（食品科学专业论文）菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究.pdf

山东农业大学硕士论文 摘要 本研究测定并比较了菠萝果、皮、茎中蛋白酶活性及蛋白质含量，得 到同一品种及成熟度的菠萝果、茎及皮中的酶活差距较大，菠萝茎中酶活 性最高，果肉中次之，皮中最低。以菠萝茎为原料，比较了高岭土吸附法， 超滤浓缩有机溶剂沉淀法及纳米二氧化钛吸附法对茎菠萝蛋白酶纯化效 果的影响。对纳米二氧化钛吸附法制备的茎菠萝蛋白酶采用离子交换层析 法进一步纯化，并进行稳定性研究。主要结果和结论如下： 1 不同方法纯化效果比较高岭土吸附法所得菠萝蛋白酶回收率为 6 4 3 ，纯化倍数2 6 3 倍；超滤浓缩有机溶剂沉淀法所得酶回收率7 8 4 ， 纯化倍数1 3 4 倍：纳米二氧化钛吸附法所得酶回收率6 4 7 ，纯化倍数达 5 2 9 倍。通过三种工艺及纯化效果比较得：高岭土吸附法生产工艺和操作 较复杂，原材料消耗多，所需设备也多，纯化倍数不高；超滤浓缩有机溶 剂沉淀法截留液中与菠萝蛋白酶分子量相近的杂蛋白无法除去，导致所得 酶制品比活力较低。而纳米二氧化钛吸附生产工艺和操作简单，原材料消 耗少，并能减少与菠萝蛋白酶分子量相近杂蛋白对后续超滤步骤的影响， 纯化效果优于前两种方法。 2 纳米二氧化钛吸附法工艺优化在纳米二氧化钛吸附工艺优化过 程中，以纳米二氧化钛用量，p h ，温度，吸附时间等为因素，在单因素 实验的基础上进行正交试验，得到纳米二氧化钛的最佳吸附条件为：纳米 t i 0 2 用量为吸附液的3 5 ，吸附液p h 为4 7 ，吸附温度1 5 ，吸附时 间2 5 r a i n ，酶吸附率达9 8 2 。采用p h 6 0 ，0 4 m o l l 的柠檬酸缓冲液作 为洗脱液洗脱3 0 m i n ，酶回收率达7 9 3 。对洗脱液进行超滤，利用4 0 k d 和2 0 k d 的超滤膜两级截留超滤可有效的浓缩菠萝蛋白酶，去除杂蛋白， 操作过程中，压力差保持在2 5 x 1 0 5 3 x 1 0 5p a ，酶回收率6 4 7 ，纯化倍 数5 2 9 倍。 3 离子交换层析进一步分离纯化用离子交换层析法对纳米二氧化 钛吸附法所得蛋白酶进一步纯化。采用美国伯乐公司离子交换树脂 15 8 0 0 3 0 ，以p h 6 0 的0 0 1 m o l l t r i s - 磷酸盐溶液为初始缓冲液，以0 1 1 5m o l l n a c l 溶液进行线瞄扰脱，得到蛋白酶比活力6 4 x10 3u m g p r , 纯化倍数提高到 1 3 7 3 倍。 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 4 菠萝蛋白酶稳定性研究对纳米二氧化钛吸附法得菠萝蛋白酶进 行保存稳定性实验，结果表明：菠萝蛋白酶在p h 5 0 6 5 时，酶活力较稳 定，p h 6 0 时酶活力稳定性最好；菠萝蛋白酶在贮存过程中光对其稳定性 的影响显著，室温贮存1 0 天后，避光条件下酶活力保留率比室内自然光 照条件下高1 3 1 ；随着贮存温度( t ) 的升高，菠萝蛋白酶活力保留率 ( s ) 明显下降，呈线性关系，s = 1 1 9 5 1 4 1 1 t 。菠萝蛋白酶在7 0 以下 加热活力下降幅度较小，超过7 0 ，酶活力急剧下降；由半胱氨酸 ( o 0 0 5 ) 、e d t a ( o 0 5 ) 组或的复合稳定剂可使菠萝蛋白酶半衰期达 2 4 0 天。 关键词：菠萝蛋白酶；纳米t i 0 2 ：超滤；纯化 2 a b s t r a c t t h i sa r t i c l ew a sc a r r i e do u tt oi n v e s t i g a t et h ep r o t e a s ea c t i v i t ya n dp r o t e i n c o n t e n to fp i n e a p p l ep u l p ，s k i n ，a n ds t e m p i n e a p p l es t e mh a dt h eh i g h e r a c t i v i t yt h a np u l pa n dt h es k i ni nt h es a m es a m p l e k a o l i na d s o r p t i o n u l t r a f i l t r a t i o nc o n c e n t r a t e da n d o r g a n i cs o l v e n te x t r a c t i o na n dn a n o t i 0 2 a d s o r p t i o nw e r es t u d i e df o rt h ep u r i f i c a t i o no fs t e mb r o m e l a i n t h es t a b i l i t y o fs t e mb r o m e l a i np u r i f i e db y n a n o z i 0 2a d s o r p t i o nw a sd e t e n n