有三种手性异构体3 s 、y s ，3 r 、y s 和3 r 、y r ， 见图1 - 2 。几何构型大部分是反式异构体，也是热力学上最稳定的构型。 化学合成的虾青素均为游离虾青索，各立体异构体之间的比例是固定的，为n o s 、 3 s ) ：n 0 r 、y s ) ：n ( 3 r 、3 。r ) = 1 ：2 ：1 。天然虾青素主要以3 s 、3 s 或3 r 、y r 形式存在，往 第一章绪论 往与蛋白质形成复合物，产生不同的颜色( 如龙虾中的蓝色、绿色和黄色) ，加热使蛋 白质变性后才呈现鲜艳的红色。虾青素在细胞中很少游离存在，因为游离的虾青素不稳 定。虾青素的末端环状结构中各有一个羟基，可与羧基结合生成酯，所以天然虾青素常 以稳定的虾青素酯形式存在，如南极鳞虾中虾青素以酯化的3 s 、3 s 结构为主；红发夫 酵母中的虾青素以酯化的3 r 、3 r 反式结构为主；雨生红球藻中虾青素的立体异构体为 3 s 、3 s ，单酯约占8 0 ，双酯约占1 5 ，游离虾青索约为l ，主要的脂肪酸有油酸、 反油酸、蓖麻酸和花生酸等【6 i 。 0 i 静 o 3 r 3 矗 图卜2 虾青素分子的三种立体异构体 f i g 1 - 2t h r e es t e x e o i s o m c r so f a s t a x a n t h i nm o l e c u l a r 删 1 2 2 虾青素的功能及应用 虾青素具有独特的着色功能，但因其不是维生素a 原，一直被认为不具备生理活性。 直到二十世纪八十年代中期，人们才发现虾青素具有极强的抗氧化性能，在抗癌变、增 强免疫和抗光敏等生物学功能上远强于其它类胡萝h 素【7 】。目前，化学合成的虾青素主 要用于动物饲料添加剂，如用于某些观赏及养殖鱼类、甲壳类动物、禽类、猪等的饲料 中，而天然虾青索在食品添加剂、保健品、医药和化妆品等方面有着广阔的应用前景。 1 2 2 1 虾青素在饲料工业中的应用 1 着色功能 第一章绪论 自然界中大多数动物自身不能从头合成类胡萝p 素，只能通过食物链从植物或藻类 中获得。对于人工饲养的动物及其产品的色泽丽言，要使其保持自然放养状态下应有的 特征与品质，就必须在它们的饲料中添加有沉积作用的色素。 虾青素是类胡萝卜素合成的终点，呈艳丽红色。它进入动物体内以后可以不经修饰 或生化转化而直接贮存、沉积在组织中。在水产饲料中添加虾青素，可改善养殖鱼类的 皮肤及肌肉的色泽，如虾青素是养殖大马哈鱼及虹鳟鱼饵料中加入的首选色素；而肉禽 饲料中添加了虾青素以后，蛋黄、皮肤、脚、嚎等呈现出金黄色，大大提高了禽蛋、肉 的商品价值。 2 增强动物免疫功能 除了着色功能外，虾青索还可以提高动物个体的存活率，改善动物的健康状况【8 】。 如泰国大规模独角虾饲喂虾青素的试验结果表明，虾青素可使独角虾存活率、个体增重 效率和饲料转化率分别提高5 - 4 0 、1 0 0 , 6 和5 - 1 5 。虾青素对鱼类的生长繁殖也起到很 重要的作用，它可作为激素促进鱼卵受精，减少胚胎死亡率，促进生长，增加成熟速度 和增强抗病驻力，同时也能提高焦类的商品价值 9 1 。例如，j o h n s o n 将红发夫酵母添加 到饵料中，鲑鱼和鲟鱼食用了经破碎细胞壁的红发夫酵母后，虾青素积累在皮肤和肌肉 中呈红色。这种鱼营养丰富、色泽鲜艳、味道好，在欧美市场很受青睐，其价格也要比 普通的鱼高出许多倍。 1 2 2 2 虾青素在食品工业中的应用 虾青素为脂溶性色素，具有艳丽红色，国外将之作为着色剂添加于果酱、果冻，饮 料，水产品、肉制品等食品中1 7 1 。另外由于虾青素是一种强抗氧化剂，它的抗氧化性能 较维生素e 强8 0 5 5 0 倍，被誉为“超级维生索e ，将其添加到面条、腌制品及含脂质 较多的食品中，能起到保鲜，防止变色、变味、变质的作用【l “。 