（森林培育专业论文）天然花青苷提取纯化及降血脂作用的研究.pdf

摘要 摘要 花青苷是一种水溶性的色素，广泛存在于植物的花、果实和茎等器官中，构成了植 物王国中绝大多数品种的蓝色、红色、紫色和黄色等颜色。花青苷是花青素与糖通过糖 昔键结合而形成的一类化合物，不但具有很强的着色能力，同时还具有美容养颜、降脂 减肥、抗衰抗癌、增加视力等多种重要的生理功能和药用功能，可应用于食品、药品、 化妆品等领域。本试验研究了提取花青苷的几种方法，并对这几种方法进行了比较：采 用薄层层析和柱层析技术纯化花青苷，并筛选出最佳层析介质和洗脱剂；研究花青苷的 降血脂作用。 研究提取花青苷的几种方法：超声波水提法、超声波酸提法、酶解法、超临界一酶 解法，其中用超临界一酶解法提取花青苷至今未见报道。通过对几种提取方法的比较， 发现超声波水提法的提取率最低为2 7 ；超临界一酶解法的提取率最高，达到 6 5 。通过正交试验，确定了酶解法提取花青苷的最佳条件为：温度3 0 ，p h 值 7 o ，圃液比l ：6 ，酶用量为2 4 i u ，时间9 0 m i n ，提取率达到6 4 。 采用层析技术对花青苷进行分离纯化，通过正交试验筛选出最佳层析介质和洗脱 剂，分别为硅胶和乙酸乙酯甲酸- 盐酸( 2 m o l l ) ( 7 4 ：1 0 ：1 2 ) ，层析所得花青苷样品纯度为 9 0 2 。 对大花葵花青苷降血脂作用的研究发现，当大花葵花青苷浓度为o 4 m g m l 时，对 羟基自由基的清除率可达3 8 8 ，对脂质体氧化的抑制率可达1 3 4 。通过建立大自鼠 的高脂模型，再喂食不同剂量的花青苷，发现喂食o 5 9 d 花青苷剂量总胆固醇下降 2 2 3 4 ，o 6 9 d 的剂量甘油三酯下降3 4 4 。 关键词花青苷提取纯化降血脂 a b s t r a c t a n t h o c y a n i n s ，aw a t e r - s o l u b l ep i g m e n t ，w i d e l ye x i s ti nf l o w e r , f r u i ta n ds t e mo fp l a n t s a n db r i n gm a n yc o l o u ro fm o s tp l a n t s u c ha sb l u e 、r e d 、p u r p l ea n dy e l l o w i t ss t u c t u r e c o n s i s t so fa n t h o c y a n i d i na n ds a e c h a r i d et h r o u g hc h em i c a lb o n db e t w e e nt h e m i th a ss t r o n g d y e i n ga b i l i t ya n dm a n yp h y s i c a lf u n c t i o n s ，s u c ha sp r o t e c t i n gs k i n 、c u t t i n go f fb l o o d f a t 、 d i e t i n g 、r e s t r a i n i n gc a n c e r 、d e l a y i n gs e n e s c e n c ea n di m p r o v i n ge y e s i g h t i tc a nb eu s e di n m a n yf i e l d ，s u c ha sf o o d 、d r u ga n dc o s m e t i c i n v e s t i g a t i o na n dr e s e a r c hw e r ec a r r i e do u tf o r s e v e r a lm e t h o d so fe x t r a c t i n g a n t h o c y a n i n s a n dc o m p a r i n gt h e s e m e t h o d s ，p u r l l y i n g a n t h o c y a n i n st h r o u g ht h i nl a y e rc h r o m a t o g r a p h ya n dc o h m a nc h r o m a t o g r a p h ya n df i n d i n go u t o p t i m u mc h r o m a t o g r a p h ym a t e r i a la n de l u t i n gs o l v e n t ，a n da b i l i t yo fr e d u c i n gb l o o d f a t i n v e s t i g a t i o nw e r ec a r r i e do u tf o rs e v e r a lm e t h o d so fe x t r a c t i n ga n t h o c y a n i n ，s u c ha s w a t e re x t r a c t i n g 、u l t r a s o n i ce