（植物学专业论文）铁皮石斛基于trntl序列的鉴别与三核苷酸ssr的开发应用.pdf

摘要 摘要 铁皮石斛( d e n d r o b i u mo f f i c i n a l ek i t l l u r ae tm i g o ) 是我国兰科( o r c h i d a c e a e ) 石斛属( d e n d r o b i u m ) 的珍稀濒危特有种，为中国植物红皮书和中国物种红色名 录中的“极危”种，具有“养阴生津、润喉护嗓、温胃明目、补肾益力、延年益 寿”等功效。 本研究对1 7 种石斛属植物的叶绿体基因组t r n t l 非编码区进行了测定，利 用分子进化遗传分析软件m e g a 4 0 对测得的序列及g e n b a n k 上已经发表的2 种 石斛的t r n t l 区进行了比较分析。1 9 种石斛样品( 不包括外类群) 的变异位点 2 1 6 个，简约信息位点9 3 个，特异位点1 1 8 个，转换与颠换之比为o 3 5 。以k i m u r a - 2 参数计算遗传距离，1 9 种石斛种间遗传距离为0 0 0 1 0 1 6 6 。不同石斛种间均存 在序列差异，可以把t r n t l 与r d n ai t s 序列相结合作为铁皮石斛d n a 条形码 的一种补充，应用于鉴别研究。 本研究还运用磁珠富集法对铁皮石斛的微卫星进行了开发。共成功开发出 8 0 条微卫星序列，并对其中的2 5 条设计了微卫星引物。经过聚丙烯酰胺凝胶检 测共开发出1 5 条具有多态性的三核苷酸重复单元的微卫星序列。对永嘉居群和 福武居群的4 0 个样本进行了多态性分析，结果显示永嘉居群单个位点的等位基 因数从3 到8 不等，福武居群单个位点的等位基因数从3 到9 。利用p o p g e n e 3 2 ， 计算出永嘉居群期望杂合度从0 6 2 9 到o 8 4 6 平均值为0 7 5 7 ，福武居群的从0 6 4 6 到o 8 4 8 平均值为0 8 0 0 。2 个居群共有4 个位点偏离哈温平衡，均无连锁不平衡 现象。本研究为铁皮石斛遗传多样性和遗传结构的分析奠定了基础。 关键词：石斛属，铁皮石斛，分子鉴别，t r n t l ，s s r a b s t r a c t a b s t r a c t d e n d r o b i u mo f f i c i n a l ek j l n u me tm i g oi sa ne n d a n g e r e da n di n v a l u a b l eh e r b e n d e m i ct oc h i n a 1 9 o f f i c i n a l ei sa c k n o w l e d g e df o ri t su n p a r a l l e l e dc u r a t i v ee f f e c t s ， s u c ha sn o u r i s h i n gy i nb e n e f i t i n gt ot h es t o m a c h , m o i s t e nt h el u n g ，e l i m i n a t i n g m i l i a r i a , r e s i s t i n gc a l l c e ra n dp r o l o n g i n gl i f e i nr e c e n ty e a r s ，d o f f i c i n a l eh a sb e e ni n s e v e r ed a n g e ro fe x t i n c t i o nb e c a u s eo fh a b i t a td e t e r i o r a t i o na n dh u m a ne x p l o i t a t i o n e n t i c e db yh i g h p r o f i t s t h et r n t lf r a g m e n t so fs e v e n t e e nd e n d r o b i u ms p e c i e sw e r es e q u e n c e db yo u r r e s e a r c hg r o u p t o g e t h e rw i t ht w od e n d r o b i u ms p e c i e sd o w n l o a d e df r o mg e n b a n k , t h et r n t - ls e q u e n c eo fn i n e t e e nd e n d r o b i u ms p e c i e sw e r ea n a l y z e db ys o f t w a r e m e g a 4 0 t h el e n g t h so fs e q u e n c e sv a r i e df r o m5 6 3 - 7 0 8b p t h e r ea r e216v a r i a b l e s i t e s ，9 3p a r s i m o n yi n f o r m a t i o ns i t e s ，118s i n g l e t