血红蛋白的提取和分离ppt课件.ppt

【课题背景】新华网首尔03年月日电韩国浦项工业大学科学家日宣布，他们已查明可抑制艾滋病病毒感染的“”蛋白质核心部分的结构。浦项工业大学生物科学系教授吴秉夏等人，当天公开了“”蛋白质内核心部分“”的三维分子结构，并称已弄清楚这一结构的正确位置及它与其他结构之间的相互作用。研究成果发表在最新一期分子细胞杂志上。2年英国自然杂志曾刊登论文说，“”蛋白质可有效抑制艾滋病病毒的感染。此后，世界各地的很多科学家开始研究“”蛋白质的结构，但到目前为止尚未有人宣称取得突破性进展。对蛋白质的研究有助于人们对生命过程的认识和理解。通常科学研究需要获得纯度较高的蛋白质。怎样才能从复杂的混合物中提取和纯化蛋白质呢？,1,2,本课题学习目标,1、主要概念：凝胶色谱法电泳法缓冲溶液它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理电泳法分离样品的原理缓冲溶液的组成和作用机理,3,(一)蛋白质分离和提取的原理,一.基础知识,根据蛋白质各种特性的差异：分子的形状、大小电荷性质和多少溶解度吸附性质对其他分子亲和力,4,（一）凝胶色谱法（分配色谱法）,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离物质的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶，来进行分离。,1.概念：,3.凝胶色谱法的原理,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。,依据的特性是：蛋白质分子量的大小。,5,（二）缓冲溶液,1.概念:,在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混合溶液。,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响，维持PH基本不变。,2.作用:,3.缓冲溶液的配制:,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_,其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科学研究(活性),磷酸缓冲液,6,（三）电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,7,知识点一：凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,8,9,凝胶色谱法的原理,依据的特性是：蛋白质分子量的大小。,10,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,知识点二：电泳,11,琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。,1、琼脂糖凝胶电泳,12,原理:聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）非变性聚丙烯酰胺凝胶:在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。SDS-PAGE:仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋质白。在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。,2、聚丙烯酰胺凝胶电泳,作用原理：教材P66,13,人们用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白,思考？,二：血红蛋白的提取和分离,14,血液组成,注：抗凝剂常用柠檬酸钠,15,实验操作（一）样品处理,血液的组成成分,16,血红蛋白由四个肽链组成(如图)，包括两个-肽链和两个-肽链。其中每条肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分了二氧化碳。血红蛋白因含有血红素而呈现红色。,实验操作（一）样品处理,17,二、实验操作：新鲜血液样品处理粗分离纯化纯度鉴定,18,1、红细胞的洗涤,阅读课本内容，回答以下问题：1、洗涤的目的？2、怎样洗涤？3、洗涤干净的标志是什么？,直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。,实验操作（一）样品处理,除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化。,血液柠檬酸钠低速短时离心吸出上层血浆红细胞5倍体积生理盐水缓慢搅拌10min低速短时离心吸出上清液反复洗涤直至上清液无黄色,速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的效果。,能否用蒸馏水或者高浓度的氯化钠？,19,磁力搅拌器,20,2.血红蛋白的释放,将洗涤好的红细胞倒入烧杯中，加蒸馏水到原血液的体积，再加40体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10min。在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。,思考：蒸馏水和甲苯的作用？,实验操作（一）样品处理,蒸馏水：红细胞过度吸水破裂甲苯：溶解细胞膜，有利于提取和分离血红蛋白,21,3.分离血红蛋白溶液,1、采用什么方法分离血红蛋白？2、离心分层后，各层的成分各是什么？3、用滤纸过滤，去掉什么成分？,实验操作（一）样品处理,红细胞破碎混合液中速长时离心（2000c/min10min）滤纸过滤除去脂质分液漏斗分离出血红蛋白，得到红色透明液体。,除去脂质类和红细胞破碎物沉淀层,22,取1mL的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300mL的物质的量浓度为20mmol/L的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12h。,4.透析,透析过程透析目的？,除去样品中分子量较小的杂质。,透析的原理透析袋是一种半透膜，能使小分子自由进出，而大分子不能通过。思考：根据材料进行实验设计：现有烧杯一只、透析袋一个、碘液、淀粉溶液、铁架台一个、棉线若干。探究碘液、淀粉是否能通过透析袋。写出实验步骤和结果预测。,实验操作（一）样品处理,23,利用透析袋透析,24,透析过程动画演示,25,（二）凝胶色谱操作,（1）凝胶色谱柱的制作：取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,26,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。凝胶色谱柱的装填方法：A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。注意装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,27,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时，使凝胶装填紧密。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,28,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、使吸管管口沿管壁环绕移动。,29,三、纯度鉴定,SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,判断纯化的蛋白质是否达到要求，需要进行蛋白质的鉴定。,30,蛋白质的提取和分离一般分为四步：（1）样品处理：包括洗涤红细胞；血红蛋白的释放；离心等操作收集血红蛋白溶液。（2）粗分离：透析除去分子较小的杂质。（3）纯化：通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去。（4）纯度鉴定：通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。,小结,31,1、用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的