（食品科学专业论文）米糟蛋白提取及酶法制备抗氧化活性肽及降血压活性肽的研究.pdf

浙江人学博上学位论文 摘要 本文以米糟为原料，采用酶法和碱法、凝胶分离技术、高效液相色谱分离技术、质谱等手段， 研究了提取米糟中蛋白质的一l 艺条件、大米蛋白质改性、血管紧张素转换酶( a c e ) 抑制肽和抗 氧化活性肽的工艺条件和技术方法，进一步分离和确定了具有高a c e 抑制活性短肽的一级结构， 并进行动物实验观察了米糟蛋白酶解物的降血压效果。 首先，确定了酶法提取米糟蛋白的最佳提取条件，即酶量1 0 、料波比1 ：4 、p h = 8 0 、温 度6 5 c 、时间7 h 。在该条件下，蛋白质的提取率为6 2 6 。提取物的蛋白质含量为8 4 o 。碱法 提取米糟蛋白质的最佳工艺条件为温度6 5 、碱浓度0 8 、时间6 h 、料液比1 ：6 ，在该条件下 蛋白质的提率为7 6 2 ，提取物蛋白质含量为8 0 。酶法及碱法提取米糟蛋白质的研究结果在米 糟蛋白提取研究中处于领先水平。 米糟蛋白经碱性蛋白酶改性后，其溶解性、乳化性、起泡性等性质得到了明显的改善，在中 性条件下，4 0 9 l 蛋白酶解物溶液的氮溶解指数( n s i ) 、乳化性、起泡性分别达到了9 5 、5 5 、 7 0 。 在本研究中首次对米糟蛋白的碱性蛋白酶酶解产物进行了抗氧化活性的探索，研究结果表 明，米糟蛋白的碱性蛋白酶酶解产物不仅具有还原能力，而且还具有清除d p p h 自由基的能力。 对米糟蛋白酶解物、茶多酚、丁基羟基茴香醚( b h a ) 、v c 进行的清除d p p h 自由基的能力比较 结果表明，米糟蛋白酶解物清除d p p h 白由基能力接近b h a 。以还原能力为响应值对酶解反应 进行了响应面优化研究，结果表明，酶解法获得抗氧化活性肽的最佳条件为p h 7 7 4 、温度6 1 5 、料液比1 ：5 2 3 。 本研究中用蛋白酶酶解的方法从米糟中获得了血管紧张素转换酶( a c e ) 抑制活性肽。对中 性蛋白酶、酸性蛋白酶、复合风味蛋白酶、水解蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶酶解物的血管紧张 素转换酶( a c e ) 抑制活性比较结果表明，胰蛋白酶酶解物的a c e 抑制活性最强。并以a c e 抑 制活性为响应值对酶解反应进行优化研究，结果显示，最优条件为p h 8 0 2 、温度3 7 0 、蛋白 酶量 e i s i = 0 7 5 a u 、料液比( w r ) 为1 ：4 1 3 、水解时间4 o h ，在该条件下获得的酶解物的a c e 抑制活性为8 4 9 5 。有关从米糟蛋白中获得a c e 抑制活性肽方面的研究尚未见报道。 通过葡聚糖凝胶s e p h a d e xg 1 5 分离a c e 抑制活性肽获得了六个多肽组分即f 【、f - 【i 、f - h i 、f i v 、f - v 、f - ，其中组分f - v 的a c e 抑制活性最强，其a c e 抑制活性达到了8 4 7 ， 对f v 进行的h p l c 分析结果表明，f v 中含有4 个组分，其中f v l v 的含量占9 3 8 9 ，用 r p h p l c 进行制各f - v i v 组分斤用质谱分析方法研究了组分f - v 的一个分子量为6 4 5 肽的氨 基酸一级结构，结果表明，氮基酸一级结构为f n g f y ( p h e a s h g l y p h e r y r ) 。 动物实验中，一次性给药实验结果显示，a c e 抑制活性肽1 m g k g 纽、1 0 m g k g 组、5 0 m g k g 组及 托普利( c a p t o p r f l ) tm g k g 组在给药斤1 h ，原发性高血压人白鼠( s h r ) 血压分别1 0 9 6 m m h g 、1 6 7 7m m h g 、2 6 3 9m m h g 、1 6 6 1m m h g ；k 期给约实验结粜显示，a c e 抑制活性肽 9 浙江大学博士学位论文 1 0m g k g 组和2 0m g k g 组在给药4 个星期后，s h r 的血压分别平均f 降了1 6 8 8m m h g 和2 6 2 2 m m h g ；米糟蛋白酶解物不仅具有促进s h r 生长作用，而且s h r 的心率没有任何影i 晌。 关键词： 大米蛋白，血管紧张素转换酶抑制肽( a c e l ) ，胰蛋白酶，抗氧化活性肽 0 浙江人学媾i ：学位论文 a b s t r a c t t h et e c h n o l o g i e s o p t i m u mc o n d i t i o n so fe x t r a c t i n gp r o t e i nf r o mr i c ed r e g s ( r d ) ，r i c ep r o t e i n m o d i f y i n g ，e x t r a c t i n g a n t i o x i d a t i v e a c t i v i t yp e p t i d e a n d a n g i o t e n s i n l - c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r yp e p t i d et o w e r es t u d i e d e n z y m a t i cm e t h o d ，a l k a l i n em e t h o d ，g e l a t i nf i l t r a t i o n ，h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( h p l c ) a n dm a s ss p e c t m m ( m s ) w e r ee m p l o y e di nt h er e s e a r c h t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fe x t r a c t i n gp r o t e i nf r o mr dw i t he n z y m a t i cm e t h o dw e r ee n z y m ed o s a g e 【e 】【s 】_ 1 ，r a t i oo fr a w m a t e r i a l t o w a t e r ( r a r e ) 1 ：4 ，p h = 8 0 ，t e m p e r a t u r e = 6 54 c ，t i m e = 7 h u n d e r t h e s ec o n d i t i o n s ，e x t r a c t i v er a t eo fr i c ep r o t e i nw a s6 2 6 ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no fp r o t e i ni nt h e e x t r a c tw a s8 4 o t h eo p t i m u mc o n d i t i o n se x t r a c t i n gp r o t e i nf r o mr dw i t ha l k a l i n em e t h o dw e r e a l k a l ic o n c e n t r a t i o n0 8 ，r w1 ：6 ，t e m p e r a t u r e = 6 5 ，t i m e = 6 h u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，e x t r a c t i v e r a t e o fr i c ep r o t e i n w a s7 6 2 ，a n d t h e c o n c e n t r a t i o no f p r o t e i n i n t h ee x t r a c t w a s8 0 o t h e r ew a se v i d e n ti m p r o v e m e n ti nt h ed i s s o l v a b i l i t y , e m u l s i f i a b i l i t ya n df o a m a b i l i t yo fp r o t e i n e x t r a c t e df r o mr da f t e ri t sm o d i f i c a t i o nw i t ha l c a l a s e i n4 h y d r o l y s a t e sn e u t r a ls o l u t i o n t h en i t r o g e n s o l u b i l i t yi n d e x ( n s o ，e m u l s i f y i n ga b i l i t y , f o a ma b i l i t yw e r e9 5 ，5 5 ，7 0 r e s p e c t i v e l y t h eh y d r o l y s a t e sw h i c hd e r i v e df r o mt h eh y d r o l y z a t i o no fr dp r o t e i nw i t ha l c a l a s ep o s s e s s e dn o t o n l yr e d u c i b i l i t y , b u tt h ep o w e ro fs c a v e n g i n gd p p hr a d i c l e t h ec a p a b i l i t yo fs c a v e n g i n gd p p h r a d i c l ew a sc o m p a r e da m o n gh y d r o l y s a t e s ，t e ap o l y p h e n o l ，b u t y l a t e dh y d r o x y la n i s o l e ( b r t a ) a n d v i t a m i nc t h er e s u i ts h o w e dt h a tt h eh y d r o l