1 2 2 3 虾青素在化妆品工业中的应用 虾青素可解除光诱导的氧化胁迫，抑制光敏作用的能力强于b 胡萝h 素【“】。国外在 口红、唇膏中添加l 的红色发夫酵母油，使产品的着色力及持色性都得到了明显改善。 1 2 2 4 虾青素在医药工业中的应用前景 大量的流行病学调查、组织培养、动物试验及人体干预试验表明，虾青素具有防癌、 抗癌、提高免疫，预防氧化性组织损伤、血管硬化、视网膜黄斑退化等作用。如研究虾 第一章结论 青素等类胡萝 索对黄曲霉毒素b 1 ( a f b t ) 引发致癌作用的影响时发现，给由二乙基亚硝 胺( d e n ) 或* 硝基丙烷引发肺肿瘤的鼠饲喂3 - 4 周的虾青素，可显著降低肺肿瘤病灶的 大小与数目”1 。虾青索虽没有维生素a 活性，但能显著降低小鼠淋巴结病和蛋白尿的 发生，对这些症状的延迟作用比p 胡萝h 素更显著，虾青素还可显著促进小鼠脾细胞对 t d a g 反应中抗体产生，提高依赖于t 专一抗原的体液免疫反应1 1 2 l 。 1 2 3 虾青素的来源 虾青素主要存在于水生动物、藻类、酵母、细菌等生物类群中，这些都是虾青素的 潜在来源。目前医药用虾青素尚未产业化，- r l k 用的虾青素大部分为化学合成品，并且 价格昂贵，约为2 0 0 0 2 5 0 0 美t u k g 。随着虾青素多种保健功能的发现以及美国食品和 药品管理局( f d a ) 对化学合成虾青素使用范围的诸多限制【1 引，采用生物法生产天然虾 青索的研究越来越受到人们的关注。 1 2 3 1 化学合成 虾青素是类胡萝卜素合成的终点，人工化学合成比较困难，要经由多步化学和生物 催化反应才能完成 1 4 1 。1 9 8 4 年，瑞士的h o f f n m n n - l a - r o c h e 公司以( s ) 3 一乙酸基4 - 氧代b 紫罗酮为原料合成了反式虾青素，商品名为加丽素粉红( c a r o p h y l l p i n k ) ，虾青索含量 占5 - 1 0 ，是目前市场上鲑鱼饲料中着色剂的主要来源【1 5 1 。另外，德国的b a s f 公司 以3 - 甲基一5 ( 2 ，6 ，6 一三甲基- 3 氧- 羟基- 1 一环己烯基) 2 ，4 戊二烯三芳基磷酸盐和2 , 7 二甲基 2 , 4 ，6 三十八烯二醛反应合成9 6 9 7 的全反式虾青素1 6 1 。由于采用生物法生产虾青素 目前存在单位重量细胞的虾青素含量较低的问题，所以化学合成的虾青素仍具有一定的 竞争优势。 1 2 3 2 甲壳类动物及其副产品 大多数水生动物体内及软体动物的壳内都含有虾青索，自从1 9 3 2 年从蟹卵中提取 出虾青素后【1 7 1 ，甲壳类动物及其副产品一直是提取天然虾青素的主要原料。在挪威，虾 壳废奔物在传统上被用作饲喂鲑鱼和鳟鱼的虾青素来源【埔1 。但大多数甲壳类动物及其副 产品中的类胡萝h 素含量非常低，仅为8 0 - 2 0 0 m g k g 干废物，且提取费用较高，所以此 法不适用于商品化生产，发展潜力不大。 1 2 3 3 藻类 藻类中属于单细胞，带鞭毛的红藻类，如雨生红球藻( 胁陀m 口f d c o c c 埘础v c 以? ) 和微 第一章绪论 藻类的小球藻中都含有虾青素，血红裸藻( e u g l e n a s a n g u i n e a ) 和绿藻( c h l o r e l l a 踊力等在 不利的生长条件下也能产生虾青素，但含量较低。其中，雨生红球藻被认为是最具商业 化生产前景的藻类1 1 ”。该藻在氮缺乏条件下藻体内可积累虾青素，占藻体干重的2 - 4 ， 约占其类胡萝h 素总量的7 5 。