（发育生物学专业论文）卵泡发育和黄体形成过程中sparc基因在小鼠卵巢中的表达与调节.pdf

摘要 摘要 富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白( s e c r e t e dp r o t e i n , a c i da n dr i c hi nc y s t e i n e s p a r c ) 是一种对 细胞活性有广泛影响的基质相关的糖蛋白。s p a r c 及其相关蛋白可以与细胞外基质相互作用， 影响细胞外基质分子的表达、调整细胞的形态、减少细胞间的粘附、影响细胞的迁移以及由生 长因子诱导的细胞增殖和血管发生，并在肿瘤发生、损伤修复以及胚胎发育等过程中发挥着重 要作用。本实验利用原位杂交，研究了s p a r c 在小鼠卵巢中的时空特异性表达情况。利用小鼠 性成熟模型、e c g 诱导的卵泡发育模型、h c g 诱导的排卵模型以及黄体形成和退化模型，研究 了s p a r c 在小鼠卵泡发育和黄体形成与退化过程中的调节。在小鼠的性成熟过程中，s p f u 在卵巢基质中弱表达，在发育卵泡的卵泡膜细胞中较强表达，而在颗粒细胞和卵母细胞中都不 表达。在e c g 诱导的卵泡发育过程中，注e c g6 小时之后，s p a r c 在卵泡膜细胞和卵巢基质中 的表达开始上调，之后显著增强，4 8 小时在膜细胞和卵巢基质中都强表达。注e c g 后再注h c g ， s p a r c 在卵巢基质和膜细胞中的表达维持在高水平，注h c g9 小时之后壁层颗粒细胞开始弱表 达，之后逐渐增强，1 3 小时排卵时在壁层颗粒细胞强表达。注l l c 2 4 小时后，鲫! 6 眦在卵巢 的新生黄体中强表达，并且这种表达情况一直持续到结构性的黄体退化。在结构性退化的黄体 中，仅能在基质细胞观察到基本水平的s p a r c 表达，在发育卵泡的膜细胞有较强水平的表达。 这些结果表明，s p a r c 可能在小鼠卵泡发育和黄体形成与退化过程中起重要作用。 关键词：富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白，卵巢，卵泡发育，黄体 i v a b s t r a c t e x p r e s s i o na n dr e g u l a t i o no f s p a r ci n m o u s e o v a r yd u r i n g f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t a n d c o r p u s l u t e u mf o r m a t i o n a b s t r a c t s p a r c ( s e c r e t e dp r o t e i n , a c i d i ca n dr i c hi nc y g 由0i sam a w i x - a s s o c i a t e dg l y c o p r o t o i nt h a t j n v o l 憎i nav m o t yo fc o u u l a ra c t i v i t i e s 。s p a r ca n di t sd l 】蝴p e p t i d e sb i n dt os e v e r a lp r o t e i n so f t h eo x t r a c e l l u l a rm a t r i x0 三c m ) ，a f f e c te c mp r o m i ne x p r e s s i o n , a l t e rc e l ls h a p e ，r e d u c ec e l l u l a r a d h e s i o n , i n f l u e n c em i g r a t i o n , a n dm o d u l a t eg r o w t hf a c t o r - i n d u c e dc e l lp r o l i f e r a t i o na n da n g i o g e n e s i s s p a rci sa l s oi m p o r t a n tf o rt u m o r i g e n e s i s ，t i s s i n j u r ya n de m b r y o n i cd e v e l o p m e n ti nt h i ss t l 】 d y 9 w om a di ns i t uh y b r i d i z a t i o nt oe x a m i n et h et e m p o r a la n ds p 撕a le x p r e s s i o np a t t e r n so fs p a r ci n m o u i s co v a r yd u r i n gt o i f i c u l a rd e v e l o p m e n ta n dc o r p u sl u t e u mf o r m a t i o n f u r t h e r m o r e ，w ee x a m i n e d t