o ns i t e s 19 i n d e l sh a p p e n e di nt h i s f r a g m e n t , w h i c hl e dt ot h eg r e a td i f f e r e n c eo fs e q u e n c el e n g t h s n i n e t e e ni n d e l s h a p p e n e di nt h i sf r a g m e n t ，w h i c hs i c ei s f r o m2t o4 0b p g e n e t i cd i s t a n c e sw e r e c a l c u l a t e du s i n gt h ek i n l u r a2 - p a r a m e t e rm o d e l g e n e t i cd i s t a n c e sv a r i e df r o m 0 0 0 1 0 16 6a m o n gn i n t e e ns p e c i e s t h ed i f f e r e n c e so ft h ei n t e r s p e c i e so ft r n t l f r a g m e n tw e r ed e m o n s t r a t e d i no u ro p i n i o n , t h ec o m b i n a t i o no ft r n t - lf r a g m e n tw i t h r d n ai t sr e g i o ni sq u a l i f i e da sd n ab a r c o d ef o rd e n d r o b i u m m i c r o s a t e l l i t ed n aw a si s o l a t e df r o md o f f i c i n a l eg e n o m ed n at h r o u g ht h e m e t h o do fe n r i c h m e n tb ym a g n e t i cb e a d s f i f t e e np o l y m o r p h i cm i c r o s a t e l l i t e sw e r e d e v e l o p e df o r1 9 o f f i c i n a l e m i c r o s a t e l l i t el o c iw e r et e s t e df o rp o l y m o 叫s m a c r o s sa t o t a lo f4 0i n d i v i d u a l sf r o mt w on a t u r a lp o p u l a t i o n s 砀ea v e r a g en u m b e ro fa l l e l e s f o rt h e s em i c r o s a t e l l i t e sw a sf i v ef y o n g i i ap o p u l a t i o n ) a n dn i n e ( f u w up o p u l a t i o n ) a l l e l e sp e rl o c u sr e s p e c t i v e l y a v e r a g eo b s e r v e dh e t e r o z y g o s i t i e si nt h et w o p o p u l a t i o n sw e r e0 6 5 7 ( r a n g e = 0 3 0 0 - - 0 9 0 0 ) a n d0 5 9 3 ( r a n g e = o 3 5 0 - - 0 8 0 0 ) f o u r l o c is h o w e ds i g n i f i c a n td e p a r t u r e sf r o mh a r d y - w e i n b e r ge q u i l i b r i u mi nb o t ht h e p o p u l a i o ma n dn ol i n k a g ed i s e q u i l i b r i u mw e r ef o u n db e t w e e na n yl o c ip a i r s i nt h e f u t u r e ，t h e yw o u l dp r o v i d ei m p o r t a n ti n f o r m a t i o nt ot h es t u d yo fg e n e t i cd i v e r s i t ya n d p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i po fd o f f i c i n a l e k e rw o r d s ：d e n d r o b i u m ，d e n d r o b i u mo f 劈c i n a l e , m o l e c u l a ra u t h e n t i c a t i o n , t r n t l ， s s r 第1 章文献综述 第1 章文献综述 1 1 铁皮石斛的研究进展 铁皮石斛( d e n d r o b i u mo f f i c i n a l ek j m u r ae tm i g o ) 是我国兰科( o r c h i d a c e a e ) 石斛属( d e n d r o b i u m ) 的珍稀濒危特有种，为中国植物红皮书和中国物种红色名 录中的“极危”种。