（发酵工程专业论文）10HDA抗菌实验的初步研究.pdf

摘要 摘要 1 0 羟基2 癸烯酸( 1 0 h d a ) ，性质稳定，是蜂王浆中一种重要的不饱和脂肪 酸，占总脂肪酸的5 0 左右，在蜂王浆中的含量为1 4 2 0 。自然界中只有蜂 王浆中含有，因此又称王浆酸或蜂王酸。1 0 h d a 具有多种生理活性：它能强壮 机体和强烈抑制淋巴癌、乳腺癌等多种癌细胞，增强机体免疫功能，治疗急性辐 射损伤和化学物质所致损伤等。本论文主要研究了从蜂王浆中提取1 0 h d a 的工 艺流程，并以提取的1 0 h d a 为原料，用常规药敏法和流式细胞仪法检测了 1 0 h d a 的抑菌效果，并对1 0 h d a 的抑菌机理做了一个初步的推断。 本论文主要采用了二次有机溶剂萃耿，两次调p h 值的方法来提取蜂王浆中 的1 0 h d a 。蜂王浆中1 0 h d a 的最佳提取条件为：先将蜂王浆的水溶液调p h 至 1 0 ，然后加入5 0m l 乙醚，除去蜂王浆中的脂溶性杂质，再调p h 值至2 ，加入 5 0m l 乙醚，从溶液中提取出1 0 h d a ，旋转蒸发回收乙醚，再加入1 0 m l 的乙 醇溶解，过滤，回收乙醇即可得到1 0 h d a 的粗提品。 接着以提取出的1 0 h d a 为原料，用常规的抑菌圈法和牛津杯法检测了 1 0 h d a 对实验室常见的3 种细菌和2 种酵母的抑菌效果，并用二倍稀释法检测 了1 0 一h d a 的最小抑菌浓度( m i c ) 。结果表明：1 0 一h d a 最小抑菌浓度和抑菌作 用因菌种不同而有所不同，大肠杆菌为1 2 5m g m l ，最大抑菌圈直径为2 7 3 m m ； 枯草芽孢杆菌为2 5m g m l ，最大抑菌圈直径为2 4 4 m m ；金黄色葡萄球菌为5 m g m l ，最大抑菌圈直径为2 2 5 m m ；而对酵母无抑制作用。其抑菌效果为：大 肠杆菌 枯草芽孢杆菌 金黄色葡萄球菌 酵母，实验表明1 0 h d a 对常见细菌 有较好的抑制作用。 最后本论文又以大肠杆菌为模板，膜非渗透性荧光染料p i 作为探针，用流式 细胞仪法进一步探讨了1 0 h d a 的抑菌机理。其结果为；在1 0 一h d a 作用于大肠 杆菌2 h 后，其细胞内的p i 荧光强度随着1 0 h d a 浓度的增加而不断的增大，并 且呈现一定的线性关系。因此可以据此推断：1 0 h d a 作用大肠杆菌后，细胞膜 的完整性遭到破坏，其渗透性增强，导致胞内重要生命物质流失，最终致使细胞 死亡。 流式细胞仪是一种先进的高科技精密仪器，具有简便、快速、灵敏，结果客 观、准确等优点，如果将其形成一套成熟的科学方法应用到常规的微生物实验中， 必将会引起传统的微生物实验发生革命性的变化。 关键词：1 0 羟基2 癸烯酸( 1 0 h d a ) ；提取；抑菌作用；最低抑菌浓度( m i c ) ； 流式细胞仪；抑菌机理 i v 山东轻t 业学院硕l 学位论文 一 二一 a b s t r a c t 10 ，h y d r o x y 2 d e c e n o i ca c i d ( 10 h d a ) ，t h ec h e m i c a lp r o p e r t yo fi t i ss t a b l e i ti sa n i m p o r t a n tu n s a t u r a t e df a t t ya c i do fr o y a lj e l l ya n d i t sc o n t e n ti s5 0 o ft o t a lf a t t ya c i d a n d1 4 2 o o fr o y a lj e l l y i te x i s t so n l yi nr o y a lj e l l yi nt h en a t u r e ，s oi ti sc a l l e d q u e e na c i do rr o y a lj e l l ya c i d i th a sm a n yp h y s i c a la c t i v i t i e s ：i tc a n t o n eu po u rb o d y a n d c a ns t r o n g l yi n h i b i tl y m p h o m a ，b r e a s tc a n c e ra n do t h e rc a n c e rc e l l s ；i tc a ne n h a n c e t h ei m m u n ef u n c t i o na n dc a nc u r ea c u t er a d i a t i o ni n j u r ya n dt h ed a m a g ec a u s e db y c h e m i c a ls u b s t a n c e s i nt h i sp a p e r ，w ed i s c u s s e dt h et e c h n i c a lf l o wo fe x t r