i n e d a n d f u r t h e rp u r i f i e db yi o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y p r i m a r i l yr e s u l t sw e r ea s f o l l o w s ： 1 t h ec o m p a r i s o no fp u r i f i c a t i o na m o n gd i f f e r e n tm e t h o d s a2 6 3 f o l dp u r i f i c a t i o nw a so b t a i n e dw i t ht h er e c o v e r yo f 6 4 _ 3 t r e a t e db vk a d i l l a d s o r p t i o n ，a n dt h o s eb yu l t r a f i l t r a t i o nc o n c e n t r a t e da n dn a n o t i 0 2a d s o r p t i o n w e r e1 3 4f o l d ，7 8 4 a n d5 2 9 f o l d ，6 4 7 ；r e s p e c t i v e l y c o m p a r i s o no ft h e p u r i f i c a t i o ne f f e c ts h o w e dt h a t ：k a o l i n a d s o r p t i o nh a dd i s a d v a n t a g e so f c o m p l e xp r o c e s s i n g ，c o n s u m p t i v e ，e x c e s s i v ee q u i p m e n t s ，a n dl o wp u r i f i c a t i o n r a t e ；u l t r a f i l t r a t i o nc o n c e n t r a t e da n do r g a n i cs o l v e n te x t r a c t i o nc o u l dn o t r e m o v e p r o t e i n s o fs i m i l a r _ 。v e r , n a n o - t i 0 2a d s o r p t i o nw a s l e s s c o n s u m p t i v e ，a n dp u r i f i e d m o l e c u l a r w e i g h t w i t h b r o m e l a i n ；h o w e t h eb e s t p u r i f i c a t i o nm e t h o dw i t hs i m p l e ， 2 o p t i m i z a t i o no fn a n o - t i 0 2 a d s o r p t i o np r o c e s s o r t h o g o n a l e x p e r i m e n to fn a n o - t i 0 2a d s o r p t i o np r o c e s sw a sr e s e a r c h e db a s e do ns i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s t h e o p t i m i z e da d s o r p t i o nc o n d i t i o n so fn a n o t i o ， a m o u n t ，p h ，t e m p e r a t u r e ，a n da d s o r p t i o nt i m ew e r e3 5 ，4 7 ，15 ，2 5 m i n r e s p e c t i v e l y u n d e rt h ec o n t r o l l e dc o n d i t i o n s ，t h eb r o m e l a i na d s o r p t i o nr a t e w a s9 8 2 ，a n dt h eb r o m e l a i nr e c o v e r yw a s7 9 3 ，e l u t e d3 0 m i n u s i n gc i t r i c a c i db u f f e ro f 0 4 m o l l ( p h 6 0 ) t h ee l u a t ec o u l db ep u r i f i e db yt w o2 r a d eo f u l t r a f i l t r a t i o nw i t h4 0 k da n d2 0 k du l t r a f i l t r a t i o n m e m b r a n e w i t l lt 1 1 e p r e s s u r e2 5 x 1 0 s - 3 0 x 1 0 5 p a ，a n dt h er e c o v e r yo f p r o t e a s ea c t i v i t yw a s6 4 7 3 f u r t h e rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nb yi o n e x c h a n g ee h r o m a t o g r a 。