（生物化学与分子生物学专业论文）转基因小鼠乳腺表达具有抗菌活性重组溶菌酶的研究.pdf

转基凼巾惑巍羧表这具有抗薅活性重缀灌藏酶的骥究 i l l l l l l l l 中文摘要 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) 又称胞蹙质酶( m u r a m i d a s e ) 是天然非特异性免疫物质，具有强力杀 菌作用。广泛分布人和动物多种组织、分泌物以及某些植物和微生物中。人张中溶菌酶禽量约 1 琵m g l m | ，眈牛、绵苇和由羊乳含量离幽1 5 0 0 4 0 0 0 倍，而入乳中溶菌酶破坏和溶解细菌的 能力约为牛乳的3 0 0 倍，是人乳中的重要抗菌因予。乳中的溶茁酶可破坏大多数革兰氏阳性菌 秘少鬣弱性菡静缨蕤壁，窍利于婴j l 瑟遵羹三常萄群酶建立帮掇离抗病能力。旌赘对奶制晶需求静 增加，奶制品韵品质也越来越受到人们的关注。利用乳腺生物反应器的方法改造奶牛、奶山羊， 使生产出豹奶成分近似予人奶，既煮营券的功能，又毒药耀的功能。这静爨霹鼓使孩予长褥毫 大，促进大脑和神经发宵，增强免疫功能，这种新型保健品一定会有广阔的前途。以小鼠为动 物模型进行乳腺特异袭达外源溶蓠酶的研究具有重大的应髑徐值。 为了获得乳腺高散袭达人溶蓊酶的小鼠模型，我们构避互些曼：! l y 翌些c 一- s i g h l y 曼母不 嗄坚篓警酶基瓣毒警煮尊e 葶4 用鬟徽注警寥孽i 篓警堡蔓塑尘堕錾堕蓬l 鱼整茎塑：戥 p b c h l y 溶菌酶表达载体包食溶萤酶基因的编鹑枣刭( 会溶菌酶信每蕊) 、b e t a c a s e i n 癌动 子、终l r 子及其部分不编码的外显子和内食子。经转基因小鼠的制备，共获得8 3 只小鼠，用 l c _ r ：蠼s o u g e m 参交的方法检测出6 只为转基因阳性小鼠，包括4 只母鼠和2 只公鼠。转基嚣 孽挂攀约为7 2 翌。经p c r 检测，每一个f o u n d e r l i n e 的f i 代都可以检测到转溶菌酶基因阳性 小鼠a 经w e 堪g m b l o t t i n g 检测在3 存活转基因刚性母鼠的乳汁中，可以检测剥重组人溶菌酶 貔表达。箍韭黑莲蓬瓣垒藕潘蘩酶表遮量达到0 2m g 细l ，3 4 号的袭这量为o 1 2r a g m ! 4 1 号潭赢检测至重组溶菌酶的表达。经溶菌安验检测，6 号转基因小鼠的酶活性为4 8 0 u m l 、3 4 号：3 0 1 u m l 、4 1 号：3 7 + 9 $ u t m l ，焉阴蛙夺鬣豹酶淫蛙戈：2 5 ，9 8 u m l ，a 豹梵：1 2 2 4 u m l 。与 阴性小鼠相比，转基因小鼠乳清的溶菌酶褥性有非常明显提黼，其中6 号小鼠摄高了1 8 倍，3 4 号提离了1 1 馈，但4 1 母几乎没肖提高。缀对重组溶菠酶比瓣力的计募，重缝溶萤酶其蠢霹大 溶菌酶相似的比活力。 辩予p b c - s i g h l y 袭这载俸采 莽，与p b c - h l y 载体相晓，p b c - s i g h l y 的不嗣之处在于用牛 b e t a - c a s e i n 信号肽d n a 序列替代了溶菌酶本身的信号肽d n a 序列。采用同样的方法获得6 3 型：鳖! 茎董璺塑篓尘整盈，鲤墨受藏彝上且公藏：翼鲢垫盏，三垒罄。经w e s t e m 翻磊i n g 检测，在3 星鏊基因阳蜓母鬣钓氍汁中，可以检测到重组人溶菌酶的表达。其中6 1 和6 3 号的 重墼冬溶菌醪煮述量筮剥罄到? m g m 1 襄穰；一i 运蕊k 蕊1 2 譬没有检测到重缓溶菠酶蛇表达。 与p b c w h l y 载体转基因小鼠的最好表达量0 2m g m l 相比，6 1 号的表达量比其提高2 0 倍。经 溶茁实验检测，转基因小鼠6 1 号的酶活性为2 1 6 0 u m i 、6 3 母：9 4 8 u m l 、1 2 母：3 0 u m l ，阴 性小裁麓酶浓度为：2 5 g g u m l ，入的为：1 2 2 4 u m | 。与翰毪小鼠相比，6 1 号转基冈小鼠乳清 的溶茁酶活性提高了8 3 倍r 6 3 号提高了3 6 倍，但1 2 号儿乎没有提高。与人乳清相比。6 1 号乳游的漆凿酶涯性挺燕了近1 謦，6 3 号瞧矮近了入羲渍豹溶蓬酶活性，约为0 8 话。 综合以上结果可以得到以下结论： 1 、 由b e t a c a s e i n 启动予指导的人溶菌酶基因表达载体p b c - h l y 和p b c - s i g h l y 能够 在转蒸因，j 、鼠g l 腺中崧效表达篓缝a 溶藏酶。