（食品科学专业论文）烟叶与卷烟中生物碱组成及其迁移规律研究.pdf

摘要 本研究采用溶剂超声提取烟草生物碱的方法，和g c n p d 分析技术系统分析 了国内外不同类型、品种和产地的4 0 个烟草样品和2 1 种卷烟( 含添加烟碱) 烟 丝、烟气和滤嘴样品中的生物碱。采用双内标法对烟叶、卷烟烟丝、主流烟气和 滤嘴中烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟碱、麦斯明和可替宁的含量进行了准确测 定。研究比较了国内外不同类型、品种和产地烟草中生物碱含量的差异，以及卷 烟生物碱由烟丝向烟气迁移变化的规律和生物碱滤嘴截留效率，研究结果表明： 采用优化的前处理方法( 1 m l5 氢氧化钠和l o m l 三氯甲烷，超声提取1 5 0 m g 烟末样品1 5 分钟) 得到了较好的重复性和回收率，相对标准偏差为0 9 4 一5 7 4 ， 回收率为9 9 3 1 一1 0 2 8 3 。国内不种品种和不同产地烤烟烟叶生物碱含量差 异较大，烤烟烟碱含量范围为0 7 9 一3 9 2 ，烟碱占总生物碱比例范围为 7 6 9 2 一9 1 0 5 ；烤烟中基本上不含麦斯明。烟碱、降烟碱和假木贼碱含量符合 上部 中部 下部的规律，新烟碱符合中部 下部 上部的规律。国内不同类型烟 叶中烟碱、麦斯明和可替宁含量呈白肋烟 马里兰烟 烤烟 香料烟趋势，降烟碱、 假木贼碱和新烟碱呈白肋烟 烤烟 马里兰烟 香料烟趋势；而烟碱占总生物碱比 例呈马里兰烟 烤烟 白肋烟一香料烟趋势。国内外烤烟生物碱含量水平大致相 当，而国外自肋烟以及香料烟生物碱含量则明显低于国内水平。由部分卷烟烟 丝中不含麦斯明和可替宁，而所有卷烟烟气中均可检测到麦斯明和可替宁，提示 了烟气中部分麦斯明和可替宁来源于烟丝烟碱，初步建立了烟丝烟碱、麦斯明和 可替宁含量与烟气麦斯明和可替宁含量之间的模拟方程，麦斯明和可替宁的计算 值分别在测定值的0 7 2 4 - 1 8 7 0 倍和0 8 6 4 1 5 9 2 倍范围内( 特长烟支、活性炭 复合滤嘴和外加烟碱卷烟除外) 。滤嘴中除了降烟碱含量低于检测5 艮外，滤嘴 对卷烟烟气中其它生物碱均有截留。 本方法适用于同时测定6 种烟草生物碱，得到的有关烟草生物碱含量数据以 及生物碱迁移行为的规律可应用于卷烟产品设计。 关键词：烟叶，卷烟，生物碱，组成，迁移行为，气相色谱，分析 a b s t r a c t i nt h i ss t u d y , t h ea l k a l o i d so fd o m e s t i ca n df o r e i g nt o b a c c oa sw e l la s c i g a r e t t e s m o k ew e r e s e p a r a t e db y u l t r a s o n i cs h a k i n ga n d a n a l y z e db y g c e q u i p p e d w i t hn p d t h ea l k a l o i d ss u c ha s n i c o t i n e ，n o m i c o t i n e ，m y o s m i n e ，a n a b a s i n e ，a n a t a b i n ea n d c o t i n i n e ，w e r e q u a n t i t a t i v e l y d e t e r m i n e d b y t w o i n t e r n a l s t a n d a r dm e t h o d t h e a m o u n ta n dc o m p o s i t i o no fa l k a l o i d so f4 0t o b a c c os a m p l e sf r o md i f f e r e n tt y p e s r e g i o n sa n dv a r i e t i e sw e r ec o m p a r e d u s i n gt h eq u a n t i t a t i v ed a t ao ft h ea l k a l o i d si n c u tt o b a c c o ，m a i n s t r e a ms m o k ea n df i l t e ro f t w e n t y o n ec i g a r e t t eb r a n d s ，t h et r a n s f e r e f f i c i e n c y f r o mc u tt o b a c c ot om a i n s t r e a ms m o k ea n dr e t e n t i o no ff i l t e rw e r e c a l c u l a t e d t h er e s u l t so b t a i n e dw e r ea sf o l l o w ：1 ) t h et a r g e ta l k a l o i d sc o u l db ea