我国的石斛属植物有7 6 种( 包雪声等，2 0 0 1 ) ，其中有3 3 个种作为商品石斛的原植物被收购，铁皮石斛是中华人民共和国药典中被收 载的石斛属植物之一。铁皮石斛为多年生附生性草本植物，常附生于海拔 8 0 0 1 6 0 0 米的密林树干或岩石上，并常与苔藓植物伴生。多分布于我国秦岭、淮 河以南的湖南、浙江、云南、贵州、福建、广东、广西等地。 铁皮石斛在每年的4 、5 月份开花，种子细如粉尘且不具胚乳，没有营养物 质供发芽之用，生长发育完全依赖共生真菌提供营养：种子成熟后保持发芽力的 时间又很短，所以在自然状态下自我繁殖能力较低。而传统的分株、扦插等方式 的繁殖率也极低。目前，铁皮石斛在国内外市场供不应求，加上药农对该资源保 护意识差，盲目追求经济利益，人为长期过度采挖，使资源濒临灭绝，在中国 植物红皮书中铁皮石斛被列为濒危种( 傅立国，1 9 9 2 ) 。 1 1 1 药用成分研究 铁皮石斛以新鲜或干燥的茎入药，有味甘、质重、粘性大等特点。铁皮石斛 在神农本草经和本草纲目中均被列为上品，被誉为“中华九大仙草之 首，具有“养阴生津、润喉护嗓、温胃明目、补肾益力、延年益寿等功效( 包 雪声等，2 0 0 1 ) 。国内外对于铁皮石斛的研究着重于药用化学方面( 伍芬芳等， 2 0 0 4 ) 。研究发现，多糖类成分是铁皮石斛中具有免疫增强作用和抗肿瘤作用的 活性成分( 李满飞等，1 9 9 0 ) ，且含量较高( 黄民权等，1 9 9 4 ) 。钱叶等( 2 0 0 5 ) 采用正交试验法进行优选，紫外分光光度计测量多糖含量，初步确定了铁皮石斛 的多糖的提取工艺。杨虹等( 2 0 0 4 ) 运用糖组成分析、甲基化分析及n m r 等方 法对多糖的结构进行分析，首次分离出d t 2 ，d t 3 ，主要成分为葡萄糖、半乳糖、 木糖等。铁皮石斛的主要有效成分除石斛多糖外还有石斛碱、石铜碱和石斛胺等 生物碱类。丁亚平等( 1 9 9 4 ) 采用酸性染料比色法对铁皮石斛等三种石斛中的生 物碱进行了测定，测得铁皮石斛生物碱含量为0 0 2 4 。认为铁皮石斛1 年茎乜 年茎 3 年茎 茎根。铁皮 石斛中还含有人体内必须的7 种游离氨基酸( h u a n g 和r u a n ，1 9 9 7 ) ，铁皮石 第1 章文献综述 斛野生品的必需氨基酸含量高于圆球茎，两者的含量分别为3 7 9 、2 6 2 。此 外还含有2 种菲类化合物：鼓槌菲( c h r y s o t o x e n e ) 和毛兰素( e r i a n i n ) ，这两种 化合物都具有抗肿瘤活性( 马国祥，1 9 9 4 ) 。 1 1 2 组织培养研究 为能规模化生产铁皮石斛以提供充足的铁皮枫斗加工原料和保护野生资源， 国内有关研究机构从2 0 世纪7 0 年代便开始了铁皮石斛的开发研究工作，利用组 培技术提供优良种苗，是推进药源良性发展的有效途径。可以通过改变种子萌发 过程中的条件，叶片、茎尖及茎段诱导原球茎，茎段诱导侧芽及丛生芽等方法实 现铁皮石斛的快速繁殖。 通过种子萌发产生原球茎并最终诱导形成完整植株，是相对简单且成功率较 高的途径。叶秀嶙等( 1 9 8 8 ) 取铁皮石斛2 巧个月种龄的种子进行组织培养发现， 种龄愈长，萌发率愈高。和6 个月种龄的种子接入培养基中，只要培养一周即可 萌发，萌发率为9 5 。培养基的选择，激素，天然添加剂等都会对种苗的生长造 成影响。曾宋君等( 1 9 9 8 ) 将铁皮石斛种子在s h 、改良n 6 、m s 、k s 、v w 、 k u n d s o nc 培养基中培养，得出最适培养基为改良n 6 或自制p t 培养基。罗吉 风等( 2 0 0 6 ) 比较了m s 、1 2 m s 、1 2 n 6 和w h i t e 培养基对铁皮石斛种子萌发 的影响，表明1 2 m s 培养基最有利于种胚萌发。在基本培养基中添加n a a ( 赵 天榜等，1 9 9 4 ：刘瑞驹等，1 9 8 8 ；唐桂香，2 0 0 5 ) 、i a a ( 刘骅等，1 9 9 8 ；顾慧 芳等，1 9 9 9 ) 、i b a ( 刘骅等，1 9 9 8 ：顾慧芳等，1 9 9 9 ) 等激素有助于试管苗生 根壮苗。在基本培养基中加入香蕉汁( 刘骅等，1 9 9 8 ) 、马铃薯汁( 刘骅等，1 9 9 8 ) 、 荸荠汁( 刘骅等，1 9 9 8 ) 、绿豆芽汁( 曾宋君等，1 9 9 8 ) 、苹果汁( 蒋林等，2 0 0 3 ) 、 椰子乳( 蒋波等，2 0 0 5 ) 等都能促进铁皮石斛幼苗的生长和根系的发育，香蕉汁 的促进作用最为显著( 蒋波等，2 0 0 5 ) 。 除种子作外植体外，以铁皮石斛的茎尖、茎段、幼叶、种胚苗、幼根为外植 体，均可培育出组培苗。