x t r a c t i n g 、e n z y m ee x t r a c t i n ga n ds u p e rc r i t i c a lf l u i d - e n z y m e e x t r a c ti n g t h e r ei sn or e p o r ts of a rf o rm e t h o do fs u p e rc r i t i c a lf l u i d - e n z y m ee x t r a c t i n g t h e r e s u l ts h o w e dt h a te x t r a c t i n gr a t eo fw a t e re x t r a c t i n gw a st h el o w e s t2 7 a n dt h a to fs u p e r c r i t i c a lf l u i d e n z y m ee x t r a c t i n gw a st h eh i 【g h e s t6 5 t h r o u g hc o m p a r i n gt h e s ee x t r a c t i n g m e t h o d s t h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n ta n a l y s i s ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o no fe n z y m e e x t r a c t i n g t e m p e r at u r e3 0 、p hv a l u e7 0 、s o l i d - t o l i q u i dr a t i o1 ：6 、e n z y m ec o n s u m p t i o n 2 4 1 u 、t i m e9 0 m i n w a sf o u n do u ta n di t se x t r a c t i n gr a t ew a s6 4 t h er e s u l to fr e d u c i n gb l o o d - f a ts h o w e dt h a tc l e a n i n gh y d r o x y lf r e er a d i c a lr a t eo f a n t h o c y a n i nw a s3 8 8 w h e nc o n c e n t r a t i o no fa n t h o c y a n i nw a s0 4 m g m l a n dr e s t r a i n i n g l i p i d d i o x i t i o nr a t eo fa n t h o c y a n i nw a s1 3 4 w h e nc o n c e n t r a t i o no fa n t h o c y a n i nw a s o 4 m g m l t h eh i g hf a tm o d e lo fb i gw h i t em o u s ew a se s t a b l i s h e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t c u t t i n gc h o l e s t e r o lr a t ew a s2 2 3 4 w h e na n t h o c y a n i nd o s a g ew a so 5 9 d ，c u t t i n gt r i g l y c e r i d e r a t ew a s3 4 4 w h e na n t h o c y a n i nd o s a g ew a s0 6 9 d k e y w o r d sa n t h o c y a n i n ；e x t r a c t i o n ；p u r i f i c a t i o n ；r e d u c i n gb l o o d f a t i i l 前言 1 前言 花青苷也称为花色素或花色苷，是一种水溶性的天然食用色素，广泛存在于植物的 花、果实茎、叶和根等器官的细胞液中构成了植物王国中绝大多数品种的蓝色、红 色、紫色和黄色等。本文以大花葵为实验原料，大花葵( m a l v as y l v e s t r i s ) 是锦葵科锦葵属 植物，其花中含有天然色素花青苷。花青昔是花青素与糖通过糖苷键结合而形成的一类 化合物 1 1 ，在不同条件下呈现不同的颜色。花青苷不但具有很强的着色能力，同时还具 有美容养颜、降脂减肥、抗衰抗癌、增加视力等多种重要的生理功能和药用功能，可应 用于食品、药品、化妆品等领域1 2 】。 城市绿化面积不断增加，花卉废弃物的处理已经成为一个重要的环境问题。在我国 花卉废物每年达几千万吨，大部分被燃烧或做为垃圾处理而浪费掉，能够利用的很少， 不但造成严重的环境污染，同时更浪费了宝贵的有用资源。因此对花卉废弃物的研究有 十分重要的经济意义和生态意义。 