c c e p t a b l y s e p a r a t e db yu l t r a s o n i c a l l ys h a k i n g1 5 0 r a gg r o u n dt o b a c c ow i t hl m l5 n a o h a n d 1 0 m lc h c l 3f o rl o m i n t h er a n g eo fr s dw a so 9 4 一5 7 4 a n dt h er e c o v e r yo ft h e m e t h o d sw a s9 9 3 1 1 0 2 8 3 2 ) t h ea m o u n to fa l k a l o i d si nf l u e c u r e df r o m d i f f e r e n tr e g i o n sa n dv a r i e t i e sw e r es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t t h er a n g eo fn i c o t i n ei n f l u e c u r e dt o b a c c ow a s0 7 9 一3 9 2 ，a n dt h er a t i oo fn i c o t i n et ot o t a la l k a l o i d sw a s 7 6 9 2 一9 1 0 5 t h e r ew a sf e wm y o s m i n ei nm o s to fa l lf l u e c u r e dt o b a c c o t h e a m o u n to fn i c o t i n e ，n o m i c o t i n ea n da n a b a s i n ei nf l u e c u r e ds h o w e dt h et e n d e n c yo f u p p e rl e a f c u t t e rl e a f l o w e rl e a f , b u tt h ea m o u n to fa n a t a b i n ea g r e e dw i t ht h e t e n d e n c yo fc u t t e rl e a f u p p e rl e a f l o w e rl e a f 3 ) t h en i c o t i n e ，m y o s m i n ea n d c o t i n i n ec o n t e n ti nd i f f e r e n tt y p e so fd o m e s t i ct o b a c c oc o n f o r mt ot h et r e n do fb u r l e y m a r y l a n d f l u e c u r e d o r i e n t a l t h ea m o u n to ft h er e s to ft o b a c c oa l k a l o i d sw a s b u r l e y f l u e c u r e d m a r y l a n d o r i e n t a l ，t h er a t i o o fn i c o t i n et ot o t a lt o b a c c o a l k a l o i d sw a s m a r y l a n d f l u e - c u r e d b u r l e y o r i e n t a l 4 ) t h e a l k a l o i d so ff o r e i g n a n dd o m e s t i cf l u e c u r e dh a dn os i g n i f i c a n td i f f e r e n t i a , b u ta l k a l o i d so ff o r e i g nb u r l e y a n do r i e n t a lw e r e o b v i o u s l y l o w e rt h a nd o m e s t i cs a m p l e s 5 ) m y o s m i n ea n dc o t i n i n e e x i s t o n l y i n p a r t o fc u t c i g a r e t t es a m p l e s ，b u t a l l c i g a r e t t e m a i n s t r e a ms m o k e c o n t a i n e dm y o s m i n ea n dc o t i n i n e i t s u g g e s t s t h a tam a j o r i t yo fm y o s m i n ea n d c o t i n i n ei nm a i n s t r e a ms m o k e o r i g i n a t ef r o mn i c