p h y f u r t h e rs e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o no fb r o m e l a i nw a so p e r a t e db y 1 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ( b i o - r a d s 15 8 0 0 30i o ne x c h a n g er e s i n ) u s m gt r i s p h o s p h a t eb u f f e ro f0 o l m o l l ( p h 6 0 ) a st h ei n i t i a ls o l u t i o n ，a n di t w a sl i n e a re l u t e db y0 。1 1 5 m o l ln a c ls o l u t i o n ，t h ep r o t e a s es p e c i f i ca c t i v i t y c o u l d r e a c ht o6 4 x1 0 3u m g p r o ，w i t hp u r i f i c a t i o nr a t e1 3 7 3f o l d 4 s t u d i e so nt h es t a b i l i t yo fb r o m e l a i nt h ea n a l y s i so fs t e mb r o m e l a i n s t a b i l i t yr e v e a l e dt h a tb r o m e l a i nw a ss t a b l ea tp h 5 0 - 6 5 ，e s p e c i a l l ya tp h 6 0 ； l i g h tw a sr e m a r k a b l et ot h es t a b l ei n f l u e n c ei nt h es t o r i n gp r o c e s so fi t t h e b r o m e l a i na c t i v i t yu n d e rd a r kc o n d i t i o n sw a s13 1 h i g h e rt h a nt h a ti nn a t u r a l l i g h tc o n d i t i o n s t h eb r o m e l a i na c t i v i t y ( s ) d e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l yw i t ht h e i n c r e a s eo ft h es t o r a g e t e m p e r a t u r e ，a n d t h el i n e a r e q u a t i o n w a ss 2 1 1 9 。5 1 。4 1 1 1 , b u ti td e c r e a s e dr a p i d l ya b o v e7 0 ：a n dt h eb m m e l a i n s h a l f - l i f ew a se x t e n d e dt o2 4 0d a y sw i t ht h ee f f e c to fc o m p o s i t e s ( c y s t e i n e ， o 0 0 5 ；e d t a ，o 0 5 ) k e y w o r d s ：b r o m e l a i n ；n a n o - z i 0 2 ；u l t r a f i l t r a t i o n ；p u f f f i c a t i o n 4 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导师签 日期： 山东农业大学硕士论文 1 引言 菠萝蛋白酶( b r o m e l a i n ) ，别名菠萝酶，是存在于菠萝( a n a n ac o m o s l 2 s ) 植株中的蛋白质水解酶，为浅黄色无定形粉末，微有异臭。菠萝的果、茎、 柄和叶片中都含有菠萝蛋白酶。一般从菠萝果中提取的称为果菠萝蛋白 酶，从菠萝皮、茎中提取的为茎菠萝蛋白酶。八成熟的菠萝果汁含有约 0 4 的菠萝蛋白酶，成熟的菠萝果汁含有o 3 左右的菠萝蛋白酶，茎汁 含8 7 的菠萝蛋白酶( m u r a c h i ，e ta 1 ，1 9 6 4 ) 。