h er e g u l a t i o no fs p a r ce x p r e s s i o ni nm o u s oo v a r yb ys e v e r a lm o d e l s ，s u c ha ss e x u a lm a t u r a t i o n , f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ti n d u c 划b yc c go v u l a t i o ni n d u c e db yh c ga n dp n i p u sl u t c u mf o r m a t i o na n d r e g r e s s i o n w ef o u n dt h a td u r i n gs e x u a lm a t u r a t i o n , al o wl e v e lo fs n u e x p r e s s i o no c c u r r e di n o v a r ym a t r i x a n dm o d e r a t ei nt h e c ac e l l s ，b u tt h e r ew a sb os i g n a ti ng r a n u l o s ac e l l sa n do o c y t e s 。 d 盯i n gf o l l i c u l a rd e v e l o p m e n ti n d u c e db ye c qt h ee x p r e s s i o no fs p _ 6 眦i no v a r ym a t r i xa n dt h e c a c e l l sw a su p - r e g u l m e da f t e r6h o u r so fc ( i n j e c t i o na n da c h i e v es u m m i t4 8h o u r s 蚍w ei n j e c t e d h c g4 8h o u r sa f t e re c gi n j e c t i o nt os i m u l a t et h ee f f e c to fl hi nv i v oa n dac o n t i n u i n gh i g hl e v e lw a f t f o u n di nm g z i xa n dt h e , 髓c e u s 9h o u r sl a t e r , t h e r ew a sal o we x p r e s s i o ni ng r a n u l o s ac e l l sa n d i n c r e a s e dg r a d u a l l y a tt h et i m eo fo v u l a t i o n , as t r o n gs i g n 丑1w 淞d e t e c t e d 2 4h o u r sp o s t - h c g t r e a t m e n t ，t h e r ew a sah i g hl e v e lo fs 眦e x p r e s s i o ni nn e w l yf o r m e dc o r p u sl u t e u m , a n dt h i s o c c u r r e du n t i ls t r u c t u r a lr e g r e s s i o no fc o r p u sl u t e u mw h e nab a s a ll e v e lw a so b s e r v e di no v a r ym a t r i x a n dm o d e r a t el e v e li nt h e c ac e l l s o u rd a t as u g g e s tt h a ts e 6 岖cm a yp l a yar o l ei nf o l l i c u l a r d e v e l o p m e n ta n dc o r p u sl u t e t u nf o r m a t i o n k e yw o r d s ：s p a r c ，o v a r y , f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t , c o r p u sl u t e u m v c a n d i d a t e ：d e n gw e n b o s p e c i a l i t y ：d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f y a n gz e n g m i n g 独创声明学位论文版权使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得或其他教育机构的学位 或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：邓支破 日期- 游年多月多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留 并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本 授权书) 学位论文作者签名：硬p s 玳 日期：w 谢年钼肜日 导师签名： 日期：砷矽年彭月伽 前言 1 前言 1 1 卵泡发育与黄体形成和退化的研究进展 卵泡发育( f o l l i c u l a rd e v e l o p m e n t ) 是指卵泡由原始卵泡发育成为初级卵泡、次级卵泡、三 级卵泡和成熟卵泡的生理过程。