（环境科学专业论文）锌铅胁迫对鄱阳湖湿地植物根际微生物的影响.pdf

塑薹 一 一。 铅的耐性更大。 ( 8 ) 锌胁迫前后，芦苇和苔草的根际三大菌落的优势分布大体上均为：细 菌 放线菌 真菌。 关键词：锌胁迫：铅胁迫：b i o l o g ；根际微生物 a b s t r a c t a b s t r a c t p h r a g m i t e sc o m m u n i sa n dc 1 e u c o c h l o r ab u n g e f r o mp o y a n gl a k ew e r es t u d i e d b a s e do nd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fz i n ca n dl e a dw i t hp o te x p e r i m e n t a n dt h e i n f l u e n c e so fz i n cs t r e s so ns t r u c t u r ea n df u n c t i o n a ld i v e r s i t yo fr h i z o s p h e r i c m i c r o o r g a n i s mw a sa n a l y z e db y t h eb i o l o l gm e t h o d a n du s i n gt r a d i t i o n a l m i c r o b i o l o g i c a lc u l t u r em e t h o d ，t h r o u g hd e t e r m i n a t i o no ft h ea m o u n to fr h i z o s p h e r i c b a c t e r i a 、a c t i n o m y c e t e s a n df u n g i ，t h et o l e r a n c eo fp h r a g m i t e sc o m m u n i sa n d c l e u c o c h l o ，口b “n g et oz n 2 + a n dp b 2 + w a ss t u d i e d t h er e s u l t s s h o w e di nt h e f o l l o w i n g ： ( 1 ) f o rp h r a g m i t e sc o m m u n i s ，t h em e t a b o l i ca b i l i t yo fm i c r o b i a lc o m m u n i t y w a sd e c r e a s e da f t e rz i n cs t r e s s ；t h em e t a b o l i ca b i l i t yo fm i c r o b i a lc o m m u n i t yo f8 0 a n d110 r a g 1z n 2 + a r eh i g h e rt h a no t h e rm i c r o b i a lc o m m u n i t yz i n cs t r e s s e d ；z n z 。a t t h ec o n c e n t r a t i o no f10m g 1c a ni n c r e a s et h ed i v e r s i t yo fr h i z o s p h e r i cm i c r o o r g a n i s m ； f o rc 1 e u c o c h l o r ab u n g e ，t h em e t a b o l i ca b i l i t ya n df u n c t i o n a ld i v e r s i t yo fm i c r o b i a l c o m m u n i “o fm5 0 m g lz n 2 + i n c r e a s e d ，b u td e c r e a s e da t8 0a n d110 m g 1z n 2 + ； ( 2 ) u n d e rz i n cs t r e s st h em e t a b o l i ca b i l i t yo fp o l y m e r s 、c a r b o x y d r a t e s 、 p h e n o l sa n da m i n oa c i d so f m i c r o b i a lc o m m u n i t yi n c r e a s e db u tm e t a b o l i ca b i l i t yo f c a r b o x y l i c a c i d sd e c r e a s e d ；t h es i xm a i nc a r b o ns o u r c et y p e sp o s s e s sh i g h e s t u t i l i z a t i o n e f f i c