在2 0 世纪末，f a o 和w h o 等国际组织联合禁止合成色素用做食用色素后，花青 昔的应用范围不断扩大【3 】，花青苷已经成为国内外公认的替代合成食用色素的理想资源 4 1 。全世界对花色苷的研究日益广泛和深入德、法、美、日等国家主要针对下列植物 中的花色苷进行了研究：葡萄，山楂，花生，银杏，日本罗汉柏，北美崖柏，土耳其侧 柏，花旗松，白桦树，番荔枝，野草莓，扁桃，可可豆，贯叶金丝桃，头状胡枝，海岸 松，洋委陵菜和大黄等。我国具有非常丰富的花色苷资源，主要有玫瑰、山楂、越桔、 荔枝及锦葵属植物等。 1 1 花青苷的化学结构与性质 花色菅一词是m a r g u a r t 在1 8 3 5 年首先用来命名矢车菊花朵中的蓝色提取物时提出 来的，现为同类物质的总称i5 1 。1 9 0 5 年m o l i s h 获得花青苷结构，现已确定花青苷具有 黄酮类的c 。c ，c 6 碳骨架结构，在植物体中通过与黄酮类相同的生物合成途径形成。花 青苷是花青素与糖类物质通过糖苷键结合形成的。花青素是花色苷的配基，通常不稳 定，因此在植物中主要以稳定的花青苷的形式存在。花青素的基本结构是3 ，5 ，7 三羟基一 2 苯基苯并吡喃，a 环3 ，5 ，7 位上的羟基以糖苷键与糖结合时便形成花色苷。由于b 环 备碳位上的取代基不同，形成各种各样的花青素。花青苷的基本形式有六种：天竺葵色 素、矢车菊色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛色素和锦葵色素。与花青素结合的糖、 有机酸的种类及数量不同，花青苷的种类不相同，结合的糖类主要有葡萄糖、鼠李糖、 半乳糖、木糖等单糖鼠李葡萄糖、龙胆二糖、槐二糖等二糖。花青苷与有机酸通常是 通过糖的酯酰形式结合。目前发现的花青苷种类已经超过2 0 0 种。 花青苷是水溶性物质，其种类不同，其溶解度也有所差异，一般可溶于水、甲醇、 乙醇溶液及其混合溶液，其呈现的颜色随着羟基、甲氧基、糖结合的位置及数目的不同 而不同。p h 值从强酸性、中性至碱性变化时，花青苷的颜色变化为红色、紫色至蓝 色。在强酸性溶液中，花青苷主要以黄锑盐阳离子形式存在，呈稳定的红色；在弱酸性 至中性溶液中，以脱水碱基阴离子形式存在，其最大吸收波长红移，呈红紫色；在碱性 溶液中以脱水碱离子形式存在，呈蓝色。脱水碱基不太稳定，容易水化成无色的假碱 基。花青苷易受某些理化因素的影响而降解或褪色，如酶、温度、氧气、光、p h 值、 v c 、糖及其降解产物、金属离子以及植物中的代谢产物等都会对花青苷的稳定性产生影 响【6 。3 1 。因此，花青苷虽然能赋予产品诱人的颜色，但未能作为食品色素而很好的加以 利用。 各种花青苷的区别主要在于分子中羟基的数目，羟基甲基化的程度，糖结合的数目 和位置，结合于糖残基上芳香酸或脂肪酸的数目和性质。这些基团的位置和种类对花青 苷的稳定性有很大影响。c 3 上的羟基可将花色素的颜色由黄橙色变为红色。大多数c 3 羟基花色素为红色，而c 3 脱氧花色素则为黄色。碳5 上有羟基或碳4 发生取代都可使 颜色趋于稳定，因为阻止了导致无色化合物形成的水合反应。 陈键初研究了茶多酚，结果表明花色苷降解都符合一级动力学反应规律，茶多酚， 铁离子，铝离子对杨梅花色苷及色泽稳定性均无显著影响【“】。 李进等对鸡冠花红色素的理化性质及稳定性进行了研究，结果表明该色素易溶于 水，在p h 5 以下呈红色，初步定为花色苷类。其耐热性较差，耐可见光和紫外光性好： 蔗糖和苯甲酸钠对色素稳定性无影响；h 2 0 2 对色素有不良影响；n a 2 s o s 对色素的影响 不显著；z d + 、m 9 2 + 、c a 2 + 和n a + 对色素稳定性无影响，而f e ”、f e ”、c u 2 + 、a l ”、 p b ”、s n ”对色素有不良影响”“。 励建荣等对杨梅汁内花色苷的热稳定性的研究结果表明，充氮处理可以明显提高杨 梅汁内花色苷的稳定性。不管是在有氧还是充氮条件下，随着p h 值的增高，e 0 值变 小，说明低d h 值下花色苷的热稳定性较好【l ”。 大多数非酰化或单酰化的花青苷具有指示剂的特点，低p h 值时呈红色，中性为淡 蓝色，离p h 值时无色。在酸性溶液中，存在着4 种花青苷的平衡：醌型碱( a ) ，黄锌 盐阳离子( a h + ) ，假碱( b ) 和查耳酮( c ) 。在p h 低于2 时，花青苷主要以红色或黄 色的黄销! 盐离子( a h + ) 存在；随着p h 值的升高，花青苷损失质子而形成红色或蓝色 的醌型( a ) ；a w 进一步水合作用形成无色的假碱( b ) ；假碱以缓慢的速度同开链的无 色查耳酮( c ) 趋于平衡1 1 7 1 当花青苷溶液加热时，平衡向着无色的查耳酮( c ) 的方向进行，同时引起有色型 化合物( a h + 和a ) 的降低。当冷却和酸化时，醌型碱( a ) 和假碱( b ) 迅速变成阳离 子( a h + ) 。但是查耳酮( c ) 的变化相当慢。 赵新淮等人认为，黑加仑果渣内花色苷的热降解反应遵循一级反应的动力学规律 。陈勇等人对紫苏花色苷热稳定性动力学进行了研究，结果和赵新淮等人的相同【l 。 c l y d e s d a l e 等报道苯乙烯酸残基与花青苷核平行堆积，从而保护色团避免水亲核攻 击【2 0 】。