a c t i o no f 10 h d af r o mr o y a lj e l l y t h e n ，w ed e t e r m i n e dt h ea n t i m i c r o b i a le f f e c to f10 一h d ab y d r u gs e n s i t i v i t yt e s ta n d f l o wc y t o m e t r yt e s tw i t he x t r a c t e dm a t e r i a l s a tl a s t ，w em a d ea p r e l i m i n a r yd e d u c t i o na b o u ta n t i b a c t e r i a lm e c h a n i s mo f10 一h d a i nt h i sp a p e r , w eu s e dt w ok i n d so fo r g a n i cs o l v e n t sa n da d j u s t e dt w i c ep h t oe x t r a c t 10 h d af r o mr o y a lj e l l y t h eb e s tc o n d i t i o n sa b o u tt h ee x t r a c t i o no f10 一h d af r o mt h e r o y a lj e l l yw a s ：f i r s ta d j u s t e dt h ep ho f t h es o l u t i o nt o10 ，t h e na d d e d5 0 m la e t h e rt o p i c k o u tt h ef a t s o l u b l ei m p u r i t yw h i c hc a nd i s s o l v ei na e t h e r , a n dt h e na d j u s t e dt h e p ht o2a n da d d e d5 0 m la e t h e rt o e x t r a c t10 - h d af r o mt h es o l u t i o n ，a n dt h e n r e c o v e r e da e t h e rf r o mt h el i q u i dw i t hr o t a r ye v a p o r a t o r ，a d d e d10 m le t h a n o lt o d i s s o l v et h ee x t r a c t i o n ，a n df i l t r a t e dt h ee x t r a c t i o n ，t h e nr e c o v e r e de t h a n o lw i t hr o t a r y e v a p o r a t o ru n d e rl o w p r e s s u r e ，f i n a l l yw ec a no b t a i nt h ec r u d ep r o d u c t so f10 一h d a t h e nw ew ed e t e r m i n e dt h ea n t i m i c r o b i a le f f e c to f10 - h d at ot h r e eb a c t e r i a sa n d t w o y e a s t sb yb a c t e r i o s t a t i cc i r c l em e t h o da n do x f o r d c u pt e s tw i t he x t r a c t e dp r o d u c t s ，a n d w ea l s od e t e r m i n e dt h em i co f10 h d ab yd o u b l ed i l u t i o nm e t h o d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h ea n t i m i c r o b i a le f f e c to f10 一h d av a r i e dw i t ht h ep a t h o g e n e t i ca n i c r o b e s t h ea n t i m i c r o b i a lm i n i m u md o s a g eo f10 h d aw e r ea sf o l l o w s ：e s c h e r i c h i ac o l i1 2 5 m g m l ，t h eb i g g e s td i a m e t e ro ff i l t e rp a p e r i n h i b i t i o nz o n ew a s2 7 3 m m ；b a c i h u s s u b t i l i s2 5 m g