（植物学专业论文）β葡萄糖苷酶基因的克隆及其表达.pdf

福建师范大学潘海芳硕士学位论文 摘要 白藜芦醇以游离态和糖苷结合态两种形式存在，是一种重要的植物抗毒素，主 要存在于虎杖、葡萄等植物中。b 葡萄糖苷酶不仅能够水解白藜芦醇苷为白藜芦醇， 还能够作用于细胞壁碎片或其它细胞组成，从而生成更多的白藜芦醇。本实验实现 了木醋杆菌b 葡萄糖苷酶基因的原核表达，目的是为了生产粗酶制剂，用于提高从 植物中提取白藜芦醇的得率；分别在d n a 和e d n a 水平从黑曲霉中克隆b 一葡萄糖苷 酶基因，为下一步在酿酒酵母中实现分泌表达以提高葡萄酒的白藜芦醇含量的研究 奠定基础。 本实验通过降落p c r 得到b 一葡萄糖苷酶基因，然后将目的基因亚克隆到原核表 达载体p q e 3 0 转化大肠杆菌m 1 5 。测序表明，表达载体构建成功。用i p t g 诱导表 达，目的蛋白表达量达到菌体总蛋白的2 38 ，但表达的蛋白主要以包涵体形式存 在。 本实验利用种属相似性设计了一对引物。先后以黑曲霉基因组d n a 、m r n a 为模 板，利用p c r 与r t p c r 技术得到b 一葡萄糖苷酶基因的d n a 序列和e d n a 序列，将目 的基因分别克隆在p m d l 8t 和p m d l 9 - - t 上。测序表明，克隆得到的d n a 序列全长 2 9 2 4b p ，c d , 、a 序列全长2 5 8 3b p ，编码8 6 0 个氨基酸。与g e n b a n k 中已登录的黑曲 霉b 一葡萄糖苷酶的氨基酸序列比较，相似性达9 7 9 9 。 关键词：$ 一葡萄糖苷酶；克隆；表达：黑曲霉；p q e 3 0 ；白藜芦醇 望垄鉴苎盔兰堡堂茎堡主堂垡笙奎 a b s t r a c t r e s v e r a t r o l ，e x i s t e di nt w of o r m s ，g l y c o s y l a t e di s o m e r sa n df r e ei s o m e r s ，i sa n i m p o r t a n tp h y t o a l e x i n , m a i n l yp r o d u c e di np l a n t ss u c hl i k ep o l y g o n u mc u s p i d a t u ma n d g r a p e f l - g l u e o s i d a s e c a l l h y d r o l y s eg l y e o s i d i c a l l y - b o u n d d e r i v a t i v e sa n dr e l e a s et h e c o r r e s p o n d i n gr e s v e r a t r o li s m o r , b e s i d e s ，f l - g h i c o s i d a s ep r o v i d e sm o r es u b s t r a t ef o rt h e r e l e a s eo fr e s v e r a t r o lf r o mc e l lw a l ld e b r i so ro t h e rc e l l u l a rc o m p o n e n t ss oa st oi n c r e a s e t h ea m o u n to fr e s v e r a t r 0 1 t h ep u r p o s eo ft h ee x p e r i m e n ti st or e a l i z et h ep r o k a r y o t i c e x p r e s s i o no fp - g l u e o s i d a s eg e n ef r o ma c e t o b a c t e rx y l i n u ma t c c2 3 7 6 9 ，w h i c hw i l lb e u s e dt op r o d u c ee n z y m ep r e p a r a t i o ns o a st od e v e l o pt h ee f f i c i e n c yo fe x t r a c t i n g r e s v e r a t r o lf r o mp l a n t s a s p e r g i l l u sn i g e rf t g l u c o s i d a s eg e n ei sc l o n e db o t ha td n al e v e r a n de d n al e v e r ，w h i c hw i l ll a yaf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c ha b o u ti t se x p r e s s i o ni n s a c c h a r o m y c e ac e r e v i s i a ei nas e c r e t o r yf o r mw i t ht h ea i mo fi n c r e a s