也有学者利用二维n m r 技术对萝1 - 色素进行分析发现，2 苯基苯并吡喃与酰基 的氢原子空间距离很近，证明了花青素折叠成“三明冶”结构f 2 ”。酰基化作用的芳香酸 如b 香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和一些脂肪酸如丙二酸、乙酸、苹果酸、草酸等对花青 苷的稳定起很大的作用。这些流动的糖链就像一条带子将折叠好的酰基缠绕在2 一苯基苯 丙毗喃骨架的表面，这种堆积作用对花青素具有保护作用，而且对色泽稳定必具有重要 作用。酰化作用还能够抗亲水攻击和其它类型的降解反应j 。 前言 d a n g l e s 等用锦葵色素一3 槐糖苷5 糖苷与3 摩尔咖啡酸酰化后定量测定它的稳定 性，结果表明随着酰化程度增大而升高，从而证实了酰化花青素较未酰化的花青素稳 定，颜色也更深田】。s a i t o 等也证实酰化花青素比未酰化的花青素稳定阱l 。y o s h i d a 等认 为从紫山药中提取的酰基化色素的稳定归因于“三明治”模型 2 5 1 。 c a w i l l i a m s 等人在对石槲属植物的紫花研究时提取到3 丙二酰。d 吡喃葡萄糖苷7 二芥子酸酰糖苷矢车菊色素和它的一些去丙二酰衍生物【2 6 1 。s h i m i z u 等从红罗h 中分离 出两种酰基化的天然色素，并发现主要是糖基化与阿魏酸化的天竺色素田1 。t a k a s h i 等 从红罗h 色素分离出1 2 种酰基化的花色素1 2 8 l 。n o r i o 等从银莲花的紫罗兰花中分离出五 种酰化花青素，并证明3 位和5 位上的吡喃型葡萄糖是与咖啡酸酰化 2 9 】。e l o l 提取了红 薯花青苷，并发现其中有酰基化的花青苷。利用g c 、m s 和n m r 方法确定其c 3 葡萄 糖基上连接的是咖啡酸，5 位上的葡萄糖基并没有被酰化1 3 0 1 。r u n es l i m e d 从矮牵牛花 中分离得到两种酰化花青苷，采用同核或异核二维n m r 技术确定结构为3 【6 o 4 ( 咖啡 酸鼠李糖苷) 吡喃葡萄糖苷】5 吡喃葡萄糖苷锦葵色素【3 1 1 。田洪等研究结果表明，阿拉 伯胶与蔗糖( 2 ：1 8 ) 的微胶囊化色素溶液理化性质稳定p ”。李键发现十二烷基硫酸钠吐温 8 0 及l 谷氨酸三种辅色剂可作为赤豆皮花色苷的稳定剂，使赤豆花色苷的2 0 天降解 率由原来的5 0 减少到1 5 左右。 目前基因工程技术的发展使本身结构稳定的天然花青苷能作为食用色素成为可能， 现已证明植物合成花青苷与植物的生长时间、阳光吸收量和其所需的营养物质等因素有 关。科学家也开始寻找象合成稳定的3 c ：咖啡酰槐糖苷5 葡萄糖苷飞燕草色素的植物基 因，但像3 二咖啡酰槐糖苷5 葡萄糖苷飞燕草色素这样本身结构稳定的花青苷通常显示 的色泽是深紫色到蓝色，而不是红色【3 4 1 。 1 2 花青蕾的分离纯化 1 2 1 花青苷的提取 花青苷主要是从植物中提取，也有用化学合成法和生物合成法合成的【3 i 。较早提 出用合成方法制备花青苷的是d e l o u r 等人【3 ”，美国学者b a s a k a a m i t t 等人用化学合成 的方法来生产线性的和分支结构的花青苷。目前通常采用的花色苷提取方法主要有压榨 法、溶剂法、c 0 2 超临界萃取法，超声波萃取法，其中c 0 2 超临界萃取法效果最佳一“。 法国科学家用这一技术可使花青苷萃取率达9 5 左右p ”。日本的a k i k o 等人发现以儿茶 素聚合体为底物的主体选择性方法合成花色苷1 3 。吴恩岐等用a m w 混合液抽取g l a u c i d i u m p a lm a t u ms i e b 花瓣的花色素苷，对纯化的花色素苷的配基、结合糖的种类以及结 合位置进行了测定，得到了g l a u c i d i u m p a l 花瓣花色素的定性分析结果f 4 0 。钦传光等采 用各种标准展开系统，对蛇莓果中的红色素及其水解产物进行纸层析分离，结果均只发 现一个红色斑点。测得红斑的r f 值并与文献值比较，鉴定了该红色素的化学结构为天 竺葵素3 葡萄糖苷【“1 。张沙艳等人用含有无机酸的低沸点醇溶剂从高梁壳中提取高梁 花色苷分离得到高梁红色素固体粉末 4 2 i 。陆国权等发现黑豆皮色素为花色苷类色素， 以o 8 的盐酸乙醇作提取剂，在7 5 恒温，l ：2 5 0 物料比的条件下，得率可达9 1 2 1 4 3 1 。刘小芬用多种溶剂提取轮叶蒲桃中的花色苷，发现盐酸乙醇作提取剂效果最好【9 1 ， 与张沙艳和陆国权的研究结果相同。胡迎芬发现用8 0 的乙醇作溶剂的效果要好于其他 溶剂，在p h 值为5 ，温度为5 0 。c ，水浴时间为4 0m i n 的条件下，提取率最高删。赵功 玲等用水解法提取番茄红色素，可大幅度的提高番茄红色素的提取速度和提取率娜1 。 1 2 2 花青苷的纯化 初步分离得到的天然色素产品，通常品质低，稳定性和着色性不好，需要进一步的 纯化精制。目前天然色素的纯化方法主要有离子交换树脂法、吸附法、超滤法和酶法。 离子交换树脂法可除去糖、有机酸、无机盐等物质，如纯化葡萄皮色素等 4 6 】。吸附 法可用于除去色素产品的异味，如用此法除去萝卜红色素的臭味等。