o t i n ei n c u tc i g a r e t t e t w os i m u l a t e d e q u a t i o n s ，w h i c he x p r e s s e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n m y o s m i n ea n d c o t i n i n ei n p a g e5o f 7 3 c o t i n i u ei um a i n s t r e a ms m o k ea n dn i c o t i n e ，m y o s m i n ea n dc o t i n i n ei nc u tc i g a r e t t e ， w e r ed e v e l o p e d ( e x c e p tf o r s p e c i a ll e n g t hc i g a r e t t e ，c h a r c o a l f i l t e r c i g a r e t t e a n d c i g a r e t t ea d d e dn i c o t i n e ) 6 ) t h ea m o u n to fn o m i c o t i n ei nf i l t e rw a sl o w e rt h a n m i n i m u md e t e c t a b l el i m i t a t i o n ，b u tr e t e n t i o ne f f i c i e n c yo fo t h e ra l k a l o i d si nf i l t e r w e l e g e n e r a l l ym o r et h a n 2 5 t h em e t h o de s t a b l i s h e di ss u i t a b l ei n a n a l y s i n g 6t o b a c c oa l k a l o i d s s i m u l t a n e o u s l y , t h ed a t a a b o u tc o m p o s i t i o n so ft o b a c c oa l k a l o i d sa n dt h et r a n s f e r b e h a v i o ro ft o b a c c oa l k a l o i d sd u r i n gc o m b u s t i o no fc i g a r e t t e sc o u l db eu s e di nt h e d e s i g no fc i g a r e t t ep r o d u c t s ， k e y w o r d s ：a l k a l o i d s ，t o b a c c o ，s m o k e ，c o m p o s i t i o n ，t r a n s f e rb e h a v i o r g c ，a n a l y s i s p a g e6o f 7 3 1 引言 1 1 烟草生物碱分析研究现状 烟草和卷烟烟气的化学组成十分复杂，至今从烟草和卷烟烟气中鉴定出的成 分已经超过5 0 0 0 种“3 ，而其中最主要的、也是烟草特有的物质就是烟草生物碱。 烟草中绝大部分生物碱是3 一吡啶基衍生物，烟草生物碱含有两个氮杂环和一个 不对称碳原子，属弱二级碱，已经定名的烟草生物碱有4 0 多种”1 ，其中主要的 烟草生物碱有：烟碱、降烟碱、麦斯明、假木贼碱、新烟碱和可替宁( 图1 ) 。 嘏0 假木贼碱新烟碱 可替宁 图16 种主要烟草生物碱 1 1 1 生物碱组成与含量对卷烟制品生理强度、烟气特征的影响 烟碱占烟草生物碱比率很高，卷烟燃吸时释放出烟碱，可使吸烟者的植物神 经和中枢神经系统感受到刺激兴奋作用”1 ，该刺激兴奋作用既可使吸烟者对烟碱 产生一种依赖作用，同时也可减少吸烟者患p a r k i n s o n i s m 及a l z h e i m e r “1 等神经 系统疾病的几率。 降烟碱对人体的神经刺激较烟碱弱，普遍认为”1 降烟碱对烟气吸味有负面的 影响，特别是降烟碱与n n n 显著正相关，极大影响卷烟制品的吸食安全性。但也 有报道”认为降烟碱吸昧柔和，并且降烟碱的迁移率很低，降烟碱较烟碱可降低 卷烟烟气的刺激性，在一定程度上对烟气吸味有正面作用。此外，降烟碱可以阻 止人体内淀粉b 一缩氨酸纤维的形成“3 ，而淀粉0 一缩氨酸纤维很容易缩聚在一起 导致人体多种严重的神经性疾病，d i c k e r s o nt j 等”1 认为降烟碱和葡萄糖可以 加成到淀粉且一缩氨酸纤维的一段链长4 0 的氨基酸片断上，进而阻止了淀粉b 一 、 明了斯p 麦 、z工 如 一 斧黼j 几 j 少 1 1 3 卷烟抽吸前后生物碱迁移行为差异 不同生物碱在卷烟烟气中迁移行为差别很大，对烟草和卷烟烟气中生物碱的 迁移行为研究一直是国外烟草研究机构研究的热点和难点课题之一。