i e n c ya t5 0 m g lz n 付； ( 3 ) t o l e r a n c eo fc 1 e u c o c h l o r ab u n g et o z i n ch i g h e rt h a np h r a g m i t e s c o m m u n i s ； ( 4 ) p o l y m e r s 、a m i n oa c i d sa n dc a r b o x y d r a t e sa r e t h em a i nc a r b o ns o u r c ef o r a 1 1t r e a t m e n tr h i z o s p h e r i cm i c r o o r g a n i s m ；p r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a t u t i l i z a t i o no fs p e c i f i cc a r b o ns o u r c ei sd i f f e r e n tf o rd i f f e r e n tt r e a t m e n t ； ( 5 ) z i n cs t r e s si n c r e a s e dt h ea m o u n to fr h i z o s p h e r i cb a c t e r i aa n df u n g io f p h r a g m i t e sc o m m u n i sa n dt h ea m o u n to fa c t i n o m y c e t e si sc o m p l e xu n d e r d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n so fz i n c ；f o rc 1 e u c o c h l o r ab u n g e，t h e c o n c e n t r a t i o n so fz n 2 + e x c e e d i n g2 0 m g lc a no b v i o u s l yr e d u c e dt h e a m o u n to fb a c t e r i aa n dw i t ht h e i n c r e a s i n go fc o n c e n t r a t i o no fz n 2 + ，i n h i b i t i o ni n c r e a s e d ；z i n cs t r e s sc a ns t i m u l a t e l l l a b s t r a c t _ 一 a c t i n o m v c e t e sa n df u n g io fc 1 e u c o c h l o r ab u n g e ，w h e nt h ec o n c e n t r a t l o n s r e a c n e s 110 m g 1 t h e 锄o u n t o ft h e md e c r e a s e d a n df l a tw i t ht h ec o n t r o l ；g e n e r a l l y ， r h i z o s p h e r i cb a c t e r i a 、a c t i n o m y c e t e s a n df u n g io fc 1 e u c o c h l o r ab u n g ea r em o r e s e n s i t i v et oz n 2 + t h a np h r a g m i t e sc o m m u n i s s ； ( 6 ) f o rp h r a g m i t e sc o m m u n i st h es e n s i t i v i t yr e f l e c t i o no r d e r o f3m i c m b e st o z n 2 + w a sa c t i n o m y c e t e s b a c t e r i a f u n g ib u t f o rc 1 e u c o c h l o r ab u n g et h es e n s l t l v l t y w a sb a c t e r i a f u n g i a c t i n o m y c e t e s ； ( 7 ) u n d e rt h es 锄e c o n c e n t r a t i o no fp b 2 + ，t h e a m o u n to fb a c t e r i a 、 a c t i n o m y c e t e sa n df u n g iw i t hw a t e rl e v e rw e r eo b v i o u s l yh i g h e r t h a nt h ew l t h o u t r h i z o s p h e r i c b a c t e r i ao fc 1 e u c o c h l o r ab u n g e a r em o r es e n s i t i v et o p 酽。