超滤法具有浓缩与 净化双重功能，是目前纯化天然色素较理想的方法。酶法是纯化色素的新方法，已用于 叶绿素的除臭。超滤法和酶法是今后的发展方向。 吴信子等从蓝靛果中分离出花色苷，用盐酸作为溶液，用纸层析和聚乙酰胺柱层析 法，将分离出来的花色苷逐级分离纯化，用核磁菸振仪进行结构鉴定，用高效液相色谱 测定含量f 4 ”。姚开，何强等人用正丁醇盐酸法和香草酸盐酸法测定了葡萄中花色苷的 含量，发现香革酸盐酸法测定化色苷含量有着较高的精密度和标准度1 48 1 。吴恩歧用t l c ( 薄层层析) 法测试花瓣中的花色苷，发现用丁醇、乙酸及乙酸乙酯( 4 ：1 ：5 ) 展开效果最 好，可使花色苷得到有效分离，再用高效液相色谱进一步提纯，可得到花色蕾纯品【4 0 1 。 刘云等对荔枝果皮花色苷及降解指数的含量进行了测定，并发现p h 差示法测定荔枝花 色苷要好于盐酸甲醇法【4 9 1 。孙芸等用反相高效液相色谱一电喷雾质谱分析了葡萄籽粒提 取物中花色苷的组成，研究表明反相高效液相色谱一电喷雾质谱联用可以分析葡萄籽中 花色苷的基本组成【5 。万本屹等人测定乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和正丁醇萃取后 的残液的含量分别为4 8 5 、3 5 6 和3 3 4 ( 5 1 1 。冯彤找出扶桑花红色素的最佳提取、 纯化工艺：将扶桑鲜花用6 0 水浸提2 0 m i n ，反复3 次，过滤，5 5 6 0 真空浓缩，乙 醇溶解、沉降，过滤，真空浓缩得粗制品，过柱，真空浓缩，得红色针状结晶睁“。 w r o l s t a d 用吸附层析的方法，以a b 8 大孔吸附树脂对原花青素粗提物进行分离，乙酸 乙酯洗脱，产物总酚含量为9 l ，经h p l c 检验，单体约占2 8 ，低聚体占6 4 ，高 聚体约占8 【53 1 。 1 3 花青苷的生理功能 自6 0 年代开始，欧洲科学家就开始将花青苷用于治疗枯草热和过敏症，并获得满 意的效果。8 0 年代初，法国用g s p e 治疗毛细血管脆化、慢性外周静脉机能减弱和视网 膜微血管病等疾病。近年来的研究表明，g s p e 是强自由基清除剂，它可以防治多种由 自由基引起的疾病。花青苷的主要生理功能如下： 1 3 1 抗氧化功能 氧化作用主要是由自由基引起的，自由基的存在可直接引起许多疾病，还与其他多 前言 种疾病的发生有关。自由基和脂质过氧化损伤是动脉粥样硬化、癌症和老化的主要原 因，而g s p e 的大量活性酚羟基具有很强的抗氧化活性。 花青苷具有抗氧化作用是2 0 世纪9 0 年代被发现的。i g a r a s h i 等人发现山葡萄中的 花青苷具有很强的抗氧化作用舻钔。t s u d a 等人用亚油酸自动氧化系统、脂质体系统、兔 血红细胞膜系统对矢车菊色素3 葡萄糖苷和矢车菊色素的抗氧化活性进行了实验，发现 它们具有很强的抗氧化活性垆”。 法国科学院研究生院曾做了葡萄籽提取的花青苷清除自由基活性实验，认为葡萄花 青苷是迄今为止所发现的最强有效的自由基清除剂之一，尤其是其体内活性，更是其它 抗氧化剂所不可比的。b a g c h id 曾用小鼠进行体内实验，用葡萄花青苷、v c 、v e 、卢- 胡萝卜素对t p a 诱导的肝、脑组织中脂质过氧化的保护作用进行了比较，发现在 l o o m g k g b w 剂量下葡萄花青苷、v c 、v e 、芦胡萝h 素均可降低t p a 诱导产生的活性 氧，使用腹腔巨噬细胞发光法测定降低率分别为7 0 、1 8 、4 7 和1 6 ，使用细胞色 素c 还原法测定降低率分别为6 5 、1 5 、3 7 和1 9 ；葡萄花青苷对氧化损伤起到保 护作用优于其它抗氧化剂。此外b a g c h id 的体外实验也获得了一致的结果。他们使用 化学发光法和细胞色素c 还原法测定了葡萄籽原花青苷、v c 、v z 、卢一胡萝h 素、超氧 化物歧化酶、过氧基的抑制率具有浓度反应关系，在1 0 0 m g l 的浓度时，葡萄籽原花青 素对超氧化阴离子和羟基自由基的抑制能力为7 8 和8 1 ；同等条件下，v c 抑制上述 两种自由基的能力为1 2 和1 9 ，v e 为5 0 和7 5 ，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶联 合作用抑制超氧阴离子的能力约为8 3 ，因此葡萄花青苷是一种比v c 、v e 更强的自由 基清除剂。w a n g 等用自由基吸附系统评价了天竺葵色素等1 4 种花青苷的清除过氧化自 由基的能力，结果表明以上花青苷对自由基都有不同程度的清除作用。其中从红葡萄中 提取的花青苷清除超氧自由基的能力最强口6 1 。l i v i e r o 等的实验结果表明，o 5 m g m l 的 葡萄原花青苷可使啤酒酵母$ 2 8 8 c 菌株线粒体的自发性基因突变比对照组减少6 5 f 5 7 】。此外，s u g i m o t o 证实葡萄籽花青苷对自由基的抑制率达9 4 。凌智群发现适量的 莲房花青苷具有抗活性氧的作用【5 8 1 。余莹等人从葡萄中提取高纯度的花青苷，测得其对 稳定自由基有清除作用，在花青苷浓度为1 0 9 l 时可清除8 0 的自由基p 。 