1 9 8 1 年，m a r c a n o 首先发现 菠萝汁中含有蛋白水解酶，随后w i l l s t a t t e r ，b e r g m a n n 和m a r t i n 相继指出， 菠萝蛋白酶存在于果、皮和茎部中，存在于茎部的称为茎酶( s t e m b r o m e l a i ne c 3 4 2 2 4 ) ，存在于果汁中的酶称为果酶( f r u i tb r o m e l a i n e c 3 4 2 2 5 ) 。m u r a c h i 和n e u r a t h 、e 1 gh a r b a w i 和w h i t a k e r 采取层析法 分离提取了菠萝蛋白酶并研究了它的活性成分。 1 1 植物蛋白酶研究进展 蛋白酶广泛存在于各种动物、植物、微生物中，由于很多胞外酶容易 提纯，分子较小，功能简单，因而在酶学中蛋白酶的研究较早也最深入， 对它的化学结构和高级结构以及它的动力学、作用机制等的研究一直处于 领先地位，是一个比较成熟经典的研究领域( 路英华，1 9 9 1 ) 。 1 1 1 植物蛋白酶的分类 蛋白酶的种类很多，按其活性中心基团不同可分为四大类，即丝氨酸 蛋白酶、巯基蛋白酶、酸性蛋白酶和金属蛋白酶类。目前研究较多的植物 蛋白酶像木瓜蛋白酶、无花果蛋白酶等都是巯基蛋白酶，另外，菠萝蛋白 酶、剑麻蛋白酶、生姜蛋白酶等也都属于巯基蛋白酶。只在剑麻中曾发现 金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。可见植物蛋白酶以巯基蛋白酶最为普遍。目 前已知大约有2 0 多个蛋白酶家族活性依赖于其活性中心的巯基结构，木 瓜蛋白酶家族是其中最重要的一族。木瓜蛋白酶家族中的成员来源不同， 催化性质各异，但大多植物蛋白酶，像木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶等都属于 这一蛋白家族。 1 1 2 植物蛋白酶的分布及存在形式 植物蛋白酶从目前的研究情况看主要存在于一些热带、亚热带植物 中，像木瓜、菠萝、剑麻等。 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 植物蛋白酶一般都包括多种存在形式，像菠萝蛋白酶不但存在于菠萝 果中，而且茎、果皮和叶片中都含有，分别称为茎菠萝蛋白酶、果菠萝蛋 白酶等。这些蛋白酶不是单一成分，而是由多种不同分子量及分子结构的 酶分子组成的多酶体系( 林韶湘，1 9 9 4 ) 。研究植物蛋白酶在植株中不同器 官的分布及存在形式，对于植物资源的综合利用具有重要的现实意义。 1 2 菠萝蛋白酶的理化性质 结构特性研究表明，果菠萝蛋白酶是酸性酶，等电点为p h 4 6 ，茎菠 萝蛋白酶的分子量比果实菠萝蛋白酶的大，约为3 3 ，0 0 0 ，等电点为p h 9 5 ， 其活性中心的氨基酸顺序和催化机理与木瓜蛋白酶相似，并确定茎菠萝蛋 白酶为糖蛋白。o t ase ta l 研究指出，茎菠萝酶分子量为3 6 0 0 0 ，末端氨 基酸残基是丙氨酸，果酶分子量为3 0 0 0 0 ，末端氨基酸残基也为丙氨酸， 碳水化合物分析与m u r a c l l i 的分析结果相似。1 9 8 8 年，t l 迈诺特等由十 二烷基硫酸钠聚丙烯胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 测定果菠萝蛋白酶分子量 为2 2 2 0 0 2 5 0 8 0 ，等电点3 8 4 8 。 1 9 9 2 年，陈清西、颜思旭等采用化学修饰法探讨了果菠萝蛋白酶的 功能基团与活性关系，并用邹式图解法求出必需基团的数目，推断其反应 机理，利用d e a e 纤维素( d e 5 2 ) 和交联葡聚糖( s e p h a d e x g 7 5 ) 柱层 析纯化、提取果菠萝蛋白酶，获得圆盘电泳单一酶制剂，测定酶的分子量 为2 9 0 0 0 ，含1 7 种不同氨基酸，总残基数为2 8 6 个。化学修饰的研究结 果表明：巯基、氨基、l 色氨酸残基和唯一的l 组氨酸残基是酶活性必需 基团，丝氨酸和羧基与酶活性无关。他们利用荧光、紫外差示等光谱研究 果菠萝蛋白酶经甲醇、乙醇、乙二醇、不同浓度的盐酸胍及不同浓度十二 烷基硫酸钠( s d s ) 中的构象变化及变性后酶活力变化情况，结果表明， 随着有机溶剂浓度增大，酶活力呈直线下降，当甲醇、乙醇、乙二醇浓度 分别达到2 5 5 、2 0 5 、2 4 o 时，酶活力丧失一半，有机溶剂浓度达 5 0 时，酶活力完全丧失。在s d s 变性中，酶活力随s d s 浓度的增大而 呈指数下降，而0 【螺旋度开始有所下降，然后出现回升趋势，s d s 达 4 m g m l 时，酶完全失活，而0 c 螺旋度增大约2 4 。李兴，潘卫在8 m o l l 脲溶液中，用巯基乙醇将热失活菠萝蛋白酶中的二硫还原，使酶分子转变 成随机卷曲构象，除去变性剂，用氧化型谷胱甘肽( g s s g ) 氧化菠萝蛋 6 山东农业大学硕士论文 白酶分子，让已发生热变性的酶复原，结果表明，在菠萝蛋白酶浓度为 0 0 8 3 9 l ，p h 8 0 8 5 时，菠萝蛋白酶可以恢复原有活性的4 4 ，从而指 出酶的天然活性构象为能量的最低状态，由于动力学能障，热失活不能自 动回复成天然活性构象。 