虽然有一些大公司( 如美国的c y a n t e e h c o r p 公司) ，已 经建立了较为成功的培养雨生红球藻生产虾青素的工业化生产模式，并注册了自己的商 标( 主要有n a t u r o s e 和b i o a s t i n 0 ) ，但藻类的培养仍存在着自养周期长、光能利用率 差、易污染及成本高等问题，而且从藻体内提取虾青素也较困难，诸如此类的众多因素 严重影响了藻类规模化生产虾青素的进程i ”i 。 1 2 3 4 酵母 一些酵母菌能合成虾青素，其中细胞的虾青素含量较高、研究较多的要属红发夫酵 母( 尸蛔铷r h o d o z y m a ) 。相比之下，其它酵母的虾青素含量较低，如p h o d o t o r a l ar u b r a 、 c r y p t o c o c c u s 和p e n i o p h o r as p 等【2 1 0 2 1 。 红发夫酵母具有作为色素生物来源的一些必要的特征：合成的类胡萝h 索以虾青素 为主、不像藻类严格需要光照、能利用多种糖作为碳源进行快速异养代谢、培养时间短、 能在发酵罐中实现高密度培养等1 2 3 1 。但是野生型红发夫酵母的虾青素含量还不够高，只 有2 0 0 - - 3 0 0 m g k g 干细胞，与工业生产要求还存在一定的差距。尽管如此，红发夫酵母 仍以其生长速度快、发酵周期短，以及色素提取后菌体单细胞蛋白可作为饵料、饲料添 加剂等优点而成为目前的研究重点。 1 2 3 5 细菌 据报道，一些细菌如乳酸分支杆菌( m y c o b a c t e r i u ml a c t i c o l a ) 、短杆菌( b r e v i b a c t e r i u m l 和土壤杆菌( a g r o b a t e r i u ma u r a t i u m ) 也能产虾青素【2 ”，但这些细菌生长缓慢，虾青素含量 比较低，实际应用意义不大。但作为细菌，尤其是革兰氏阴性菌，在色素的提取上十分 简便容易，如能找到合适的高产菌株作为基因工程宿主菌，对虾青素生产将是十分有利 的。 1 3 红发夫酵母产虾膏素的研究现状 1 3 1 红发夫酵母简介 红发夫酵母最初由p h a f f 等人于1 9 7 0 s 在美国阿拉斯加的高山上和e l 本北海道的山 区阔叶树的渗出液中采集到1 2 4 1 。该酵母最显著的性质就是由于类胡萝卜素的存在使其菌 第一章绪论 落呈现红色至橙色。它能好氧发酵多种糖类，如葡萄糖、麦芽糖、蔗糖和棉子糖等。因 为所有的菌种都分离自日本( 9 株) 和美国的a l a s k a ( 1 株) 的山地阔叶树，p h a f f 等人 用r h o d o z y m am o n t a n a 来描述这一新的属和种。后为纪念p h a f f 在酵母生物学上多年的 研究，并符合命名规则，而更属名为p h a f f i a l 2 s l 。目前文献中r h o d o m y c e s d e n d r o r h o u s 与 p h a 咖ar h o d o z y m a 互用。 就分类学而言，红发夫酵母( 肼蛳口r h o d o z y m a ) 属于真菌界( f u n g i ) 、真菌门 ( e u m y c o t a ) 、担子菌纲0 3 a s i d i o m y c e t o u s ) 、银耳目( t r e m e l l a l e s ) 、囊状线黑粉菌科 ( c y s t o f i l o b a s i d i a c e a e ) 、红发夫酵母属0 h a m a ) 。这种分类是基于g o l u b e v 等在1 9 9 5 年对 红发夫酵母形态、生理生化特征作了详细的研究，并发现其能产生卵形孢子后才确定 的【2 6 i 。在此之前，无性繁殖的p h a 咖ar h o d o o , m a 一直被认为是p h a f f i a 属的唯一个种。 