y s a t e sh a dm e r e l yp a r a l l e lp o w e rt os c a v e n g ed p p hr a d i c l e w i t hb h a w h e nt h er e d u c i b i l i t ya sr e s p o n s ev a l u e ，r e s p o n s es u r f a c eo p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t sw e r e p e r f o r m e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o re x t r a c t i n ga n t i o x i d a t i v ea c t i v i t yp e p t i d e s w e r ea sf o l l o w s ：p h = 7 7 4 ，t e m p e r a t u r e = 6 1 5 。c ，r a t i oo f w a t e rt om a t e r i a l5 2 3 t h eh y d r o l y s a t e sb yt r y p s i nw e r ef o u n d1 0h a v et h eh i 曲e s ti n h i b i t o r ya c t i v i t yt oa c ea f t e rt h e a c t i v i t yc o m p a r eo fh y d r o l y s a t e sb yn e u t r a s e ，a c i dp r o t e a s e ，f l a v o u r z y m e ，a l c a l a s e ，p e p s i n ，t r y p s i n r e s p o n s es u r f a c eo p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n t sw e r ec o n d u c t e dt oi n v e s t i g a t et h eh y d r o l y z a t i o nw i t h t r y p s i n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n sw e r ea sf o l l o w s ：p h = 8 0 2 ，t e m p e r a t u r e = 3 7 0 ， e n z y m ed o s a g e e l t s = 1 5 ，r a t i oo fw a t e rt om a t e r i a l4 1 3 ，t i m es p a n4 h u n d e rt h eo p t i m a l c o n d i t i o n s t h ea c ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo fh y d r o l y s a t e sw a s8 4 9 5 a f t e rt h es e p a r a t i o no fh y d r o l y s a t e sw i t hp o l y g l u c a ng e l a t i ns e p h a d e xg 一1 5 ，s i xp e p t i d e si n g r e d i e n t s w e r eg o t t e n ，w h i c h w e r e f i 、f l i 、f - h i 、f - i v 、f - v 、f - v i a m o n g t h e m ，f - v h a d t h e h i g h e s t a c e i n h i b i t o r ya c t i v i t y f o u ri n g r e d i e n t si nf - vw e r ef o u n da f t e rh p l ca n a l y s i s ，a n df - v i va c c o u n tf o r 9 3 8 9 t h ef v i va n a l y z e dw i t hm sa f t e rp r e p a r e dw i t hr p 。