m l 1 ，t h eb i g g e s td i a m e t e ro ff i l t e rp a p e r - i n h i b i t i o nz o n ew a s2 4 4 r a m ； s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s5m g m l ，t h eb i g g e s td i a m e t e ro ff i l t e rp a p e r - i n h i b i t i o nz o n e w a s2 2 5 m m ；b u ti tw a sn o n e f f e c t i v et ot h ey e a s t s t h ea n t i m i c r o b i a le f f e c t so f 10 h d aw e r ea sf o l l o w s ：e s c h e r i c h i ac o l i b a c i l l u ss u b t i l i s s t a p h y l o c o c c u s a u r e u s y e a s t t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e 10 - h d ac o u l de f f e c t i v e l yi n h i b i tt h e g r o w t ho fb a c t e r i u m f i n a l l yw eu s e df l o wc y t o m e t r ym e t h o d f l u o r e s c e n c ed y ep ia sap r o b ea n de c o l ia s w h i c hu s e dt h en o n p e r m e a b l em e m b r a n e at e m p l a t et of u r t h e re x p l o r et h e v a b s t r a c t i n h i b i t o r ym e c h a n i s mo f10 一h d ai n t h i sp a p e r t h er e s u l tw a sa sf o l l o w ：a f t e r 10 - h d ar e a c t e do ne c o l ic e l l st w oh o u r s ，t h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fp ii nt h ec e l l s w a si n c r e a s e dw i t h10 - h d ac o n c e n t r a t i o ni n c r e a s i n g ，a n dt h e r ew a sac e r t a i nl i n e a r r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h e m s oa c c o r d i n gt h i s ，w ec o u l di n f e rt h a t ：w h e n 10 - h d a r e a c t e do ne c o l ic e l l s ，t h ec e l lm e m b r a n ei n t e g r i t yh a db e e nd a m a g e da n di t s p e r m e a b i l i t yh a db e e ne n h a n c e d ，w h i c hl e a dt o t h ei m p o r t a n ti n t r a c e l l u l a rm a t e r i a l s f l o wo u tf r o mc e l la n df i n a l l yc a u s e dc e l lt od i e f l o wc y t o m e t r yi sa na d v a n c e dh i g h t e c hp r e c i s i o ni n s t r u m e n t ，i th a sl o t so f a d v a n t a g e s ：s i m p l e ，r a p i d ，s e n s i t i v ea n dt h er e s u l ti so b j e c t i v e ，a c c u r a t ea n d s oo n i f w ef o r mam a t u r es c i e n t i f i cm e t h o da n da p p l yi tt oc o n v e n t i o n a lm i c r o b i o l o g i c a l e x p e r i m e n t s ，i t w i