菠萝蛋白酶是各种酶的混合物，已知菠萝蛋白酶粗品中包含至少五种 蛋白水解酶，也包含非蛋白水解酶，包括酸性磷酸酶和过氧化物酶，并含 有淀粉酶和纤维素酶活性，还存在其他成分。菠萝蛋白酶成分的复杂性， 限制了其在生产中的应用，特别是医药领域对功能成分的要求上，因此对 菠萝蛋白酶的成分和各成分的具体功能的分析研究具有重要意义。 菠萝蛋白酶纯品是一种糖蛋白，分子结构中含有一个寡糖分子，由木 糖( x y l o s e ，x y l ) 、岩藻糖( f u c o s e ，f u c ) 、甘露糖( m a n n o s e ，m a l l ) 和n 一乙酰葡 萄胺( n a c e l t y l g l u c o s a m i n e ，g i c n a c ) 组成，共价连接在肽链上，i s h i h a r a 和 y a s u d a 等人分别推测出了糖分子的结构如图1 和图2 。 m a n m a n m a l l o l c l 嘎a c - g i c n a c il x y t f u c m a l l m a n g l c n a c g l c n a c ii x y l f u e ii m a n m a l l m a n g i c n a e j g l c n a c i a 曜a m a s n g l u - 图l 、i s h i h a r a 等推测的糖分子结构图2 、y a s u d a 等推测的糖分子结构 f i g 1t h em o l e c u l a rs t r u c t u r eo fs u g a r f i g 2t h e m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fs u g a r ( i s h i h a r a , 1 9 7 9 ) ( y a s u 帆1 9 7 1 ) y a s u d a 等研究表明，菠萝蛋白酶分子结构中糖分子不是催化必需的基 团。巯基基团是菠萝蛋白酶分子催化水解活性基团。陈清西等研究认为： 羧基和羟基与酶活性无关，而氨基、巯基、色氨酸残基和组氨酸残基是酶 催化活性的必需基团。 用离子交换柱层析、硫酸铵沉淀等方法提纯得到的菠萝蛋白酶进行研 究表明，菠萝蛋白酶相对分子量为3 3 2 0 0 d ，等电点为p h 9 5 5 ，酶液的最 大吸收波长为2 8 0 n m ，0 0 5 1 浓度的酶液在2 8 0 n m 的光吸收值达 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 0 9 8 4 ( m u r a c h i ，e ta 1 ，1 9 6 4 ) 。分子中有4 个n 一乙酰化的氨基己糖，含糖 2 1 ，分子中有2 8 5 个氨基酸残基，含氮量为1 5 8 8 。在m u r a c h i 等研 究的基础上，1 9 8 9 年，r i t o n j a 等排列出了菠萝蛋白酶主要组分的氨基酸 顺序，有2 0 种氨基酸，共2 1 2 个，c 端的氨基酸为谷氨酸( g l u ) ，n 端 的氨基酸为丙氨酸( a l a ) ，相对分子质量为2 3 8 2 8 。 菠萝蛋白酶作为有活性的蛋白质，易受到温度、p h 、金属离子等的 影响。研究表明( 章佩芬等，1 9 9 9 ) ：菠萝蛋白酶的最适反应温度介于 5 5 6 0 ，温度再高，酶的热失活增强，反应速度下降；菠萝蛋白酶的最 适p h 在6 5 7 5 ，在7 1 附近达最大值，在酸性环境中，酶反应速度下降 快，在碱性下有个较宽的应用范围，酶较稳定的p h 范围在3 5 4 5 ；菠萝 蛋白酶易受到铜、铁等金属离子的影响，使活性降低。而n a c l 、k c l 对 酶反应影响不大，m g c l 2 、c a c h 对酶有一定程度的抑制作用。生产过程 中，为了保护酶的活性，防止酶自身水解作用，常加入一些活性保护剂， 如e d t a 、维生素c 、半胱氨酸等，提高酶的活性，延长酶的保存时间。1 9 9 9 年，h h l i a n g 等人研究发现，茶多酚与菠萝蛋白酶结合后能提高酶的热 稳定性，延长酶的半衰期。 1 3 菠萝蛋白酶的提取纯化方法 菠萝蛋白酶的提取纯化方法很多，目前，用于工业化生产的提取方法 主要有三种( 王平诸等，2 0 0 2 ) ：高岭土吸附法、单宁沉淀法、超滤浓缩 法。 ( 1 ) 高岭土吸附法工艺流程 菠萝下脚料( 压榨) 一汁液( 高岭土吸附) 一吸附物( 洗脱、压 滤) 一洗脱液( 盐析) 一盐析物( 离心) 一湿粗酶饼( 溶解、过滤) 一澄清液( 沉淀) 一湿酶( 干燥) 一精品 ( 2 ) 单宁沉淀法工艺流程 菠萝下脚料( 压榨) 一汁液( 去杂质) 一澄清液( 加稳定剂) 啼 稳定液( 加单宁) 一单宁沉淀物( 洗脱) 一滤液( 干燥) 一酶制品 ( 3 ) 超滤浓缩法工艺流程 菠萝下脚料( 压榨) 一汁液( 去杂质) 一澄清液( 超滤浓缩) 一浓缩 液( 降温、加沉淀剂、沉淀) 一湿酶( 减压干燥) 一酶制品 山东农业大学硕士论文 以上方法中，高岭土吸附法所得产品酶活较高，但生产工艺和操作都 比较复杂，所需设备多，原材料消耗也多，酶活回收率低，污染环境，环 保投资大；单宁沉淀法，生产工艺和操作比较简单，但酶活回收率低，所 得酶的活性也不高，所加的单宁对环境造成一定污染。 