i n gr e s v e r a t r o l c o n t e n t si nw i n e s i nt h ee x p e r i m e n t ，t o u c h - d o w np c rw a su s e dt oo b t a i nb e t a - g l u c o s i d a s eg e n e t h e t a r g e tg e n ew a st h e ns u b - c l o n e t op r o k a r y o t i ee x p r e s s i o nv e c t o rp q e 3 0a n dt h e r e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e dt oe c o i lm 1 5 s e q u e n c i n gt h ec o n s t r u c ts h o w e d t h a tt h ep l a s m i dp q e 3 0 - b g l ni sc o n s t r u c t e ds u c c e s s f u l l y t h et a r g e tg e n ew a se x p r e s s e d b yi n d u c t i o no fi p t ga n dt h ee x p r e s s i o np r o d u c ta c c o u n t e df o r2 3 8 o ft h et o t a l p r o t e i n s h o w e v e r , m o s to f t h ee x p r e s s e dp r o t e i ne x i t e di nt h ef o r mo f i n c l u s i o nb e d y h lt h ee x p e r i m e n t ap a i ro fp r i m e r sw a sd e s i g n e db ys p e c i e ss i m i l a r i t y g e n o m i c d n aa n dm r n ai s o l a t e df r o ma s p e r g i l l u sn i g e rw e r es u c c e s s i v e l yu s e da sp c rt e m p l a t e t h em e t h o d so fp c ra n dr t - p c rw e r eu s e dr e s p e c t i v e l yt oo b t a i nt h ed n aa n de d n a o f b e t a g l u c o s i d a s eg e n e t h et w ot a r g e tg e n e sw e r et h e nc l o n e dt op m d l 8 - t v e c t o ra n d p m d l 9 一tv e c t o rr e s p e c t i v e l y s e q e n c ea n a l y s i si n d i c a t e dt h a td n a s e q u e n c ew a s2 9 2 4 b p ，e d n as e q u e n c ew a s2 5 8 3b p ，w h i c hi se n c o d i n g8 6 0a a t h ei d e n t i t yo ft h ed e r i v e d p r o t e i nw i t ha s p e r g i l l u sn i g e rf l - g l u e o s i d a s er e g i s t e r e d i ng e n b a n ki s9 7 - 9 9 k e y w o r d s ：b e t a - g l u c o s i d a s e ；c l o n ee x p r e s s i o n ；a s p e r g i l l u sn i g e r ；p q e 3 0 ；r e s v e r a t r 0 1 i i 福建师范大学潘海芳硕士学位论文 中文文摘 白藜芦醇以游离态( 顺式，反式) 和糖昔结合态( 顺式、反式) 两种形式存在， 是一种重要的植物抗毒素，主要存在于虎杖、葡萄等植物中药理学研究表明，自 藜芦醇具有抗癌抗心血管疾病等生理活性。b 一葡萄糖苷酶不仅能够水解白藜芦醇苷 为白藜芦醇，还能够作用于细胞壁碎片或其它细胞组成，从而生成更多的白藜芦醇。 利用基因工程手段克隆b 一葡萄糖苷酶基因，并实现它在原核系统或真核系统的表 达，有很大的实际意义。 本实验成功构建了原核表达载体p q e 3 0 一b g l n ，并实现其在大肠杆菌m 1 5 的高效 融合表达。根据质粒p u c p 6 7 ( 含木醋杆菌的b 一葡萄糖苷酶基因) 与载体p q e 3 0 的 序列。应用p r i m e rp r e m i e r5 0 软件，设计了一对带有相应酶切位点的引物。