国外对烟草 生物碱的迁移研究涉及范围很宽，既有采用g c 直接测定生物碱的迁移以及降解 行为”，也有外加含“c 烟碱示踪分析迁移行为m 3 ，此外还有热重差热质谱m 】 分析不同价态烟碱的迁移行为的细微差异等。 1 2 生物碱的分离与分析 l _ 2 1 烟碱和降烟碱的分离分析 烟草和烟气生物碱的分析一直受到烟草界的重视，但受到分离分析方法和条 件的限制，早期烟草和烟气生物碱分析多数只针对烟碱及降烟碱进行研究。早在 1 9 0 9 年，b e r t r a n dg “报道了烟碱的重量分析法。1 9 4 3 年b o w e nc v 等“”采 用蒸馏提取法，使得烟碱和降烟碱的回收率达到了9 7 2 - 1 0 1 8 ，但是还不能 对其它生物碱进行分离。 1 9 4 7 年，b o w e nc v 等”1 用正己烷作淋洗液，采用淀粉柱分离烟碱和降烟 碱，这很可能是色谱法在生物碱分离和分析中的最早应用，但这种方法对降烟碱 含量高的样品分析不是很令人满意。 1 9 5 2 年，k e n t u c k y 大学的h o u s t o nf g ”“比较了b o w e n b a r t h e l 方法“、 滴定法和硅钨酸重量法对烟碱进行测定，认为三种方法的结果基本一致。1 9 5 5 年，c u n d i f fr h ”2 i 采用苯一氯仿对烟样进行萃取，使用高氯酸进行滴定，烟碱 和降烟碱的回收率在9 7 2 一9 8 4 之间。滴定法成本低、操作简便、测定用时短 但相对标准偏差较大，对测定含量较少的其它烟草生物碱没有实质意义。1 9 5 5 年，l e i s e r s o nl 等使用纸色谱分析了烟碱和其它生物碱。1 9 5 8 年，l a u r e n e a h 等”1 使用分光光度法检测了烟气中的烟碱含量，结果与硅钨酸重量法的结果 吻合得很好。硅钨酸重量法和分光光度法在相当长的时间里被视为烟碱的标准分 析方法，尤其是分光光度法检测速度很快，对低含量的准确度很高，选择性也较 好。 1 9 6 7 年，h a r v e yw r 等人”“使用蒸馏方法提取烟草中的生物碱，用甲醇一 盐酸作提取剂，同时使用活性炭除去干扰物质，用u v 吸收检测进行定量。1 9 6 7 年，k o s s e y0 f ”使用二维薄层色谱( t h i n l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) 同时分离了 1 0 种烟草生物碱，但未能给出定量结果。1 9 6 9 年，h a r v e yw r 等“”又对蒸馏方 法的提取溶剂进行了比较，发现使用甲醇、乙酸和水可以达到较好的萃取效果。 1 2 2g c 方法分析烟草生物碱 进入2 0 世纪7 0 年代，伴随色谱技术的发展，烟草生物碱的分析逐渐转入以 气相色谱分析为主。1 9 7 6 年，瑞士烟草公司的p i l o t t ia 等1 使用g c - m s 检测 了烟碱以及一系列烟碱的代谢产物，他们使用了氘代烟碱作内标，这是首次关于 ( ；c m s 分析烟草生物碱的报道。 1 9 7 7 年b u r n sd t 等使用索氏萃取来提取烟草生物碱。索氏萃取法能提 取全部生物碱，一直到现在，索氏提取都被认为是有效的。但是索氏提取的缺点 是提取时间过长，通常不能少于2 h 。他们采用g c f i d 分离和检测烟草生物碱， 并使用h p 3 3 7 0 电子积分仪对保留时间和峰面积进行了较精确的计算。但他们不 能有效地分离麦斯明和新烟碱，也没有检测到假木贼碱。 1 9 7 9 年r o s an ”使用k o h 改性的c a r b o w a x 柱对烟草生物碱进行分离，基 本上成功地分离了烟碱和其它生物碱，这种k o h 改性的c a r b o w a x 柱后来应用得 较为广泛。但是c a r b o w a x 柱不能很好地分离新植二烯、脂肪烃和烟碱，采用f i d 进行检测势必会在色谱图烟碱峰附近出现较大的新植二烯峰，这不利于对烟碱的 准确定量，选择n p d 作为检测器则可以避开这一问题。c a r b o w a x 对麦斯明和新 烟碱的分离效果不算很好，但可以通过碱性改性进行修饰，碱性特性可以阻止色 谱柱对生物碱尤其是降烟碱的吸收，从而防止拖尾峰的形成。 1 9 8 1 年s e v e r s o nr f 等。”使用快速玻璃毛细管g c n p d 定性定量地测定了 烟草中的烟碱、降烟碱、麦斯明、新烟碱、假木贼碱和2 ，3 一二联吡啶。s e v e r s o n r f 等最初使用超声波技术是为了提取烟草中的新植二烯和脂肪烃，结果提取效 果很好，于是他们把超声波振荡应用于烟草生物碱的提取：把含2 ，4 一二联吡 啶内标的甲醇一k o h 溶液和烟样放入自动进样瓶中，在超声波浴中振荡提取 1 5 m i n ，然后取lul 提取清液进g c 分析。8 e v e r s o nr f 等对超声波振荡提取和 传统的索氏提取比较后认为：简单的超声波振荡提取与传统的索氏提取所得的结 果几乎一致，完全可以用超声波振荡提取代替索氏提取，可使提取时间从2 h 缩 短为1 5 m i n ，极大地提高了分析速度。