势燕这弛表这受位置效应瓣影嚷。 2 、 原代转基因小鼠能将外源基因传递给后代：而且，外源基因的遗传符合孟德尔遗 传规律。 3 、 溶薅实验维粜表甏重缓天溶蓠辩其有写入溶蓥酶蠲骰静玺物学话瞧。 4 、 与潞萤酶本赛信号默褶魄，牛b e t a - c a s e i n 售号默霹鞋增强整缀溶萤懿的毋泌佟翅 从 i f j i 提高重编溶菌酶的表达效率。 5 、 重缀溶菌酶的表达水平依赖子外源基因的拷贝数，呈正相关。 关键词：港蓥酶、转基因，l 、鬃、溶壤撵霆、装；茨生戆反盎嚣 h t r a n s g e n i c m i c e e x p r e s s i n g r e c o m b i n a n t l y s o z y m e w i t h a n t i b a c t e r i a la c t i v i t yi nm a m m a r yg l a n d a b s t r a c t h s o z y m e , a l s oc a l l e dm u r a m i d a s e , t s a ua n t i b a c t e r i a lf a c t o rf o ri n n a t ei m m u n i t y 1 te x i s t s 扭 m a n y t i s s u e sa n dm u c u sf o rh u m a na n da n i m a l ，a sw e i la sp l a n ta n dm i c r o o r g a n i s m 1 nh u m a nm i l k ， l y s o z y m ei so n e o ft h em o s ti m p o r t a n ta n t i b a e t e r i a lf a c t o r s ，a n di 拓c o n c e n t r a t i o ni sa b o u t0 5m g m l ， w h i c hi s1 5 0 0 - 4 0 0 0t i m e si nh t m l a n 毯垂燃t h a ni nb o v i a e 、s h e e pa n dg o a t , a n di t sa n t i b a c t e r i 鑫l a c t i v i t yi s3 0 0 t i m e sh i g h e rt h a nt h a to f b o v i n e m o s tg r a m - p o s i t i v ea n daf e wg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a a r ek i l l e d b yl y s o z y m ef o rh u m a nm i l k w h i c h i s h e l p f u l f o ri n f a n t st oi f l c r e a s ei ob e n e f i e i a l m i c r o o r g a n i s ma n d ；nr e s i s t a n c eo nd i s e a s e 。w l hi n e a 辩i nm i l kc o n s u m 辨i o n s ，t h eq u a l i t yo f m i l k i sm o r ec o n c e r n e d i ti s t h r o u g hm a m m a r yg l a n db i o r e a c t o rt h a tm i l ko fb o v i n ea n ds h e e pm a y b e c o m es i m i l a rt oh u m a nm i l k w h i c hh a sn u t r i t i o n a la n dm e d i c a lf u n o t i o n 。