t h a i l p h r a 哪i t e sc o m m u n i s s b u tt h es e n s i t i v i t yr e f l e c t i o no r d e ro fa c t i n o m y c e t e s a n d f u n g it op b 2 + w a sp h r a g m i t e sc o m l n l l n i s c 1 e u c o c h l o r a b u n g e ( 8 ) i n2 e n e r a l l y , t h ea d v a n t a g e so f t h et h r e er h i z o s p h e r i cc o l o n i e sd i s t r i b u t l o n a r e ：b a c t e r i a a c t i n o m y c e t e s f u n g i k e yw o r d s ：z i n cs t r e s s ；l e a ds t r e s s ；b i o l 。g ；r h i z 。s p h e r i cm i c r o o 唱a n i s m i v 第一章绪论 第一章绪论 1 1 根际微生物研究现状 1 9 0 4 年，德国微生物学家l o r e n zh i l t n e r 将在根系周围并受根系生长影响的 土体定义为根际。根际作为植物土壤系统能量和物质交换最活跃的界面，是 土壤、微生物和植物三者相互影响较大的区域【2 】。根际微生物的代谢活动会影响 根际的能量循环和物质代谢，同时，根际微生物所需的大量能源来自植物的根 系分泌物1 3 j 。微生物对土壤中重金属的迁移转化和有机污染物的自净等发挥着非 常重要的作用，是维持土壤根际活性的重要组成部分【4 1 。 1 1 1 根际微生物与植物的相互作用 1 1 1 1 植物对根际微生物的影晌 根系分泌物为微生物提供了大量的能源，是根际微生物与植物的中间媒介。 根系分泌物包括有机酸、氨基酸、糖、生长因子、多糖醛酸和酶类等【5 】。植物根 系分泌物的数量和成分影响着微生物的数量和种类，同时影响着微生物的生长 代谢【6 】o 微生物的数量和种群在根际远大于非根际是因为根系分泌物的作用。 z o l o t i l i n a 等发现在沙漠野生植物的根部，非根际细菌种类数比根际土壤少1 5 3 倍【7 j 。s u s h m a s l 研究发现番茄的非根际和根际土壤中荧光假单胞菌和固氮菌的数 量有显著差异。项学敏等桫j 发现香蒲和芦苇的非根际土壤的微生物活性小于根际 微生物活性，表现出明显的根际效应。李廷强等【l0 】研究结果表明，污染不同的 土壤中，生态型东南景天的非根际真菌、放线菌和细菌数量及微生物生物量碳 都小于根际。 不同植物的根际其微生物不同。张超兰等j 认为彩叶草风车草和美人蕉一 红蛋两种不同植物组合的人工湿地系统的酶活性和微生物数量表现为：美人蕉 红蛋 彩叶草风车草。郑华等【l2 j 研究表明不同生态系统土壤微生物群落对单一 碳源代谢能力的大d , j i l 页序为：湿地松林 杉木林 油茶林 天然此生林。龙新宪等 【l3 j 实验发现非超积累生态型根际土壤中的可培养真菌、放线菌和细菌的数量均 显著小于超积累生态型东南景天。张海涵等1 1 4 j 用b i o l o g 法对狼牙刺、油松、刺 第一章绪论 槐、沙棘和黄土高原柠条5 种树种的菌根根际微生物群落多样性进行了研究， 结果显示各树种根际土壤微生物总体活性表现为刺槐 柠条 狼牙刺 冬季。王彦辉等【4 1 1 研究表明，土壤水分太高或太少都会影 响微生物的生存状况。章家恩等【4 2 】研究了7 种南亚热带植物，发现根际养分状 况和微生物的关系为：土壤养分的根际效应与微生物的根际效应是一致的。除 上述因素外，一些研究者还发现其它一些影响根际微生物的因素。如高浓度c 0 2 处理对长白赤松幼苗对根际真菌和放线数量的促进作用不明显，但对根际土壤 细菌数量起明显的促进作用【4 引。 1 2 重金属胁迫下根际微生物的生态效应 土壤重金属一方面会对微生物产生直接的毒害作用，另一方面又通过对植 物的影响，改变植物的生长状况，使根际分泌物发生变化而间接影响根际微生 物的生物量、生物活性和多样性等。 ( 1 ) 重金属胁迫对根际微生物生物量的影响 土壤微生物生物量作为一个比较敏感的生物学指标，可以用来表征氮和碳 的变化。杨良静等1 4 4 1 研究发现，随着c d 浓度的变化，好氧微生物细菌数量缓 慢增加，而放线菌和真菌的数量则先增加后减少。陈承利等h 5 j 研究了青菜种植 条件下，外源p b 和c d 不同处理对这两种微生物的生物量碳的影响，结果表明 当外源c d 和p b 的浓度分别大于1 5 m g k g ，和5 0 0 m g k g 时，两供试土壤微生物微 生物商和生物量碳逐渐下降。