在小鼠在出生前，原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 通过背肠系膜到达生殖嵴，停止有丝分裂并进入减数分裂，从而转化为卵母细胞，并由包围在 其周围的一层纺锤状原始颗粒细胞形成原始卵泡( p r i m o r d i a lf o l l i c l e ) ( e p # ge t a t , 2 0 0 4 ；g i m b u r g e ta l ，1 9 9 0 ) 。原始卵泡启动募集后，卵母细胞周围的原始颗粒细胞会由扁平变为立方或高柱状 的颗粒细胞，同时，颗粒细胞产生的活化素( a c t i v i n ) 可以通过自分泌和旁分泌的机制促进f s h 受体的表达，发育成为初级卵泡。实验表明，最先形成的原始卵泡晟早启动生长，并向卵巢髓 质部迁移，并证明卵巢中原始卵泡和生长卵泡的分布类型是在胚胎的1 2 天左右就已经定型 ( b y s k o ve ta l ，1 9 9 7 ) 。 近年来。越来越多的研究表明，卵泡发育是一个卵母细胞和外层的颗粒细胞紧密联系的过 程。已证实，表达于卵母细胞中的重要基因生长分化因子9 ( g d f 9 ) 和骨形态发生蛋白1 5 ( b m p - 1 5 ) 对促进腔前卵泡颗粒细胞的发育有非常重要作用( s h i m a s a k ie ta l , 2 0 0 3 ；f e u e r s t e i ne t a 1 2 0 0 6 ) 。而卵母细胞表达的连接蛋白3 7 ( c ) 【3 7 ) 可以形成间隙连接，使卵母细胞和外层颗粒 细胞紧密联系在一起。c x 3 7 基因敲除小鼠的颗粒细胞在很早阶段就黄体化，卵母细胞发育不到 具有恢复减数分裂能力的状态( g o o d - - u g he ta t , 1 9 9 9 ) 。 腔前卵泡发育是一个f s h 非依赖性的过程，最近的研究发现在这个过程中有很多基因参与 其中，包括f i g a ( s o y a le ta 1 2 0 0 0 ) 、f o x 0 3 a ( c a s t r i l l o nc ta l2 0 0 3 ) 、n o b o x ( r a j k o v i c e ta l ，2 0 0 4 ) 、 f o x l 2 ( s c h m i d t e t a t , 2 0 0 4 ；u d a c t a l ，2 0 0 4 ) 、s o h l h l ( p a n g a se t a l ，2 0 0 6 ) 和s o h l h 2 ( b a l l o w e t a l ， 2 0 0 6 ) 等等。 随着腔前卵泡继续发育，卵泡的结构逐渐发生变化，表现为颗粒细胞数目的不断增多和卵 泡膜细胞的形成，形成次级卵泡( s e c o n d a r yf o l l i c l e ) 。颗粒细胞在卵母细胞分泌的g d f 9 和 b m p - 1 5 的作用下不断的增殖变厚。在次级卵泡阶段另一个重要的事件是膜细胞的形成，骨形态 发生蛋白- 4 ( b m p - 4 ) 是这个过程中的标志性分子( s h i m a s a k ie t a t , 2 0 0 3 ) 。膜细胞会分成两层： 内膜细胞和外膜细胞，内膜细胞分化成膜间质细胞，外膜细胞分化成平滑肌细胞。膜细胞的发 育还伴随着许多小血管的生成，这样，围绕卵泡的血液就可以把营养物质和促性腺激素运送到 正在发育的卵泡，同时把卵泡产生的废物和分泌的物质运送出卵泡。最近的研究表明各类前列 腺素家族分子也积极的参与到卵泡的形成与发育过程中，f i l i o n 等和s u n 等检测到膜相关的前列 腺素e 合成酶1 ( m i c r o s o m a lp r o s t a g l a n d i nes y n t h a s e , m p g e s - i ) 在初级卵泡和次级卵泡的颗粒 细胞中明显表达，s u n 等还在初级卵泡和次级卵泡的颗粒细胞和卵母细胞中检测到了较强的胞 质型前列腺素e 合成酶( c y t o s o l i cp r o s t a g l a n d i nes y n t h a s e ，c p g e s ) 的表达，而p r o s t a g l a n d i ne ( p g e 2 ) 受体4 ( e p 4 ) 则主要在腔前卵泡的卵母细胞中表达，由此推测，在卵泡的形成和发 东北农业大学理学硕士学位论文 育过程，c p g e s 合成的p g e 2 可能通过e p 4 在卵母细胞中行使功能，促进卵泡的发育和卵母细 胞的成熟( f i l i o ne ta l ，2 0 0 l ；s e 西e t 出，2 0 0 3 ；s u ne ta l ，2 0 0 6 ) 。 