此外，他们还发现：同时使用填充柱和n p d 时n p d 响应曲线的线性较差：而同时使用毛细管g c 和n p d 则可以得到较好的线 性响应，并且重现性也比较好。s e v e r s o nr f 的方法对以后提取分离烟草生物 碱方法的发展影响较大。 1 9 8 8 年，b u r t o nh r 等”1 分析了采收和调制期间白肋烟中生物碱以及酰化 生物碱的含量，他们采用的方法与s e v e r s o nr f 等。”的方法完全相同，他们在 试验中发现：过熟烟叶中可替宁含量较高，成熟烟叶中新烟碱含量几乎是欠熟烟 叶中含量的百倍，这和f r a n k e n b u r gw g 等。”的结果一致。 1 9 8 9 年，a n d e r s o nr a 等。也采用类似s e v e r s o nr f 的方法，他们采用 p h = 4 5 的含有微量抗坏血酸的柠檬酸盐一磷酸盐缓冲溶液做提取液，对烟样提 取后把p i 调至5 0 ，然后加入3 0 m l 乙酸乙酯进行萃取，经过相分离取部分乙酸 乙酯相加盐酸分离反萃取3 次，得到的水相用n a o h 调p h = 5 0 ，在冰浴下用氯 仿萃取3 次，氯仿萃取后加入无水硫酸钠然后密封，于5 保存直至进气相分析。 1 9 9 7 年，刘百战“”使用大孔毛细管g c - f i d 测定了烟草中的生物碱，他使用 乙醚和5 的n a o h 对烟样进行提取，烟碱的回收率可达9 7 以上。刘百战认为： 烟碱和其它生物碱含量的差别很大，要求色谱柱容量大；烟碱和其它生物碱 含量的结构相似，要求柱效强：生物碱的极性大，要求色谱柱惰性好。因此他 采用了0 5 3 m m 内径的大孔毛细管柱来分离烟草生物碱，大孔毛细管柱结合了填 充柱和毛细管柱的优点，柱容量大且柱效高，分析一个样品4 5 分钟即可完成。 实验结果表明该法可以快速准确地测量烟草生物碱。2 0 0 1 年，云南烟草研究院 的杨金辉等也使用g c f i d 测定了烟样中的生物碱的含量，进一步说明该方法 的快速准确和可行的特点，值得推广。杨金辉等采用了三种溶剂：c h 。c 1 。，c h c i 。 以及c h c l 。：苯( 1 ：9 ) 对烟样进行了提取，并比较了三种溶剂提取效率。从结 果看，c h 。c l 。提取效率最高，但仅达到了8 2 3 7 ，这可能与他们添加的碱过少致 使生物碱没有完全游离化有关。 2 0 0 1 年，史宏志等。7 1 分析了我国主要烟区烟叶中烟碱、降烟碱、假木贼碱和 新烟碱的含量，并着重分析了我国烟草生产中烟碱向降烟碱转化的问题，他们采 用甲基丁醚作提取溶剂，其方法与b u r t o nh r 。2 1 和s e v e n s o nr f ”“的方法类 似。 色谱柱是g c 分离的关键，而色谱柱固定相的极性则对烟草生物碱的分离效 果有较大的影响，最常使用的是碱改性过的聚l - - - - 醇非极性固定相。2 0 0 0 年 l o u r e n c om d g 等。”使用g c 检测了烟草中的生物碱，他们使用了各种不同极性 的固定相对烟草生物碱进行了分析和对比，认为极性柱有以下两个缺点：( 1 ) 极 性柱对降烟碱的吸附能力过强；( 2 ) 烟草萃取物中其它物质对生物碱的定量干扰 严重。他们采用了一种新型的非极性色谱柱和经过碱改性的固定相来分离烟草中 的生物碱，并同时使用两种内标分别对烟碱和其它生物碱定量，使得定量更为精 确。由于新烟碱不能买到标样，他们近似认为其响应值与假木贼碱相似，由于新 烟碱和假木贼碱结构非常相似，这样的近似也是合理的。 2 0 0 2 年，菲莫公司的y a n gs s 等l 使用c c n p d 分离检测了烟草中的生物 碱，他们使用氨水对生物碱进行游离化，并对前处理参数进行了很细致的优化， 他们考察了甲醇、丙酮、二氯甲烷、己烷以及混合溶剂对生物碱的提取效率，认 为：提取生物碱的关键是在溶剂的极性以及溶剂和氨水的互溶度之间找到一个平 衡的最佳点。最终他们选择的最优溶剂条件为甲醇：二氯甲烷= 1 ：3 ，此外他们 还提高了进样口温度实现热聚焦，对进样衬管进行硅烷化减少吸附导致的峰展 宽，在进样衬管中填充了红硅藻土担载的2 k o h 改性的1 0 c a r b o w a x2 0 m 减少 过载并避免甲醇进入色谱柱。 最近几年，s p m e ( 固相微萃取) 技术也被应用于烟草生物碱的分析。1 9 9 8 年，y a n gs s 等“”采用s p m e g c n p d 测定了烟草中生物碱的含量，这是s p m e 技 术首次应用于烟草生物碱的分析。s p m e 定性效果非常好，检测限甚至在p p b 以 下。s p m e 的无溶剂进样技术使得它特别适合于与快速g c 对接，由于不用担心巨 大的溶剂峰影响，还可以采用气相无分流进样模式。 2 0 0 2 年，w uw j 等“”使用s p m e - g c m s 测定了烟草中的生物碱的含量，他们 采用了氘代生物碱作内标，该法结合了s p m e 的高通量、最少溶剂使用、非接触 操作和毛细管g c 的高色谱解析能力以及质谱定性和高灵敏度的优点，但是该法 的定量效果一般。 