张书萍等( 2 0 0 8 ) 以铁皮石斛的茎段为外殖体诱导丛生 芽壮苗生根，提出当n a a 的浓度为0 3m g l 、6 - b a 的浓度为5m g l 时，铁皮 石斛丛生芽的增殖率最高。王云等( 2 0 0 8 ) 以铁皮石斛叶片为外植体诱导原球茎， 发现最早诱导出拟原球茎的是n 6 培养基。张启香等( 2 0 0 5 ) 以铁皮石斛茎尖作 为外植体，成功诱导出原球茎。研究发现1 2m s 培养基为最适合培养基，添加 o 3m g l 的6 - b a 和0 1m g l 的k t 以及0 0 5m g l 的n a a 时，原球茎的诱导 率达到8 。关于铁皮石斛组织培养的研究目前已取得一定的进展，成功培育出 试管苗，但有关试管苗移栽方面的报道还较少。蒋兴明等( 2 0 0 9 ) 以苗高、苗粗、 黄叶比和生根比为指标，通过正交试验方法研究培养基中n a a 、香蕉、土豆浸 第1 章文献综述 液对铁皮石斛壮苗生根的影响，综合考虑各因素，育苗最优水平组合为0 5 m g l n a a + 5 0g l 香蕉。 1 1 3 遗传多样性研究 遗传多样性与遗传结构的研究是铁皮石斛的研究热点之一。随机扩增多态 d n a 技术( d ) 可检测物种的遗传多样性，探索物种的亲缘关系、进化趋势 和种属特异性。刘石泉等( 2 0 0 5 ) 采用r a p d 技术对铁皮石斛无性繁殖的遗传稳 定性和不同生长阶段遗传稳定性进行研究，发现建立铁皮石斛稳定的无性快繁体 系是可行的。肖鲲等( 2 0 0 8 ) 用r a p d 构建了4 种枫斗类石斛属植物的指纹图谱， 发现遗传多样性丰富，并认为r a p d 技术可以作为石斛属植物鉴别的有效方法。 内部简单重复序列分子标记技术( i s s r ) 已广泛用于植物品种鉴定、基因 定位、遗传多样性等研究。针对铁皮石斛i s s r 的反应特点，沈洁等( 2 0 0 6 ) 通 过对铁皮石斛居群差异的研究，建立稳定可靠的i s s r 分子指纹标记反应体系， 能较好地应用于铁皮石斛的居群鉴别及居群分子生态研究。丁鸽等( 2 0 0 8 ，2 0 0 9 ) 运用s r a p 、r a p d 、i s s r 技术对铁皮石斛居群的遗传多样性水平和居群遗传结 构进行了分析，并为铁皮石斛的居群建立了分子身份认证。 扩增片段长度多态性( a l f p ) 的分子标记方法也被应用于铁皮石斛多态性 的研究。李雪霞等( 2 0 0 8 ) 通过a l f p 技术对1 2 个居群的7 1 个铁皮石斛个体展 开研究，结果表明铁皮石斛在种的水平上拥有较高的遗传多样性，居群间存在有 中等水平的遗传分化。王慧中等( 2 0 0 7 ) 采用此技术对1 3 种石斛属植物的遗传 多样性进行了分析，结果表明a l f p 分析结果与传统分类学的结果基本一致。 1 1 4 其他方面研究 此外，g u 等( 2 0 0 7 ) 首先探索铁皮石斛微卫星富集文库的构建和条件优化， 对目前开发微卫星分子标记较为有效的磁珠富集法进行了一系列改进，极大提高 了微卫星标记的开发效率。邵世光等( 2 0 0 9 ) 对1 5 种枫斗类石斛的叶绿体基因组 p s b a t r n h 区进行了测定，利用分子进化遗传分析软件m e g a 3 0 对测得的序列进 行了比较分析。提出p s b a t r n h 序列和先前报道的石斛属i t s 序列组合起来，可以 作为整个石斛属的d n a 条形码。 综上所述，现在的分子手段已经应用铁皮石斛居群遗传多样性和石斛属系统 研究。相信不久就能够更明确的了解铁皮石斛的系统发生，为建立种质资源库提 供理论依据。根据理论在自然保护区内选择几处适宜的地方作为野生铁皮石斛的 种质资源库，这对处于濒危状态的铁皮石斛资源的保护是十分必要的。 第1 章文献综述 1 2 基于d n a 序列的中草药鉴别 我国现有已知药用植物达1 1 1 4 6 种，中药品种的多基源性由来已久，所以中 草药鉴定的任务十分重要和艰巨。目前一直采用经典的性状鉴定、显微鉴定及理 化鉴定等方法研究中药材。这些方法的鉴定标识仅建立在个体形态和客观观测水 平上，但是未能考虑到遗传因素、生物体的生长发育阶段、环境条件、人类活动 等因素引起的遗传变异，因此存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。随着生 命科学的不断发展，分子生物学技术在中草药领域的日益渗透，在分子水平上检 测基因多态性分子标记的中草药鉴别方法得到了不断地发展与应用。 d n a 序列分析技术是以d n a 序列为核心的分子标记技术，是建立在p c r 技术基础之上的d n a 测序分析技术。具有d n a 信息量大、不受外界因素影响、 与生物体发育阶段无关、没有组织器官差异，具有高度的准确性和重复性等优点。 d n a 序列的变化是保守和变异共存的，不同基因在进化过程中变异率各异，一 些基因在种间存在适度的差异，直接分析这些基因的序列就能达到鉴别的目的。 另外，此技术对d n a 质和量的要求不是很高，可以对少量样品和经加工后的样 品进行分析。随着测序技术的普及，d n a 序列分析技术己成为近年来该领域应 用最多的d n a 分子标记技术。 