到目前为止，p h a f f i a 属至少存在两个种，即进行无性繁殖的p ，咖r h o d o z y m a 和有性繁 殖的x 咧h o p h y l l o m y c e sd e n d r o r h o u s t 2 7 1 。 a n d r e w s 等人【2 8 1 钡j 定了红发夫酵母野生菌株中的类胡萝h 素组成，其所产生的1 0 多种类胡萝卜素主要包括虾青素、争胡萝卜素、1 胡萝卜索及3 - 羟基3 ，4 f 一二脱氢巾坤- 胡萝h 素- 4 酮( h d c o ) 等。野生的红发夫酵母菌株中类胡萝b 素总量一般不超过 5 0 0 m g k g 干细胞，其中虾青素含量占4 0 - 9 5 。 1 3 ，2 红发夫酵母的虾青素生物合成途径 红发夫酵母的虾青索生物合成途径首先由a n d r e w s 等人1 2 剐于1 9 7 6 年根据从八氢番 茄红素( p h y t o e n e ) 至虾青索合成过程中所得的不同类胡萝h 素中间体而提出，而后在不 断发现叛中闻体的过程中被j o h n s o n 等人p 9 1 与a n 等人i ”1 完善。目前看来，若由葡萄糖 出发，经e m p 途径生成丙酮酸，氧化脱羧后生成a c c t y lc o a 以后，红发夫酵母的虾青 素合成路径可能如图1 3 所示。在整个合成过程中，甲羟戊酸0 讧v a ) 、异戊烯焦磷酸( r a p ) 、 法呢基焦磷酸固p p ) 、援牛儿犍牛儿焦磷酸( g g p p ) 、八氢番茄红素( c i s - p h y t o e n e ) 、四氢 番茄红素( n e u r o s p o r e n e ) 、b 一胡萝卜素等是该生物合成途径中的重要中间产物，它们及其 相应的结构类似物通常可作为高产菌株筛选的抑制剂或发酵过程的调控剂。 1 3 3 红发夫酵母育种研究概况 野生型红发夫酵母菌株在工业条件下生长良好，虽然其虾青素含量是甲壳类动物虾 青素含量的5 5 0 倍，但只有雨生红球藻中虾青素含量的1 1 0 。因此红发夫酵母生产 第一章绪论 虾青素的水平还必须提高l o 5 0 倍才能与工业化的化学合成虾青素以及雨生红球藻生产 的天然虾青索进行竞争。 对红发夫酵母进行菌种改良的方法主要有诱变育种、原生质体融合及基因工程技术 育种，而三种方法各有其优缺点。 1 3 3 1 诱变育种 对野生菌株进行随机诱交并筛选出虾青素高产菌株，是相对比较简单的方法。但此 方法依赖于诱变的效率及合适的筛选方法。因虾青素的颜色为橙红色，为突变株的初筛 分离提供了较为简便的方法。通常采用紫外线( u v ) 、硫酸二乙酯( d e s ) 、甲基磺酸乙酯 ( e m s ) 和亚硝基胍( n t g ) 等诱变红发夫酵母，然后进行突变株的分离。 l e w i s 等人【1 3 1 用1 0 5 m o l l b 紫罗酮筛选红发夫酵母，得到在平板上生长为黄色的突 变株n t g - 3 一l ，虾青素含量可提高2 - 3 倍，达到7 2 5 9 9 g 千细胞；f a n g 等人p 1 】用n t g 处理红发夫酵母数次，再用含有b 紫罗酮的酵母麦芽汁琼脂平板筛选，得到一变异株 n c h u - f s 3 0 1 ，产虾青素1 5 1 5 6 3 9 9 g 干细胞( 出发菌株产虾青素5 6 50 8 岭，l ) 。 c a l o 等人d 2 1 用e m s 和b e n o m y i 处理红发夫酵母获得突变株，其虾青素含量增加了 2 3 2 ，达到1 5 0 0 0 9 g 干细胞，一些变异株的细胞壁和，或细胞膜也发生改变，使胞内的 色素可直接用乙醇提取，虽然比用二甲基亚砜的色素提取率低，但虾青素产量仍然比出 发菌株提高了8 0 。