目前，国内工业上生产大多采用超滤浓缩的方法。此法利用分子截留 原理，把大于和小于蛋白酶分子的大部分物质过滤除去，以达到浓缩酶液 的目的，菠萝汁超滤浓缩后，再进行干燥得到酶制品。这种方法较前两种 方法操作步骤少，条件温和，降低了酶活损失，生产和环保投入少，但所 得酶制品中含有没有酶活性的杂蛋白较多，此类蛋白分子量和菠萝蛋白酶 近似，所以超滤过程无法除去。此法所得酶活性也不足以满足医药级别及 食品中对酶活要求较高的应用。王平诸等在实验中对超滤浓缩法进行了改 进，把用p s a 膜超滤后的菠萝浓缩汁添加有机溶剂使酶沉淀，再经减压 干燥等步骤得到高活性酶制品。 为了解决目前工业生产方法不能得到高活性菠萝蛋白酶的现状，国内 外的研究者探索出了许多新的提取和精制菠萝蛋白酶的方法。虽然还没实 现工业化生产，但对大规模生产应用提供了可能。 将t i o z 、黏土、s i 0 2 、c a c 0 3 及活性炭混合，经高温烧结，制得可用 于柱层析的t i 0 2 多孔陶瓷( 李兴等，2 0 0 2 ) 。以陶瓷柱层析结合超滤法纯 化果菠萝蛋白酶，得到酶制品比活力9 3 7 u r a g ，酶活力回收率为4 8 ，纯 化倍数为5 倍。这种吸附材料化学惰性好，适用的p h 范围宽，可用于柱 层析，实现连续吸附、洗脱、再生这一层析过程，为工业化生产提供了可 能性。 利用磁性氧化铁微球固定聚丙烯酸吸附菠萝蛋白酶，研究表明 ( d o n g h w a n gc h e ne ta l ，2 0 0 4 ) ，室温下，p h 介于3 5 范围内，菠萝蛋 白酶的吸附率接近1 0 0 。在p h = 7 ，以o 1 m o l l 的磷酸缓冲液和浓度介 于o 6 2 0 m o l l 的k c l 作为洗脱液进行洗脱，由于没有内扩散阻力，吸附 和解吸过程在1 分钟内就能完成，菠萝蛋白酶的酶活回收率为8 7 4 。 利用包含环氧乙烷和环氧丙烷共聚物的双水相体系分离菠萝蛋白酶， 结果表明( r a b e l oe ta 1 ，2 0 0 4 ) ，最佳分离条件为共聚物中环氧乙烷含量 1 0 、共聚物的分子量2 0 0 0 9 m o l 、共聚物浓度为5 ( w w ) 、温度2 5 、 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 p h 6 0 、盐溶液浓度在1 5m m o l l 时，酶活回收率可达到7 9 5 。 用于酶纯化的方法主要有层析和电泳等技术，目前已得到部分层析纯 和电泳纯的单一菠萝蛋白酶组分，并弄清了某些组分的理化性质及药理作 用，但由于纯化材料价格昂贵等原因，限制了菠萝蛋白酶纯化的工业化应 用。 1 9 7 2 年，o t a e t a l 建立了一种分离纯化菠萝蛋白酶的方法，先将菠萝 蛋白酶溶解离心，收集s e p h a d e xg 7 5 柱层析的活性成分，再用 c m s e p h a d e xc 2 5 层析得到s b b1 - s b b55 种组分。 19 8 8 年，r o w a n 等用f p l c ( f a s tp r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) 通过 m o n os 阳离子交换柱分离出了茎菠萝蛋白酶中的主要成分s t e m b r o m e l a i n 和两种结构中不含糖分子的组分a n a n a i n 和c o m e o s a i n 。 h a r r a c he ta 1 在1 9 9 5 年和1 9 9 8 年用f p l c m o n os 阳离子交换柱和q 阴离子交换柱分别从菠萝蛋白酶中分离出了3 种有活性的碱性酶f 4 ，f 5 ， f 9 和2 种酸性酶s b a a ，s b a b 。 t l 迈诺特等将菠萝蛋白酶溶解于p h 5 0 的乙酸缓冲液中，通过在 s - s e p h a r o s e 上快速高效液相层析，用3 0 0 m l 以上的溶于乙酸缓冲液中的 0 - 0 8 m o l l 氯化钠线性梯度洗脱以分离菠萝蛋白酶的成分，得到经 s d s p a g e 测定的约1 5 0 7 k d 、2 5 8 5 k d 和2 7 4 5 k d 分子量并具有等电点 1 0 4 和1 0 4 5 的蛋白，并申请了专利。 1 4 菠萝蛋白酶的应用 菠萝蛋白酶在食品、医药、轻工化妆品等方面有广泛的应用。 1 4 1 菠萝蛋白酶在食品工业中的应用 在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、 酯和酰胺等，可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。菠萝 蛋白酶对含酪氨酸较多的蛋白质有很强的水解能力，用于牛肉加工中的嫩 化过程，可缩短时间、提高牛肉的适口感。