1 2 1d n a 测序技术 基于p c r 的d n a 直接测序技术，极大地提高了d n a 序列分析的效率，促进 了该项技术的应用研究。目前用于中药d n a 测序的基因主要有植物叶绿体基因 组的而c l 、m a t k 、r p o c 等；植物核基因组的r r n a 、i t s 等( 曹晖等，1 9 9 8 ) ，这 些被选序列的共同特点是进化速率快，基因序列变异大，基因序列均匀地分布于 整个基因组，分辨率高。 1 2 1 1 叶绿体基因测序 由于叶绿体基因组相对保守，目前c p d n a 被广泛用于研究植物的系统发 育、分类等( c h a s ee ta 1 ，1 9 9 3 ；汪小全等，1 9 9 7 ) 。植物叶绿体基因组( c p d n a ) 为闭合环状双链d n a ，约占植物总d n a 的1 0 2 0 。植物叶绿体基因组因具有下 列特性，为序列比较分析提供了便利的条件：( 1 ) 基因组较小，但包含大量的 d n a 成分；( 2 ) 在分子水平上的差异明显，为比较进化研究提供了基本的信息 支持；( 3 ) 编码区和非编码区序列进化速率相差较大，适于不同分类阶元的研究 ( c l e g ge ta 1 ，1 9 9 4 ) 。叶绿体编码区的核酸替代速率相对较低，为植物深层系 统进化研究提供了可能的契机，越来越多的c p d n a 编码基因( 如r b c l 、m a t k 、 4 第1 章文献综述 n d h f 、a t p b 等) 被广泛应用于整个被子植物的系统发育研究中，并取得了一定的 成果。近年来c p d n a 非编码区( 包括内含子和基因间区) 序列在植物不同分类 阶元的系统研究中也得到了广泛的应用。与编码基因相比，非编码区基因在功能 上的限制较少，表现出更快的进化速率，能提供更多的具有系统学意义的信息位 点，故多用于较低分类阶元及近期分化类群间的系统学研究。 编码1 ，5 一二磷酸核酮糖羧化酶氧化酶大亚基i 拘r b c l 基因位于植物e p d n a 的 大单拷贝区，长约1 4 0 0b p ，分辨率高，变异较均一分布，进化速率差异大，是 研究物种间系统学关系比较恰当的指示基因，已广泛应用于植物系统研究中。 n i c k r e n t ( 1 9 9 6 ) 和s o l t i s 等( 1 9 9 7 ) 分别用r b c l 和1 8 sr d n a 序列构建了被子植物 系统发育树，同时比较了这两个基因的变异速率及其在系统学中的分辨率，结果 发现前者不仅分辨率高而且变异在整个基因上的分布较均匀。h a y a s h i 等( 1 9 9 8 ) 分析了甘草及近缘植物的r b c l 基因片段的序列，从遗传学的角度研究了相关植物 的亲缘关系。k o n d o 等( 1 9 9 8 ) 分析半夏和天南星的r b c l 部分序列，能够更准确 地识别7 种序列类型，为鉴定半夏和相关天然药物的原植物品种提供基因水平的 依据。 m a t k 位于t r n k 基因的内含子中，长约1 5 0 0b p ，编码一种成熟酶( m a t u e a s e ) ， 这种成熟酶参与r n a 转录体中型内含子的剪切，是叶绿体基因组蛋白编码基 因，进化速率快，一般用于种级以上的分类系统研究( w o l f ee ta 1 ，1 9 9 1 ) 。j o h n s o n 和s o l t i s ( 1 9 9 5 ) 对狭义虎耳草科、花葱科及其近缘类群的研究不仅解决了系统 学问题，同时发现在重建系统树时不必对不同类型的变异进行加权，极大地增强 了分子系统树的可靠性。滕艳芬等( 2 0 0 2 ) 用m a t k 基因序列比较了几种药典收 载石斛与常见市场混淆品种，发现非石斛属的几种混淆品与正品石斛间的m a r k 基因序列差异远大于正品石斛间的差异。曹晖等( 2 0 0 1 ) 对蛇床子6 个居群的叶 绿体m a t k 基因进行测序分析，表明蛇床子居群间的亲缘关系与地理分布及所含 香豆素化学型呈良好的相关性。 叶绿体d n at r n l f 序列区包含t r n l 基因和t r n l f 基因之间的间隔区。长度为 8 0 0 1 0 0 0b p ，易于扩增。由于不受功能的限制，受外界选择压力小，进化速率 相对较快，可较好地用于属间或属下等级的亲缘关系和系统位置的研究。已成功 地应用于瓶尔小草科( o p h i o g l o s s a c e a e ) ( h a u ke ta 1 ，2 0 0 3 ) 、金虎尾属( r a n k e f e ta 1 ，2 0 0 3 ) 、大麦属( h o r d e u m ) ( n i s h f i k a we ta 1 ，2 0 0 2 ) 、川续断目( d i p s a c a l e s ) ( z h a n g e ta 1 ，2 0 0 3 ) 等分类群的系统学研究。在药用植物鉴定方面，葛艳芬等 ( 2 0 0 7 ) 采用p c r 技术对5 种苍术属( a t r a c t y l o d e sd c ) 药用植物的t r n l f 序列 进行了准确测定，表明5 种苍术属药用植物的物种分化不完全，序列进化不一致。 