l ll e a dt oar e v o l u t i o n a r yc h a n g eo ft h et r a d i t i o n a lm i c r o b i a l e x p e r i m e n t s k e yw o r d s ：10 h y d r o x y - - 2 - d e c e n o i ca c i d ( 10 h d a ) ；e x t r a c t ；a n t i m i c r o b i a la c t i o n ； m i c ( m i n i m u mi n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ) ；f l o wc y t o m e t e r ( f c m ) ；m e c h a n i s m o f a n t i m i c r o b i a la c t i v i t y v i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名： 日期： 主1 8 年生月二l 日 日期： 立竺基年立月0 乙日 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 1 1 引言 蜂王浆( r o y a lj e l l y ) 简称王浆，又名蜂乳，是从工蜂头部营养腺分泌出来 的一种乳白色或淡黄色( 取决于所含花粉色素种类) 、略带甜、酸、涩味的半透明 浆液，带辛辣，略甜。在水和乙醇中部分溶解，在氯仿中不溶。遇光热、空气或 置室温中均易变质并产生强烈臭气。p h 值3 5 4 5 ，酸价3 6 3 4 6 0 。蜂王浆的化 学成分极为复杂，新鲜蜂王浆中含水6 5 6 8 、蛋白质1 1 1 4 、脂类6 、碳水化 合物1 4 1 7 、灰分1 、未确定物质3 。蜂王浆中有机酸主要是脂肪酸，至少 含有2 6 种游离脂肪酸：壬酸、癸酸、亚油酸等多种重要酸类物质，其中有一种特 殊有机酸，称为1 0 羟基2 癸烯酸，简称癸烯酸( 1 0 h d a ) ，它在天然食物中只 能在蜂王浆内发现，因此又称王浆酸或蜂王酸，是蜂王浆的主要活性成分之一， 也是一种非常稳定的物质，该成分的量占总脂肪酸的一半以上，是蜂王浆中含量 最高的脂肪酸，在鲜蜂王浆中的含量约1 4 2 0 t 1 1 ，蜂王浆能促进淋巴细胞抗 体的产生及具有对淋巴细胞增殖促进因子的促进效果：能提高机体的非特异性免 疫机能；并且还与特异性免疫功能和抗癌活性有关；对动物机体的血糖具有一定 的调节作用，它能降低正常动物的血糖，也能降低四氧嘧啶引发糖尿病动物的高 血糖和代谢性高血糖；使各种内分泌旺盛、促进食欲、增强体力、防衰老、安神、 抗菌、抗癌、抗辐射等多种生理活性作用【2 - 3 】。其中大部分的生理活性功能都与其 功能因子1 0 h d a 有关。 1 21 0 h d a 的性质简介 1 2 1 研究进展及来源 1 0 一羟基一2 一癸烯酸是由德国科学家d j 朗格( 1 9 2 1 ) 首次在工蜂上颚腺中发现 的，日本学者佐藤道夫也以大量数据证实，1 0 h d a 主要分泌于工蜂的上颚腺， 刚出房的工蜂上颚腺中1 0 h d a 含量极微，随着日龄的增加，含量有增加的趋势， 1 5 - 2 0 日龄哺育蜂的上颚腺中含量最高，2 0 日龄以后开始有降低的趋势，1 0 h d a 含量的增加与青年哺育蜂分泌蜂王浆有关，在蜂群大繁殖期含量极高，而外勤蜂 上颚腺中的1 0 h d a 含量则极低。b a t e n d t 首先报导从王浆中分离出1 0 h d a ，至 今还未在自然界其他物质中发现此化合物，所以1 0 h d a 通常又被称为王浆酸【4 1 。 随后，人类对10 h d a 的研究工作有了新进展，t o w n s e n d 和c c l u c a s 对蜂王浆 成分进行了研究，并认识到蜂王浆乙醚提取液中大部分为一种无光学活性的有机 酸，化学式c 1 0 h 1 8 0 3 ，并详细报告了有关王浆酸，即1 0 h d a 的元素组成，首次 提出了王浆酸m o l w t = 1 8 6 、c 6 4 4 5 、h 9 6 8 、m p = 5 8 。c ，这一结论后来又 被a b b o t 和f r e n c h 所证实。h r e m b o l d 对1 0 h d a 的研究，于1 9 5 7 年取得突破 * i 章镕* 性进展，他们利用红外光谱法发现了王浆酸中的羟基和不饱和双键的位置，从而 确定王浆酸的结构式。进入7 0 年代特别是8 0 年代以来，随着高压液相、气相、 质谱、核磁等先进仪器的问世和使用，对1 0 - h d a 的结构、性质有了更进一步的 了解，确定其结构为( e ) 一1 0 - 羟基。癸烯酸。 12 2 结构 1 0 一羟基之- 癸烯酸( 1 0 - h y d r o x y 2 - d e c e n o i ca c i d , 1 0 - h d a ) ，分子量1 8 62 5 ，其 分子式是：h o c h 2 ( c h 2 ) 6 - c h = c h c o o h ( c h8 0 3 ) 。