t h er e c o n s t r u c t i v em i l ki s 8 p r o m i s i n gp r o d u c t ，w h i e hp r o m o t e s c h i l d r e ng r o w t ha n dd e v e l o p m e n to f n e r v e s y s t e ma n db r a i na n d i m m u n i t ya b i l i t y t oa c h i e v et h i st h i sg o a l ，w ee s t a b l i s ht r a n s g e n i cm o u s em o d e lw h i c hs p e c i f i c a l l y e x p r e s s e sr e c o m b i n a n th u m a nl y s o z y m emm a m m a r yg l a n d ， i no r d e rt oe s t a b l i s ht h em o u s em o d e l ，t w od i f f e r e n tl y s o z y m e e x p r e s s i o nv e c t o r s , p b c - h l y a n d p b c - s i g h l y , w e r ec o n s t r u c t e d t r a n s g e n i em i c ew e a - eg e n e r a t e db ym i c r o i n j e c t i o no f f e r t i l i z e do o c y t e w i t ht w oc o n s t r u c t s p b c - h l ye x p r e s s i o nv e c t o r sc o m p o s e do f a p r o m o t e r , t e r m i n a t i o n 聆g i o l l e x o na n di n t r o no f b e t a - c a s e i n ，a n dt h el y s o z y m ee n c o d i n gr e g i o n ，e i g h t y - t h r e em i c ew o r eg a i n e db ym i c r o i n j e e t i o n , a n d 6 p o s i t i v et r a n s g a n i cm i c ew e 瑶i d e n t i f i e db yp c r a n dc x m f i r r a e db ys o u t h e m b l o t t i n ga n a l y s i so f t a i l d n a t h ei n t e g r a t i o nr a t ei s7 2 。f im i c ef o re v e r yf o u n d e rl i n ew e r ea l g od e l e t e db yp c r a n dt h e p o s i t i v et r a n s g e n i cm i c ew e r ef o a n d 。r e c o m b i n a n th u m a nl y s o z y m ew a si d e n t i f i e di i tt h em i l ko f f e m a l ep o s i t b c et r a n s g e n i cm i c eb yw e s t e r nb l o t t i n g ，a c c o r d i n g 韬t h eh y b r i d i z a t i o ns i g n a l ；tw a s e s t i m a t e dt h a tt h ec o n c e n t r a t i o no fr e c o m b i n a n tl y s o z y m ef 研n 0 ，6t r a n s g e n i cm o u s ei s0 + 2m g m 1 t h a to f n o 。3 4 i s 0 1 2 m g m l ，b u t n o 4 li s l i t t t e 。o u rr o s e i t ss h o w t h e w h e y o f n o 6 m o l l i ee x h i b i t s i t s s t r o n g e ra n t i m i c r o b l a la c t i v i t yt h a nt h a to f 碡悼l i t t e r m a t e s w h i c hl y s o z y m ea c t i v i t yi s4 8 0 u m l ；t h e l y s o z y m ea c t i v i t yo f n o 3 4t r a n s g e n i cm i c ei s3 0 1 u m t 。