以质 粒p u c p 6 7 为模板，通过降落p c r 得到b 一葡萄糖苷酶基因( 本文定义为b g l n ) ，然 后通过酶切、纯化、连接，将目的基因亚克隆到原核表达载体p q e 3 0 上，转化大肠 杆菌m 1 5 。双抗性筛选重组子，提取重组质粒，酶切初步鉴定后送检测序。结果表 明，确实含有目的基因片段，且读码框正确，重组质粒p q m 3 0 一b g l n 构建成功。 得到的重组菌虽然证明含有目的基因，但不同的菌株表达该基因的能力不同， 因此需要诱导后，用s d s - p a g e ( s d s 一聚丙烯酰胺凝胶电泳) 来筛选能够高效表达 外源基因的菌株。该菌株用i p t g ( 异丙基硫代一b d - 半乳糖苷) 诱导后，检测不 同诱导时间的表达情况。结果表明，诱导0 5 小时，外源蛋白的表达量即有大幅增 加，诱导3h 以后表达量不再增加。利用t o t a l l a b 软件对s d s p a g e 胶中各泳道进 行了分析，结果表明目的条带诱导3h 后表达量可以达到最高，占总蛋白的2 3 8 。 检测外源蛋白在大肠杆菌中的存在形式，所表达的外源蛋白在细胞中主要以包涵体 的形式存在。这种情况在原核表达中属于正常现象。在诱导外源蛋白表达时候，分 别尝试了低温( 2 5 c ) 、低i p t g 浓度( o 0 5m m ) 诱导、降低培养时摇床的转速、 加大抗生素的剂量( 减少重组质粒拷贝数的下降) 、延长超声破菌的时间、超声破 菌前添加溶菌酶处理( 有助细菌破壁) ，结果表明这些措施均对减少包涵体的形成 没有太大影响。这主要与表达的外源蛋白的氨基酸组成( 外源蛋白含有2 个半胱氨 酸，脯氨酸含量高达6 2 ) 有关。由于包涵体富含重组蛋白，且易于分离纯化， 只要能对包涵体成功复性，就可获得大量有活性的b 一葡萄糖苷酶，将可用于生产粗 酶制剂，对植物组织酶解后进行提取，有助于提高白藜芦醇的得率。 i l l 福建师范大学潘海芳硕士学位论文 本实验分别在d n a 和e d n a 水平从高产9 一葡萄糖苷酶的黑曲霉品种中克隆了b 一 葡萄糖苷酶基因根据s i e g e ld a n 等人2 0 0 0 年报道的黑曲霉b 一葡萄糖苷酶基因 全序列，应用p r m i e rp r e m i e r5 0 软件设计了一对引物。先通过p n p g ( 对一硝基 苯基一b d - 葡萄糖苷) 为底物的比色法测定黑曲霉的b 一葡萄糖苷酶活性，来优化 发酵培养基的碳源，并证明该黑曲霉菌种具有较高的b 一葡萄糖苷酶活性，可以作为 提取r n a 的材料采用改进的c t a b ( 十六烷基三乙基溴化铵) 法提取黑曲霉基因组 d n a 。电泳结果表明d n a 质量良好，能够满足下一步实验的需要。以此d n a 作为模扳， 使用设计的引物p c r 获得b 一葡萄糖苷酶基因的d n a 序列。利用同样的引物，使用 r t p c r ( 反转录p c r ) 的方法克隆b 一葡萄糖苷酶基因的c d n a 序列。先进行黑曲霉 的诱导培养。为便于菌丝球与培养基的分离，对半固体培养基做了适当改进，成为 液体培养基，并添加纤维二糖作为诱导物。以诱导培养3 天的黑曲霉菌丝球作为实 验材料，按照p r o m e g a 的s vt o t a lr n ai s o l a t i o nk i t 的操作要求提取总r n a 电泳结果表明r n a 质量良好，能够满足下一步反转录的需要。以0 1 i g o ( d t ) ”p r i m e r 和r a n d o mp r i m e r ( 6 9m e r ) 为下游引物反转录为c d n a 第一链，再通过p c r 获得 c d n a 第二链即b 一葡萄糖苷酶基因的c d n a 序列。将得到的p c r 产物经纯化之后分别 克隆在t 载体p m d l 8 - - t 和p m d l 9 一t 上。蓝白斑筛选重组子，提取重组质粒，p c r 及酶切初步鉴定后送检测序。 测序结果与n c b i 上的黑曲霉b g l l 基因( 登录号为a j l 3 2 3 8 6 ) 进行比对，发现 d n a 序列十分类似，含有七个外显子和六个内含子，第一个外显予编码信号肽，后 面六个外显子编码成熟肽。开放阅读框由8 6 0 个氨基酸组成，推测分子量为9 2k d a 。 d n a 序列全长2 9 2 4b p ，相似性达9 8 6 ；c d n a 序列全长2 5 8 3b p ，相似性达9 8 8 ；氨基酸序列相似性达9 9 。其中发现有2 7 个碱基发生置换，1 个碱基发生插入 ( t ) ，但碱基插入的位置是在内含子区域，不影响基因的编码区。有部分碱基置换 发生在外显子区域，引起了两个氨基酸的改变：苯丙氨酸( f ) 变成酪氨酸( y ) ，天 冬酰胺( n ) 变成天冬氨酸( d ) 克隆得到的b 一葡萄糖苷酶基因推导的氨基酸序列 ( 本文定义为pg ) 与另一个已登录的黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e ra s 3 3 5 0 ) 的 b e t a - g l u c o s i d a s e ( 登录号为a b b 2 9 2 8 5 ) 氨基酸相似性达9 7 。