h p l ca n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e p r i m a r ys t r u c t u r eo ff - v i vw a sf n g f y ( p h e a s n g l y p h e t y r ) a n i m a le x p e r i m e n t sw i t hr dh y d r o l y s a t e si nd i f f e r e n td o s e ( 1m g & g ，1 0m g & g ，5 0m g k g ) a n d c a p t o p r i l ( 1m g k g ) w e r ec o n d u c t e d t h eo n c e o r a la d m i n i s t r a t i o nr e s u l ts h o w e dt h a tt h eb l o o dp r e s s u r e o fs p o n t a n e o u sh y p e r t e n s i o nr a l s ( s h r ) d r o pf o r1 09 6m m h g ，1 67 7m m h g ，2 6 3 9 m m h g ，1 6 6 1 m m h gi n1m g k g ，1 0m g k g ，5 0m g k gh y d r o l y s a t e sa n d1m g k g c a p t o p r i lr e s p e c t i v e l ya f t e rl h a d m i n i s t r a t i o n ，t h er e s u l t so fl o n gt e r mo r a la d m i n i s t r a t i o ne x p e r i m e n t ss h o w e dt h a tt h eb l o o dp r e s s u r e o fs h rd r o pf o r1 6 8 8m m h g ，2 6 2 2m m h gi n1 0m g & ga n d2 0 ”g l ( gr e s p e c t i v e l ya f t e rl m o n t h 1 l 浙江大学博士学位论文 a d m i n i s t r a t i o n r dh y d r o l y s a t e sn o to n l yp r o m o t et h eg r o w t ho fs h r ，b u ta l s oh a v en oi n f l u e n c eo i l h e a r tr a t e k e yw o r d s ：r i c ep r o t e i n ( r d ) ，a n g i o t e n s i nl - c o n v e r t i n ge n z y m e ( a c e ) i n h i b i t o r yp e p t i d e ，e n z y m a t i c h y d r o l y z a t i o n ，t r y p s i n 浙江人学博i 学位论文 1 大米蛋白质的研究概况 1 1 大米蛋白质的概述 第一章绪论 大米是世界上主要粮食之一，全世界一半以上，我国三分之二以上的人口以大米为主食。我 国种植面积居世界第2 位，总产量居世界第一位，年产量为1 8 5 亿吨约占世界稻谷总产量的3 6 左右【1 1 。这些除一部分供应人们的日常饮食之外，大部分都用于工业用途，如味精发酵、淀粉糖 工业等。 大米中两大主要成分为淀粉和大米蛋白，其含量分别为8 0 和8 口j 。大米蛋白根据溶解性 可以分为4 类，即水溶性白蛋白( a l b u m i n s ) 、盐溶性球蛋白( g l o b u l i n s ) 、碱溶性谷蛋白( g l u t e l i n ) 和醇溶性蛋白( p r o l a m i n s ) ，其中碱溶性谷蛋白和盐溶性球蛋白分别占8 0 和1 2 ，醇溶性蛋白 仅占3 3 1 。大米谷蛋白分子量约为6 1 0 4 6 10 5 ，由二硫键连接的多个亚基构成，而大米球蛋 白的分子量仅为约1 2 1 0 m “。 研究结果显示，大米蛋白是优良营养品质蛋白，不仅氮基酸组成非常合理，而且由于其不含 类似致敏因子，具有低过敏性特点。大米蛋白质的氮基酸组成与w h o f a o 推荐理想模式非常 接近1 6 i 。大米蛋白质中蛋氨酸含量可达2 2 ，这是其他动植物蛋白无法比拟的【7 j ，此外，精氨酸 含量也很高，比较适合于婴幼儿食品中添加使用。大米蛋白质的生物价( b v ) 为7 7 、蛋白质效 用比率( p e r ) 为1 3 缸2 5 6 ，因此蛋白质的利用率也较其他谷物高。 在以大米为原料的工业生产中产生大量的副产品，例如味精厂、葡萄糖厂以及其他发酵厂中 会产生大量米糟。米糟是大米经过糖化后产生，其中的蛋白质降解不多，大部分都保留了下来。 米糟中的蛋白质含量可达4 0 一6 5 ( 干基) 范围内p j 。米糟作为大米加工后的副产品，如果不能 综合利用，势必造成资源浪费、污染环境、经济损失。如果能进一步综合利用，将会收到可观的 经济、社会效益。 1 2 大米浓缩蛋白( r p c ) 和分离蛋白( r p i ) 浓缩蛋白( r p c ) 一般是指经去除原料中非蛋白成分而获得的蛋白质含量在5 0 - - 8 9 的蛋 白产品。分离蛋白( r p i ) 是指通过各种方法去除原料中的非蛋白成分而获得的纯度较高的蛋白 质产品，一般蛋白质含量为9 0 以上p j 。 r p c 年r p i 般通过碱法利酶解法获得。传统方法为用碱法获得r p c 和r p i ，佃由 一碱法 易引起一些副反应，如蛋白质的变性水解；增强m a i l l a r d 反应的程度；增加和蚩白质结合在一起 的非生白成分的葶取耸，使蛋白质品质降低。