s p m e 的优点很突出：高通量，无溶剂使用，无携带问题，易制样，灵敏度高， 定性能力很好。但8 p m e 缺点也很明显：烟草体系复杂，而s p m e 灵敏度极高， 普通内标化学性质与各生物碱差异较大，选用普通内标将使定量精度和准确度大 打折扣。( 童) s p m e 纤维容易老化，重复性试验效果不好，致使定量效果不是很理 想，标准偏差较大。 1 2 3l 砰l c 方法分析烟草生物碱 h p l c ( 高效液相色谱) 法较少应用于烟草生物碱分析。1 9 8 0 年，p l a d ej j 等“使用h p l c 分离测定了烟草提取液中的4 种生物碱。h p l c 方法通常要求p h 范围为2 - 9 ，因为高p h 会损害色谱柱上的硅粒，但是在低d h 条件下，生物碱多 里双质子态导致保留时间很短，这一矛盾使得应用h p l c 同时测定多种生物碱的 时候显得很困难，并且h p l c 方法的灵敏度比g c 低，这使得h p l c 分离烟草生物 碱的应用很少。 1 9 8 1 年s a u n d e r s5 a 等“”使用h p l c 对烟草生物碱进行了定量分析，色谱 柱使用反相c ，a 柱，为保持生物碱以游离态存在并避免高p h 对柱的损伤，他们把 流动相p h 精确调至7 2 5 ，h p l c 系统对生物碱的检测限为4 0 - 5 0 n g ，他们分析一 个样品需要2 天以上，耗时太长，并且前处理过程极其繁琐。 1 2 4c z e 方法分析烟草生物碱 最近几年，c z e ( 毛细管区域电泳色谱) 作为高效的分离分析手段，也被应 用于烟草生物碱的分析。1 9 9 5 年，y a n gs s “”使用磷酸盐缓冲溶液，用u v 做 检测器，对烟草中的部分生物碱含量进行了分析。c z e 分析速度快，l m i n 即可完 成一个样品的分析。c z e 可以在较宽的p h 范围内操作，可通过调节p h 来控制生 物碱的3 种形态，低p h 可使生物碱处于双质子态，有利于c z e 分析。1 9 9 6 年， y a n gs s “”进一步改进了处理过程，使得c z e 可以同时测定结构相似的生物碱。 2 0 0 1 年，l o c h m a n nh 等“使用较高浓度的柠檬酸盐缓冲溶液，使得p h 更低， 这样不仅得到了更高的分离效率，同时还降低了检测限。l o c h m a n nh 甚至实现 了分析单个烟草细胞中局部组织的烟碱含量，这给c z e 分析整株烟草的烟碱浓度 的空间分布带来了可能。l o c h m a n nh 在分析了单个细胞的烟碱含量以后，发现 细胞膜巾的烟碱含量显著地高于细胞质中的烟碱含量。细胞膜是烟叶组织暴露于 大气中的第一道屏障，含有高浓度的烟碱以抵御害虫的攻击也是合理的。 c z e 作为新兴的分离分析方法具有很独特的优点：样品消耗极少、高效、高 分辨率、分析时间短、选择性好、与其它分析方法互补性较好，如果缓冲溶液 p h 足够低的话，样品保存数天也没有明显损失，不会降低回收率。需要特别指 出的是c z e 要求进样量极少，只用纳升级样品，这给分析单个烟草细胞中生物碱 含量带来了希望。但c z e 方法也有其缺点：仪器很昂贵；u v 检测器对某些 生物碱的灵敏度较低。使用c z e 分析生物碱的两个关键因素是：生物碱的离子化 和电渗流。这两点取决于缓冲溶液的p h 和离子强度，p h 越低以及离子强度越高， 生物碱质子化程度则越充分，电渗流则越慢，色谱峰形状和u v 吸收则越好“4 ”1 。 1 3 生物碱由卷烟烟丝向烟气的迁移行为研究 国外对生物碱迁移率的研究开展较早，1 9 8 3 年，j a n e i r or ”在英美烟草 公司的一次研讨会上提出：“为了使吸食者更满意，应不断改进产品，这要求烟 草制造商应尽可能了解和把握烟碱，也就是找出影响烟碱从烟丝向烟气迁移的因 素，以及找出影响烟碱在烟气中由粒相向气相传递的速率。”事实上，只要测得 同一批卷烟烟丝的生物碱含量和卷烟抽吸后烟气中的生物碱含量即可求得生物 碱的迁移率：生物碱转移率= 羹蠹器量睾瓣。 1 9 7 3 年h o u s e m a n t h f 1 6 l 使用1 4 c 标记物对烟草生物碱的迁移行为进行了示 踪研究，结果表明：烟草中固有的生物碱和外加的生物碱表现出的迁移性质较 为相似：生物碱只存在于粒相物中，分析剑桥滤片截流的粒相物而不用考虑气 相，即可得到准确的烟气生物碱含量。 1 9 9 9 年s t e v e n sn a 等“”使用g c a e d 在卷烟中添加了氘代烟碱，对氘代烟 碱在卷烟抽吸过程中的变化历程进行了跟踪，结果发现7 9 的氘代烟碱可以进入 到主流烟气和侧流烟气中。 1 9 9 9 年s e e m a nj i 等“7 1 使用t g d t a m s ( 热重分析差热分析质谱) 分析 了烟碱和烟碱盐向气相中的热迁移，他们认为烟碱的热迁移有三种机理： ( 1 ) 烟碱盐的脱质子化： 淤i 滞l 嘏 ( 2 ) 烟碱盐中羧酸阴离子基团分解： ( 3 ) 单质子态烟碱盐的岐化反应： ：嚣亭一毋? + 滞训 2 0 0 0 年p e r f e t t it a 等”1 使用g c m s 对不同烟碱盐迁移为主流烟气中烟碱 的行为进行了对比分析。