a n 等人【3 3 】的研究表明，使用e m s 诱变红发夫酵母，正变率为0 2 ，正变幅度可达5 0 ，但突变株高产性能不稳定，回复突变频率高达5 1 0 。 n a m t h i p 等人【3 4 1 用7 5 1 u n o l l 二苯胺( d p a ) 处理红发夫酵母得到突变株的虾青素含量 为9 1 2 i _ t g g 千细胞，比野生菌株提高l 倍，细胞产量则与野生菌株差别不大。而吕玉华 等人】的研究说明二苯胺抗性突变频率极低。 通过诱变育种得到的高产突变株，其最主要缺陷是基因的不稳定性，在连续几次诱 变后，分离出高产虾青素突变株非常困难。虽然某些研究己经成功的分离出了改进虾青 素生物合成的突变株，但这些稳定的突变株大部分在生长速率或细胞产量上表现出明显 下降的趋势【3 ”。 1 3 3 2 原生质体技术育种 利用原生质体融合能大大提高重组频率，并扩大重组幅度，但此法通常要在使用选 择性标记上要做很多工作，方可获得高产虾青索的多倍体融合子。原生质体融合可用于 第一章绪论 乙酰辅酶a 2 ( a c 叫c o a ) 一 5 焦磷酸甲羟戊酸 ( 5 - d i p h o s p h o m e v a l o n 哟) 乙酰乙酰辅酶a1 3 - 甲基- b - 甲基戊二酰辅酶a ( a c o t o c t y lc o a ) _ ( h m g c o a ) 0 5 磷酸甲羟戊酸甲羟戊酸 1 。一( 5 - p h o s p h o m e v a l o n a t e ) 一( m o v a l o n a t e ) 异戊二烯焦磷酸；二? y - 二甲基烯丙基焦磷酸 o p p )。 ( d m a p p ) + 法呢焦磷酸( f p p ) 0 档牛儿槛牛儿焦磷酸( g g p p ) 八氢番茄红素( c i s - p h y t o o n o ) 四氢番茄红素( n c u r o s p o r e n e ) 产坠l 番茄红票( l y c o p e n e )b 玉米胡萝h 秉( b - z a a c a r o t c n e ) _i、 p 胡萝h 素( ：- c a r o t e n e )3 ，4 二脱氢番茄红紊o ，4 - d i d e h y d r o - l y c o p e n e ) c a r o t e n e ) t o m l l 。 ， 胡萝h素叶 上 海胆酮( e c h i n o n e )3 - 酮基t o r u l c n e 脱氢海胆酮( h y d r o x y o o h i n o n e )3 4 麟- 3 a - - 二脱氢& v - 胡萝p 素- 4 酮( h d c o ) 上 绯红素( p h l l i c o x “n ) 3 - 3 - 二脱氢d ，妒胡萝h 素_ 4 , 4 - 二酮( d c d ) 上 图1 - 3 红发夫酵母的虾青素生物合成途径 f i g 1 - 3b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo f a s t a x a n t h i ni np h a f f i ar h o d o z y m a 9 第一章绪论 无性生殖的用吲弦口r h o d o o , m a c h u n 等人3 6 1 利用原生质体融合技术构建了具有稳定高 产性能的类胡萝h 素户硇垆口r h o d o z y m a 杂交菌株，杂交菌株是色氨酸、亮氨酸、蛋氨酸 或精氨酸营养缺陷型，产类胡萝卜素约为2 2 3 0 2 2 8 0 1 x g g 干细胞( 出发菌株产类胡萝 素约为1 6 0 0 1 a g g 干细胞) 。然而，关于其杂交菌株的虾青素含量或酵母生长的信息