而酶解法反应条什温和，易丁控制， i 所获得蚩白 浙江人学瞎l j 学位论文 质具有溶解性、乳化性、起泡性等特点，冈此，很多研究人员建议采川酶解法生产r p c 和r p i 。 生产r p c 和r p i 的原料有三种即大米、米猿利米糟。s h i h 认为，大米粉中蛋白质含量比较低( 一 般在7 一9 之间) ，因此，用大米粉生产r p c 和r p i 成本较高，不适合商业化，建议用米糟生产 r p c 和r p i 。s h i h t ”1 的实验结果表明，用a 淀粉酶处理后再用葡萄糖淀粉酶处理米糟，可得到 8 5 的r p c ；再用纤维素酶和术质素酶处理，可以获得9 1 以i - 的r p l 。此外，从米糠中提取蛋 白质的研究方面也取的一定的成就。最近几年很多r p c 和r p l 是从米糠中提取。但由于米糠中 的蛋白含量也只有1 8 左右，闶此，从米糟中获得r p c 和r p i 的前景更为广阔。 r p c 和r p i 营养价值较高，不仅具有普通蛋白质所具有的营养作用，而且还具抵抗癌变作用 及降低血脂功能等保健功能。m o l i t a 等【】l l 对大米分离蛋白( r p l ) 的研究结果表明饲喂r p i 的二 甲基苯并葸( d m b a ) 诱导雌性小白鼠肿瘤重量低于饲喂酪蛋白小白鼠，说明r p i 具有抵抗d m b a 诱导癌变作用。在另外实验中，m o l i t a ”1 以r p i 和酪蛋白饲喂小白鼠的对比实验中发现，r p i 能 够显著降低血清中的胆同醇、磷脂和甘油的浓度，r p i 的小白鼠的肝重量也低于饲喂酪蛋白的小 白鼠。 由于米糟是经高温处理工艺产出的副产品，因此，不仅易于消化吸收，而且酶解法生产的蛋 白质具有良好的溶解性，还具有低过敏性特点，尤其适合于婴幼儿食品中应用。r p c 和r p i 可以 作为正常蛋白摄入量减少或蛋白质消化机能受到损害的病人的补充食物，维持氮平衡；可作为消 化性溃疡、渗压性利尿剂、外伤的辅助治疗；又由于它起泡性强，可作为糖果的发泡剂。r p i 可 经过水解或生化修饰后生产出各种食用蛋白添加物。大米蛋白不仅可用于食品、医药等行业，而 且在化妆品工业中也有着广泛的用途。 1 3 大米改性蛋白 大米改性蛋白是指大米蛋白经过蛋白酶处理以后，其功能性如溶解性、稳定性、乳化性、发 泡性等得到增强的蛋白质。其中溶解性是表现蚩自质功能的重要因素之一，良好的溶解性可以增 加蛋白质的潜在功能。大米蛋白的溶解性较差原因是因为大米蛋白中龠有一定数量的谷蛋白多 肽。谷蛋白含有二条多肽链，一条肽链为a 链，另一条肽链为b 链。n 链的等电点为6 6 7 5 ，b 链的等电点为9 4 1 0 3 ，在p h 4 1 0 的范围内，大米谷蛋白溶解性很小。b e l e l o w l l 3 1 认为溶解性受 到疏水性及电荷频率两个参数的影响，高的电荷频率、低的疏水性可以有效提高溶解性。但王文 高等【1 4 1 认为大米蛋白在蛋白酶的作用f 水解的时候，随着水解度的增加，疏水性增加，然而其溶 解度却增加，这是由于在大米蛋白水解物中其电荷频率的影响远远大于疏水性的影响，因此，尽 管疏水性有一定的增加但其溶解性却提高。 蚩n 质是人分子物质，冈此，含自许多极陆和1 f 极性基团，具有亲水和亲油的倾向，在水和 油混合体系中可以起剑糅合作瑚即具有乳化性。蚩r 1 质的乳化性与蛋白质表面的亲水、疏水基团 1 4 浙江大学博士学位论文 及分子大小有关t “l 。随着酶解反应的进行，疏水基团的逐渐暴露，疏水性增加有利于与油滴的结 合，从而提高乳化性，当水解度过大时，尽管疏水性增加，但由于产生小分子量蛋白质，因此， 仍降低乳化性口”。a n d e r s o n 用p r o n a s e 酶处理米谷蛋白后，进行水解物功能评价时，发现，处理 后p h 为2 1 2 范围的溶解性增加，乳化性和发泡性也可得到改善【。易翠平等1 1 8 j 利月| 脱酰胺对 人米蛋白功能特性进行了改性研究，结果表明大米蛋白的溶解性、乳化性、起泡性及持水、持油 性等功能性质增加。 大米蛋白的改性产品可用于大米蛋白发泡粉、乳化剂等用途。 1 4 抗性蛋白 在1 9 8 0 年，t a n a k a 用蔗糖密度梯度离心法分离出两种不同形态的蛋白体p b i 和p b 一1 i 。p b i 在透射电子显微镜下观察为球状，呈明显片层结构，颗粒致密，直径为0 5 2u m ，而p b - i i 呈 椭圆型，质地均匀，无层片结构，直径约4 um ，其外周膜不明显。b e c h e l 和p o m e b a n z 称p b i 为球状蛋白粒子，p b i i 为晶状蛋白粒子【1 ”。s d s - p a g e 分析表明，p b i 中含有多种蛋白组分， 主要为1 0 k d a 、1 6 k d a 球蛋白、1 3 k d a 醇溶蛋白和5 7 k d a 谷蛋白等，而p b i t 中含有分子量为 2 2 k d a 、3 7 k d a 、3 8 k d a 谷蛋白和2 6 k d a 球蛋白。