pg 成熟肽的第 2 6 1 位氨基酸是a s p ( d 2 6 1 ) ，这是糖苷水解酶家族3 的高度保守氨基酸，作为该酶 的催化亲核试剂。此位点以及周围的几个氨基酸序列v m s d w 在糖苷水解酶家族3 中 也是高度保守的。运用分子进化遗传分析软件m e g a3 1 对g 与g e n b a n k 上登录的 福建师范大学潘海芳硕士学位论文 9 种真菌的b 一葡萄糖苷酶氨基酸序列做系统进化树分析，结果体现了黑曲霉与这些 真菌物种的亲缘关系与差异性。 为表达克隆得到的bg 基因，以便进一步了解蛋白质功能并实现其应用价值， 欲将bg 基因构建到带有信号肽的酿酒酵母质粒上，实现在酿酒酵母中的分泌表达。 这样的转基因酵母可以应用在葡萄酒的酿造上。分泌表达的d 一葡萄糖苷酶可以水解 部分风味前体物质，明显改善葡萄酒的风味。更重要的是，表达的9 一葡萄糖苷酶不 仅能够水解白藜芦醇苷为白藜芦醇，还能够作用于葡萄细胞的细胞壁碎片或其它细 胞组成，从而增加葡萄酒的白藜芦醇含量。因此，实现黑曲霉的b 一葡萄糖苷酶基因 在酿酒酵母中的分泌表达，不失为葡萄酒行业提升葡萄酒品质，增加经济效益的一 个重要前提。 v 第1 章综述 第1 章综述 1 1纤维素酶的概述 纤维素是地球上数量最大的可再生性能源物质。据报道，全球每年通过光合作 用产生的纤维素高达1 5 5 xl o 吨，其中8 9 尚未被人类利用“1 。对纤维素的有效利 用将给能源、饲料和食物的持续供应带来巨大作用。从化学反应来看纤维素的降解 只涉及b 一1 ，4 一糖苷键的水解作用及氢键的断裂，是一个简单的反应过程。但是作为 植物细胞结构的纤维素是由纤维二糖单元组成的螺条形的糖链通过氢键( 或其它共 价键) 相互作用来定向平行排列和堆彻而成的惰性高聚物，需在纤维素酶系中三类纤 维素酶的协同作用下才能完全降解为葡萄糖 纤维素酶是能将纤维素水解成葡萄糖的一组酶的总称，分为内切b - 1 ，4 - 葡聚糖 苷酶( e n d o 一1 ，4 - g l u c a n a s e ，e g ，e c 3 2 1 4 ) ，在纤维素内部随机切断糖苷键；外 切b d - 1 ，4 一纤维二糖水解酶( e x o - 1 ，4 - b c e l l o b i o h y d r 0 1 a s e ，c b h ，e c 3 2 1 9 1 ) ， 从纤维素非还原端或还原端释放纤维二糖基本单位；b - d - 葡萄糖苷酶 ( 6 一d - g l u c o s i d a s eo rc e l l o b i a s e ，b g l ，e c 3 2 1 2 1 ) ，将各种寡糖及纤维二糖 降解为葡萄糖。这些酶协同作用有效降解纤维素。 m a r kh o l t z a p p l e 等认为纤维素酶水解纤维素的中间产物纤维二糖是纤维素酶 的非竞争性抑制物，会对纤维素酶的催化作用形成强烈的反馈抑制，纤维二糖的水 解是纤维素酶降解纤维素的限速步骤0 1 b 一葡萄糖苷酶在纤维素酶水解过程中为最 后一步关键酶，对纤维素糖化水解具有关键性作用。但从微生物所产纤维素酶来看， b 一葡萄糖苷酶在纤维素酶中所占比例很低，不足l ，这使得b 一葡萄糖苷酶成为纤 维素降解成单糖的瓶颈啪。由于纤维素是生物圈内最重要的可再生生物质资源，在 解决能源和环境危机中可起到重要作用。但纤维素需被降解为葡萄糖后才能被大多 数微生物所利用，因此许多研究者正致力于纤维素转变为单糖的工作铷 1 2b 一葡萄糖苷酶的概述 1 2 1b 一葡萄糖苷酶的分类与底物特异性 根据氨基酸序列分类，人们将b 一葡萄糖苷酶划分在糖苷水解酶家族1 和3 中。家 族1 中的b 一葡萄糖苷酶来自于细菌、植物和哺乳动物；家族3 中的酶来自于真菌、细 菌和植物。家族1 中的酶除有葡萄糖苷酶活性外，还有很强的半乳糖苷酶活性“1 。 几乎所有的b 一葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差，能裂解c 一0 糖 福建师范大学潘海芳硕士学位论文 苷糖、c s 键、c _ n 键，c - f 键等；有些对糖基部分的c 4 和c ：构形也不专一，能同时水 解b 一葡萄糖苷酶键和1 3 一半乳糖苷键，有些甚至c 。位的专一性也不高，能水解木糖。 但在所有底物中，b 一葡萄糖苷酶对纤维二糖的活性最强。在b 一葡萄糖苷酶c 端的高 度保守序列可能与结合糖苷底物有关，在这区段的微小差异决定了1 3 一葡萄糖苷酶的 不同底物特异性叫。 1 2 21 3 一葡萄糖苷酶的理化性质 b 一葡萄糖苷酶有胞内酶和胞外酶之分，有些生物体内只含有胞内1 3 一葡萄糖苷 酶，也有些只含胞外p 一葡萄糖苷酶，但也有少部分微生物体内同时含有胞内和胞外 8 一葡萄糖苷酶。1 3 一葡萄糖苷酶的相对分子量一般在4 0 - 2 5 0k d a 之间。不同来源的 1 3 一葡萄糖苷酶的相对分子量由于其结构和组成不同而差异很大。大部分b 一葡萄糖 苷酶的最适p h 都在酸性范围，并且变化不大，但最适p h 可以超过7 0 ，而且酸碱耐受 性强。大部分b 一葡萄糖苷酶的p i 在酸性范围，并且变化不大，一般在3 5 - 5 5 2 间， 也有少数的1 3 一葡萄糖苷酶其p i 在碱性范围。