膜细胞的分化及其表达的l h 受体以及颗粒细胞表达的f s h 受体为卵泡越过腔前卵泡发育 为三级卵泡提供了条件。颗粒细胞表达的l d t 配基和卵母细胞表达的间隙连接蛋白c x 3 7 可以促 使血浆渗出，形成卵泡液，同时，卵母细胞与其周围的颗粒细胞一起形成卵丘。在小鼠性成熟 之后，受体内内分泌环境的调节，下丘脑开始分泌c m r h 对体内f s h 和l h 发生的周期性变化 进行调节，并形成周期募集，选择优势卵泡排卵，其余的不能顺利排卵的卵母细胞则在发育的 各个阶段发生卵泡闭锁( f o l l i c u l a ra t r e s i a ) 。三级卵泡的颗粒细胞大量合成f s h 受体，并与体内 的f s h 结合，促进卵泡颗粒细胞增生，表达更多的f s h 受体。当体内的f s h 水平下降而l h 水平上升时，只有那些含有足够f s h 受体的卵泡才可以在低浓度的f s h 水平下继续发育成为成 熟卵泡，形成优势卵泡。被选择的颗粒细胞开始表达p 4 5 0 芳香化酶，与颗粒细胞从初级卵泡就 开始表达的1 7 羟甾醇脱氢酶( 1 7 h s d ) 共同作用，可以使颗粒细胞具有分泌雌激素的作用 ( e r i c k s o ne ta 1 1 9 9 3 ) 。 排卵前期，在l h 峰的刺激下，颗粒细胞开始表达l h 受体、类固醇激素快速合成调节蛋白 ( s t a r ) 、p 4 5 0 侧链裂解酶( p 4 5 0 s c c ) 以及3 羟甾醇脱氢酶( 3 h s d ) ，在这个过程中可能是由 于卵泡液中微环境的变化，致使卵母细胞的抑制作用在排卵前期变得非常弱( e p p i ge ta t , 2 0 0 1 ) 。 而膜细胞表面也开始表达l h 受体、胰岛素、胰岛素样生长因子i ( i g f i ) 、脂蛋白、活化素、 抑制素、生长分化因子9 和骨形态发生蛋白4 等( e r i c k s o ne ta l ，2 0 0 1 ) 。l h 与膜细胞中膜间质 细胞上的l h 受体结合后会催化胆固醇合成雄烯二酮，而胰岛素、胰岛素样生长因子i 、脂蛋白、 活化素和抑制素等可以调节雄激素的合成量。膜细胞合成的雄烯二酮会通过基膜扩散到颗粒细 胞，颗粒细胞在f s h 的刺激下会诱导p 4 5 0 芳香化酶的产生，雄烯二酮会被p 4 5 0 芳香化酶催化 生成雌酮雌酮又在1 7 肛羟甾脱氢酶( 1 7 b - h s d ) 的作用下转化为雌二醇，即“两细胞，两促性 腺激素”假说。排卵前还伴随着卵母细胞成熟，包括蛋白质和m r n a 的积累、恢复到第二次减 数分裂中期和生发泡破裂( g d ) 等过程。 卵泡排卵是一个受激素调节的非常复杂的过程，虽然对其机理的研究已经持续了很多年， 但其机理仍不清楚。小鼠在周期性的l h 峰作用下，自发排卵并形成功能性黄体。l h 对排卵过 程的影响主要表现在，排卵前由雌激素正反馈形成的l h 峰可以激活卵泡膜中的腺苷酸环化酶， 导致c u 伊的增加，引起颗粒细胞的黄体化，使卵泡内的孕酮量增加。孕酮可激活卵泡中的一 些蛋白分解酶、淀粉酶、胶原酶等，这些酶作用于卵泡壁的胶原，使其张力下降，膨胀性增加， 这一系列的级联反应将会导致卵丘扩展( c u m u l u se x p a n s i o n ) ，最后诱发排卵。卵母细胞对排卵 的影响则主要表现在能够分泌一种卵丘扩展促进因子( c u m u l u se x p a m i o n - e n a b l i n gf a c t o r , c e e f ) ，诱导卵丘卵母细胞复合体( o o c y t e - c u m u l u sc e l lc o m p l e x e s ) 中的颗粒细胞合成透明质酸 酶，参与卵丘扩展过程。j o y c e 等发现p g e 2 的表达源于膜间细胞，但是其浓度却受到卵母细胞 旁分泌因子的控制( j o y c ee ta l ，2 0 0 1 ) 。现在对卵丘扩展促进因子有很多猜测，e l v i n 等的实验发 现，g d f - 9 可以诱导颗粒细胞产生透明质酸酶2 ，并且可以诱导环氧合酶2 ( c y c l o o x y g e n a s e - 2 ， c o x 2 ) 和p g e 2 受体e p 2 的表达，进而影响p g e 2 的表达推测g d f - 9 可能是一种重要的卵 丘扩展促进因子( e l v i ne ta l ，1 9 9 9 ；e l v i ne ta l 。2 0 0 0 ) 。前列腺素家族分子在排卵过程中发挥着重 要作用，c o x 2 敲除小鼠由于不能形成正常的卵丘扩展以及不能形成排卵柱头，表现为排卵量 2 前言 皇皇曼暑鲁詈鲁1 。-l i l 大幅减少( l i r ae ta l ，1 9 9 7 ；d a v i se ta l ，1 9 9 9 ) 。e p 2 敲除的小鼠排卵后卵丘卵母细胞复合体不正 常，说明e p 2 也参与正常的卵丘扩展过程( h i z a k ie ta l ，1 9 9 9 ) 。