t a n a k a 2 0 1 从蛋白含量推断p b i 是醇溶蛋白 的储藏体，p b 1 1 是谷蛋白的储藏体，且谷蛋白主要为2 2 k d a 、3 7 k d a 、3 8 k d a 组分。 1 9 7 5 年，人们在东京下水道内发现无数1 - 2um 非细菌粒子。通过喂养试验确定这些粒子来 源于大米消耗后的残渣，称其为残渣蛋白粒子( f p p ) 。食品学者称f p p 为抗性蛋白。由于f p p 具有抗消化功能，因此，作为药品的载体使用。有关f p p 来源及形成机理尚不明了，但许多学者 认为f p p 的生成与p b 一【有关。研究人员已经利用酶法生产出与f p p 结构相似的颗粒。 1 5 大米蛋白提取的研究现状 早在1 9 5 6 年就开始，研究人员分别用润滑剂、有机溶剂法、碱法、蛋白酶法等对大米蛋白 进行了提取探索。目前，大米蛋白的提取方法有溶剂提取法、碱法、蛋白酶法，其中主要的大米 蛋白质的提取方法为碱法和蛋白酶法。由于润滑剂法和溶剂法不仅提取率低，且存在溶剂残留问 题，因此，并不是理想的大米蛋白质提取方法。 碱法提取蛋白质是提取蛋白质的传统方法，至今仍在使用碱法提取大米蛋白质。碱法的理论 基础为利用大米蛋白质的8 0 以上是碱溶性谷蛋白；稀碱可以使大米中的紧密的淀粉结构变的疏 松：碱对人分子谷蛋白有降解作州从人米淀粉颗粒中的蛋白质溶山而被分离f ”。碱法的提取 1 艺简单，成本较低，对脂质有很好的提取效果，获得的蛋白质产 色泽质地和持水性都比较好 但对氨基酸有破坏佧州，同时也存在提取液h 比人，等电点沉淀消耗的酸蕈人、脱盐纯化难度人， 浙江人学博l 学位论文 提取时需要消耗大龄的碱和水等缺点。其简单提取r 艺如下图1 - 1 。 一罟甲 图1 - 1 碱解法提取蛋白质工艺流程 尽管碱法提取蛋自有上述缺点，但其提取率很高。 酶解法提取蛋白质是利用蛋白酶对大米蛋白质的降解作用，使其增加可溶性而被提取出来。 酶解法的一般提取工艺如下图1 - 2 。 匝 际习 i一 t e d 堕口担卫 图1 - 2 酶解法提取蛋白质工艺流程 酶法提取大米蛋白反应，反应条件温和、营养物质基本不被破坏，大分子蛋白被降解为短肽 而有利于蛋白质的消化，而且相对碱法提取反应液固比小，既可节省碱和水的消耗量，又提高了 反应混合液中的固形物含量。但是，目前酶解法对蛋白酶的活力要求比较高，成本高，所获得产 品色泽较深，提取率较低等缺点。 有些研究人员结合碱法与酶解法进行了提取人米蛋白质研究，两种方法结合以后，由于需要 进行两次提取，而且反应条件需要重新调整，因此，提取过程变的非常复杂，反应条件也较难控 制。在提取火米蛋白时，所用的原料一般为夫米、米糠和米糟。其中研究比较多的是，直接从大 水里提取蛋白质平从米糠中提取蚩白质，从米糟中提取蛋白质方面的研究处丁起步阶段。由于人 米中的蛋白质含馘仪为8 ，而且淀粉含苗较高，冈此，不官用蛋白酶法提取，m l 比较适合刚碱 法提取。米糟作为发酵产品等产品的副产物，蚩自质禽姑较高，且已玄除人部分的淀粉，冈此， 浙江大学博士学位论文 比较适合用酶法提取蛋白质。 2 生物功能肽的研究概述 2 1 生物功能肽概述 生物活性肽( b i o a c t i v i t yp e p t i d e s ) 是指那些具有特殊生理功能的肽类，不仅易消化吸收，而 且还具有多种人体代谢和生理调节功能，如促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、促进 矿物质吸收等作用。按其来源可分为天然存在的活性肽、蛋白质酶解活性肽和化学合成的活性肽。 其中，天然存在的活性肽包括肽类抗生素、激素以及在各种组织、骨骼、肌肉、免疫系统、消化 系统、中枢系统中存在的活性肽，这些活性肽的缺点是含量少，或提取比较困难。化学人工合成 费时费力，成本昂贵。因此采用酶解蛋白的方法来生产生物活性肽是一种比较合理的途径i 丑l 。在 酶解蛋白的方法中，生物活性肽一般从细菌蛋白质、植物蛋白质和动物蛋白质的水解中获得，通 常为分子量比较小的多肽片段。 近几年来，采用酶解蛋白质法已获得了多种具有生理活性的多肽，如鸦片样活性肽、免疫调 节肽、抑制a c e 活性肽，和抗血栓肽、抗菌肽等，按其功能分为以下一些类型。 2 2 生物功能肽 2 2 1 鸦片样活性肽( o p i o i dp e p t i d e s ) 鸦片样活性肽是一类具有吗啡受体配体活性的生物活性肽，包括脑啡肽、1 3 一内啡肽、强啡肽、 孤啡肽和内吗啡肽。鸦片样活性肽能够作为激素和神经递质与体内的“一、6 * 、y - 受体相互作用 发挥镇痛、诱导睡眠、促进胰岛素和胰高血糖素的分泌和延长食物在肠道中的运转时间等作用。 一般认为鸦片样活性肽具有以下五个特征：一、能够在胃肠道中产生；二、不能被肠蛋白酶水解； 三、进入血液时未被降解；四、穿过血脑屏障到达阿片受体；五、与这些受体相互作用。 肽类 外啡肽a 。 外啡肽凡 外啡肽b 5 外啡肚b 。 源于小麦谷蛋白的鸦片样活性肽 肚序列 g l y - 耐p t y r - p r o - t h r g l y - 耐f - t y r - p r o l j r g l y g l y t r p l e u dr _ g l y g l y t r p 浙江大学博一l 学位论文 鸦片样活性肽是研究最多、最早的活性肽，早在1 9 7 9 年c h r i s t i n ez 等报道，川胃蛋白酶水 解小麦谷蛋白和酪蛋白，能够获得鸦片样活性肽，具有与阿片( 吗啡) 相似的性质，称其为外啡 肽( e x o r p h i n ) 之后，已经陆续从食物来源的蛋白质中获得了鸦片样活性肽。