g r e n e l l a 等的研究表明，对于长期受镉污染的土 壤，即使外源镉浓度很低，土壤微生物量碳也会下降h 6 1 。杨元根等【47 j 对贵州赫 章土法炼锌区的土壤分析发现，此区的土壤微生物生物量( 用含碳量表示) 较 低。李小林等【4 8 1 对锌铅矿区不同重金属浓度的土壤样品进行了微生物数量的研 4 第一章绪论 究，分析发现重金属含量与细菌数量呈极显著负相关，与放线菌数量和真菌数 量呈显著负相关。 ( 2 ) 重金属对根际微生物活性和多样性的影响 土壤微生物活性在维持土壤生态系统生产力方面有着十分重要的作用，根 际土壤中的物质代谢和能量循环都要依赖于微生物的代谢功能。其多样性和活 性的变化可以敏感地反映土壤状况。重金属对土壤中一些敏感微生物会产生抑 制作用，会影响微生物的活性和多样性。段学军等【4 9 】采用d g g e 分析方法的研 究结果表明：高浓度的镉对稻田土壤微生物群落产生了显著的毒害作用，而群 落对低浓度的镉有耐受性。杨元根等【5 0 j 应用b i o l o g 方法，探讨了城市土与农村 土的区别，研究发现城市土壤微生物对碳源的消耗量增加，消耗速度更快，重 金属对城市土壤微生物群落的损害有不可恢复性和长期性。 1 3 根际微生物对重金属污染物的作用 根际微生物的活动对重金属污染物有很大影响，主要是通过细胞内束缚及 转化、细胞外沉淀和络合等起作用，将重金属转化为低毒或无毒。根际微生物 能够改变金属离子在土壤环境中的存在形态，其代谢产物能沉淀、螯合金属离子。 某些细菌如硫酸还原细菌可以产生h 2 s ，将重金属离子还原为硫化物而使重金属 沉淀。一些微生物还能够产生带有大量阳离子基团的胞外聚合物，与重金属离 子结合而起到降低重金属毒性的作用。v a n kj w 研究表明，很多微生物通过脱烃、 氧化还原和甲基化等作用参与重金属的转化，将重金属转化为低毒或无毒的形 太 s q ，l ! 一。 根际微生物还能影响植物吸收重金属的活性。f e n gm h 等 5 2 1 研究认为土壤的 生物化学活性会受土壤微生物数量的影响，土壤微生物的活动可减少植物体内 的金属，减少植物对金属的利用。然而，也有很多研究发现根际微生物能促进 植物对重金属的吸收利用。目前研究比较多的是超积累植物，它具有非常强的 积累和吸收重金属的能力。龙新宪等【5 3 j 通过研究超积累和非超积累生态型东南 景天发现，超积累生态型东南景天的非根际土壤中可培养微生物的数量、微生 物商和a w c d 值都明显小于根际土壤，并且超积累生态型东南景天的根际土壤的 交换态和水溶态z n 含量要明显低于非根际上壤。胡焕斌岭4 j 试验结果表明：芦苇 能较强地富集重金属镉和铅。g r o w l e yd e 等【5 5 j 认为根际微生物可以加速植物对 第一章绪论 f e 矛i i m n 等矿物质的吸收。以上研究都表明，微生物的存在与重金属在植物跟际 的迁移转化等有一定的联系。 1 4 国内外微生物研究方法进展 微生物研究的方法很多，目前应用最广泛最有效的方法有微生物平板纯培 养法、b i o l o g 微平板分析法、磷脂脂肪酸法和分子生物学技术等。 1 4 1 微生物平板纯培养法 这种方法用于是监测特殊微生物目标物种是非常有效的，利用这种方法已 分离得到许多很有应用价值的微生物。根据目标微生物选择相应的培养基，然后 通过各种微生物的生理生化特征及外观形态等方面进行分离鉴定。这种方法用 于测定小种群多样性方面是一种比较快速的方法【56 i 。这种方法的一些培养条件 被人为地限定了，未能全面反映微生物的自然生长条件，并且只有一小部分环 境微生物群落可用这种方法得到，据估计只有约1 2 0 的微生物种可培养得到 【5 ，因此这种方法只能作为一种辅助手段，并且要结合其他的生物技术才能更 为真实、全面、客观地反映微生物群落结构的信息。 1 4 2b i o l o g 微平板分析法 b i o l o g 法最初仅被用于菌种鉴定。1 9 9 1 年，m i l l s 和g a r l a n d 将这种方法用 于研究微生物群落。19 9 5 年，h a a c k 等【58 j 用b i o l o g 方法研究发现微生物群落组 成与代谢多样性类型相关。此后，b i o l o g 法成为研究微生物代谢功能多样性非 常有力的方法，在评价土壤微生物群落代谢功能多样性方面有非常广泛的应用。 微生物在利用碳源过程中产生的自由电子，与四唑染料发生还原显色反应， 颜色的深浅可以反映微生物对碳源的利用程度。由于微生物对不同碳源的利用 能力很大程度上取决于微生物的固有性质和种类，因此在一块微平板上同时测 定微生物对不同单一碳源的利用能力，就可以鉴定纯种微生物或分析比较不同 的微生物群落【5 圳。b i o l o g 方法研究微生物群落功能多样性能通过简单的操作获 得大量的数据，目前较为成熟的数据分析方法有a w c d 、主成分分析( 在主成分 分析之前一般需要将数据进行标准化) 、聚类分析法和多样性指数计算等。 6 第一章绪论 1 4 3 磷脂脂肪酸法 磷脂脂肪酸谱( p l f a p r o f i l e ) 常用来研究比较复杂的微生物群落多样性。