w h i l et h el y s o z y m ea e t i v i t yo fw t l i t f o r m a t e a n dh u m a ni s2 5 ，9 9 u l m ta n d1 2 2 4 u t m l r e s p e c t i v e 驻t h el y s o z y m ea e t i v 蹲n i n e 6a n d3 4t r a n s g e n i e m i c ei s18a n dl t i m e sh i g h e rt h a nt h a to f 、wi i n e r m a t er e s p e c t i v e l y , t h es p e c i f i c a c t i v f t y o f r e c o m b i n a n tl y s o z y m ei ss i m i l a rt ot h a to fh u m a n t h ed a t as h o wt h a tt h el y s o z y m ea c t i v i t yo ft h e w h e yi ss i g n i f i c a n t l ye n h a n c e d i np b c - h l y r a n s g e n i cm i c e a tt h es a m et i m e ，p b c - s i g h l vl y s o z y m ee x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e db a s e do n p b c - h l y 确eu n i q u ed i f i e r e i c eb e t w e e nt h e mi st h a ts i g n a i p e p t i d ed n af r a g m e n to fb e v i n eb e t a + c a s e i n s u b s t i t u t e sf o rt h a to f l y s o z y m e j np b c - s i g h l y e x p r e s s i o nv e c t o r f i v eo f 6 3m i c ea r ep o s i t i v ea n dt h e i n t e g r a t i o nr o t e i s7 9 r e c o m b i n a n th u m a n t y s o z y m ew a sa 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i m i c r o b i a la c t i v i t y , w h i c hi ss i m i l a rt oh u m a n l y s o z y m e 4 t h es i g n a l p e p t i d eo fb o v i n eb e t a - c a s e i nc a ne n h a n c et h es e c r e t i o no fr e c o m b i n a n tl y s o z y m e ， c o m p a r e d t ot h e s i g n a lp e p t i d eo fl y s o z y m e 5 一t h ee x p r e s s i o nl e v e lo f r e c o m b i n a n t l y s o z y m ei sd e p e n d e n t o nt h e c o p i e so f t r a n s g e n e ，w h i c hi st h e p o s i t i v ec o r r e l a t i o n k e yw o r d s ：l y s o z y m e ，t r a n s g c n i cm i c e ，a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y ，m a m m a r yg l a n db i o r e a c t o r 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：时间：年 月日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名 导师签名： 时间：年月日 时间：年月f 1 。