体内c o x - 2 常与m p g e s 1 耦联 合成i p 3 e 2 ，所以在排卵过程中通过此途径合成的p g e 2 可能通过其受体e f 2 介导参与正常的排 卵过程。排卵的最终过程是卵泡壁在水解酶的作用下发生裂解以及卵母细胞的释放。在这个过 程中，纤溶酶系统可能发挥着重要作用。颗粒细胞主要表达纤溶酶原激活因子( t p a ) ，而膜间 质细胞主要产生t p a 的抑制因子血浆纤溶酶原抑制因子1 ( p a l 1 ) 。在激素调控下，颗粒 细胞表达的激活因子t p a 和膜间质细胞产生的抑制因子p a l 1 在卵泡不同细胞中的协同表达， 可导致定向局限蛋白水解流的形成，诱发卵泡局部定向破裂，引起排卵( l i ue t a l , 2 0 0 4 a ；l i u e t a t , 2 0 0 4 b ) 。 排卵后，颗粒细胞和膜细胞由于l h 峰的作用进一步黄体化，并与卵泡膜血管、成纤维细 胞、以及巨噬细胞一起填满卵泡腔，形成黄体( p a a v o l ae ta l , 1 9 7 9 ) 。黄体是一个短暂的内分泌 器官，其主要功能是分泌孕酮，孕酮对生殖系统有多种生物学功能。如果没有受精或者着床失 败，黄体将经历功能上和结构上的退化，逐渐萎缩变成白体，失去分泌功能。 在黄体形成过程中，颗粒细胞在数小时之内由分裂增生的细胞转化为具有分泌功能的粒性 黄体细胞，具有产生类固醇激素细胞的典型超微结构，含有大量的包括胆固醇酯的脂滴，一系 列的基因编码调节因子的顺序表达精细的调节着此过程( r i c h a r d s 眈a t , 2 0 0 1 ) 。首先在l h 的作 用下，内源性的c d k 抑制因子诱导颗粒细胞停止在g o ( 1 期，之后在颗粒细胞膜上快速、短暂的 诱导孕酮受体( p r o g e s t e r o n er e c e p t o r , p r ) 、c o x 2 、c a t r 增强子结合蛋白( c a t r e n h a n c e rb i n d i n g p r o t e i n 艮c e b 邱) 和早期生长反应蛋白( e a r l y g r o w t hr e s p o n s e p r o t e i n - l , e g r - i ) 等等( l i me t a t , 1 9 9 7 ；s t e m c c k e t a t , 1 9 9 7 ；e s p c ye t a l ，2 0 0 0 ；p a r ke t a l , 2 0 0 1 ) 。敲除c o x - 2 、p r 、和c e b 邱的小鼠 都不能生育，在外源性激素的诱导下，c o x 0 2 和p i t 敲除小鼠无法排卵，但是却可以形成功能性 的黄体。进一步的研究表明由于m p g e s 1 、c o x 2 和e p 2 都在新生的黄体中强表达，暗示由 m p g e s - 1 和c o x - 2 耦联合成的p g e 2 通过e p 2 在黄体形成过程中起着重要的作用，同时c p g e s 和 c o x - i 耦联生成的p g e 2 对黄体的功能有非常大的意义( a r o s hc ta t , 2 0 0 4 ；s a k u r a ie ta t , 2 0 0 3 ； h a r r i se ta 1 2 0 0 1 ；t a n i o k ae ta t , 2 0 0 0 ；s u ne ta t , 2 0 0 6 ) 。c e b p p ( i - ) 经外源激素诱导后虽然可以 诱发排卵但是无法形成黄体，表明在黄体形成过程q j c m b 邓起着必不可少的作用，l h 与颗粒细 胞膜上的l h 受体作用增加胞内的c a m p ，进而激活c r e 结合蛋白( c r eb i n d i n gp r o t e i n , c r e b ) ， 而c e b 叩的启动子含有两个c a m p 反应元件( c a m p 陀s l 0 n 辩e l e m e n t s ，c r e s ) ，彼此结合促使 c e b p l 3 的表达，起始黄体化过程，但由于在发生黄体化之后的形成黄体中不表达，因此，c e b p p 并不能维持黄体存在。e g r - i ( - ) 小鼠卵巢中l h 受体的表达减少，垂体中的l h p 的表达也明显 减少，使得颗粒细胞对l h 的反应性降低，导致排卵异常和黄体化失败( s i m i se ta t , 1 9 9 3 ；r 矗m j ie t a l ，2 0 0 2 ；p a r ke ta t , 2 0 0 3 ；r u s s e l le ta l ，2 0 0 3 ) 。 在黄体细胞分化的同时，卵泡结构发生重大变化，经历细胞外基质( e x t r a c e l l u l a rm a t r i xe c m ) 重组和血管发生( v a s c u l o g e n e s i s ) 。e c m 主要起支持和保护作用，对很多生理过程有着重要的影 响。在黄体化过程中，l h 诱导的基质金属蛋白酶( m a t r i xm e t a l l o p r o t e i n a s e s , i v l m p s ) 中的m m p 2 和m m p 9 积极的参与，裂解i v 型胶原，同时l h 还可以诱导基质金属蛋白酶组织抑制因子( t i s s u e i n h i b r o r so f m e t a l l o p r o t e i n a s e s 。