结构为： h o 、八八弋c o o h k 弋。矿姆 哪溘， 蠡 网1 1 1 0 - h d a 结构式 f i g li t h es t r u c t u r a l f o r t t l u l a o f l 0 - h d a 12 3 物理化学性质 常温时为白色晶体，性质稳定，在室温或高温下长时间存放时，结构不会被 破坏或完全消失。熔点6 4 ，溶于甲醇、乙醇、乙醚、和氯仿，微溶于丙酮，不 溶于水，对石蕊试纸显酸性，能使溴水迅速退色，也能使高锰酸钾溶液迅速退色， 对三氯化铁不显紫色是一种天然的不饱和脂肪酸，1 9 8 1 年同本琦玉养蜂株式会 社技术部通过实验证明，蜂王浆在1 3 0 0 c 加温6 0 m i n ，1 0 一h d a 几乎全部存在，其 残存率神，9 66 ，说明1 0 - h d a 在高温环境中相当稳定，并且可以比较容易地从 蜂王浆中将其分离出来，也可进行人工合成。 131 0 一h d a 的的生理活性 1 0 - h d a 有多种生理活性：它具有强壮机体和强烈抑制淋巴癌、乳腺癌等多 种癌细胞的作用5 卅；能增强机体免疫功能【7 】= 防治脱发吼可用作化妆品的增效 荆；还用作治疗急性辐射损伤 9 1 和化学物质所致损伤i j 。 13 1 增强免疫功能 1 0 - h d a n f 调节t 淋巴细胞参与免疫反应，增强免疫力，井能恢复因多种因素 所致的免疫功能低下，从而能为人体增强免疫力起积极和促进作用。谢卓丘等【】” 在1 9 9 0 年研究发现1 0 - h d a 可抗拒环磷酰胺对小鼠皮肤迟发性超敏反应的抑制，并 山东轻工业学院硕十学位论文 可促进环磷酰胺所致免疫功能，抑制小鼠的溶血素形成，且1 0 h d a 对免疫抑n 4 , 鼠的细胞免疫功能和体液免疫功能的影响是一致的。此外，1 0 h d a 亦可提高免疫 抑n 4 , 鼠的炭粒廓清速率，说明在一定程度上1 0 h d a 可增强免疫抑制小鼠单核巨 噬细胞的功能。此研究结果表明，1 0 一h d a 仅能增强免疫抑制小鼠的免疫功能，而 对正常小鼠的免疫功能无明显影响，表明它可能是一种免疫调节剂。 1 - 3 2 抗癌、抗肿瘤作用 我国戴静芝等于1 9 8 5 年经过实验也表明，1 0 h d a 抑制肿瘤细胞生长的作用 明显，并能促进吞噬细胞的吞噬功能i l2 1 。黄强等经动物实验研究，结果提示 1 0 h d a 有明显的抗肿瘤作用，并可提高骨髓增殖能力【1 弘1 4 j 。如预先将l m l 腹水 癌细胞悬浮液与l m l1 0 - h d a 混合后再给小鼠接种，则可使小鼠得到完全保护， 无一发生肿瘤；但两者剂量减少时，只能延长移植肿瘤小鼠的生存时间，而不能 使其免于死亡。证明1 0 h d a 为高生物活性物质，可通过刺激环状腺磷甘的合成， 使蛋白质螺旋结构和氨基酸序列正常化，从而使受肿瘤破坏的结构正常化，因而 对癌细胞有抑制作用，可延长患癌动物的生存期【l5 。此外，1 0 h d a 是0 【不饱和 脂肪酸，它的酸化特性对肿瘤也可起到缓冲作用。 1 3 - 3 抗辐射作用 1 0 - h d a 抗急性辐射损伤的实验是用三组小白鼠，分为预防组、治疗组和对 照组，分别在照射前服用1 0 h d a ，照射后服用1 0 h d a 及不服1 0 h d a ，三组饲 养条件相同，用钴6 0 的y 射线对小鼠作全身一次性照射，观察小鼠3 0 天存活情 况。结果发现，预防组可提高存活率4 4 5 ，治疗组可提高3 3 4 ，并都延长死 亡小鼠的平均寿命。分析受照射小鼠肝、脾、肾的含氮量表明，小鼠受照后r n a 和d n a 的含量明显降低，而服用1 0 h d a 后，上述各重要物质含量明显提高。 由此可知，1 0 h d a 能保护和恢复生命的核心物质一内脏罩的蛋白质、核糖核酸 和脱氧核糖核酸，并对机体组织的含氮量、r n a 和d n a 有保护和恢复的作用， 所以它能对急性辐射损伤起防治作用，从而使照射动物的死亡率降低。 1 3 4 抑制脂肪合成、降脂作用 k i t a h a r a a ( 1 9 9 5 ) 研究发现王浆中的羟基酸对皮脂腺脂肪合成的抑制作用。 1 0 - h d a 已被证明具有抑制脂肪合成的作用，在这个研究中，他们还检测了王浆中 的其他脂质对脂肪合成的影响，发现一系列的羟基酸l l l 0 h d a 能更有效抑制标记 乙酸结合到仓鼠耳朵皮脂腺。而且，当局部用到雄性仓鼠耳朵，1 0 一羟基2 癸烯酸 和1 1 羟基十一烯酸抑制皮脂腺脂肪生成。此外，许东掣怕】等通过喂养高脂食物建 立高脂血动物模型，测定1 0 h d a 对高脂血动物预防给药及治疗给药的作用，结果： 1 0 一h d a 具有明显降低实验性高脂血症鼠血液中甘油三酯( t g ) 、总胆固醇( t c ) 、总 脂蛋白含量，同时升高高密度脂蛋i 兰i ( h d l ) 含量，说明1 0 h d a 对高脂血症具有良 好的治疗作用，它是蜂王浆治疗高脂血症中的功能因子。 