5 第1 章文献综述 1 2 1 2 植物核基因测序 核基因组结构大且复杂，目前对核基因组序列的研究主要集中在编码核糖体 r n a 的重复区( n r d n a ) 内。n r r n a 在植物中以重复连续排列方式存在，包含进 化速率不等的编码区、非编码转录区和转录区。 i t s 区位于1 8 s 和2 6 sr d n a 基因之间，被5 8 sr d n a 基因分为两段，i t s 1 和 i t s - 2 。1 8 s 、5 8 s 、2 6 sr d n a 的序列非常保守，这样就可以用与其序列互补的通 用引物对i t s 区进行p c r 扩增、测序。i t s 序列选择压力小、变化速率快、能够提 供较丰富的变异位点和信息位点，近几年i t s 序列分析越来越多地用于中药品种 的鉴定以及被子植物系统进化的研究。高建平等( 2 0 0 3 ) 通过比较采自湖南、四 川、陕西、河南、山西、浙江等1 2 个自然居群的华中五味子和绿叶五味子r d n a i t s 区的d n a 序列的差异及其规律性，认为r d n ai t s 区可以作为鉴别中药南五味子 与混淆品绿叶五味子的一种良好的分子标记。飚t 瘌i t o ( 2 0 0 0 ) 利用i t s 序列对 产于东亚的乌头亚属一些二倍体种与四倍体种进行了系统发育分析。u t e l l i 等 ( 2 0 0 0 ) 测定了产于欧洲与高加索山脉的所有牛扁亚属的种与产于欧洲的乌头亚 属的种的n r d n ai t s 序列及c p d n a 的p s b a - t r n h 序列，解释了产于欧洲的黄花牛 扁( 4 1 y c o c t o n u m ) 复合体的系统关系。 1 2 2 位点特异性引物p c r 鉴别 a s - p c r ( a l l e l e s p e c i f i cp c r ) ，又称位点特异性p c r ( d i a g n o s t i cp c r ) ，自 d e s a u e 等( 1 9 9 6 ) 首次在n a t u r e 上发表了利用鉴别引物对鱼子酱中鱼卵所属鲟鱼 的种类进行鉴别之后，在全世界得到推广和应用，尤其在珍稀濒危植物种质的鉴 别中有着广泛的应用前景。在中药材鉴定领域，王义权等( 1 9 9 8 ) 首次在金钱自 花蛇及其伪品的鉴定研究中应用了此种方法，设计出的特异性引物可以1 0 0 检 出金钱白花蛇，同时还可以检测出给定的药材粉末中是否含有金钱白花蛇组分， 使得此法成为中成药复方组分鉴别的一种新手段。丁小余等( 2 0 0 1 ，2 0 0 2 ) 对束 花石斛、玫瑰石斛、喇叭唇石斛、报春石斛、兜唇石斛、曲茎石斛、铁皮石斛、 齿瓣石斛及其相似种植物进行r d n ai t s 序列比较，根据r d n ai t s 区碱基序列差 异设计特异性引物，能准确鉴别各种石斛及其相似种植物及药材。位点特异性 p c r 还应用于伊贝母( w a n ge ta 1 ，2 0 0 5 ) 、姜黄( s a s a k ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 、大黄 ( y a n ge ta 1 ，2 0 0 4 ) 等药用植物的鉴别，建立了中药材简便、高效的特异性鉴 定方法，为研制鉴定试剂盒提供理论依据。 6 第1 章文献综述 1 3 微卫星( s s r ) 技术及其在植物研究中的应用 1 3 1s s r 标记的原理和特点 s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ) 即简单序列重复，亦称微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a ) 是由1 6 个碱基组成的基序( m o t i f ) 串联重复而成的短片 段，它是由z i e t k i e w i c z 等( 1 9 9 4 ) 建立的一种基于p c r 的新型分子标记技术， 均匀地分布在整个真核生物基因组的编码区和非编码区。重复序列长度一般在 1 0 0b p 以内，较短( 周延清，2 0 0 5 ) 。这些短的串联重复是在d n a 复制过程中， 由于d n a 滑动、复制时滑动链与互补链碱基错配，而产生的一个或几个重复单 位的插入或缺失。微卫星基因序列中，重复基因的重复次数不同、重复的基因序 列不同，产生了简单序列长度多态性和随机扩增微卫星多态性，从而反映高度的 等位基因多样性。已经证明，真核生物的基因组中散布着大量的串联重复序列， 它们具有丰富的多态性，并能按孟德尔规律稳定地遗传与分离( d a v i s ，1 9 9 5 ； h a y m e r ，1 9 9 4 ) 。 按重复结构的差异可将微卫星分为三类：完全重复型( p e r f e c t ) ，单一序列 单元无中断或无颠倒；不完全重复型( i m p e r f e c t ) ，单一序列单元有中断或有颠 倒；混合型( c o m p o u n d ) ，多个序列中单位有或无中断和有或无颠倒的混合( w e b e r e ta l ，1 9 9 0 ) 。例如：单核苷酸及二核苷酸模式：( d n 和( a t ) n 、( g t ) n 等；三核 苷酸及四核苷酸模式：( a t t ) n 、( g t g ) n 和( t t t c ) n 等。