1 3 2 抗突变、抗肿瘤功能 1 9 8 0 年，m a r m i r o l i a 在线粒体抗突变试验中，发现从葡萄中提取的花青苷能有效降 低线粒体突变化率 5 9 】。l i v i e r o 发现用0 5 m g m l 花青苷可使啤酒酵母s 2 8 8 c 菌株线粒 体的自发性基因突变比对照组减少6 5 ，用相同菌株进行的实验还观察到g s p e 可抑制 细胞核由对刀豆氨酸敏感型到耐受型豆氨酸的自发性突变【4 6 1 。本世纪初s u g i n o t o k 发现 花青苷对t r pp 2 致突变剂的抑制率达9 4 哪j 。 y o m s h i m o t o 用鼠伤寒杆菌为材料，评价了四种甘薯块根水提取物的抗突变活动， 发现紫肉甘薯中的花色苷可有效地抑制杂环胺、3 胺基一l 、4 二甲基一5 氢吡哆一( 4 - 3 6 ) 吲哚引起的突变作用【6 l 】。r e s p i r a t o r yd e f i c i e n t 用$ 2 2 8 c 细胞株，以突变体作为线 粒体突变型的表现，记录突变体的产生率，结果表明花青苷能有效降低线粒体突变发生 率1 6 2 】：他们还用该细胞株，记录刀豆氨酸敏感型突变为刀豆氨酸耐受型的数量，结果试 东北林业大学硕士学位论文 验组细胞核突变率减少8 8 9 2 【6 3 ，“】。 s sj o s h i 等的体外研究发现2 5 m g l 的葡萄提取物花青营对m c f 7 人类乳腺瘤细 胞、a 一4 2 7 人类肺癌细胞和c r l l 7 3 9 人类胃腺癌细胞具有细胞毒性。在2 4 、4 8 、7 2 h 抑 制生长率分别为7 、3 0 、4 3 。同时，葡萄花青苷可提高正常人类胃粘膜细胞和正常 j 7 7 4 a 1 尿道上皮细胞的生长和存活能力【6 5 】。 m b a g c h i 等在烟草与肿瘤关系的研究中，也用葡萄中提取的花青苷对烟草提取物 ( s t e ) 诱导的人类口腔角化细胞的氧化抑制及细胞凋亡的保护作用进行了研究据统 计在美国约1 3 的肿瘤与烟草有关，口腔癌约占全部肿瘤的3 。他们在实验中采用正 常人类口腔角化细胞，研究了烟草提取物对脂质过氧化( l p ) ，细胞色素还原( c c r ) ， d n a 片段( d f ) 和细胞凋亡的影响，并对不同抗氧化剂的保护作用进行了评价。从人 类口腔组织分离培养细胞并用s t e 处理2 4 h ，用c c r 检测超氧化阴离子的生成，用l p 和d f 检测组织氧化损伤，用流式细胞仪检测程序化细胞死亡，并比较了7 5i xm d l v c ，7 5um d lv e ，v v e 和1 0 0 1 - tm d l 葡萄中花青苷对上述损伤的保护作用。当细胞用 3 0 01 1g h n l 的s t e 处理后，观察到程序化细胞死亡分别增加9 、2 9 和3 5 ，使用抗 氧化荆后，保护率增加4 0 7 2 6 6 1 。 1 3 3 保护肝功能 日本在对含大量花青营的紫肉甘薯饮料的生理功效实验中，喂食大鼠四氯化碳，产 生体内游离基，引发急性肝炎，血清中谷氨酸一草醋酸转氨酶( g o t ) 、谷氨酸一焦葡 萄糖酸转氨酶( g p t ) 激增结果表明紫肉甘薯饮料能显著抑制病鼠血清中g o t 、g p t 的上升，且对血清中的硫化巴比妥酸( t b a ) 反应物、肝脏中的t b a 反应物及氧化脂蛋白 的增加都有一定的抑制。w a n g 等用1 5 m m o l l 叔丁基过氧化氢( t - b h p ) 处理分离的鼠肝 细胞3 0 m i n ，引起肝脂肪氧化和细胞中毒，而o 1 或o 2 的花青苷可降低t - b l i p 的作 用【6 7 l 。在老年鼠的体内实验中，花青苷也可显著降低由t - b h p 引起的肝细胞损伤。用百 草枯引起鼠肝损害，同样证明花青苷对肝脏具有保护作用i 6 。 1 3 4 降血脂功能 近年来采用维生素e 、1 3 胡萝p 素和类黄酮类等抗氧化物质，防治心血管疾病愈来 愈受到重视，这些化合物能抑制脂质过氧化、清除自由基活性和防治高血脂症等。花青 苷对一t x , 血管疾病预防和治疗作用也正是其抗氧化活性和清除自由基能力的表现j 。 从红葡萄中提取的花青苷能有效地清除超氧自由基和羟基自由基。在体外实验中， 花青菅能明显抑制低密度脂蛋白的氧化和血小板的聚集 7 0 l 。花青苷在体外明显抑制 a c e 活性，兔静注5 m g k gg s p e 可减轻血压对血管紧张素i 和i i 的应答，花青苷对高 血压有治疗作用【7 ”。k a y a m o r i 喂食大鼠含大量胆固醇的食物，同时饲喂从茄子中提取 的酰基化飞燕草花青苷结果鼠血清中的总胆固醇含量下降，而粪便排泄物中的胆固醇 和胆汁酸增加【7 2 】。 另外，从葡萄中提取的花青苷可用于提高血管抵抗力，降低毛细血管渗透性“j 。 动物实验和临床研究发现，葡萄花青苷可以有效地降低胆固醇和低密度脂蛋白的水平， 前苦 预防血栓的形成，并有助于预防心脑血管疾病1 7 “。 匈牙利的b l a z s o 等用海岸松树皮中的原花青素给小鼠腹腔注射后明显抑制了巴豆油 引起的耳水肿并呈量效关系，此作用可能与原花青素捕获过氧离子活性密切相关。