t i m p s ) 的表达r p l 诱导m m p s 的另外一种抑制因子以巨球蛋白 ( 0 2 n l a c r 0 四o b u j i 皿a 2 m ) 表达，通过调节微环境中m i p s 和其抑制因子的比例来促进黄体细胞 3 东北农业大学理学硕士学位论文 的分化( i r v i n g - r o d g e r se ta l ，2 0 0 5 ；c u r r yc ta l ，2 0 0 3 ；y e o we ta l ，2 0 0 1 ) 。黄体发达的血液网络为黄 体细胞分泌的激素快速有效的发挥作用提供了保证，同时为黄体细胞合成类固醇激素提供足够 的原料和养份。卵巢黄体化过程同样也是一个复杂的过程，现在的研究证明参与其血管生成调 节过程的分子主要包括血管内皮生长因子( v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r , v e g f ) 、碱性成纤 维细胞生长因子( b a s i cf i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r , b f g f ) 、内分泌腺来源的血管内皮生长因子 ( e n d o c r i n eg l a n d - d e r i v e dv e o f , e g v e g f ) 和血管生成素( a n g i o p o i e t i n s ，a n g ) 以及它们的受 体，其过程由l h 起始( f r a s e rc ta l ，2 0 0 5 ； , e c o u t e re ta i ，2 0 0 2 ；f r a s e re ta t , 2 0 0 0 ) 。 卵泡颗粒细胞分化为功能性的黄体细胞后，对外部不同的信号通路的反应性也随之发生改 变，主要表现为f s h 受体( f s h r ) 沉默、l h 受体( l h r ) 的快速减少、催乳素受体( p r o l a c t i n r e c e p t o r , p r l r ) 的持续表达、p r 受体的增加以及雌激素受体u ( e s t r o g e nr e c e p t o r 风e r a ) 的减 少，而雌激素受体b ( e s t r o g e nr e c e p t o rb ，e 邸) 增多。之后通过各自不同的信号通路途径参与不 同的生理过程，主要是甾类激素的合成，其中最主要的过程是孕酮的合成和分泌，同时还伴随 着雄激素和雌激素的合成。来源于高密度脂蛋白体( i l i g hd e n s i t yl i p o p r o t e i n s ，h d l ) 和低密度脂 蛋白( 1 0 wd e n s i t yl i p o p r o t e i n s 。l d l ) 的胆固醇转运到胞内后在线粒体内转化为孕烯醇酮，在 2 0 t l q s d 的催化下进一步转化为孕酮。由于黄体不是一个自主性器官，因此其调节受多种激素共 同作用。在这个过程中p r l 和雌激素对啮齿类孕酮的分泌有重要的影响，同时雄激素和孕酮以 自分泌的方式进行反馈式调节。p r l 或者p r l r 敲除的小鼠可以正常排卵和受精，但是由于孕酮 的量不够而不能着床和发生蜕膜化，导致妊娠失败。 如果在正常的发情周期中没有怀孕或者妊娠失败都将导致黄体退化。小鼠中的黄体退化经 历两个主要的阶段：孕酮含量急剧下降引起的功能性退化和之后的结构性退化，随后形成白体。 p g f 2 a 和l h 在黄体退化中发挥重要作用。注射外源的p g f 2 a 会使血液中的孕酮水平降低，并 导致流产，而如果在妊娠末期抑制p g f 2 a 的合成，将会阻止体内l 烈3 f 2 a 水平的下降，分娩延迟， 如果敲除p g f 2 a 受体，分娩过程将不会发生。胞质型的磷脂酶a 2 ( c y t o s o l i cp h o s p h o l i p a s ea 2 ， c p l a 2 ) 可以催化花生四烯酸的释放，在c o x 1 和前列腺素f 合成酶的催化下可合成p g f 2 a ， c p l a 2 ( - ) 和c o x 1 ( - - ) 小鼠的分娩时间延后几天，且体内的孕酮水平比野生型高。子宫 是包括啮齿类动物在内的许多物种p g f 2 a 的主要来源。最近的研究表明，在妊娠末期，子宫中 高水平的p g f 2 a 与c o x 1 有关，而黄体中高水平表达c o x - 2 与黄体中的p g f 2 a 表达有关，因 此推测，子宫中脉冲式释放的p g f 2 a 在c o x - 2 的作用下可以促进黄体中p g f 2 a 的合成，促进 黄体的退化，其作用机理是p g f 2 a 在妊娠末期可以增加2 0 m - i s d 启动子的活性，使2 0 a h s d 的 表达迅速升高，从而把孕酮催化为二氢孕酮( 2 0 a - d i h y d r o p r o g e s t e r o n e ，2 0 a d h p ) 。