1 9 9 2 年s h i n i c h i 和y o s h i k a w a i ”i 通过色谱分离小麦谷蛋白的胃蛋白酶水解物获得了四种鸦片样活性肽，分别命名 为谷蛋白外啡肽a 5 、a 4 、b 5 和b 4 ，它们的一级结构分别为g l y _ t y r _ 1 m p r o - t h r 、g l y t y r t y r - p r o 、 n r _ g l y g l y - t r p l e u 和t y r - g l y g l y - t r p ( 如下表1 - 1 ) 。t a k a h a s i 等 2 4 1 从大米清蛋白的酶解物中获 得了一种具有类阿片样拮抗作用的寡肽，称为o r y z a t e n s i n ，其氦基酸序列为g l y t y r _ p r o m e t - t p r o l e u p r o a r g 。类阿片样拮抗肽对治疗因阿片样拮抗肽亢进引起的各种疾病( 如休克) 特别有效。c h i b a 等l ”】从k 一酪蛋白的水解产物中发现c a s o x l na 、c a s o x i nb 、 c a s o x i nc 三种类 型，其中c a g o x i nc 的拮抗活性最高。t a n i 等【z q 从人乳铁蛋白中分离出l a c t o f e r r o x i na 、 l a c t o f e r r o x i n b 、l a c t o f e r r o x i n c 也有阿片拮抗肽活性。 此外，还从大豆蛋白、玉米蛋白、牛血蛋白等中也发现了鸦片样活性肽。 2 2 2 免疫调节肽( i m m u n o s t i m u l a t i n gp e p t i d e s ) 免疫调节肽是指具有提高机体免疫功能的肽类，具有激活巨噬细胞和淋巴细胞的吞噬功能、 刺激外周淋巴细胞转化、诱导淋巴细胞增生、诱导淋巴细胞分泌淋巴因子等作用。外源性免疫活 性肽中研究较多的主要是乳源性免疫活性肽。 研究人员己从酪蛋白、大豆蛋白、大米蛋白和小麦蛋白的胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶水解物中 分离中获得了多种免疫调节肽【2 7 - 2 9 1 。从牛酪蛋白里分离出的三肽l e u l e u 1 n 、六肽1 1 m 1 一m e t p r o l e u t y r ，从人乳酪蛋白的胰蛋白酶胰凝乳蛋白酶水解产物中获得的三肽g l y l e u p h e 和六 肽v a l g l u p r o i l e p r o t y r 均具有激活巨噬细胞的吞噬功能的作用p 0 1 ；鸡肉蛋白，尤其是肌球 蛋白、原肌球蛋白和胶原蛋白，含有具有促进免疫能力的活性片段，理论上可以通过蛋白酶k 水 解释放这些活性肽。f u m i o 等1 报道，大豆多肽与原来人豆蛋白相比能更显著增强大鼠肺泡巨噬 细胞的吞噬绵羊红细胞的功能，而且大豆多肽的作用优于酪蛋白多肽。杨小军p 7 】报道，大豆蛋白 酶解物能显著促进大鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力、刺激外周血淋巴细胞转化、提高肠道s l g a 水 平。k i m 等【3 3 】报道，从大豆蛋白水解物中分离并纯化获得了种抗癌活性肽( 9 肽) ，其分子量 为1 1 5 7 。y o s h i k a w a 等【3 4 1 从胰蛋白酶水解大豆蛋白的水解物中获得一种6 肽，其一级结构为h i s c y s g i n a r g p r o a r g ( h c q r p r ) ，它可以刺激巨噬细胞和多核细胞的吞噬作用，具有免疫调节 作州。但是有关这类免疫活性肽的生理机制目前还不很清楚，尚需进一步深入研究。 1 8 浙江大学博i 学位沦文 2 2 3 抗血栓肽( a n t i t h r o m b o t i cp e p t i d e s ) 血栓的形成是心血管疾病的主要病吲之一。血栓的形成与两个生理过程密切相关：一是血纤 维蚩白原在凝血酶的作用下转化为血纤维蛋白的过程，另外一个过程为血小扳的凝集。血纤维蛋 白原不仅参与纤维蛋白的形成，而且还通过血小板表面的特殊受体( 糖蛋白i i b - h i a 复合体g p i i b - l _ i i a ) 相结合参与血小板的凝集。现已证实血小扳凝集过程中血纤维蛋白原分子有两个结合位点： 一个为四肽片段a x g g l y a s p s e r ( 或p h e ) ，另一个为纤维蛋白y 链c 端片段( h i s h i s l e u g l y g l y a l a l v pg i n a l a g l y a s p v a i ) 。这两种肽都抑制血小板和纤维蛋白原结合到a d p 活性血 小板上p “。 