磷脂 是所有活细胞细胞膜的基本成分，p l f a s ( 磷脂脂肪酸) 是磷脂的组分，具有高 的生物学特异性和结构多样性，是非常有效的生物标记物【6 0 】。一旦生物细胞死 亡，其中的p l f a s 马上消失【6 l 】，所以p l f a s 可作为区分活体微生物的标记【6 2 1 。 生物可以把相对稳定的磷脂类化合物作为它们的生物量，磷脂类化合物与微生 物的密切关系和它的这些特性，可用作土壤中微生物群落结构指纹分析。应用 磷脂类化合物的脂肪酸组成来研究微生物群落结构多样性是近几年来发展起来 的一种新方法。该方法很适合用用来作总微生物群落的分析，包括不可培养的 微生物，但是也有其局限性。第一，它只能鉴定到微生物属，不能鉴定到种； 第二，它因为较强的依赖于标记脂肪酸，如果标记脂肪酸变化，那么就会错误 地估计群落变化；第三，真菌和细菌在不同的环境条件及生长时期，脂肪酸含 量会发生变化，给监测带来一定困难【6 3 1 。 1 4 4 分子生物学技术 最近2 0 3 0 年间，以核酸分析技术为主的分子生物学技术( o 口p c r 、r f l p 、 r a p d 、p c r d g g e t g g e 、a f l p 、a l h p 等) l 删【6 】的广泛应用，为从分子水 平揭示生物多样性提供了新的方法，微生物多样性的研究也逐渐地采用分子生物 学技术。p c r 技术是聚合酶链式反应，可用于微生物d n a 的扩增。它是一种体 外扩增核酸序列并由此可以得到多个核酸拷贝的技术，同时对扩增产物进行定性 或定量分析；d g g e 即变性梯度凝胶电泳，是根据p c r 扩增产物中长度相同但g + c 含量不同的r d n a 片段混合物在电泳胶中的移动位置不一样，进而形成不同 r d n a 指纹，因而可直接地反映微生物r d n a 的多样性。r f l p 是利用p c r 扩增产 物用限制性内切酶进行切割并电泳，以酶切后d n a 片段长度变化表现出来，通过 d n a 转印及分子杂交方法检测。 1 5 湿地植物修复重金属污染的应用前景 近年来重金属污染日益严重，重金属因在环境中毒性强、不易降解、具有 环境积累效应等特征而引起科学家们的广泛关注。z n 是生命代谢的必需微量元 素，同时z n 和p b 也是- g e e 常见的环境有毒重金属。常用的物理化学方法治理 锌污染因其成本高而且会对环境造成二次污染而难以投入实际应用。植物修复 7 第一章绪论 技术受到广泛重视，因其具有运行费用低、效率高、对环境影响小等优点。湿 地系统在地球生态系统中发挥着重要的作用。湿地可以通过湿地土壤对重金属 离子的吸附固定、沉淀、溶解等作用，湿地微生物对重金属离子的吸收、转化、 沉淀、络合等作用，湿地植物对重金属的挥发、吸收和储存等作用降解土壤中 重金属含量。重金属的湿地植物修复是一种利用自然生长的湿地植物或者通过 遗传工程培育植物，来修复受重金属污染的水体或土壤的技术总称f 6 引。目前国 内对超积累植物的研究也有很大进展，很多地方也已经出现了人工的湿地生态 系统用于环境污染的修复。 用湿地植物修复受污染的土壤，研究修复过程中微生物的生态效应，有利 于揭示湿地植物积累和吸收重金属的机理，进而可以指导重金属污染土壤的生态 系统恢复和重建，为我国环境污染控制的研究和为解决我国目前和未来面临的 严峻的环境保护问题，提供环境保护理论依据。 1 6 研究目标及内容和方法 1 6 1 研究目标 鄱阳湖是中国最大的淡水湖，也是我国公布的首批国家重点湿地保护之一。 植物是湿地系统的重要组成部分。微生物在土壤中有最丰富的种类数，在土壤 生态系统中，微生物发挥着重要的生态功能作用。微生物对污染物的反应比植 物更为灵敏。本研究采用盆栽实验，通过加入不同浓度的z n 2 + 和p b 2 + 对鄱阳湖 两种具有代表性的优势植物( 芦苇和苔草) 进行胁迫培养，对于p b 2 + 胁迫培养 的植物，还加入水位的变化，以探讨三大根际微生物数量( 细菌，放线菌，真 菌) 上的变化，并研究了z n 2 + 胁迫下芦苇和苔草根际微生物群落功能多样性及 利用碳源能力，以期为鄱阳湖湿地植物修复环境污染提供理论依据。 1 6 2 研究内容和方法 ( 1 ) 湿地植物的调查 通过对鄱阳湖湿地植被调查及相关文献分析，系统地了解了目前鄱阳湖植 物的种类组成及其植被类型和分布。调查发现苔草和芦苇根系都很发达，芦苇 还具有发达的通气组织，为鄱阳湖具有代表性的优势物种，从而选择这两种植 物采用瓮栽实验进行着重研究。 ( 2 ) 不同z n ”和p b 抖浓度培养条件下三大根际微生物数量变化 8 第一蕈绪论 一 计数采用传统的平板培养法，细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂，放线菌采用改 良高氏i 号培养基，真菌采用马丁氏培养基( 孟加拉红培养) 。 ( 3 ) 不同z n 2 + 浓度培养条件下，根际微生物群落功能多样性变化 b i o l o g 法研究微生物群落功能多样性能通过比较简单的操作获得大量的数 据，本研究采用a w c d 、主成分分析和多样性指数计算分析方法分析数据。 9 第二章鄱阳湖南矶山研究区域概况及样品分析 第二章鄱阳湖南矶山研究区域概况及样品分析 2 1 鄱阳湖南矶山研究区域概况 鄱阳湖是我国第一大的淡水湖，隶属于上饶市。