第1 章绪论 1 3 5 其它功能 此外，1 0 h d a 它能升高白细胞的含量【1 。7 】及降低血浆中甘油三酯，提高游离 脂肪酸含量【l8 1 。1 0 h d a 与百里醌或者含有百里醌的植物产物结合用来治疗艾滋 病和其它的免疫缺乏疾病药物已经被发明【1 9 1 。遗传毒理学和药理学研究结果表 明，1 0 一h d a 能促进骨髓细胞分裂，促进入体外周血淋巴细胞脱氧核糖核酸合成， 促进被p h a 激活的淋巴细胞的转化作用，增强免疫力。1 0 h d a 还能广泛应用于 发酵食品与发酵饮料中，增加营养保健功能。 1 41 0 - h d a 的制备 目前国内1 0 h d a 的生产方法主要有提取法、化学合成法。 1 4 1 物理提取法 提取法主要是通过有机溶剂根据相似相溶的原理从蜂王浆及废渣中提取 1 0 一h d a ，目前主要有乙醇提取法、乙醚提取法等。 ( 1 ) 先将蜂王浆用乙醚萃取，再用稀碳酸氢钠反萃取，用盐酸调p h 值至2 ， 置冰浴中沉析，然后滤出结晶，洗涤、干燥得白色晶体，再用稀乙醇重结晶，得 白色晶体【2 0 1 。 ( 2 ) 从蜂王浆渣中提取蜂王酸是将蜂王浆渣用水溶解，用乙醚萃取，然后取 乙醚层浓缩至干，即得粗产品，再用稀甲醇重结晶，得无色针状结副2 1 1 。 ( 3 ) 将蜂王浆渣加入9 5 乙醇中，振荡，萃取1 2 h ，抽滤，所得滤液按1 ： 3 体积加入蒸馏水反萃取，放入冰箱4 6 h ，过滤得滤饼( 1 0 h d a 结晶) ，风干 2 4 h ，真空干燥得产品瞄j 。 但是随着提取，萃取技术的不断进步，蜂王浆中提取1 0 h d a 的技术有了较 大的发展，一些新的萃取技术被采用。例如，日本专利报道了以高压( 4 0 m p a ) c 0 2 为萃取剂，低级脂肪醇或低级脂肪烃为共沸剂，从蜂王浆中提取1 0 h d a 的 方法。而在另一篇专利文献中，提出了以水溶性有机溶剂为萃取剂，所获得的 1 0 一h d a 用乙醚重结晶，其纯度可达8 2 ，回收率达6 3 以上。提取法制备 1 0 一h d a ，投资少，设备要求简单，操作简单、方便。 1 4 2 化学合成法 化学合成法是从简单易得的原料出发，经一步或多步化学反应合成1 0 h d a ， 成本较低，适宜于大规模生产，而且产品的纯度会更高，质量更易于保证。有关 1 0 一h d a 的合成路线，文献有很多报道，经报道的合成路线不下十多种：如格氏试 剂法，w i t t i n g h o m e r 鼢l j 法、臭氧化法、溴化法、k n o e v e n a g e l 缩合法等【2 3 。2 5 1 。 格氏试剂法：用格氏试剂增长碳链是合成蜂王酸的常用方法，主要是以己二 醇为原料，5 ( 四氢2 呋喃) 氧 戊基氯作成格氏试剂，使b 乙烯基p 内酯开环， 经酸处理，加碱使双键移位，可得到1 0 h d a 2 6 j 。 k n o e v e n a g e l 缩合法：该方法是以辛二酸为基本原料，先用氢化铝锂将其还原 4 山东轻工业学院硕士学位论文 成1 ，1 ，8 辛二醇，再在a 9 2 c 0 3 硅藻土催化下，将l ，l ，8 辛二醇选择性氧化成8 一羟基辛 基醛，与乙酐酰化后，再与丙二酸缩合。最后将缩合产物水解，即得1 0 h d a 。 但从实用观点来看，许多路线一般工艺流程较长，且收率低，由于合成条件 苛刻，工业生产的实用价值不大。其中比较有价值的是缩合法。 此外，国内外还有蓖麻油法制取1 0 - h d a 。用蓖麻油为原料合成王浆酸，有多 种工艺：可以先将蓖麻油热裂生成l o 羟基癸酸，再经酰化，溴化，消除h b r 生成 双键等步骤合成1 0 h d a ；也可以蓖麻油为基本原料来合成1 0 h d a ，即先用蓖麻 油制成1 0 一乙酰氧基癸酸，再由后者合成。目前最有前途的工艺是将蓖麻油先进行 裂化生成十一烯酸，再有后者合成1 0 - h d a 。用蓖麻油为原料合成王浆酸是蓖麻油 最为重要的深加工产品，可使人工合成方法向前推进，无疑符合未来的发展方向。 但要进行工业化生产的话，实验条件及步骤还需改进。 1 4 3 微生物法 近几年来国内外不断采用的微生物生产目的脂肪酸，关于l o 羟基一2 癸烯酸微 生物菌株的选育在国内也有报道，但技术仍不是很成熟，其中我校的王腾飞老师 就通过不同的诱变手段初步筛选出产1 0 h d a 的高产菌株，但产脂肪酸的性能并不 稳定，需进一步完善【2 7j 。另外我们应在通过对菌株代谢途径的研究，发现新的代 谢途径，以及控制代谢的关键酶和关键基因片断，通过基因手段改造菌种产 l o h d a 的能力。 1 51 0 h d a 的测定方法 迄今为止已经建立了很多种测定1 0 h d a 的方法，包括薄层扫描法、气相色谱 法、高效液相色谱法、分光光度法、酸度转换法、毛细管等速电泳法、红外光谱 法和气相色谱质谱联用法【2 髓9 1 。上述测定方法在实际应用中各有优缺点，刘放等 人曾先后对其中的一些方法进行了分析和比较【3 0 1 。