现在还有研 究表明，p g f 2 a 可以通过阻止l h 诱导的c a m p 聚集和黄体细胞对c a - m p 的反应性，从而表现 出抗l h 的活性。结构性的黄体退化主要表现为黄体体积和重量的显著减少，最后形成白体。 这个过程主要是一个细胞凋亡的过程。p g f 2 a 在结构性黄体退化过程中一方面是可以激活细胞 凋亡细胞信号通路，引起细胞程序性的死亡，另一方面与m h i p s 共同作用使e c m 降解。p r l 对黄体功能的调节是双向的，在正常发情周期诱导黄体退化，但在妊娠和假孕时则有恢复和维 持黄体功能的作用。黄体的退化是一个复杂而又严密调节的过程，现在发现的与退化过程紧密 相关的分子还有t n f 2 a 和干扰素2 c ( i f n2 c ) 、单核细胞趋化蛋白2 1 ( m c p 2 1 ) 等。 4 2s p a r c 基因的研究进展 21s p a r c 基因的生物学特性 富肯半胱氧酸的酸性分泌蛋白( s c c r e t e dp r o t e i n ，a c i da n dr i c h i ne v s t e i n e ，s p a r c ) ，办称骨 联蛋白( o s t e o n e e d n ) ，是基质蛋白家族( m a t r i c e l l u l a rp r o t e i n f a m i l y ) 中的员，呵以与细胞表 l 面受体、胞外基质( e x w a c e l l d a r m a t r i x ，e c m ) 、各种生长园子和蛋白酶类糟巨作用，是一个多 功能的分泌型糖蛋白( m o t a m e de ta l ，1 9 9 9 ；b o r n s t e i ne t 副，2 0 0 2 ) 。s p a r c 以及在蛋白酵作用下 水解产生的多肽可以改变细胞的形态( b r e k k e n na l ，2 0 0 1 ) 、降低细胞舸的粘附( r o s e n b l a r d a l ， 1 9 9 7 ) 、抑制细胞周期( f u n kc ta 1 1 9 9 1 ) 、调整胞外基质( b a 咄盯n m ，2 0 0 5 ) 、调竹细胞增殖和 迁移( h a s s e l a m - da l ，1 9 9 2 ；w uc t a l 2 0 0 6 ) 。通过与血小板来源的生长崮子( p l a t e l e t d e r i _ v e d g r o w t h f a c t o r , p d g f ) ( r a i n e se t a l1 9 9 2 ) 、m 舒内皮生长园子( v a s c m 盯e n d o t h e l j a l g r o w t h f a c t o r , v e g f ) ( k u p p r i o n da 1 1 9 9 8 ) 、碱性纤维生长因于( b a s i c f i b r o b l a s tg r o w t h f a c t o r , b f g f ) 和转化生长困 予( t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r , t g f ) ( m u r p h y u l l n e hc ta l ，1 9 9 i ，s e h i e m a 蛐e ta l ，2 0 0 3 ) 等各种 细胞困子相互作用，调竹细胞的反应性。 2l1s p a r c 基因和蛋白结构 s p a r c 足一种在种问具有高度保守性的单拷贝基困，在人中定位十染色体s q 3 2 l - 3 3 ( b r e k k e n d a l2 0 0 1 ) 。s p a r c 基因编码2 9 8 3 0 4 个氨基酸的蛋自，n 末端在翻详后修饰成糖基 化形式在剪切昂f 始合成的1 7 个氨基酸之后形成具有分泌功能的4 3 k d 的蛋白( s a g eda l ， 1 9 8 4 ) 。s p a r c 蛋白包含3 个不同结构域，且现在的体外研究表明，s p a r c 裂解之后形成的多 肚行使与s p a r c 不同的功能。 图1 - 2s p a r c 的分子结构( 引自s 啦吐吐1 9 8 9 ) f i g i - 2 s t r u e m r o o f s p a r c ( f r o ms a g c d a t1 9 8 9 ) 东北农业大学理学硕士学位论文 第一个结构域为氮末端的1 - - 5 2 氨基酸序列，可以与c a 2 + 以低亲和力结合，并可介导与羟磷 灰石的相互作用，包含了s p a r c 主要的免疫学表位( s a g ee ta l ，1 9 8 4 ) 。在这段序列中有包含了 肽段1 1 ，有去粘附和使细胞变圆的作用( l a n ee ta l ，1 9 9 0 ) ，同时还有抑制迁移和影响e c m 蛋白 表达的作用( h a s s e l a m e ta l ，1 9 9 2 ) 。