1 3 一葡萄糖苷酶的最适温度在4 0 - 1i o 。c 之间都有分布，一般来说，来自古细菌的b 一葡萄糖苷酶其热稳定性和最适温度要高 于普通微生物来源的d 一葡萄糖苷酶。对于工业应用来说，酶的热稳定性越高越有利， 因此，从嗜热细菌中分离b 一葡萄糖苷酶引起了人们的兴趣0 1 。最近p a r k 等人对从海 洋嗜热真细菌( m a r i n eh y p e r t h e r m o p h i l i ee u b a c t e r i u mt h e r m o t o g an e a p o l i t a n a ) 中克 隆得到的b 一葡萄糖苷酶基因( b g l a ) 进行原核表达，并分析得到的重组蛋白( b g l a ) 性质。b g l a 在1 0 0 c 时仍能够保持9 4 以上的初始酶活。酶的半衰期分别是1 0 0 ， 3 6h ；1 0 5 c ，1 2m i n 1 2 3 产b 一葡萄糖苷酶的微生物 目前已经发现的产生b 一葡萄糖苷酶的生物类群包括原核生物、真核生物、古细 菌三个界，共几十个属，几百个种”1 。虽然b 一葡萄糖苷酶广泛存在于植物的种子和 微生物中，但植物来源的8 一葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低“1 ，所以目前的研 究主要集中在微生物上。 产b 一葡萄糖苷酶的微生物种类极多，陆地及海洋微生物均有分布。主要包括好 氧及厌氧的细菌、丝状真菌、放线菌、酵母、藻类及古细菌等。这其中既有生长在 潮湿环境中，可以分解植物残体的腐生菌，也有能够侵染植物的寄生菌以及反刍动 物体内的瘤胃微生物。在一些极端环境如盐碱湖、热泉中，也发现具有产b 一葡萄糖 苷酶能力的微生物。目前对b 一葡萄糖苷酶产生菌研究较多的是丝状真菌，主要为曲 2 ， ，t l i j 第1 章综述 霉属和木霉属。而细菌中研究得较多的是芽抱杆菌属眦。在产b 一葡萄糖苷酶的微生 物中有很多种都不止编码一种b 一葡萄糖苷酶，它们的酶学性质也可能相差很远。如 从d s p e r g i l l u $ t u b i n g e n s i s n - i 纯化出四种不同的b 一葡萄糖苷酶，用s d s p a g e 测得 的分子量分别为1 3 1k d a 、1 2 6k d a 、5 4 k d a 、5 4k d a ，等电点分别为4 2 、3 9 、3 7 、 3 6 【”。 1 2 4b 一葡萄糖苷酶活力的测定方法 9 一葡萄糖苷酶活力的测定方法很多。概括起来主要有电化法、荧光法、分光光 度法等。电化法由g u i l b a u l t 和k r a m e r 设计。以扁桃苷为底物，根据所产生的氢化物， 用与自发( 内) 电解池相联结的一对银一铂电极来测定其葡萄糖苷酶活性；r o b i n s o n 使用4 一甲基伞形酮的b - d - 葡萄糖苷作为底物，经b 一葡萄糖苷酶作用，专一地分解 为具有强烈荧光的4 一甲基伞形酮，此荧光法灵敏度高且快速：分光光度法可用水杨 苷为底物，将水杨苷裂解为水杨醇和6 书一葡萄糖，然后对所产生的葡萄糖进行比色 测定；也可用熊果苷( b d - 葡萄糖苷一对苯二酚) 作为底物，对产生的葡萄糖用碘 量法加以测定；另外还可用p n p g 为底物进行酶解，底物水解后释放出来的对一硝基 苯可直接在4 0 0 - - 4 2 0n m 2 _ 间比色进行测定【“1 1 2 5b 一葡萄糖苷酶的应用 ( 1 ) 纤维素是自然界最丰富的碳资源，从纤维素分解为葡萄糖需要三种酶协同 作用b 一葡萄糖苷酶可以将纤维二糖水解为葡萄糖，而纤维素酶组分中b 一葡萄糖 苷酶含量少，活力低，因此成为纤维素酶解的瓶颈。有报道，当增加纤维素中b 一 葡萄糖苷酶活性，会有效提高纤维素酶解效率“2 】。因此通过基因重组技术构建工程 菌，分泌表达高活性的b 一葡萄糖苷酶对纤维素有效降解具有重要意义。 ( 2 ) 近年来，利用纤维素生产乙醇“”町在各国引起了广泛的关注，在酶水解纤 维素过程中，纤维二糖常因为b 一葡萄糖苷酶催化效率低及稳定性差而累积从而抑制 纤维素酶的水解效率毕赤酿酒酵母被广泛应用于工业酒精的生产，但酿酒酵母不 能利用纤维二糖“”，因此构建能利用纤维二糖的工程酵母菌株有很大的实际意义。 由于酿酒酵母细胞膜上缺少通透酶，使得纤维二糖不能进入胞内，从而需使编码b 一 葡萄糖苷酶的外源基因带有信号肽能够被分泌到胞外，以便更好利用纤维二糖“” ( 3 ) 高歇氏病( g a r c h e r sd i s e a s e ，葡萄糖脑苷脂酶缺乏症) 治疗，病因是 b 一葡萄糖苷酶g l u 3 7 0 - s e r 3 7 0 ，假基因和功能基因有9 6 相似必须用人的b 一葡萄 糖苷酶来治疗，不能用细菌的，因为细菌没有翻译糖基化( c o t r a n s l a t i o n a l 福建师范大学潘海芳硕士学位论文 g 1 y c o s y l a t i o n ) 的功能“”。 ( 4 ) 植物中的口一葡萄糖苷酶在防御害虫方面起着非常重要的作用。