位于江西省北部、长江南 岸，跨南昌、星子、九江、都昌、鄱阳、湖1 5 1 和永修等地方。位于鄱阳湖主湖 区的南矶山湿地自然保护区是赣江南、中、北三支尾闯部分正在迅速生长发育 中的新生湿地，是东亚中重要的鄱阳湖湿地的核心区域之一，是鄱阳湖的典型 代表区域1 6 7 1 ，具有极其重要的环境生态、科研和经济价值。 南矶山湿地自然保护区在鄱阳湖南部，地处赣江南支、中支和北支汇入鄱 阳湖开放水域冲积形成的三角洲前沿地带，地理范围为东经1 1 6 0 1 0 7 2 4 ”至 1 1 6 0 2 37 5 0 ”北纬2 8 0 5 27 2 l ”至2 9 0 0 67 4 6 ”之间【6 8 】。根据湿地的自然环境状况，适 当涉及乡界边沿部分的季节性湖泊，成为了一个由典型湿地生态系统单元形成 的相对完整的区域，区域内除南山岛和矶山岛外，其余为湖滩草洲和水域1 6 圳。 南矶山湿地温暖多雨，全年气候四季分明，多年平均气温为1 7 3 ，年际变化 范围为0 5 1 o 。c ；南矶山湿地多年最低水位约9 5 9 1 1 0 2 m ，最高水位在 2 2 4 3 2 2 5 7 m 之间，水位最大年变幅为9 5 9 1 0 9 4 m ，最小年变幅3 8 0 4 4 2 m 【7 川。 南矶山自然保护区属于鄱阳湖区域内典型的湿地，完全处于水陆过渡地带 1 7 1 。保护区的土壤类型主要为水下沉积物、草甸沼泽土和草甸土。鄱阳湖湿地 植被按中国植被1 7 2 1 可划分为2 个植被类型：湿地植被型和沙地植被型。鄱 阳湖常见湿地植物有狗牙根群落( 狗牙草、牛鞭草、粟米草等) 、苦草群落( 苦 草、菹草、眼子菜) 、蓼子草群落( 蓼子草，稻槎菜、细籽焊菜) 、葫草蓼子草 水田碎米荠群落( 蓼子草、红穗苔草、皱叶酸模) 、芦苇、南荻群落( 芦苇、南 荻) 、刚毛荸荠群落( 刚毛荸荠) 、蕃菜一竹叶眼子菜轮叶黑藻+ 苦草群落( 善菜、 竹叶眼子菜、轮叶黑藻、苦草) 和苔草群落( 灰化苔草和糙叶苔草) 3 | 。 2 2 样品采集与前处理 2 2 1 土壤的采集与处理 分别于2 0 11 年4 月10 同和2 0 11 年1 0 月1 1 日在鄱阳湖南矶山湿地采集土 1 0 第二章鄱阳湖南矶山研究区域概况及样品分析 壤，将用于理化分析的土壤装入聚乙烯密封袋，将用于盆栽实验的土壤用编织 袋装好，及时运回实验室，为避免微生物引起的生物作用，取出潮湿土壤，平 铺成2 c m 厚的土层。将采集的土样在阴凉处自然风干后，挑去植物残体、小碎 石等杂物，再用玛瑙研钵将样品研细过2 m m 尼龙筛。对于用于土壤理化分析的 土壤用四分法进行缩分，装入干净的真空塑料袋中，密封低温保存备用；用于 盆栽实验的土壤则放在自然条件下备用。 2 2 2 植物的采集与处理 分别于2 0 11 年1 0 月1 1 日和2 0 1 2 年4 月2 9 日，在鄱阳湖南矶山湿地采集长 势较一致的芦苇和苔草，植物的根部用塑料膜包好以防止水分挥发，迅速将植物带 回实验室，将植物种植于用上次采集的土壤模拟湿地环境已2 个月的小盆中。 2 3 实验材料 2 3 1 主要试剂 n a 3 c 6 h 5 0 7 2 h 2 0 ( 分析纯) ，n a h c 0 3 ( 分析纯) ，n a 2 8 2 0 4 ( 分析纯) ，h 2 0 2 ( 优级纯) ，h f ( 优级纯) ，h n 0 3 ( 优级纯) ，h c l 0 4 ( 优级纯) ，铁、锰、铅3 种重金属标准溶液l0 0 0 m g 1 。 2 3 2 实验仪器 本实验测定土壤理化性质主要仪器设备见表2 1 。 表2 1 实验仪器设备 t a b l e 2 1t h ei n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t so fe x p e r i m e n t s 2 4 测定方法 ( 1 ) 含水率的测定 第二章鄱阳湖南矶山研究区域概况及样品分析 取1 0 0 0 0 9 土样，将土壤样品在1 0 5 。c 的烘箱内烘6 8 小时至恒重，然后 称量烘干后土的质量，计算样品烘干过程中土壤损失的质n - 与烘w 土质量 的百分比。 ( 2 ) p h 测定一电位法 称取经风干后研磨过2 m m 网筛的土壤样品1o o g ，置于2 5 m l 烧杯中，加入 1 ：1 去离子水混匀，用玻璃棒迅速搅拌2 - 4 m i n ，静置半小时后，用p h 计测定 数值7 4 1 。 ( 3 ) 有机质的测定一重铬酸钾容量法一稀释热法 准确称取0 5 0 0 0 9 土壤样品，置于5 0 0 m l 的锥形瓶中，加入l m o l l 的重铬 酸钾溶液1 0 m l 混匀。然后加浓硫酸2 0 m l ，转动锥形瓶使其与土壤充分发生作用。 静置3 0 m i n 后，加水置刻度2 5 0 m l ，然后加入3 4 滴邻啡哕啉指示剂。用0 5 m o l l f e s o 。标准溶液滴定直至生成砖红色为止，设三个平行样。用相同的方法 测空白( 不含土样) ，根据滴定用量计算有机物的含量1 7 制。 ( 4 ) 总磷的测定- n a o h 熔融一钼锑抗比色法 准确称取0 2 5 0 0 9 风干的土壤，放于坩埚底部，加入无水乙醇3 4 滴湿润土 壤，再平铺2 9 氢氧化钠于土壤表面，最后放入马弗炉内。当温度升至4 0 0 。c 左 右时，关掉电源。1 5 m i n 后再打开电源加热至7 2 0 。c ，1 5 m i n 后取出冷却。最后 加入1 0 m l 的水( 8 0 。c ) 并用水多次洗涤坩埚，将提取液与冼涤液一起倒入1 0 0 m l 容量瓶内，冷却后定容至刻度，再过滤。取上述溶液7 m l 于5 0 m l 的容量瓶中， 用水稀释至3 0 m l ，调节溶液p h 至微黄色。加入5 m l 钼锑抗显色剂摇匀，加水 定容至刻度线。放置3 0 m i n 后，用7 0 0 n m 波长进行比色测定。读取吸光度，从 校准曲线上查得相应的含磷量。 校准曲线：分别准确吸取5 m g l 1 磷标准溶液0 、1 、3 、5 、7 、1 0m l 于5 0 m l 容量瓶中，同时加入2 - - - 3 滴二硝基酚指示剂，并调节溶液p h 至刚呈微黄色， 重复上述步骤测定吸光度，以磷浓度( m g l _ ) 为横坐标，吸光度( a b s ) 为纵 坐标，绘制校准曲线【7 引。 ( 5 ) 总氮测定半微量开氏法 按文献两】中的方法测定总氮。 ( 6 ) 土壤重金属锌、铅、铜的测定i c p a e s 土壤重金属的消解采用微波消解法，重金属含量的测定采用i c p a e s 方法。 微波消解法。 1 2 第二章鄱阳湖南矶山研究区域概况及样品分析 准确称取预先处理好的土壤样品o 5 9 ，用称量纸送入到消解罐底部。加入 1 - 2 m l 去离子水润湿土壤样品，依次加入消解液4 m l h n 0 3 ，4 m l h f ，2 m lh 2 0 2 ， 混匀，放到1 8 0 电热板上预热约1 5 m i n ，预热时要注意防止样品和消解液溢出， 待大量白色气体或棕色气体释放完，即可停止加热，预热后可再加2 m l h n 0 3 ， 并可冲洗附在消解罐壁的样品，这样消解更彻底。微波消解仪的消解步骤为( 1 ) 5 a t m 3 m i n ；( 2 ) 1 0 a t m 2 m i n ；( 3 ) 1 5 a t m 5 m i n ；( 4 ) 2 0a t m 1 0 m i n ，按这四步分 步进行加热。采用单罐消解，单罐消解四步的功率分别为1 、2 、2 、3 。待消解 完毕并冷却后，将消解液移入1 0 0 m l 聚四氟乙烯烧杯中，并用去离子水多次清 洗消解罐盖和罐体，同样也移入四氟乙烯烧杯中，放于电热板上，待样品接近 蒸干时取下冷却，用1 的稀硝酸溶解残渣，并移入1 0 0 m l 容量瓶中，用2 稀 硝酸定容，并做空白和平行样，待测。i c p a e s 测定：i c p a e s 的工作条件和 主要参数见表2 3 。 表2 3i c p a e s 的工作条件和主要参数表 t a b l e 2 3w o r k i n gc o n d i t i o n sa n dt h em a i np a r a m e t e r so fi c p 诅e s 参数( p a r a m e t e r s ) 数值( n u m e r i c a lv a l u e ) 射频功率( r f p o w e r ) 载气流量( f l o wr a t eo f c a r r i e rg a s ) 雾化气( a t o r n i z a t i o ng a s ) 辅助气( a u x i l i a r ya i r ) 观察高度( o b s e r v a t i o nh e i g h t ) 波长p b ( w a v e l e n g t h - p b ) 波长- z n ( w a v e l e n g t h z n ) 波k - c u ( w a v e l e n g t h c u ) 2 5 测定结果 鄱阳湖南矶山湿地自然保护区的部分理化性质如表2 3 。 洲 一 胁 一 一 一 b 尥 呲 眦 m m ；耄 跏 表2 3 试验土壤的理化性质 t a b l e 2 1p h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f t e s t e ds o i l 土壤含水率 有机质总氮 总磷z n 含量 p b 含量 c u 含量 - i l i 品( )v , , ( ) ( m g k g ) ( m g k g ) ( m g k g ) ( m g k g ) ( m g k g ) 一 南矶山土样2 6 6 2 6 0 09 94 3 2 7 56 6 0 1 1 7 81 4 12 7 8 第三章b i o l o g 法研究锌胁迫对芦苇、苔草根际微生物功能多样性的影响 第三章b i o l o g 法研究锌胁迫对芦苇、苔草根际 微生物功能多样性的影响 3 1 试验材料 3 1 1 实验仪器 本实验所需的主要仪器设备见表3 1 。 