在实验中，他们共添加了7 种烟碱盐( 水杨酸烟碱盐、 酒石酸烟碱盐、藻酸烟碱盐、单宁酸烟碱盐、半乳糖醛酸烟碱盐、醋酸烟碱盐和 二苯甲酰酒石酸烟碱盐) ，他们发现：烟碱盐的热稳定性对主流烟气中的烟碱外 消旋化没有任何贡献，也就是说烟碱盐与主流烟气中新产生的d - n i c o t i n e 无关。 此外，他们还发现烟草固有的d - n i c o t i n e 和- n i c o t i n e 以及外加的纯 - n i c o t i n e 和纯d - n i c o t i n e 由烟草向烟气的迁移行为没有显著差别。在卷烟燃 烧温度下，不必考虑各种烟碱盐热稳定性的差异，因此各种烟碱盐向烟气中输送 烟碱的效率很相似。 2 0 0 1 年p e r f e t t it a 等1 使用g c m s 研究了- n i c o t i n e 和d - n i c o t i n e 由 烟丝到主流烟气的迁移行为，结果显示：烟碱的迁移率与烟草的类型和种类有关， - n i c o t i n e 和d - n i c o t i n e 的迁移率非常接近，可以认为没有显著差异。他们得 到的- n i c o t i n e 和d - n i c o t i n e 的平均迁移率为1 5 2 5 ，r 2 = o 9 8 。 截至目前，还没有有关烟碱外其它生物碱迁移率的报道，也没有生物碱之间 相互“变形迁移”的报道。随着烟叶生产技术和烟叶内在质量的不断提高、卷烟 加工工艺和生产装备不断的改进，以及新型滤嘴以及通风稀释等技术被采用，卷 烟产品焦油量和烟气烟碱含量也在逐年降低，当今卷烟产品的生物碱迁移规律与 以往的报到相比肯定有较大的差异。 综上所述，目前烟草生物碱分析主要有3 种方法：气相色谱法”“，高效液 相色谱法| ：”4 ”和毛细管区域电泳法。“”。其中，高效液相色谱法灵敏度较低，对 流动相p h 要求严格，现在已很少采用：毛细管区域电泳法分辨率高，分析时间 短，并且样品消耗极少，可对单个烟草细胞进行生物碱含量分折，但其仪器昂贵， 相应的紫外检测器对某些生物碱的灵敏度较低，目前采用的很少；而气相色谱法 前处理简单，可方便使用n p d 检测含n 的烟草生物碱，应用相对广泛。 总之，烟草生物碱的组成以及在卷烟燃吸过程中的迁移行为对卷烟产品的生 理强度、品质风格及其吸食安全性都有很大的影响，而多项研究结果的差异也反 映出各种烟草生物碱及其衍生反应物测定方法的差异。因此，系统准确地研究国 内外各类型烟草、卷烟中生物碱组成与含量以及迁移行为，统一建立简捷的测定 方法，对于提高卷烟产品的设计水平和准确评价卷烟吸食安全性是非常有意义 的。 本研究拟采用g c n p d 测定国内外4 0 种烟叶中的6 种生物碱，对溶剂超声提 取前处理参数进行优化，并建立溶剂提取前处理和g c - n p d 分析烟草生物碱的方 法，对国内外不同类型、品种以及产地烟叶中的生物碱组成和含量进行全面分析， 进而提供较全面的我国主要类型烟叶中生物碱含量数据，并对国内外主要类型烟 叶中的生物碱含量进行对比。同时，选取部分国内外代表性卷烟品牌，分析其卷 烟烟丝、主流烟气和抽吸后滤嘴中生物碱组成和含量，对生物碱的迁移行为进行 探讨，试图找出部分生物碱的迁移变化规律，以利于在卷烟产品设计中较准确地 控制生物碱及其反应衍生物的释放量。 2 实验 2 1 样品、标样、试剂和仪器 2 1 1 实验样品 2 1 1 1 烟叶样品 国内烟叶样品如表1 所示，收集了2 4 个烤烟样品、4 个白肋烟样品、2 个香 料烟样品和1 个马里兰烟样品，总计3 1 个烟样。 袭1 国内烟叶样品 国内烟叶类型样品产地品种等级 年份 烤烟 4 福建龙岩长汀k 3 2 6b 2 f2 0 0 3 福建龙岩长汀k 3 2 6c 3 p2 0 0 3 福建龙岩长汀k 3 2 6x 2 f2 0 0 3 云南大理弥渡 k 3 2 6b 2 f 2 0 0 3 云南大理弥渡k 3 2 6c 3 f2 0 0 3 云南大理弥渡k 3 2 6x 2 f2 0 0 3 河南平顶山郏县 n c 8 9b 2 f2 0 0 3 河南平顶山郏县 n c 8 9c 3 f2 0 0 3 河南平项山郏县n c 8 9x 2 f2 0 0 3 山东潍坊临朐n c 8 9b 2 f2 0 0 3 山东潍坊临朐 n c 8 9c 3 f2 0 0 3 山东潍坊临胸n c 9 9x 2 f2 0 0 3 山东潍坊临朐中烟1 0 0b 2 f2 0 0 3 山东潍坊l 临朐中烟1 0 0c 3 f 2 0 0 3 山东潍坊临朐中烟1 0 0x 2 f 2 0 0 3 河南平顶山郏县中烟1 0 0 b 2 f2 0 0 3 河南平顶山郏县中烟1 0 0c 3 f2 0 0 3 河南平项山邦县中烟1 0 0x 2 f2 0 0 3 云南楚雄烟科所云烟8 5b 2 f 2 0 0 3 云南楚雄烟科所云烟8 5c 3 f2 0 0 3 云南楚雄烟科所云烟8 5x 2 f2 0 0 3 贵州遵义绥阳云烟8 5b 2 f2 0 0 3 贵州遵义绥阳云烟8 5 c 3 f2 0 0 3 贵州遵义绥阳云烟8 5x 2 f 2 0 0 3 白肋烟湖北恩旖 湖北恩施 云南宾川 云南宾川 鄂烟1 号 鄂烟1 号 t n 8 6 t n 8 6 上二 中三 上二 中三 2 0 0 3 2 0 0 3 2 0 0 3 2 0 0 3 p a g e17o f 7 3 香料烟 湖北十堰杰里克上一 2 0 0 3 云南保山b a s w aa b 级 2 0 0 3 马里兰烟 湖北宜昌五峰2 0 0 3 国外烟叶样品如表2 所示，烤烟选择了津巴布韦和巴西产地；白肋烟选择了 巴西和马拉维产地，香料烟选择了土耳其a g 。