随着色谱技术和其他相关技术 的发展，原来的测定方法不断被改进和优化，如分光光度法、色谱法等，同时许 多新方法相继被提出，如酶联免疫吸附法、g c m s 法等。 1 5 1 分光光度法 包括紫外分光光度法、薄层层析一紫外分光光度法、聚酰胺薄膜层析分光光度 法、二阶导数分光光度法、红外分光光度法。对该方法研究最多的是样品前处理 的改进及最佳波长的选定。赵静报道的三波长紫外光谱法通过消除干扰因素，使 传统紫外光谱法导致测定结果偏高的问题得到了改善【3 l 】。近年来出现的许多新的 分光光度法【3 2 1 ，如示差分光光度法和一阶导数分光光度法，样品无需事先分离就 能消除共有组分的干扰，测定快速简便，是应用较广的分析方法之一【3 3 1 。 1 5 ，2 色谱法 包括薄层色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、胶束电动毛细管色谱法。 几种色谱测定法中，气相色谱法须进行硅烷化或甲酯化处理，操作较为繁琐，具 第l 章绪论 体分析条件见表1 1 。薄层色谱法易受试验环境等多种因素的影响，方法重现性差， 故以高效液相色谱法较为理想【3 4 1 。由于它具有操作较简便、省时，结果灵敏、准 确等优点，所以仍然是目前王浆酸定量分析中研究最多且有着广泛应用前景的测 定方法，其定量方法有外标法和内标法，操作条件见表1 2 。色谱法的研究重点是 供试样品的准备、色谱条件的优化、流动相及固定相的选择。值得一提的是刘满 仓等人用自行合成的乙烯基交联氨基键合固定相建立了不经分离、只需稀释就可 进样定量分析蜂王浆中1 0 h d a 的高效液相色谱方法，使10 h d a 的测定变得更 加准确而简便【3 5 】。孙保国等建立的胶束电动毛细管色谱法用内标法定量测定 1 0 h d a ，不但快速简便，而且消除了其它脂肪酸的干扰，检测成本也比h p l c 法低很多【3 6 】。 表1 1 采用g c 法测定1 0 h d a 的分析条件【3 7 】 t a b l e1 1t h ea n a l y t i c a lc o n d i t i o no fd e t e r m i n i n g10 - h d ai nr o y a lj e l l ya n dp r e p a r a t i o nb yg a s c h r o m o t o g r a p h y 载气温度- ， 色谱柱固定液 n 2h 2 a i r进检 检测 内标物 m x m m相体 m lm l k 柱样测 器寸日7 伞 吩| 分食 口 器 2 1 x 3 棕榈酸 h e x a d e c a n o i c1 6 x 3 a c i d 棕榈酸 1 6 x 3 2 h e x a d e c a n o i c 5 x e 6 0 c h r o m o s o r b w a w ( 8 0 1 0 0 ) 1 5 r 一4 0 0 1 5 o v 2 2 5 c h r o m o s o r b w a w ( 6 0 8 0 ) 3 s e 一3 0 眵二4 w d m c s ( 6 0 8 0 ) 3 s e - 3 0 w a w 2 5 1 7 02 5 0 2 5 0 f i d 4 00 60 51 9 52 6 02 5 0f i d 5 00 70 51 8 52 5 0f i d 4 01 6 02 5 0 f i d 6 酸 | ；| d烷甜撕懒等 卜一 山东轻工业学院硕i j 学位论文 a c i d d m c s ( 6 0 8 0 ) 棕榈酸 12 x 0 23 s e 一3 0 h e x a d e c a n o i c 2102 6 02 6 0f i d 2 a c i d 癸酸 1 2 x 0 2 n d e c e n o i c 3 s e 一3 0 1 82 8 0 2 4 0 3 0 0 f i d 2 a c i d 3 s e 3 0 棕榈酸 w a w h e x a d e c a n o i c2 x 3 d m c s a c i d ( 6 0 - 8 0 ) 10 s i l i c o n e g e s e 3 0 1 6 x 3 2c h r o m o s o r b w a w 4 05 0l1 9 02 5 0 5 02 0 0 2 6 0f i d ( 6 0 8 0 ) 2 o v 1 7 癸二酸 c h r o m o s o r b 1 5 x 4 4 52 8 03 0 0f i d s e b a c i ca c i dw a w ( 6 0 8 0 ) 表1 2 采用h p l c 法测定1 0 h d a 的定量方法和分析条件 t a b l e1 2t h eq u a n t i t a t i v em e t h o d sa n da n a l y t i c a lc o n d i t i o no fd e t e r m i n i n g10 h d ai nr o y a lj e l l y a n dp r e p a r a t i o nb yh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 7 第1 章绪论 1 5 3 酶联免疫吸附法( e l i s a ) 免疫学检测技术是7 0 年代发展起来的新技术，潘荣生等人将其引用到1 0 h d a 的检测中，主要原理是将1 0 h d a 结构中一端原有的羧基通过化学修饰的方式加以 保护，将另一端的羟基与琥珀酸酐反应，连接一个带有羟基的“桥”，用混合酸酐法 将1 0 h d a 与载体蛋白偶联，制备得到1 0 - h d a ，人工合成免疫原。