在植物基因组中，二核 苷酸微卫星序列最丰富，以( a t ) n 居多，其次为( g a ) n ( w a n ge ta l ，1 9 9 4 ) 。据 报道在水稻基因组中，( g a ) n 为单位的微卫星个数达1 3 6 0 个，( m 3 n 为单位的 微卫星达1 2 3 0 个( p a n a u de ta 1 ，1 9 9 5 ) 。三核苷酸微卫星序列的含量比二核苷 酸微卫星序列大约低1 0 倍，而四核苷酸微卫星序列则相对较少。此外，二核苷 酸和四核苷酸微卫星序列更多分布于非编码区、基因间隔区，三核苷酸、六核苷 酸主要分布在基因编码区( p a n a u de t a l ，1 9 9 5 ；l ie t a l ，2 0 0 4 ) 。 由于重复基序的数目变化大，s s r 显示出较强的多态性。它呈共显性，符合 孟德尔遗传模式；数量没有生物学的限制，覆盖整个基因组，揭示出高度多态性； 标记的带型简单，条带一致，客观明确；具有多个等位基因，信息量高而且该标 记易于操作，具有高度重复性和可靠性，被认为是目前最好的分子标记之一。微 卫星d n a 的两侧序列一般是相对保守的单拷贝序列，侧翼序列使得该微卫星特 异地定位于染色体的某一部位。根据这一特性，可以设计引物来对微卫星d n a 进行扩增，经过电泳就可以检测到重复次数不同的d n a 区域的多态性。 7 第1 章文献综述 1 3 2 获得s s r 标记的方法 在s s r 引物的来源问题上，概括起来有以下四种途径：1 、相关文献；2 、 近缘种的引物；3 、数据库搜寻法：利用专门的s s r 分析软件，搜索g e n b a n k 、 e m b l 和d d b j 等公共数据库中的d n a 序列和e s t ( c x p m s s e as e q u e n c et a g s 表 达序列标签) 序列获得s s r 序列，然后设计引物；4 、建立基因组文库，从中筛 选出好的s s r 序列然后设计引物( 孟清照等，2 0 0 7 ) 。 、 最方便，最经济的方法应该是从已发表的文章中直接引用已经开发成功的微 卫星引物。但这种方法局限性也比较大，仅限于已经开发过的物种而且引物的数 量也只是停留在原有基础上。 对于近缘种引物的应用，s s r 标记应用的关键是根据微卫星两翼的保守序列 设计引物，从而有效扩增重复序列。引物在什么范围内适用一直是研究者关注的 焦点。自鲸属验证了微卫星两翼序列的保守性( s c h l o t t e r e re ta 1 ，1 9 9 1 ) 以来， 利用近缘种微卫星引物来扩增物种基因组d n a 的研究逐渐开展起来。一般认为 s s r 引物在同科不同属或者更近物种间具有适用性。姜蔚等( 2 0 0 9 ) 选用1 4 对 白菜s s r 引物和8 对油菜s s r 引物对3 种类型油菜进行扩增，发现全部引物都 可用于3 种类型的油菜。乔玉山等( 2 0 0 4 ) 发现来源于壳斗科( q u e r o u s p e t r a e a ) 的1 4 对s s r 引物能在属中的英国栎和其它种中表现出多态性。雷天刚等( 2 0 0 7 ) 能够利用从柑桔中筛选出来的1 0 对多态性位点丰富的s s r 引物对柚和7 个杂柑 品种进行鉴别。由此说明s s r 引物在亲缘关系较近的物种间具有适用性。 近年来随着数据库中e s t 序列的增加，通过数据库搜寻法获得e s t - s s r 的 报道越来越多，如茶树、小麦、云杉、甘蔗苜蓿、油菜等中已见报道。在此基 础上进行s s r 引物开发也就成了一种非常经济又方便的方法。e s s s r 标记与 基因组s s r 标记相比，具有开发方法简单及成本低廉等优点，而且前者来自于 基因的编码序列，更容易获得基因表达的信息，为功能基因的直接鉴定提供了可 能性( v a r s h n e ye ta 1 ，2 0 0 5 ) 。张亚东等( 2 0 0 9 ) 利用1 2 对e s t - s s r 标记对 湖北省内目前主要栽培的8 个黑杨品种进行分子鉴定，表明杨树e s t - s s r 标记 完全可以应用于品种鉴定及群体遗传多样性分析。邓科君等( 2 0 0 9 ) 以生物信息 学方法对g e n b a n k 的e s t 数据库中公开的1 0 2 8 8 条丹参e s t 进行整理，设计开 发了8 3 对e s t o s s r 引物，对1 3 个不同居群丹参样品及1 0 种鼠尾草属物种进行 了扩增效率、多态性及通用性检测，发现其中7 2 对引物在供试材料中可进行特 异性扩增。 s s r 引物尽管可以通过前3 个途径获得，但对于大部分物种而言，其数量有 限。因此，最根本、有效的途径是通过构建微卫星文库来开发本物种的s s r 引 第l 章文献综述 物。通过基因组文库开发s s r 引物的方法主要有文库法和富集法。 1 3 2 1 文库法 文库法首先制备基因组d n a ，建立基因组文库，然后用含有微卫星序列的 探针与之杂交筛选文库，接着挑选阳性克隆测序，再根据s s r 两端的侧翼序列 设计引物，最后用该引物对相应的s s r 座位作定性分析。