罗马 尼亚k o n t e k 等用葡萄花青苷制成的制剂“e n d o l e t o n ”与浓缩的葡萄籽提取物成功地降 低了大鼠毛细血管通透性并抑制了爪水肿。b a r b i e r 等发现花青苷可降低因静脉注射组 胺、缓激肽等引起的毛细血管通透性增高“。 1 3 5 改善视觉功能 花青苷具有改善视力的作用。f u s i 等对越桔花青苷改善眼疲劳的作用进行了人体试 验，给予7 5 例因长期在显示屏前工作的眼疲劳患者每天服用葡萄籽提取物原花青素3 0 0 m g ，2 个月后其相对敏感性和客观症状均有明显改善7 ”。在对近视患者视觉作用的临床 试验中，m o r i c o n i 给2 0 0 名近视性视网膜非炎性改变的患者服用葡萄花青苷，每日1 5 0 m g ，2 个月后受试者视力有明显提高。 1 4 本项目的研究内容 天然色素是从植物、动物、矿物等天然物质中提取出来的可食用的着色物质。它的 优点是安全性高，有的还具有营养价值和有益的生理功能。大花葵花青萤是一种水溶性 天然食用色素，具有多种对人体有益的生物活性。目前，国内外对花青苷的提取纯化和 生理功能的研究已有许多报道，但对大花葵花青苷的研究尚无报道。本文首先分别用超 声波法、酶解法及超临界一酶解提取法对花青苷进行提取，找出最佳提取方法及提取条 件；再用吸附层析技术，包括薄层层析、柱层析，纯化花青苷粗提样品，并筛选出最佳 洗脱剂和层析条件，并研究了花青苷的降血脂作用。下面分别介绍对大花葵花青苷的提 取、纯化和降血脂作用的研究。 东北林业大学顾上学位论文 2 花青苷提取工艺的研究 2 1 实验材料与仪器 2 1 1 实验材料 大花葵干花，采自东北林业大学实验林场 2 1 2 实验试剂 乙醇、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、苯、正己烷、乙醚、三氯乙烯、盐酸、 n a o h 、冰醋酸、正丁醇、乙酸乙酯、四氯化碳、甲醇、乙酸、甲酸、氯仿、液态二氧 化碳，纤维素酶( 4 0 0 万活力单位) 。所用试剂均为分析纯。 2 1 。3 实验仪器 k q 5 2 0 0 d b 型数控超声波清洗机，n d j 8 s 数字显示粘度计，a l c - 2 1 0 4 型电子天 平，t g l 一1 6 g 飞鸽离心机，a p 0 1 p 型真空泵，f w l o o 型高速万能粉碎机，r - 2 0 1 型旋 转蒸发器，d z f 6 0 3 0 型真空干燥箱，超声波发生器a e 3 2 0 0 电子天平( 日本) ，7 5 4 紫外可见分光光度计，p h s 2 酸度计，a l p h a i 2 真空冻干干燥机( 德国) ，g x z 型生 化培养箱，r e 一5 2 a 旋转蒸发仪，1 0 1 2 a 型电热鼓风干燥箱，1 0 1 3 型电热恒温鼓风干 燥箱，1 2 1 - 2 a 5 0 0 2 超临界萃取装置。 2 2 实验方法 2 。2 。1 花青苷提取率的测定 2 2 1 1 标准曲线的制作取花青苷标准品分别配成l 、2 、3 、4 和5 的溶液，取 l m l 定容至1 0 0 m l ，用7 5 4 紫外可见分光光度剂分别进行全程扫描。选择2 8 0 n m 处的 吸光值，做成花青苷含量与吸光度值的标准曲线，并计算出回归方程与相关系数。 2 2 1 2 花青苷提取率的测定将花青苷的提取物在与制作标准曲线相同条件下进行溶 解、定容，测定2 8 0 n m 处的吸光值，按公式( 2 一1 ) 计算出花青苷的提取率。 花青昔提取率= ( o 0 5 8 7 x 吸光度值+ o 0 0 2 7 ) l o o 公式( 2 1 ) 2 2 2 花青苷萃取溶剂的选择 将大花葵干花粉碎，过4 0 目筛，选用酸、碱和多种有机溶剂浸泡2 0 m i n ，料液比 为1 ：3 0 ；然后在室温条件下，在不同的超声波频率下提取花青苷，比较各种溶剂对花青 2 花青苷提取工艺的研究 苷的溶解能力。 2 2 3 超声波法提取花青苷的研究 将大花葵干花粉碎，过4 0 目筛；用乙醇预处理，除去脂溶性成分；过滤除去滤 液，将剩余残渣真空干燥，温度为4 0 。c ，时间为2 4 h ；再用蒸馏水浸泡2 0 m i n ，在不同 的料液比、不同提取时间、不同超声波功率和不同温度的条件下提取花青苷：过滤，将 滤液减压浓缩除去溶剂，温度为4 0 ；将浓缩物真空冷冻干燥，得到花青苷粗提产品。 2 2 3 1 不同因素对花青苷提取率的影响 ( 1 ) 提取时间对花青苷提取率的影响在超声波频率为3 0 k h z 、温度为3 0 c 的条件 下，提取时间分别为2 0 、4 0 、6 0 、8 0 、1 0 0 m i n ，测定花青苷的提取率。 ( 2 ) 提取温度对花青苷提取率的影响在超声波频率为3 0 k h z ，时间为4 0 r a i n 的条 件下，温度分别为2 5 、5 0 、7 5 、1 0 0 ，测定花青苷的提取率。 ( 3 ) 提取溶剂对花青苷提取率的影晌在超声波频率为3 0 k h z ，时间为4 0 m i n ，温度 为3 0 的条件下，分别用水、浓度为1 的硫酸和氢氧化钠以及5 0 的乙醇做提取剂， 测定花青苷的提取率。 ( 4 ) 溶剂浓度对花青苷提取率的影响在超声波频率为3 0 k h z 、温度为3 0 、时间 为4 0 m i n 的条件下，分别用硫酸和氢氧化钠作为溶剂提取花青苷，测定花青苷的提取 率。 2 2 3 2 正交试验 ( 1 ) 水提法的正交实验在单因素试验的基础上，确定水提法的时间、温度、料液 比、超声功率的三个水平，进行正交实验，见表2 - l 。 表2 i 水提法的因素水平表 因素a 时间b 温度c 料液比d 频率 坐垩f 翌! 1 21 旦! g 生! ! 鉴旦三2 16 03 01 ：1 0 2 0 28 0 4 01 ：1 53 0 31 0 05 0 l ：2 04 0 在2 8 0 r i m 处测定吸光度值，比较各组溶液吸光值的大小，吸光度值最大的一组为 最佳提取条件。 在最佳提取条件下进行3 次重复实验，在2 8 0 n m 处测定吸光度值，结果取平均 值，并与最佳提取条件下的吸光度值比较，确定它的最佳工艺参数。 ( 2 ) 有机溶剂提取的正交实验在水提法提取花青苷的基础上，以乙醇和丙酮的混合 溶剂为提取剂，确定提取的溶剂比、提取温度、料液比、超声功率的三个水平，进行正 交实验，见表2 - 2 。 测定真空冷冻干燥后所得花青苷粉末的质量，比较各组所得花青苷的质量，质量最 大的一组为最佳提取条件。 在最佳提取条件下进行3 次重复实验，测定所得花青苷的质量，结果取平均值，并 与最佳提取条件下的质量比较，确定最佳工艺参数。 2 2 4 纤维素酶解法提取花青苷的研究 将大花葵干花粉碎，过4 0 目筛，与蒸馏水以l ：4 的比例混合，分别在不同p h 值、 不同酶用量、不同温度和不同时间条件下进行酶解；然后抽滤，将剩余残渣干燥，将滤 液减压浓缩，温度为4 0 。c ；将浓缩物真空冷冻干燥，得到花青苷成品。 2 2 4 1 酶解条件对花青苷提取率的影响 ( 1 ) 温度对花青苷提取率的影响用4 0 目大花葵干粉1 0 9 ，在p h 值为6 0 、酶用量 8 i u 、酶解时间为6 0 m i n 的条件下，在2 0 4 0 的温度范围下进行酶解，测定花青苷的 提取率。 ( 2 ) p h 值对花青苷提取率的影响用4 0 目大花葵干粉1 0 9 ，在温度为3 0 。c ，酶解时 间为6 0 m i n ，酶用量8 i u ，分别在p h 值为3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、7 0 、8 0 、9 0 条件下进 行酶解，测定花青苷的提取率。 ( 3 ) 酶用量对花青苷提取率的影响用4 0 目大花葵干粉1 0 9 ，在温度为3 0 ，p h 值 为6 , 0 ，酶解时间为6 0 m i n ，酶用量分别为4 3 2 i u ，测定花青昔的提取率。 ( 4 ) 时间对花青苷提取率的影响用4 0 目大花葵干粉1 0 9 ，在温度为3 0 c ，p h 值为 6 0 ，酶用量为8 i u ，酶解时间分别为3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 、1 5 0 、1 8 0 m i n ，测定花青苷的 提取率。 2 2 4 2 酶耪条件的优化根据单因素试验的结果，纤维素酶的最适温度为3 0 。c ，最适 p h 值为7 0 。在此条件下，选择酶解时间、酶用量、大花葵干粉与水的质量比( 固液 比) 为因素指标，在单因素试验的基础上，确定因素水平表进行正交试验，确定酶解法 提取的最佳工艺参数，见表2 3 。 2 2 5 超临界一酶法提取花青苷的研究 将大花葵干花粉碎，过4 0 目筛，取2 0 0 9 装入超临界萃取装蜀的萃取釜中，加入纤 维素酶，以水作为夹带剂，在不同压力、不同温度、不同流量的条件下进行降解；将提 2 花青苷提取工艺的研究 取液减压浓缩，将浓缩物真空冷冻干燥，得到花青苷粗提产品。 2 2 s 1 不同因素对花青苷提取率的影响 ( 1 ) 压力对花青苷提取率的影响在温度为4 0 0 ，流量为3 0 k g h ，酶用量为1 6 i u 、 时间为9 0 m i n 的条件下，压力分别2 0 ，3 0 ，4 0 m p a ，测定花青苷的提取率。 ( 2 ) 温度对花青苷提取率的影响在压力为3 0 m p a ，酶用量为1 6 i u ，流量为 3 0 k g h 、时间为9 0 m i n 的条件下，温度分别为3 0 、4 0 、5 0 ，测定花青苷的提取 率。 ( 3 ) c 0 ：流量对花青苷提取率的影响在压力为3 0 m p a ，酶用量为1 6 i u ，温度为4 0 、时间为9 0 m i n 的条件下，c 0 2 流量分别在2 0 k g h 、3 0 k g h 、4 0 k g , h ，测定花青苷的 提取率。 2 _ 2 6 不同提取方法提取花青苷的提取率对比 在最佳工艺条件下，比较四种提取方法对花青苷的提取率。 2 2 6 1 超声波水提法提取花青苷的提取率用4 0 目大花葵干粉1 0 9 ，在超声波频率为 3 0 k h z 、料液比为1 ：1 0 、温度为4 0 0 、时间为6 0 r a i n 的条件下提取花青苷，测定花青苷 的提取率。 2 2 6 2 超声波酸提法提取花青苷的提取率用4 0 目大花葵干粉1 0 9 ，在超声波频率为 3 0 k h z 、温度为4 0 0 、料液比为l ：1 0 、提取