m e l e n d oe t a l 于1 9 9 5 年研究了 菠萝蛋白酶对香肠的嫩化作用，菠萝蛋白酶以不同的浓度加入到一种干燥 的西班牙口利左香肠中，结果表明，菠萝蛋白酶对肌浆球蛋白和其他的肌 原纤维蛋白有明显的水解作用，以浓度6 u 1 0 0 9 的浓度加入到香肠中，低 温冷藏4 8 h ，感官分析得此浓度和作用时间的菠萝蛋白酶有很好的嫩化效 山东农业大学硕士论文 果并且不影响香肠固有的风味。1 9 9 7 年，m e l e n d oe t a l 又用菠萝蛋白酶对 鱿鱼进行嫩化研究，发现菠萝蛋白酶在8 0 u 1 0 0 9 的浓度、p h 7 0 、温度3 7 条件下与切成片状的鱿鱼作用3 0 m i n ，能产生比较理想的嫩化效果。用菠 萝蛋白酶对醇法所得大豆浓缩蛋白进行了水解研究，发现p h 6 5 ，反应温 度4 8 c ，底物浓度6 ，加酶量6 0 7 u g 的条件下水解4 h ，蛋白的水解度可 达11 0 7 ( 马宇翔等，2 0 0 6 ) 。 1 4 2 菠萝蛋白酶在医学上的应用 医学上认为菠萝蛋白酶是一种具有消炎及抗水肿作用的巯基酶，可以 用于各种原因所致的炎症、水肿、支气管炎、急性肺炎、乳腺炎等。与抗 菌药物合用治疗关节炎，蜂窝组织炎，小腿溃疡，呼吸系统的各种炎症和 尿路感染等。口服后能加强体内纤维蛋白的水解作用，将阻塞于组织的纤 维蛋白及血凝块溶解，改善体液的局部循环，从而消除炎症和水肿。与抗 生素及化疗药物并用，能促进药物对病灶的渗透和扩散，能分解纤维蛋白 的大分子，还能水解酪蛋白及血红蛋白等，它的水解蛋白的活性较木瓜酶 1 0 倍以上，因此有更加广泛的用途( m u r a c h it ，1 9 6 4 ) 。菠萝蛋白酶中含有 分子量为2 7 0 0 0 3 0 0 0 0 的两个肽酶，用其制备的脱痂制剂治疗深二度和三 度烧伤可在3 4 小时完成脱痂，全过程无需麻醉、备血，费用低，无手术 痛苦，脱痂十分彻底，对于功能部位的烧伤治疗具有重要的意义( 闰隆飞 等，1 9 9 8 ) 。 口服菠萝蛋白酶用于治疗各种癌症的研究起源于7 0 年代。体外研究已 证明菠萝蛋白酶具有某些细胞毒素的潜能。在m a u r e r 和b a t k i n 等人所作研 究之前，菠萝蛋白酶的抗肿瘤活性主要被解释为其纤溶活性和抑制血小板 聚合的作用，认为菠萝蛋白酶干扰了血纤维和肿瘤细胞的凝结。1 9 9 0 年， d e s s e re ta 1 发现菠萝蛋白酶在体外血液单核细胞培养中刺激产生c 【肿瘤坏 死因子。免疫调控，特别是细胞素的释放，被认为是产生菠萝蛋白酶治疗 潜力的原因。曾有专利认为菠萝蛋白酶的某一组分可用于治疗免疫系统受 抑制的病症或作为疫苗佐剂。菠萝蛋白酶具有免疫刺激作用，血液中丙种 球蛋白缺乏症病人的吞噬细胞表现出对这种刺激特别敏感。体内外的研究 表明，通过对辅助细胞的刺激作用和对t 细胞的直接抑制反应，菠萝蛋白 酶可以增强和抑制t 细胞的免疫反应。 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 也有研究表明，菠萝蛋白酶能作为胆汁酸受体拮抗剂阻止胃肠道重吸 收胆汁酸，从而治疗及预防高胆固醇血症及类似疾病。近年来也有研究发 现菠萝蛋白酶是免疫刺激剂、抗微生物剂和抗癌剂，它可用于治疗免疫系 统受抑制的病症、作为疫苗佐剂可用于治疗实体瘤或其它肿瘤( m e t z i g c ， 1 9 9 9 ) 。 菠萝蛋白酶的应用已有很长的历史，随着提取纯化技术的进步，它将 有更广泛的应用。我国菠萝资源丰富，年产菠萝1 0 0 万吨以上，每年都有 大量的菠萝皮、茎被浪费掉。同时，我国对菠萝蛋白酶的需求量逐年增多， 特别是高活性的菠萝蛋白酶。 在医药领域，对菠萝蛋白酶的纯度要求越来越高，甚至要明确起功能 作用的具体成分，而目前工业化生产的酶很难达到此标准，这就要求提取 纯化技术要不断进步，以满足各领域的需求。菠萝蛋白酶作为生物活性物 质，决定了其易受到外部环境的影响而失活。因此，在生产、储存、运输 过程中保持所需的酶活至关重要，这就要求酶的固定化技术、酶制品的微 胶囊化技术等要有所突破。 1 5 本课题研究的目的、内容、意义 1 5 1 研究目的 ( 1 ) 通过研究纳米二氧化钛对菠萝蛋白酶的吸附与洗脱，并与高岭 土吸附等传统方法比较，确定纳米二氧化钛对菠萝蛋白酶吸附效果的影响 及最佳洗脱条件。 ( 2 ) 通过研究超滤技术对菠萝蛋白酶液的浓缩，确定超滤技术浓缩 菠萝蛋白酶的最佳条件。 ( 3 ) 通过对离子交换层析进一步纯化菠萝蛋白酶的研究，确定纯化 菠萝蛋白酶的最佳条件。 ( 4 ) 通过纳米二氧化钛吸附、离子交换层析纯化及稳定性研究，确 定高活性菠萝蛋白酶的生产工艺。 1 5 2 研究内容 ( 1 ) 纳米二氧化钛吸附与高岭土吸附及超滤浓缩有机溶剂提取菠萝 蛋白酶的对比研究 ( 2 ) 纳米二氧化钛吸附、超滤技术纯化及冷冻干燥制备菠萝蛋白酶 山东农业大学硕士论文 的工艺优化 ( 3 ) 离子交换树脂柱层析技术纯化菠萝蛋白酶的研究 ( 4 ) 菠萝蛋白酶的保存稳定性研究 1 5 3 研究意义 我国菠萝资源丰富，年产菠萝1 0 0 万吨以上，约有2 0 万吨菠萝皮和 1 0 0 万吨菠萝茎被废弃，造成了浪费和环境污染。从这些废弃物中提取菠 萝蛋白酶，不仅使菠萝产业增值，而且开辟了菠萝废弃物综合利用的新途 径。 