，。彗茎詈尘量! ! 星童薹量至圣呈鋈堡差塑鎏呈璧箜翌圣 p g u l a m d b d b s a c d n a d n t p d n a d t t e b e d l a l i p t g k a n k b k d a r n g m l n g o r f p c r r n a 九) m s d s s d s p a g e t e m e d 1 y i s o d x g a i 缩略表 m i c r o g r a m m i c r o l i t r e a m p i e i l l i n b a s ep a i r b o v i n es e r u ma l b u m i n c o m p l e m e n t a r yd n a d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d i t h i o t h r e i t o i e t h i d i u mb r o m i d e e t h y l e n ed i n i t r i l o t e t r a c e t i ca c i d l i t r e i s o p r o p y l t h i o p - o - g a l a c t o p y r a n o s i d e k a n a m y c i n k i l ob a s ep a i r k i l od a l t o n m i l l i g r a m m i l l i l i t r e n a n o g r a m o p e nr e a d i n gf l a m e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i b o n u c l e i ca c i d r o u n d sp e rm i n u t e s o d i u m d o d e c y ls u l f a t e s d s p o l y - a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s n ，n ，n , n - t e t r am e t h y l e t h y l e n ed i a m i n e t r i h y t d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e o p t i c a ld e n s i t y 5 - b r o m d - 4 c h l o r o - 3 一i n d o l y l - b d g a l a c t o s i d e 3 4 溶菌酶转基因小鼠研究技术路线图 墼雀坠鳖塑丝型坠塑塑些筌坠一 第一章文献综述 引言 目前，动物转基因研究涉及的领域非常广阔，研究的内容也日新月异。其基本特征是就是改 变动物的遗传组成，而改变动物遗传组成的目的是极其多样化的，与动物生产关系比较密切的是 赋予转基因动物新的表型特征。制作转基因动物的方法主要有原核期胚胎的显微注射，逆转录病 毒载体感染发育早期的动物胚胎精子载体法，e s 细胞技术及p g c s 技术等。随着动物克隆技术 的发展，转基因技术也得到了革命性的发展。利用克隆进行转基因，一旦核移植成功，从理论上 讲，转基因成功率为1 0 0 。利用克隆进行转基因时，转基因动物的性别会被提前决定。这样的 话，如果想得到能在乳腺中表达蛋白质，就可以使克隆的转基因动物全是雌性动物。动物乳腺生 物反应器是一种利用动物转基因技术在乳腺细胞中表达多肽药物、工业酶、疫苗和抗体等蛋白的 技术。这样，转基因克隆动物就成为了“制药工厂”，为医用蛋白和蛋白保健品的开发和生产开 辟了广阔的应1 e l = i 前景。 “杯奶强健一个民族”，随着生活水平的提高，人民对奶制品需求越来越大。目前中国已 进入到了奶制品需求快速增长期，近年来人均消费增长率每年都超过1 0 。至2 0 1 5 年，中国奶 产品消费总量将达到2 5 0 0 万吨，年均增长6 8 ，高于世界同期1 到2 的增长速度。同时，应 该看到中国奶产品的生产还处在一个比较落后的水平。目前中国人年均消费奶制品只有8 公斤。 