在c a l l u m 和j o s e p h ( 1 9 9 4 ) 研究拟南芥，t o k u k o 等( 1 9 9 8 ) 研究东南亚热带雨林树种龙脑香科植 物，s h o r e a ( 1 9 9 8 ) 和g e o f f r e y ( 2 0 0 1 ) 等人研究c h a n n e l c a o q s h 的时候，都曾 用过此法开发s s r 引物。但是这种经典构建和筛选基因组文库的方法得到的s s r 阳性克隆比率很低。s t r u s s 等( 1 9 9 8 ) 用( c a ) n 和( c t ) n 重复序列为探针从大麦 噬菌体文库中检测了3 9 0 0 0 个克隆，分别只有4 8 2 个( 1 2 ) 和2 8 5 个( 0 7 ) 为阳性克隆。b r y a n 等( 1 9 9 7 ) 用( c a ) 1 6 、( g a ) 1 6 、( c a a ) 1 0 、( g a a h o 、( a c g ) l o 和( c a g ) l o 等6 个不同的s s r 重复序列为探针，从小麦m 1 3 噬菌体文库中共检 测了7 0 0 0 0 0 个克隆，阳性克隆仅有2 2 2 个。z a n e 等( 2 0 0 2 ) 对1 9 9 9 2 0 0 1 发表 在m o l e c u l a re c o l o g yn o t e s 上的利用传统方法开发微卫星引物的情况做了统计， 大部分的物种筛选阳性克隆的比率很低，加上其他的因素，得率会更低。总体来 说，传统文库法必须对每个克隆进行筛选鉴定，工作量大，费财力，而且效率较 低( 张增翠等，2 0 0 2 ) 。因而在实际应用过程中产生了富集法这一新的s s r 引物 设计方法。 1 3 2 2 富集法 微卫星富集文库法避免了传统文库法分离s s r 位点耗时费力的文库构建和 阳性克隆筛选环节。此法概括起来可以分为两种：一种是用含微卫星序列的p c r 引物进行p c r 富集，另一种是用含微卫星序列的探针进行杂交富集。其本质是 在筛选小插入片段基因组文库的基础上，再增加一次筛选，或者先用p c r 富集， 再用探针杂交筛选；或者两次都用杂交筛选( r o s a n ee t 以，1 9 9 9 ) 。总之，经过 这样的筛选，获得s s r 克隆的效率大大提高。 1 3 2 2 1r a p d ( r a n d o m l y a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ) 富集法 在研究中人们发现将r a p d 随机引物连接s s r 作为p c r 扩增引物，或者将 r a p d 扩增产物条带用s s r 探针进行s o u t h e m 杂交，可以有效富集重复序列。 c i f a r e l l i 等( 1 9 9 5 ) 提出利用s s r 与随机扩增产物杂交的开发策略，在糖用甜菜、 橄榄、向日葵获得r a p d 扩增条带中阳性条带的比例分别为o 9 、7 、1 0 7 。 对阳性条带进行回收、克隆、测序。序列分析表明，该克隆包含r a p d 扩增片 段( 序列两端为r a p d 引物) 及s s r 序列。l u n t 等( 1 9 9 2 ) 先用几个r a p d 引 物从基因组中获得随机扩增片段，扩增片段切胶回收纯化，经t a 载体克隆后， 9 第1 章文献综述 用特异s s r 及载体引物进行菌液p c r 筛选含s s r 克隆。最后对阳性克隆测序设 计s s r 引物。这些利用r a p d 富集s s r 的报道，均避免了基因组文库的构建， 有利于节省时间和人力、物力，但以后基于此方法进行大量s s r 分离的成功报 道却很少。 1 3 2 2 2 引物法富集 引物法富集微卫星一般是指使用同目的微卫星重复互补的寡核苷酸作为引 物，通过p c r 反应在文库构建前或构建后富集微卫星位点。基因组d n a 酶切并 进行片段大小筛选，然后将所筛选的d n a 片段克隆到单链噬菌体载体上，转化， 洗脱平板上的克隆，构建初级文库；然后以初级文库d n a 为模板，含有特定重 复序列寡核苷酸为引物进行p c r 扩增得到的双链d n a ，并转化到大肠杆菌寄主 细胞，得到高度重复序列的二级文库，挑选阳性克隆，根据微卫星序列两端的保 守序列设计微卫星引物。o s t r a n d e r 等( 1 9 9 2 ) 和p a e t k a u 等( 1 9 9 9 ) 最先试验引 物法，发现阳性克隆率很高。o s t r a n d e r 用此法进行s s r 的富集，阳性克隆率为 4 0 5 0 ；p a e t k a u 得到的阳性克隆的比率达到9 9 5 。e l a i n e 等( 1 9 9 2 ) 以狗 的基因组d n a 为材料，采用传统方法先获得一个小插入片段的初级基因组文库， 然后以5 磷酸化的核苷酸( c a ) n 为引物进行一步p c r ，经连接、转化，获得一个 含( c a ) n 的标记选择库。随机挑取单克隆培养后转膜，杂交，再次筛选，得到的 结果是：4 0 5 0 都是强烈阳性克隆，比起传统方法效率提高了5 0 倍。 1 3 2 2 3