b 一葡萄糖 苷酶能分解植物中丰富的b 一葡萄糖苷dm b o a g i c ( 2 一o - b e t a - d - g l u c o p y r a n o s y l 一4 一h y d r o x y 一7 - m e t h o x y - 1 ，4 - b e n z o x a z i n - 3 - o n e ) ， 释放有毒的苷配基部分dm b o a ( 2 ，4 - h y d r o x y - 7 - m e t h o x y - 1 。4 - b e n z o x a z i n 一3 一o n e ) ， 是植物体中防御食植动物和害虫的主要化学物质佃1 ( 5 ) b 一葡萄糖苷酶可应用在食品增香上很多研究表明在水果和蔬菜中，除 了游离的挥发性风味物质外，还有更多的以b 一葡萄糖苷形式存在的非挥发性风味前 体物质果蔬在成熟期利用内源8 一葡萄糖苷酶水解这些前体物质，释放风味成分， 但内源酶的活性往往比较低，风味前体物质不能得以充分的水解，如果用外源b 一 葡萄糖苷酶进行适当处理，则果蔬制品的风味会大大提高“9 】。 葡萄酒的风味是衡量葡萄酒品质的重要指标，其风味成分十分丰富，主要是由 葡萄酒本身以及酵母发酵形成的。葡萄中富含潜在的芳香物质( 如萜烯化合物) ， 它们对葡萄酒风味的作用已被确定。尽管成熟的葡萄本身含有b 一葡萄糖苷酶，能 将小部分的风味前体物质水解，释放出游离态的芳香物质，从而使成熟的葡萄呈现 出葡萄所特有的风味。但是由于其在葡萄中的含量非常少，水解速率低，限制了葡 萄酒风味的增强和改善“”。很多试验表明，用外源b 一葡萄糖苷酶处理葡萄酒，可以 明显改善其风昧。g u e g u e n 等人用来源于c a n d i d am o l i s c h i a n a3 5 m 5 x 的e 一葡萄糖苷 酶直接处理葡萄酒后，分析香气成分的变化，结果发现，酶处理样和对照相比，苯 甲醇，香叶醇，橙花醇，2 一苯乙醇和芳香醇分别提高了1 5 7 5 ，1 2 0 0 ，6 0 0 ， 5 0 0 n 1 5 5 ”1 。d a v i dt a t e 通过研究表明在酿酒过程中添加商品化的b 一葡萄糖苷 酶可以提高葡萄酒的风味；或用酵母发酵葡萄酒，如果酵母菌株产b 一葡萄糖苷酶能 力越强，酿出的葡萄酒的风味也越浓1 。 ( 6 ) b 一葡萄糖苷酶在提高白藜芦醇含量方面的研究进展。 白藜芦醇是植物体内抵抗病原侵染的一类重要的植物抗毒素，其存在形式主要 有四种：顺式白藜芦醇( c i s r e s v e r a t r 0 1 ) 、反式白藜芦醇( t r a n s - r e s v e r a t r 0 1 ) 及其相应的葡萄糖苷形式一白藜芦醇苷( c i s p i c e i d 、t r a n s p i c e i d ) 。白藜芦醇苷 在b 一葡萄糖苷酶的作用下能释放出自藜芦醇。白藜芦醇具有抗氧化、抗自由基的作 用，因而具有多种生物学作用，主要包括抗肿瘤作用嘲3 、心血管保护作用o ”、植物 雌激素作用嘲、抗肝纤维化作用1 和抗菌作用等。白藜芦醇在天然植物中的含量 4 第1 章综述 普遍较低，主要存在于虎杖、葡萄、花生等植物中虎杖中白藜芦醇含量远高于葡 萄等其他植物，主要以白藜芦醇苷的形式存在呻1 。对葡萄的研究表明，在葡萄各 组织中，果皮、果穗中自藜芦醇的含量较高o ”，红葡萄酒的白藜芦醇含量高于白葡 萄酒嘲。 迄今的研究报导表明，白葡萄酒中白藜芦醇含量低微，因此，采用转基因酵母 提高白藜芦醇的含量具有重要的研究意义。g o n z a l e z - c a n d e l a s 等在葡萄酒酿造过程 中用表达黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) a b f b 基因( 编码d l - 阿拉伯呋喃糖酶) 或 表达一种假丝酵母( c a n d i d am o l i s c h i a n a ) b g i n 基因( 编码b 一葡萄糖苷酶) 的重 组体酵母株作为工具以提高白葡萄酒中自藜芦醇的含量。研究结果表明，用表达b g i n 基因的酿酒酵母酿造葡萄酒，酒中自藜芦醇含量有十分显著的提高，而白藜芦醇苷 含量下降了约4 0 。g o n z a l e z c a n d e l a s 等对这一现象的解释有两个，一种可能是这 种转基因酵母不仅能够水解白藜芦醇苷为白藜芦醇，还能够作用于葡萄细胞的细胞 壁碎片或其它细胞组成，为水解白藜芦醇提供更多的底物，从而增加葡萄酒的白藜 芦醇含量；另一种解释是可能存在目前的文献资料中没有报道的其他形式的白藜芦 醇衍生物瞄3 1 。 1 3b 一葡萄糖苷酶的分子生物学研究 1 3 1b 一葡萄糖苷酶基因的克隆 对b 一葡萄糖苷酶基因方面的研究已有较长历史，到目前为止，己有上百个微生 物b 一葡萄糖苷酶基因己得到克隆。早期b 一葡萄塘苷酶基因的克隆是通过构建总d n a 文库或鸟枪法进行活性筛选的方式获得的，随着p c r 技术的应用，利用种属相似性扩 增克隆得到许多b 一葡萄糖苷酶基因。随着基因组学的发展，越来越多的微生物基因 组全序列被测定，通过序列筛查定位分析出可能的b 一葡萄糖苷酶基因，是获得b 一 葡萄糖苷酶新基因的有效手段o 】。 b 一葡萄糖苷酶可与许多底物作用并显色，且方法简便灵敏度较高使得筛选工作 很方便。