而世界奶制品消费平均水平为1 0 0 公斤，欧洲为3 1 9 公斤。在农业总产值中，中国奶业产值只占 3 而发达国家的农业总产值中，奶业产值平均超过2 0 英国更是达到4 0 。那么随着对奶 制品需求的增加，奶制品的品质也越来越受到人们的关注。利用乳腺生物反应器的方法改造奶牛、 奶山羊，使生产出的奶成分近似于人奶，既有营养的功能，又有药用的功能，这种奶可以使孩子长得 高大，促进大脑和神经发育，增强免疫功能，这种新型保健品一定会有广阏的前途。溶菌酶是存在于 乳汁中天然非特异性免疫因子，具有广谱的抗菌消炎和提高免疫力作用。人乳中的溶苗酶含量是 牛乳中的3 0 0 0 倍而人乳中溶菌酶破坏和溶解细菌的能力约为牛乳的3 0 0 倍，是人乳中的重要抗菌 因子。并且t 不同的溶菌酶具有不同的抗菌谱。不同来源的溶菌酶，其溶菌酶各不相同。鸡蛋清 溶菌酶只对革兰氏阳性菌有溶菌作用。在这些溶菌酶中，人体中的溶菌酶活性最高，其次是鸡蛋 白中的溶苗酶t 最低的是牛乳中的溶菌酶。因此，提高畜奶的溶菌酶含量具有重要意义。通过基 因重组技术来表选溶菌酶的研究一直被人们所关注。1 9 8 6 年，j i g a m i 等a y f 始用酵母作为实验体 系来表达溶菌酶，但是重组的溶茵酶并不具有抗菌活性。1 9 9 4 年，m a g a 等人开始用小鼠作为实 验来表达溶苗酶，这种溶菌酶具有生物活性。近年来，人们利用植物作为实验体系表达出具有生 物活性的溶菌酶。这些研究为我们进一步利用乳腺生物反应器来提高乳汁中溶菌酶的含最打f 了 坚实的技术基础。基于此，本章主要包括三部分：转基因动物的研究进展、乳腺生物反应器和牛 奶人乳化、溶菌酶的研究进展。 5 每譬表热太学鞲圭擘谯论文 毒寰! 皇詈曼鼍寰糟曼量鼍寡罡感冀! 皇皇舅舅i 种i i i i i i 一i i i i i i , i 蝌鼍曼曼 第一帮势转基嚣动物酶戮究透麓 转蒸溺动耱姘究是a 裘接着爨磊鹩意爨脊露豹、青计翔、肖根据、霄预觅璁茂变动物的遗传 组成，而改变其遗传组成的目的是多种多样的。比如避传学家希望通过改变动物的遗传组成来观 察其表受变凭，囊壤学家霹耀避过憋究基嚣靛衷这寒酸究该蓉麓对撬蒋童理凝嚣靛彩嫡，与动秘 生产有关的转基因研究则希耀通过转基因技术来赋予动物新的袋型性状。该项研究在实验技术上 锻赖分子嫩物学、幼携薤撩鹈配子操捧技本。罐无疑瓣，这燕一鞭稷喜糖竣性翁掰究，爨拳懿是 该项研究在其闯磷搿的十多年里，缀过世界各蹰献身予该领域的科学家们不懈的努力，其辉煌前 墩已初嚣端倪+ 甚黧可以说转基因动物造福人类的时代鼹烃至米了n i e m a n n2 0 0 0 。潮建忠2 0 0 0 ) 。 一、转纂因动物的制l 擘方法 转基因动物的锚4 作方法鼹蓠主要睿原竣期题照静基徽注射，逆转录瘸毒感染发甯早麓翡砖褥 簸黔，猜予载诲法，e s 编施技术，p s 技术，体细胞梭移植技术，逆转漾病毒载体感染m i 期 的卵母细胞。精子汰与d n a 台并注射卵母细胞法。这些方法上的改进与提赢大大地促进了转基霹 动耪矮究盘实验室岛生产实践转筵鹃进程。 i 、摄援期骚黪瓣显徽注辩 该方、撩由美国入g o r d o n 发明，魑目前应用比较广涎、效粜b b 较稳窟的制作转藏因动物的方 法之一( g o r d o n1 9 8 0 ) 。g o r d o n 将s v 4 0 鲍复铡摄点帮窟动子与瘢疹病毒蛉程基霹撬天缨蓥矮鹱 p 摊3 2 2 ，然后将之注入受藕小鬣胚船嗣原棱，并将经蕊糨注射籀的胚胎植入假孕母鼠韵输卵管。 之厢对出生的小鼠朋s o u t h e r n 印迹杂交法检测箕基因组中是否禽商注射基鼹的同源片段。礁瘩生 静7 8 灵枣簸孛，箕中两只被诀为是转基因鬻撼+ 由于蒙转韵羧涮，g o r d o n 当时辨来得到活的转 熬园小鼠，但这一伟大的尝试确证了外源基因w 以通过遮种方法撼合到宿盎基因组巾，从而为殴 蘑懿硪究工箨蚤辟了一条崭新瓣途径。缝g o r d o n 攒遴了显覆注嘉争法产生转基霆小虢乏螽。p a l m i t e r 1 9 8 2 年的报道在生命科学领域中引起了一场不小的轰动。p a l m i t e r 将5 调控区缺失厝的大鼠生长 激素基因等小赋金麟硫蛋是i 基嚣窟韵予摆连接，然爨将融台羹瓣注天受耱枣簸的壤愿棱，生出 2 1 只小鼠，其中7 鼠为转藻阁襁性鼠。在阳性鼠中，2 号鼠在生厢7 4 天时，体重达到同窝非转 攀因小鼠平均体重的1 8 7 倍，这便是装名的“巨型小靛”枣 孛( p a l r a i t e r , t 9 8 2 ) ) ，h a m m e r 等聪 勰该方法藏臻建翻终了转基辩兔、端| 棼和猪( h a m m e r ，1 9 8 5 ) 。