抑制试验显示 其检测范围在7 8 1 2 2 5 0 1 a g g 之间。对照试验表明，用该法检测的结果与液相色谱法 的符合率为9 1 以上【3 8 】。e l i s a 的应用，为检测机构和基层单位提供了一个简便、 快速、准确的l o h d a 测定法。 1 5 4 气相色谱质谱联用法( g c m s ) 该方法选用d b 1 7 石英毛细管柱，采用色谱柱程序升温，利用毛细管不分流进 样及其溶剂效应技术，并应用气相色谱质谱选择离子测定方式来进行测定。在试 验过程中，首先用1 0 h d a 标准溶液通过全扫描方式做出总离子流图，然后根据其 质谱图中的碎片离子针对各种样品进行选择离子测定方式的选择试验，最后确定 8 山东轻t 业学院硕士学位论文 7 3 、8 6 、1 2 4 a m u 碎片离子作为定量的特征目标监测离子。应用气相色谱质谱选择 离子测定方式具有灵敏度高、选择性好和抗干扰的特点。通过全扫描方式做出总 离子流图，然后根据其质谱图中的碎片离子针对各种样品进行选择离子测定方式 的选择试验，最后确定7 3 、8 6 、1 2 4 a m u 碎片离子作为定量的特征目标监测离子【3 9 。 应用气相色谱质谱选择离子测定方式具有灵敏度高、选择性好和抗干扰的特点。 1 6 立题的背景及研究的目的意义 本课题研究的目的在于通过从蜂王浆中提取出的1 0 h d a ，并着重研究 1 0 h d a 对实验室常见的微生物的抑制作用，再用流式细胞仪法进一步探索研究 1 0 一h d a 的抑菌作用机理。 开展本课题的研究，具有理论和现实意义。随着科技的不断进步，生活水平 的不断提高，人们越来越重视蜂王浆的保健作用，对1 0 h d a 的研究也不断的深入， 目前国内有部分厂家开始着手研发富含1 0 h d a 的保健品了，但是对1 0 h d a 的理 论研究还比较肤浅。到目前为止，有关1 0 h d a 对微生物的抑制作用的详细研究至 今未见报道，因此本论文初步研究1 0 h d a 对实验室常见的微生物的抑制作用，为 进一步探索1 0 h d a 应用于食品、药品提供参考，积累一些经验。同时为多途径丌 发利用蜂王浆提供新的思路。 1 7 论文的主要研究内容和任务 论文主要研究内容是探讨从蜂王浆中提取1 0 h d a 的最佳提取条件；研究 10 一h d a 对实验室常见的微生物抑制作用；用流式细胞仪进一步探索10 h d a 的抑 菌作用；初步探索1 0 h d a 的抑菌作用机理。 9 第l 章绪论 1 8 论文的基本设计路线 1 0 h d a 有机萃取条件的优化 蜂王浆溶液碱性条件的确定( p hi ) 蜂王浆中杂质萃取乙醚加入量的确定( 乙醚i ) 蜂于浆溶液酸性条件的确定( p hi i ) 萃取1 0 一h d a 的乙醚加入晕的确定( 乙醚i i ) 提取条件的正交实验 、l j ， 流式细胞仪法研究1 0 h d a 的抑i 探索流式细胞仪检测微生物的最佳条件 流式法检测1 0 h d a 的抑菌作用 图1 2 论文基本没计路线 f i g u r e 1 2t h eb a s i cd e s i g np r o g r e s so ft h e s i s 1 0 山东轻t 业学院硕十学位论文 第2 章常规法检测10 - h d a 白, 0 抗菌作用 2 1 蜂王浆中提取1 0 h d a 的研究 从前面的介绍我们已经知道1 0 h d a 具有多种生理活性，尤其是具有抗癌功 能，是一种天然的绿色保健品，因此1 0 h d a 的获取必将引起各个厂家的重视。目 前制备1 0 h d a 的生产方法主要有提取法 4 0 l 、化学合成法【4 1 1 。但是目前化学合成法 许多路线一般工艺流程较长，且收率低，合成条件苛刻，实验室的实用价值不大。 而物理提取法设备要求简单，操作条件容易，省时省力，得率较高，提取效果好， 具有不可比拟的优势，因此在实验室规模主要采用了二次有机溶剂萃取，两次调 p h 值的方法来提取蜂王浆中的1 0 h d a ，并为下一步的研究提供原料。 2 1 1 有机萃取1 0 h d a 的基本原理及提取路线 ( 1 ) 萃取基本原理 有机萃取是利用化合物在两种互不相溶( 或微溶) 的溶剂中溶解度或分配系 数的不同，使化合物从一种溶剂内转移到另外一种溶剂中，即利用适当的萃取剂 和萃取方法从原料中把有效成分分离出来的过程。1 0 h d a 是一种单不饱和脂肪 酸，在p i l l 0 左右的溶液中以盐的形式存在，因此萃取前首先调蜂王浆水溶液