表3 1 实验仪器与设备 t a b l e 3 1t h ei n s t r u m e n t sa n de q u i p m e n t so fe x p e r i m e n t s 序号仪器名称型号生产厂商 3 1 2 主要试剂 硫酸锌，o 8 5 的生理盐水 3 2 盆栽实验 本实验土壤的锌处理浓度以锌离子计，设计两个因素，a 因素为植物种类；b 因素为锌离子浓度，每个处理设3 个重复。 采用盆栽实验，于2 0 1 1 年8 月1 3 日，在每盆中装入取自鄱阳湖南矶山( 采 样时间为2 0 11 年4 月1 0 日) 经风干，过2 m m 孔径的土2 k g 。盆的内径为1 5 c l t ， 盆高为2 0c m ，盆内加水浸泡( 保持水面高于土面5c m ) 模拟湿地环境。在2 0 11 年1 0 月11 日，挑取从鄱阳湖南矶山当天采集的长势较一致的芦苇和苔草种植 于盆中，每盆栽湿地植物幼苗1 株。植物生长过程中，盆内保持5c m 左右的水 深。在2 0 1 1 年1 0 月3 1 目，待盆中均有生长良好的植物，排干清水，在盆中加 1 5 第三章b i o l o g 法研究锌胁迫对芦苇、苔草根际微生物功能多样性的影响 入人工配制的硫酸锌溶液( 使z n 2 + 浓度梯度为0m g l 、1 0m e c l 、2 0m g l 、5 0 m g l 、8 0m g l 和1 1 0m g l ) ，每盆大概1 2 5 l ( 相当于恢复水深至5c m ) ，每个 处理均设3 个重复，总共3 6 盆，全部材料置于透明塑料棚内自然生长。在投入 z n s 0 4 溶液一段时期后，于2 0 1 2 年2 月2 9 日取根际土进行分析。 3 3b i o l o g 实验 称取相当于1 0 0 0g 新鲜根际土壤( 含水率为6 5 4 ) 于2 5 0m l 锥形瓶中， 加入9 0 m l0 8 5 氯化钠无菌溶液，4 下充分振荡1 0 m i n ，取2 m l 稀释液于 1 8 m 1 0 8 5 的无菌氯化钠溶液中，用o 8 5 氯化钠无菌溶液配制成1 0 。3 土壤悬浮 液。将b i o l o ge c o 微平板从冰箱中取出，在恒温箱中预热到2 5 ，用8 道加 样枪吸取此土壤悬浮液1 5 0 p 1 至e c o 板的微孔中，以上操作菌在无菌条件下进 行。最后将接种的b 1 0 l o ge c o 微平板在2 5 培养，每1 2h 用b i o l o ge n a x 自动读盘机测定5 9 0 n m 处光密度值，培养了2 4 0h 。分别取4 8 h ，9 6 h 和实验结束 时2 4 0 h 的b i o l o g 数据进行主成分分析( p c a ) 并绘制a w c d 随时问变化的曲 线。 3 4 数据处理与分析 3 4 1 土壤微生物总体活性表述 b i o l o ge c o 微平板采用孔的平均颜色变化率( a v e r a g ew e l lc o l o r d e v e l o p m e n t ，a w c d ) 计算，表达式7 6 】【7 7 1 为： a w c d 2 ( c i r ) n 其中c i 是除对照孔外3 1 个反应孔在5 9 0 n m 下测定的吸光值， r 为对照孔的吸光值， n 为碳源种类数，e c o 板n = 3 l ， 计算中c i r 小于零的孔，记为零，即：c i 。r o 【7 8 1 下同。 3 4 2 群落多样性指数计算 本实验采使用6 个指数来反映不同浓度锌胁迫下土壤微生物代谢功能多样 性的差异，不同的多样性指数反映了根际土壤微生物群落多样性的不同侧面。 1 6 笙三兰里! 竺! 竺堡鎏研究锌胁迫对芦苇、苔草根际微生物功能多样性的影响 二二二二二二二= 二二_ ：二：= = ! ! ! 兰：! = ! ： ( 1 ) 丰富度指数( s 1 丰富度指数s 指被利用的碳源的总数目，用颜色变化孔数表示，即相对吸光 值大于0 2 5 的碳源个数【8 0 【8 l 】。 ( 2 ) s h a n n o n 指数( h7 ) s h a n n o n 指数h7 用于评估微生物丰富度和均匀度，计算公式吲【8 3 1 为： h 7 = - e p i 。l n p i p i 为第i 个培养孔的相对吸光度与整个平板相对吸光度总和的比，即 p i 2 ( c i - r ) 侄( c i - r ) ( 3 ) 均匀度指数( e h ) 均匀度指数e h 是通过s h a n n o n 指数h7 计算出的均度，计算公式【8 4 】为： e h = h l n s s 为颜色变化孔的数目。 ( 4 ) s i m p s o n 指数( 1 d 1 s i m p s o n 指数1 d 用于评估某些最常见种的优势度【8 5 】， d ：y 丛! ! ：坠 一( j ) v 一1 ) n i 是第i 孑l 的相对吸光值( c i r ) n 是相对吸光值总和。 ( 5 ) m c i n t o s h 指数( u ) m c i n t o s h 指数u 是基于群落物种多维空间上的多样性指数，计算公式 8 5 1 8 6 1 如下： u 2 n i 2 n i