目前在平板上筛选重组转化子大致有三种方法：( 1 ) 在x - g l u ( 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o lg l u c o p y r a n o s i d e ) 平板上筛选，当b 一葡萄糖苷酶与 x - g l u 作用时，可水解底物释放出5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l ，显蓝斑。( 2 ) 用m u g ( 4 - m e t h y lu m b e l l i f e r y l b d - 9 1 u c o p y r a n o s i d e ) 筛，酶液可水解m u g 释放出 4 - m e t h y lu m b e l l i f e r y l ，4 - m e t h y lu m b e l l i f e r y l 可在紫外灯下显荧光( 3 ) 用p n p g ( p n i t r o p h e n y l - o d - g l u c o p y r a n o s i d e ) 筛，酶与底物作用时，水解底物释放出 福建师范大学潘海芳硕士学位论文 p - n i t r o p h e n y l 显黄色嗍。 1 3 29 一葡萄糖苷酶基因的表达调控 微生物b 一葡萄糖苷酶的产生是一个复杂的调控过程，不同的培养条件对微生物 产酶具有非常大的影响。近年来，人们试图从分子水平上探明b 一葡萄糖苷酶的诱导 机制，但目前仍有很多问题没有解决。所面临的困难在于b 一葡萄糖苷酶诱导的复杂 性，很多因素都可能在b 一葡萄糖苷酶产生的过程中起作用。同时，产b 一葡萄糖苷 酶的微生物千差万别，很难找到一种普遍的机制目前通常采用的方法是建立各种 突变株，并利用体外转录、d n a 足迹法、凝胶滞留及双杂交技术等寻找顺式作用元件 和反式作用因子，研究其相关功能啪。 丝状真菌由于能大量产生胞外水解酶因而其表达调控在近些年得到了广泛的重 视，取得了很多进展。许多编码蛋白水解酶基因的顺式作用元件和反式作用因子有 了深入的研究1 。 1 3 3b 一葡萄糖苷酶基因的结构与功能 通过x 射线晶体衍生法分析b 一葡萄糖苷酶三维空间结构。糖苷水解酶家族1 的典型结构具有8 个( n b ) 结构围成的桶状结构，也被称为4 7 超家族。糖苷水 解酶家族3 有a 区和b 区两个域构成，b 区包括s d w 序列，内有活性为点a s p ( d ) 残基。在分子水平上，水解酶家族3 的编码基因有5 个典型的区域构成，n 端区、 n 端催化区、非同源区、c 端未知功能区、c 端残基o ”。来自水解酶家族3 的b 葡 萄糖苷酶亲核中心如图1 一l 所示。 九n l 叠e r2 “ 九w e n t i l 。 1 九a c u l a t u 82 6 4 s f l b u l l g a r a l 2 7 9 s f l b n l i g e r a z 2 8 3 h a n o m a l a 2 8 3 t r a g , s o l 笛1 s 叶c o p a r s i c i2 6 4 t u m e f a c l n m2 0 6 i lm a m i a n u s 2 0 9 c g i l v u s 2 7 5 c t h e r m o c e l l u m2 1 5 e c o l j2 7 1 t b r o c k s 1 0 5 m b i s p o r a 2 6 8 图i - 1 糖苷水解酶家族3 的推测催化亲核试剂一天冬氨酸棚 f i g 1 - la l i g n m e n to f r e g i o nc o n t a i n i n gt h ep r o p o s e dc a t a l y t i cn u c l e o p h i l ea s p a r t a t ei ns e l e c t e d g l y c o s y lh y d r o l a s e so f f a m i l y3 6 勰忿撕淞m锄m撇捌纵挑撕挪懈枞 第l 章综述 经研究认为b 一葡萄糖苷酶的催化机制是：保留型的酸催化双置换机制( d o u b l e d i s p l a c e m e n tm e c h a n i s m ) 。催化反应需要两个重要氨基酸残基：质子供体( p r o t o n d o n o r ) 和亲核试剂( n u c l e o p h i l e ) 它们一般是带羧基侧链氨基酸( a s p 或g l u ) ， 位于糖苷键的氧原子的氢键距离内。水解反应的基本过程是：第一步，酶的亲核试 剂在第二个羧基侧链提供酸碱催化( 提供一个质子) 帮助下，去攻击底物的糖苷键 氧原子，并与其连接形成酶底物过渡态；第二步，酸碱集团催化一个水分子攻击酶 底物过渡态，与之反应，以切断糖苷键释放一个b 一单糖产物和酶。目前对酶催化糖 苷键水解的机理了解的还不是很清楚，普遍认为酶有两个催化活性中心，一个为亲 核中心，另一个为酸碱催化中心。在糖基化作用中，酶的亲核中心攻击底物异头碳 原子，形成a 构像的糖基酶共价中间体。