第二个结构域包含5 2 1 3 7 肽段，是一个富含半胱氨酸的、 含有卵泡静止素( f o l l i s t a t i n l i k e ，f s ) 的区域( 如图l 一2 所示) ，f s 的氮末端是一个b 发夹结构， 其中的肽段2 1 能延迟内皮细胞的周期，有抗粘附、抑制内皮的增殖和血管发生的作用( f u n ke ta l ， 1 9 9 1 ：f u n ke ta l ，1 9 9 3 ) ，对成纤维细胞的增殖有双向的调节作用；而f s 的羧基端含有由一对反 向平行的q 螺旋组成的肽段2 3 ，能增加基质金属蛋白酶的表达、增强内皮细胞和成纤维细胞的增 殖以及血管发生等生理作用( l a n ee ta l ，1 9 9 4 ) 。第3 个结构域包含1 3 8 - - 2 8 6 肽段，由两个e f 基 序( e f h a n dm o t i f ) ，所包含的肽段4 2 能抑制内皮细胞的增殖和迁移、影响e c m 蛋白的表达、 使细胞变圆，并有抗粘附的作用( m u r p h y - u l l d c h e t a l , 1 9 9 5 ；s a g e e t a t , 1 9 9 5 ) 1 2 1 2s p a r c 基因的表达 s p a r c 最早发现于人和牛的骨组织中( t e r m i n ee ta l ，1 9 8 1 ) ，在胚胎发育的各种组织中广泛 表达( b m k k e ne ta 1 2 0 0 1 ) ，在成体组织中，只是在具有快速细胞增殖的组织和经历组织重建 的组织、损伤修复的组织中以及非侵入性的产生类固醇的细胞中表达( b r e k k e ne t 扎1 9 8 9 ) 。在 小鼠成体中的成骨细胞、成牙本质细胞、人活化的血小板、巨核细胞、肾上腺、睾丸、卵巢和 肺中都有高水平的s p a r cm r n a ，在肝和脑中表达较少( h o l l a n de ta l , 1 9 8 7 ) 。在人体产生类固 醇的细胞、软骨细胞、胎盘滋养层、血管平滑肌和内皮细胞中有适度的表达( p o r t e re ta l , 1 9 8 9 ) 。 在损伤组织的成纤维细胞、内皮细胞、上皮细胞和巨嗜细胞中有强表达( r e e de ta l ，1 9 9 3 ) 。并 且，在体外，s p a r c 表达水平的升高常常与前列腺癌( j a c o be ta t , 1 9 9 9 ) 、乳腺癌( g i l l e se ta l ， 1 9 9 8 ) 、胃癌( m a e n ge ta t , 2 0 0 2 ) 、胶质母细胞瘤( g o l e m b i e s k ie ta t , 1 9 9 9 ) 和恶性黑色素瘤( l e d d a e ta l ，1 9 9 7 ) 的侵入性增强有关。 与之相反，h u a n g 等在鼻咽癌中利用基因芯片发现s p a r c 的含量显著减少，由于转录因子 y 染色体上的性别决定区域盒子5 ( s r y ( s e x - d e t e r m i n i n g r e g i o ny ) 一b o x5 ，s o x - 5 ) 明显上调， 用短的发夹r n a ( s h o r th a i rr n a ，h s r n a ) 下调s o x 5 之后。s p a r c 明显上调，推测s o x 一5 可以直接与s p a r c 的启动子结合，抑制s p a r c 的表达( h u a n g e ta l ，2 0 0 8 ) 。在结肠癌中s p a r c 的表达同样也明显降低，y a n g 等利去寡核苷酸芯片和甲基化芯片分析了去甲基化试剂处理前后 的结肠癌细胞系中s p a r c 的表达，发现s p a r c 由于启动子区域的异常甲基化引而失活，暗示 此过程可能与结肠癌的形成和发育有关( y a n g c ta l ，2 0 0 7 ) 。 1 2 2s p a r c 基因的作用机制和功能 1 2 2 1s p a r c 与e c m 的相互作用 细胞外基质( e c m ) 主要包括胶原、非胶原糖蛋白以及蛋白聚糖。糖蛋白包括纤连蛋白、 层粘连蛋白、腱生蛋白( t c n a s c i n ) 、巢蛋白( n i d o g e n e n t a e t i n ) 、分区蛋白( m e r o s i n ) 、血小 6 前言 板反应蛋白( t h r o m b o s p o n d i n , t s p ) 、玻连蛋白( v i t r o n e c t i n ) 等；蛋白聚糖是一类含有核心蛋 白和大量多糖分子的大分子物质，多糖分子主要是糖胺聚糖，包括透明质酸、肝素、硫酸乙酰 肝素、硫酸角质素、硫酸软骨素和硫酸皮肤素。若按核心蛋白为基础分类，蛋白聚糖可分为双 糖链蛋白聚糖( b i g l y c a n ) 、基底膜蛋白聚糖( p e r l e c a n ) 、p 聚糖( b e t a g y c a n ) 及核心蛋白聚 糖( d e c o r i n ) 等( m o t a m e de ta l ，1 9 9 9 ) 。 许多细胞的活性调节与e c m 紧密相关，e c m 是由成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞局部分 泌并在胞外聚集形成的网状结构，s p a r c 在正常细胞