上述三起研究被认为怒动物转纂冈 研究历程上的里穰 i 嗜! 。值得提的是大家畜原拨期的胚胎胞浆中禽有大量纳泡状颗粒，影响其透 龙程，不囊撵箨。为了器确越楚鼗往癸在曼徽演封之蓊对艇黔经避离心处壤 t 5 0 0 0 r p m ，3 r a i n + ) 使原核暴瓣，而试验动物如小鼠、纨则基本不存在这问题。此外，反热动物胚坩龠发育同步性 篱，经超撵处理蜃袋撂蟾部分疑黪不楚娃 疆棱戆黪强骆。 喜 图1 1 通过显微注射制备转基因小鼠 f i g1 1g e n e r a t i o no f t r a n s g e n i cm i c eb ym i c r o i n j e c ：f i o n 2 、逆转录病毒载体感染发育早期的动物胚胎 j a e n i s c h 以鼠莫氏白血病毒感染附植前的小鼠胚胎( 4 8 细胞) 得到整合外源基因小鼠， 并用回交方法证明这种整合外源基因的小鼠其外源基因的遗传遵循孟德尔规律的报道较g o r d o n 的报道早4 年( j a e n i s c h ，1 9 7 6 ) 。当时的研究表明，宿主动物每一细胞整合外源基因的拷贝数为1 ， 整合位点是两个可能的整合位点中的一个。之后，s a l t e r 等用禽白血病病毒感染早期的鸡胚胎制 作了转基因鸡( s a l t e r , 1 9 8 7 ) ，h a s k e l l 等应用该方法制作了转基因牛( h a s k e l l ，1 9 9 5 ) 。以逆转录 病毒为载体导入外源基因时，外源基因多属单拷贝整合，这一点有别于上述显微注射法和下面将 阐述的精子载体法。 3 、精子载体法 早在1 9 7 1 年b r a c k e t ( 刘红林，1 9 9 7 ) 及其合作者就开始了精子介导外源d n a 转移的先驱工作： 将精子暴露于纯化的s v 4 0d n a ( h 3 标记腺嘌呤) 中后，在精子的头部检测到放射性物质。其结 果表明异源d n a 可以进入哺乳动物精子，而且精子能将外源d n a 携入卵母细胞。1 8 年后l a v i 缸 a n o 等将小鼠精于与环状或线性化的p s v 2 c l t 质粒在等渗的缓冲液中孵育1 5 m i n ，之后用于小鼠卵子 7 中雹农业大学蹲擘位论立 的体外受精，受精卵在2 细胞时移入受体鼠的输卵管( l a v i t r a n o ，1 9 8 9 ) 。在受体鼠产生的2 5 0 只 小鼠中商3 0 9 5 鹣个体为转基因赠毽转基弼不设可以遗传绘焘代，蔼鼠后代尾组织和飘肉组织 c a t 基因的表达水平十分可观。但随后很多实验室无 去重复出l a v i t r a n o 的报道结果。 r o t t m a n 对此法进行了改进，其改进方法是：首先将外源dna 与精质体相互作爝形成脂质俸 一dna 复台体，此复合体比较容翁和精子细胞膜融台，从而进入细胞内。对1 2 日龄鹏胚用 s o u t h e r n 印迹杂交法检测发现转基因阳性率为2 6 ，最理想的一次阳性辜高达9 2 。实验还显 示在这神情况下孙源d n a 并来整合避宿主基阂组，面鼹以辩翔体的形式存在于染色体之外。我们 认为精予可以介导外源基因在宿主基因组中的整合，但真正的整合阳性率不见褥会高于前面介 绍过弱两种方法。 4 、 胚艚干细胞( es ) 介导法胚骀干继胞是从早鞘憝船的内细胞函经体外培葬建立的多潜能缓 胞系。体外培养时保持未分化状态，可以传代增殖。外源dna 可以通过多种方法转移到胚胎干 细胞内。实现外源基因的转穆和表达。 簿这种方法售l 伟转基因小鬣的阳性率接近1 0 0 ，经过耐心细致的选择，极商可能得别稳定 遗传的动物新品系。但遗憾是截止目前世界范围内只脊小鼠胚胎干细胞的建系方法比较成熟，而 大家整千细胞系麴建立方法良蓠逐远不够或熟。 5 、p g c s 技术 脊稚动物的原始生殖细胞( p r i m o r d i a lg e r mc e l l s ，p g c s ) 起源于性腺以外的组织，而后在胚 胎发育的早期迁移到性腺组织。八十年代中期寄研究者就发现两牺类动物 蟾蜍x e n o p u sl a e v i s ) 的p g c s 在个体发育旱期酏分化并不是不可逆的( w r l i e 。1 9 8 5 ) ，此外有研究表明上皮细胞的基 膜( b a s e m e n tm e m b r a n e s ，b m ) 对p g c s 的迁移具有重要作用( j a n e t ，1 9 8 5 ) 。