然后是有水介导酶底物中间体水解；酶的 另一活性中心供给一h + ，糖苷键水解。b 一糖基产物形成，酶回复到其初始的质子 化态。通过动力学标记、序列分析、对特殊氨基酸进行化学修饰、点突变等方法来 研究酶催化底物水解的分子机制，对于酶的活性中心的一些氨基酸残基的特殊作用 已取得一些进展。酸性氨基酸带有一c 0 0 h 基团在b 一葡萄糖苷酶的催化过程起着非 常重要的作用，酶的亲核催化中心和酸碱催化中心都含有酸性氨基酸a s p 和g l u 。 家族l 中的b 一葡萄糖苷酶属于4 7 超家族成员，在其b 折叠结构中的c 端第4 位和 第7 位都是g l u 残基。而在家族3 的成员中，则发现a s p 为保守氨基酸瞰4 1 。 1 3 4b 一葡萄糖苷酶基因的重组表达 b 一葡萄糖苷酶基因重组表达是当前8 一葡萄糖苷酶研究热点之一，早期研究多 在大肠杆菌中表达，这种以克隆为目的的重组表达一般采用自身的启动子，不能获 得高效表达，多数重组菌产酶活力不如原始菌株0 1 。随着表达系统的发展与完善， b 一葡萄糖苷酶已在大肠杆菌和酵母中得到高效表达，重组表达的酶活量可达野生型 菌株的几十倍m ，。 2 0 0 4 年m u r r a y 等从嗜热真菌t a l a r o m y c e se m e r s o n i i 中克隆了b 一葡萄糖苷酶基 因c e l 3 a ，在里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e ，) 中表达，并研究了重组b 一葡萄糖苷 酶性质舳1 r o d j a n ao p a s s i r i 等从水稻苗的c d n a 中克隆了b 一葡萄糖苷酶基因b g i u l 并在大肠杆菌中实现了可溶表达m 1 。最近邵金辉等从扣囊复膜孢酵母的总d n a 中扩增 得到b 一葡萄糖苷酶基因，实现了在毕赤酵母中的高效表达m 1 。 1 4本论文研究的目的及意义 纤维素是世界上最丰富的碳水化合物资源。随着地球上不可再生资源日益耗竭， 7 福建师范大学潘海芳硕士学位论文 利用生物技术将木质纤维进行生物转化具有重大意义b 一葡糖苷酶是纤维素酶系的 重要成员，对纤维素的彻底降解起瓶颈作用采用基因工程与蛋白质工程手段获得 性质优良的e 一葡糖苷酶已成为研究热点国外多家研究机构正致力于一葡糖苷酶 的分子生物学研究，从基础领域研究酶的催化机制及表达调控机制，以期望更好改 善纤维素酶的催化效率，更好得利用纤维素资源。 提高葡萄酒中的白藜芦醇含量的传统方法一般通过在酿酒过程中添加商品化的 b 一葡糖苷酶，但这样明显增加了生产成本。本论文的主要目的是希望通过基因工程 手段提高葡萄酒的白藜芦醇含量。根据种属相似性利用r t - p c r 技术从高产b 一葡糖苷 酶的黑曲霉品种的m r n a 中克隆得到b 一葡萄糖苷酶基因，欲将其构建到酿酒酵母质粒 上，转化酿酒酵母。运用这种转基因酿酒酵母发酵葡萄酒，既可以增加葡萄酒的白 藜芦醇含量，又能够改善葡萄酒的风味，同时还可以节省购买酶的成本，将可能给 未来的葡萄酒行业带来新的商机。 本论文还构建了一个p q e 3 0 一b g l n 原核表达载体并实现其在大肠杆菌中进行高 效的融合蛋白表达，产生b 一葡萄糖苷酶，为下一步生产b 一葡萄糖苷酶粗酶制剂， 用于酶解处理植物材料如虎杖组织，以提高白藜芦醇得率的设想奠定基础。 t p f 。 争 喜 参 第2 章b 一葡萄糖苷酶基因的原核表达 第2 章1 3 一葡萄糖苷酶基因的原核表达 2 1 前言 原核生物具有增殖快，易操作的特点，因此能够较方便地利用它来实现基因的 异源表达，以研究基因所编码的蛋白质结构与功能。本部分内容实现了一个由日本 k e n j it a j i m 等人克隆出来的木醋杆菌( a c e t o b a c t e rx y l i n u ma t c c2 3 7 6 9 ) 的b 一 葡萄糖苷酶基因( b g l x a ) h 町的原核表达，并对表达条件进行优化，初步建立一个原 核表达体系，为下一步研究蛋白质的功能并尝试运用表达的蛋白提高从植物中提取 自藜芦醇的得率奠定基础。 2 2 材料与方法 2 2 1 实验材料 2 2 1 1 菌种、质粒、引物菌种j m l 0 9 、d h 5o 由本实验室保存。质粒p u c p 6 7 ( 含 木醋杆菌的b 一葡萄糖苷酶基因) 由日本s a t o s h it a b a t a 教授惠赠。p q e 3 0 m 1 5 原 核表达载体系统由本实验室保存。根据质粒p u c p 6 7 与载体p q e 3 0 的序列，应用 p r i m e rp r e m i e r5 0 软件，设计了一对带有相应酶切位点的引物，引物由大连 t a k a r a 公司合成，其序列分别如下： 5 端引物序列：5 一c g c g g a t c c a t g a t g a t g t c t c g t 从a c 一3 b a m hi 3 端引物序列：5 一a t t g g t a c c t c a g g g g g c c a t g t t c 一3 k p ni 2 2 1 2 仪器和试剂 ( 1 ) 生化试剂l b 液体培养基与固体培养基购自北京鹭桥试剂公司。琼