样品采集年份分别为1 9 9 8 年和2 0 0 3 年。 2 1 1 2 卷烟样品 表2 国外烟叶样品 产地类型商品名年份 选取有较大市场占有率的1 8 种卷烟样品，自制3 个添加烟碱样品。 国内烤烟：红塔山，红双喜，大红鹰，白沙，南洋双喜( 香港) ； 国外烤烟：5 5 5 ，d u n h i l l ( 括性炭复合滤嘴) ，d a v i d o f f ； 国内混合型：中南海3 m g ( 活性炭复合滤嘴) ，中南海5 m g ( 活性炭复合滤 嘴) ，中南海1 0 m g ，七匹狼，都宝，中美，金鹿，嘉得乐： 国外混合型：k e n t ，h i a r l b o r o ； 其它：添加过烟碱( 4 5 1 2 m g 支，7 5 2 0 m g 支，1 5 0 4 0 m g 支) 的“白沙”。 具体规格如表3 所示。 表3 卷烟样品具体规格 盒标焦油盒标烟碱烟支长度滤嘴长度接装纸长度 样品名称生产厂家 m gm g m mm mm m 红塔山红塔集团1 51 28 4 2 42 8 红双喜上海烟草集团1 l1 o8 4 2 02 4 大红鹰宁波卷烟厂1 51 38 42 02 9 白沙长沙卷烟厂1 5098 42 03 0 |蓦撇舢li竖 - 一 5 5 5 英美烟草集团1 21 28 42 lz 5 i h l n h i l l 伦敦登喜路烟草公司30 38 42 23 2 南洋双喜香港南洋兄弟烟草1 6128 42 02 4 d a y i d o f f德国利足美股份有限公司1 30 99 32 52 9 中南海3 m g北京卷烟厂30 38 42 53 0 中南海5 a g北京卷烟厂50 58 42 53 0 中南海1 0 n l g北京卷烟厂1 0108 32 02 5 七匹狼龙岩卷烟厂90 88 4 2 02 9 都宝芜湖卷烟厂8108 42 02 9 中美武汉烟草集团1 7l38 42 02 4 金鹿上海烟草集团80 78 4 2 53 0 嘉得乐韶关卷烟厂1 51 ，1 8 42 02 4 k e n t 布朗威廉森 1 30 98 32 12 b m a r l b o r o菲莫烟草集团1 21 08 42 12 5 2 1 2 试剂 n a o h ，c h z c l 2 ，c h c l 3 ，c h j o h ，乙醇，氨水，无水硫酸钠( 分析纯) 。 2 1 3 标样 生物碱标样：烟碱( f l u k a 公司) ，降烟碱、麦斯明、假木贼碱、可替宁( a l d r i c h 公司) 。以上纯度 9 8 内标：2 一甲基喹啉、2 ，4 一二联吡啶( a c r o s 公司) 。以上纯度 9 8 2 1 a 仪器 感量天平 h p 6 8 9 0 g c n p d h p 6 8 9 0 g c h p 5 9 7 3 m s j j z 一2 0 型自动抽烟机 超声波振荡器 1 0 1 a 一1 型干燥箱 s p m e l d e t t l e r 公司 a g i l e n t 公司 a g i l e n t 公司 无锡通辰科技公司 昆山市超声仪器有限公司 宁波自动化仪表厂 v a r i a n 公司 2 2 实验方法 2 2 1 实验样品准备 烟叶：将烟叶抽梗，在1 0 1 a l 型干燥箱中恒温4 0 。c 干燥2 小时，取出后用 粉碎机粉碎，过4 0 目筛后置于密封带中待测，用烘箱法测定含水率。“。 卷烟：按照卷烟抽样标准“2 1 将成品卷烟从盒包中取出，置于温度2 0 1 、 相对湿度6 0 2 环境下平衡4 8 h 以上”，筛选重量和吸阻后使用j j z 一2 0 型自动 抽烟机抽吸，捕集烟气后的剑桥滤片待测，捕集烟气后的滤嘴待测。 卷烟烟丝：将2 0 一4 0 支成品卷烟剥开，取烟丝，在烘箱中恒温4 0 。c 干燥2 小时，称重计算各牌号单支卷烟净烟丝平均重量，然后用粉碎机磨碎烟丝，过 4 0 目筛，密封待测，用烘箱法测定含水率”“。 添加烟碱的“白沙”：抽取一定数量经抽样、平衡并筛选过重量和吸阻后的 白沙，分为3 组，各用微量注射器注入1 0 0 pl 烟碱溶液，添加量分别为：4 5 1 2 m g 支、7 5 2 0 m g 支和1 5 0 4 0 m g 支，再次平衡4 8 h 后抽吸。 2 2 2 烟草中生物碱的测定方法的建立i 删 2 2 2 1 标样标准工作曲线 取准确量的标样，混合后采用逐步稀释法配制6 个不同浓度的生物碱标准溶