目前，我国年需菠萝蛋白酶千吨以上，而国内生产量不足1 0 。因此， 本课题采用高效吸附剂结合超滤技术从菠萝皮、茎中提取高活性菠萝蛋白 酶，并对其活性保持进行研究，对提高菠萝废弃物的综合利用，加快菠萝 及其蛋白酶产业的发展有重要意义。 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 2 材料与方法 2 1 主要材料 菠萝果、茎：海南果蔬食品配送有限公司提供，无刺卡因品种，7 - 9 成熟。 2 2 主要试剂 试剂名称生产厂家纯级 纳米t i 0 2 ( d 、 8 时，用1 0 u1 ) 总量1 0 m l 。 2 4 2 酶活测定方法 对于供试酶液( 2 4 4 1 ) 量取5 m l ( 酶制品称取样品0 0 1 5 9 ，置研钵 中，加适量酶稀释液研磨1 0 r a i n ) 用水移至1 0 0 m l 量瓶中，加水至刻度， 摇匀，量取5 m l 至1 0 m l 量瓶中，加酶稀释液至刻度，摇匀，放置1 5 m i n 后，准确量取l m l ，置具塞试管中于3 7 + 0 24 c 水浴中保温1 0 m i n ，精密 量取在3 7 0 2 c 中保温的酪蛋白溶液5 m l ，迅速加入混匀，同时开动秒 表，准确反应1 0 r a i n ，立即加入三氯乙酸溶液5 m l ，摇匀，过滤。另取样 品溶液l m l 置具塞试管中于3 7 + 0 2 c 保温1 0 m i n ，精密加入3 7 三氯乙 酸溶液5 m l ，准确反应1 0 r a i n ，立即精密加入酪蛋白溶液5 m l ，摇匀，过 滤，滤液作空白，按照分光光度法( 中国药典1 9 7 7 版) 在2 7 5 n m 处测定 吸光度( 施特尔马赫，1 9 9 2 ) 。 准确称取酪氨酸标准品5 0 m g ，置1 0 0 m l 量瓶中，加o 1 m o l l 盐酸溶 菠萝蛋白酶提取、分离纯化及稳定性研究 液至刻度，摇匀，准确量取l m l 置1 0 m l 量瓶中，加o 1 m o l l 盐酸溶液 至刻度，摇匀( 每l m l 含酪氨酸5 0 9 9 ，以水作空白，在2 7 5 n m 处测定吸 光度。 在p h 7 0 ，3 7 * ( 2 条件下，每分钟水解酪蛋白生成l p g l 酪氨酸所需的 酶量为一个活力单位。 酶活力计算公式： 每克( m l ) 菠萝蛋白酶活力u g ( u m l ) = 石a s o 。1 1 。意以 1 0样品体积( 重量) a ：样品吸光度 a s ：酪氨酸吸光度 1 1 ：样品最后反应完毕体积 1 0 ：反应时间 5 0 ：每m l 含有酪氨酸的烬数 2 4 3 蛋白含量测定方法 采用考马斯亮兰g 2 5 0 法( g e o r g er ，1 9 7 3 ) 测定蛋白质含量： 标准蛋白溶液的配制：称取1 0 m g 牛血清白蛋白溶于去离子水并定 容至1 0 0 m l ，配成0 1 m g m l 的标准蛋白溶液。 考马斯亮兰g 2 5 0 染料试剂：称1 0 0 m g 考马斯亮兰g 2 5 0 ，溶于 5 0 m l9 5 的乙醇后，再加入1 2 0 m l8 5 的磷酸，用水稀释至l l ，过滤后 贮于棕色瓶中。 标准曲线的绘制：取7 支试管，编号后如表1 ，混匀，放置2 m i n 后，在5 9 5 n m 波长下比色测定( 应在l h 内完成) ，以牛血清白蛋白含量 ( 嵋) 为横坐标，以吸光度为纵坐标。 表1 不同浓度蛋白溶液的配制 t a b l e1s o l u t i o n so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so ft h ep r o t e i np r e p a r a t i o n 蛋白质标准溶液( 1 n l ) 0 o 1o 2 o 4 0 60 81 0 去离子水( m l ) 1 0 0 90 80 6o 40 20 蛋白质浓度( i r t g m l ) 0 1 02 04 06 08 01 0 0 山东农业大学硕士论文 蛋白质含量的测定： 根据表1 不同蛋白质浓度样品液分别测定吸光度，以蛋白含量为横坐 标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线： 图3 蛋白质浓度标准曲线 f i g 3s t a n d a r dc u i v eo fp r o t e i nc o n c e n t r a t i o n 所得曲线方程为：y = o 0 0 2 8 x + 0 0 7 4 3 ；r 2 = o 9 9 9 6 ；式中：y 为吸光度， x 为蛋白质浓度触。 2 4 4 酶的纯化方法 2 4 4 1 供试酶液的制备 清洗后菠萝茎在4 c 冷室中预冷1 2 h ，组织捣碎机捣碎，加1 倍o 0 5 m o 儿，p h 6 0 磷酸缓冲液( 含5m m o l l 的e d t a ) 浸提，缓慢搅拌，浸 提l o m i n ，4 层纱布过滤，离心( 4 0 0 0 r p m ，1 5 m i n ) ，上清液即为供试酶 液，蛋白质含量为1 6 2m g m l 。( 菠萝果、皮中酶供试液制备方法同上) 操作