凝乳酶可以释放出位于牛k 酪蛋白的1 0 6 1 1 6 位残基间的十二肽，及存在于人乳铁蛋白中的 四肽( k r d s ) ，相当于3 9 4 2 位残基可抑制a d p 诱导的血小板的聚集，人乳中纤维蛋白原y 一链 c 末端的十二肽有更强的抑制活性 3 6 。o l 。来源于乳铁蛋白( 1 a c t o f e r r i n ) 的一些短肽也可能参与 同血小板的结合，因此具有微弱的抗血栓活性【4 1 1 。 2 2 4 矿物质元素结合肽( m i n e r a lb i n d i n gp e p t i d e s ) 酪蛋白磷酸肽是目前研究最多的矿物质元素结合肽。研究人员己从nn 酪蛋白、os 2 酪蛋白、 1 3 酪蛋白中获得了酪蛋白磷酸肽，这些磷酸肽能够抵抗肠道中的分解作用，与钙形成可溶性复合 物，阻l 钙磷酸盐的沉淀，从而加强肠道对钙的吸收和钙在体内的保持 4 2 】。a ，酪蛋白、n 。酪 蛋白经酶解产生的c p p s 的功能区结构主要有q 虹- ( 4 3 5 8 ) 2 p 、s 1 - ( 5 9 7 9 ) 5 p 、q ；2 ( 4 7 7 0 ) 4 p 。1 3 一酪蛋白经酶解产生的c p p s 的功能区结构主要有1 3 ( 1 - 2 5 ) 4 p 、1 3 ( 1 - 2 8 ) 4 p 及b ( 3 3 4 8 ) 4 p 1 4 3 i 。 有报道从鸡蛋和唾液中获得的磷酸肽具有抗龋齿的活性【4 2 】。从酪蛋白衍生获得的磷酸肽可以 与微量元素如f e 、m n 、c u 和s e 形成有机磷酸盐，有效的避免了这些金属离子在小肠中性和碱 性环境中被沉淀，起到微量元素载体的作用，这些磷酸肽已经用于治疗佝偻病m l 。牛乳中的a ；。 酪蛋白第6 6 7 4 氨基酸残基片段来源的九肽( s e r - s e t - s e r g l u g l u l i e v a l p r o a s h ) ，可结合 游离的c a 、f e 、c u 、z n 等金属离子形成可溶性盐，促进这些离子的被动转运过程1 4 5 1 。c p p s 还可通过使牙齿珐琅质重新钙化而抑制龋齿，用于牙科疾病的治疗【3 5 l 。尽管这些c p p s 的氮基酸 序列各不相同，但它们具有共同的结构特征，即大多数c p p s 具有以下结构s e r - p s e r - p s e r p g l u g l u ，这种结构对于发挥其生理功能是必需的1 4 “。 目前，已有多种商品化的酪蛋白磷酸肽食品投入市场，存r 本雨l 德国已经丌发成为功能性食 品上市，1 9 9 8 年德国已经开发成药物并，0 入药典。 浙江人学博一i ：学位论文 2 2 5 抗菌肽( a n t i b a c t e r i a lp e p t i d e s ) 从2 0 世纪8 0 代开始真正兴起多肽抗生素的研究。1 9 8 0 年b o m a n 等从美国天蚕蛹中分离得 到了具有抗菌活性的多肽- - c e c r p i n s ，并于次年在( ( n a t u r e ) ) 上公布了其氨基酸序列，同年l e f u r 等从兔的巨噬细胞中分离到一种多肽抗生素- - d e f e n s i n s ，并于三年后公布了其氨基酸序列。此厉， 人们从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物、人类体内发现了多肽抗生素。由于多 肽抗生素具有很强的抗菌活性，因此在医疗、农业等领域得到广泛应用。 目前，抗菌肽的获得方法主要有以下几种途径：天然抗菌肽的分离提取；化学合成法1 47 l ：基 因工程合成法1 4 8 】：酶解法【”1 。其中蛋白酶酶解方法由于成本低，便于操作，易于实现工业化生产， 因此，该方法比较受到欢迎。 l a c t o f e r r i c i n 是从牛乳铁蛋白中得到的活性肽，比乳铁蛋白更加有效抵抗革兰氏阴性细菌和 白色念珠苗的活性。c o r n e l i al i e p k e 等用胃蛋白酶在模拟婴儿消化道的酸性环境下对人乳进行酶 解获得了相当于人乳k 酪蛋白的6 3 1 1 7 位氨基酸残基的肽，能够抑制革兰氏阴性、革兰氏阳性 和酵母菌的生长【5 0 】。o h a s h i 等研究发现人乳铁乳铁传递蛋白中的y 6 7 9 民。5 短肽和牛乳b 酪蛋白 中的l 1 3 3 - q 。，短肽可以通过抑制细菌、病毒的半胱氨酸蛋白酶活性而发挥抗菌和保护肠道的作 用，而且由于人体肠道中无半胱氨酸蛋白酶，所以不会影响人体对食物蛋白质的消化 4 7 j 。 抗菌肽类一般都有很高的热稳定性，可以在食物和动物饲料的加工过程中成为比较理想的防 腐剂，应用前景广泛。 2 2 6 抗人体免疫缺陷病毒( 抗爱滋病病毒) 肽( a n t i - h i vp e p t i d e s ) 人体免疫缺陷病毒( h i v - 1 ) 感染是患爱滋病的原因。研究人员发现，一些肽具有阻碍h i v 的复制、整合、成熟等步骤的调空酶的作用。病毒编码蛋白( h i v - p r ) 是一种天冬氨酸蛋白酶， 它对病毒的成熟非常重要，研究人员已经合成出该酶的肽类抑制剂，另外一些肽可以阻碍被病毒 感染细胞内病毒蛋白的合成【5 ”。