p g c s 赍导的转基 因技术在原理秘方法上与s 细戆较术相纭，应用p 6 c s 技术在翻作转基困家禽方面有明显的优势。 b r i n s t e r 等尝试了在公畜个体之间转移精原细胞的可行性。研究者将z f l a c z 系供体小鼠的d g c s 植入c 5 7 b l 6 x s t l 杂交一代小鼠蛉魏精缨篱，之矗靛研究结蒙表明经移植后鹩p c , c s 能够发育成 典有受精能力的精子细胞，并产生了后代( b r i n s t e r ，1 9 9 4 ) 。n a i t o 等应用此方法制作了转基 阂鸡( n a i t o ，1 9 9 4 ) 。 大家畜p 6 c s 可否象小鼠e s 细胞那样抑制分化并增殖到目前还不能得出确切结论，如粜能， 这将为动物转基因带来一场不小的革瓤。这项技术结合基因定位整合技术极有可能在较短的时闫 内得黧转基因家畜纯最系。 6 、 遥过体细赡竣移植接木翩作转基因动物 随着兜隆技术的发展，基因操作技术与觉隆技术相结合是目前最主要的特点。目前，取得 的主要进耀是转基围技术稚靶位操作技术在克建动媲土的应鼹。首先，稻甩克窿进行转莲弱是指 在孩移植前先把目的基因和标记基因的融合基因导入培养的体细胞，再通过标记蒸因的表现来 筛选转基闭的刚性细胞及其克隆，然艨再移植。1 9 9 7 年英国p p l 公司的科学家s c h n e k e 与罗 斯转綦舞究所舱w i l m u t 等联手通过俸细胞筷移植技术率先在世界上制作了转基丽绵羊( s c h n i e k e ， t 9 9 7 ) 。利片j 胎儿成纾维细胞系，经过转染之后，再克隆。被转染的外源基因含有人的凝血阁子 s 茎兰里尘堡垒塞耋釜量查茎彗塑兰茎堡薹耋童堡塑窒圣。，。，一 基因的完整编码区和b - b l g 基因启动子，凝血因子能被高效表达，每毫升奶中包含1 2 5 g 的凝血因子蛋白。1 9 9 8 年，携带外源基因的克隆牛再次诞生，其被转染的基因是p c m v ，b g e t 3 基因( c i b e i l i ，1 9 9 8 ) 。利用克隆进行转基因比原核注射的方法有着更多的优点。利用原核注射的 转基因技术相对简单，只需将裸露的d n a 注入受精卵，但是，其有着效率低和随机整合的缺陷n a l e x a n d e r 等通过体细胞核移植技术获得了三只转人抗胰蛋白酶( h a t ) 基因的奶山羊( a l e x a n d e r ， 1 9 9 9 ) 。据统计。利用原核注射的方法，培育1 个转基因动物，需要5 1 4 个动物，而利用克隆转 基因的方法只需2 0 8 个。利用克隆进行转基因，一旦核移植成功，从理论上讲，转基因成功率 为1 0 0 。原核注射的方法会使大量的非转基因胚胎被怀孕，这是一种资源浪费，而利用克隆进 行转基因技术不会造成代理母亲去怀孕非转基因动物。此外，利用克隆进行转基因时，转基因动 物的性别会被提前决定。这样的话，如果想得到能在乳腺中表达蛋白质，就可以使克隆的转基因 动物全是雌性动物。 然而，更重要的是基因靶位操作技术与克隆技术的结合。基因靶位操作技术通过外源d n a 与 染色体d n a 间的同源重组，定点修饰、改造基因组特定位点的技术( 汪亚平，2 0 0 0 ) 。该技术在 小鼠实验体系己被广泛应用，主要因为小鼠体内存在具有全能性的胚胎干细胞。然而，在大牲畜 体内，至今还没有发现胚胎干细胞，所以基因靶位操作技术在大牲畜身上的应用一直没有实现 ( s u r a o k a r ，2 0 0 0 ) 。利用克隆技术与基因靶位技术的结合恰好可以弥补了大牲畜没有胚胎干细胞 这缺陷。2 0 0 0 年，n a t u r e 杂志发表了基因打靶克隆羊( m c g r e a t h ，2 0 0 0 ) 的消息。m c c r e a t h 等首先在成纤维细胞进行基因靶位操作，他们选择了c o l l a l ( 原胶原) 基因位点作为被打靶的内 源序列，因为原胶原蛋自在成纤维细胞被高水平地表达。打靶的d n a 序列是在c o l i a i 基因内部 插入n e o 盒和人a 卜抗胰蛋白酶基因。n e o 盒能表达一种能容许细胞在g 4 1 8 上生长的物质。经过 同源重组后。再进行体细胞克隆，从而获得了基因打靶克隆羊。该羊能在乳腺内高效表达人的t l 卜抗胰蛋白酶。这样，人a 卜抗胰蛋白酶基因就被定点整合到c o l l a l 基因的位置。转基因技术 根本无法解决的问题是外源基因的髓机整合。外源基因不太可能恰好整合到一个理想的位置