（食品科学与工程专业论文）固定化乳酸乳球菌生产绿豆淀粉的初步研究.pdf

摘要 绿豆淀耪瓣传绕生产方法是二合浆法，本实验谶过包埋孚l 酸孥0 球菌来改善绿豆淀粉的生 产方法。分别选用海藻酸铺、琼自耱和壳耀糖作为包耀材料，以他们沉淀淀粉的效果、凝胶 材料的使用寿命和材料的价格为标准来衡量三种凝胶，实验中发现海藻酸钠凝胶优于其它的 掰种凝驳。将不同浓度的海藻黢镳凝胶( 2 。3 ，4 和5 ) 用来包堙霉l 酸乳球菌沉淀 淀粉，实验中发现4 浓度的海藻酸铺凝胶颗粒，对承分和其它的营养物质避入凝胶内部都 没有限制，沉淀淀粉的遽度最快，淀粉得最平均值也高于其它的凝胶。当包埋的乳酸乳球菌 为1 0 5 c f u m l 时，凝胶颗粒的泄漏蓠数离子其它鹾种浓度( 1 0 7 署鞋l 妒c f u m 1 ) ，淀粉沉淀 的效果也好予其它两静浓度。在工厂安酥应用中得撒每毫舟豆浆的最佳凝获鬏粒用量为0 1 4 g 和淀粉沉淀6h 后可以得到最大的淀粉麓。凝胶连续使用4 次淀粉产量没有麓别。两种方 法得到的淀粉在水分、脂肪、酸度、糊化时间、透光率、沉降性和直支链淀粉的含量上都霄 显著的差异。凝胶淀耪露备的耪丝表_ 藉魄较粗糙，内部空隙大。掰戳粉丝的多 观不如二台鼗 法，但是与= 合浆法相比较，可以减少5 0 的用水量、使绿豆淀粉的生产实现自动化和减 少对环境的污染。 蓑键字：淀粉，海藻酸钠，包埋，粉照 i i a b s t r a c t t h et r a d i t i o n a lp r o d u c t i o no fm u n g b e a ns t a r c hu s e ds o u rl i q u i d ，i ne x p e r i m e n tw ei m p r o v e d t h ep r o d u c t i o no f m u n g b e a ns t a r c hb yt h ee n t r a p m e n to f l a c t o c o c c u s a tl a b ，w ec h o s e da l g i m a t e ， a g a r o s ea n dc h i t o s a na st h em a t e r i a lo fe n t r a p m e n t ，a n dt h ee f f e c to f s t a r c hs e d i m e n t a t i o n ，t h el i f e a n dt h ep r i c eo f g e l sw e d et h es t a n d a r d so f e v a l u a t i n gt h eg e l s w ef o u n da l g i n a t ew a sb e t t e rt h a n t h eo t h e r s t h e nw eu s e dd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fa l g i n a t e s ( 2 ，3 ，4 a n d5 ) t oe n t r a p l a c t o c o c c u s a sar e s u l t 4 a l 【g i m a t eh a dn oe f f e c to nt h ed i f l u s i o no f w a t e ra n dn u t r i t i o ni n t ot h e i n s i d eo f g e l s ，t h ev e l o c i 咄o fs t a r c hs e d i m e n t a t i o n a n d t h ey i e l d o f s t a r c h w e r e t h e b e s ta m o n g t h e g e l s w h e nt h ep o p u l a t i o no fc e l l sw h i c hw e l ee n t r a p p e di nt h eg e l sw a s1 0 6c f u m l ，t h ec e l l s l e a k e d f i o m t h e g e l s w a s h i g h e r t h a n t h eo t h e r s ( 1 07 a n d l 0 c f u 枷) t h ey i e l d o f s t a r c h w a sa l s o h i g h e rt h a nt h eo t h e r s t h e nt h i sm e t h o dw a sa p p l i e di nt h ef a c t o r y , w ef o u n dt h eb e s tn u m b e ro f g e l sw a so 1 4 咖lm u l l g b e a nm i l ka n dt h eb e s ts e d i m e n t a t i o nt i m ew a s6h t h eg e l sm a yb e c o n t i n u o u s l yu s e d4t i m e sw i t l ln od i f f e r e n c eo nt h ey i e t do fs t a r c h b u tt h ec o n t e n to fw a t e r , f a t a c i d i t y , b r a n c hs t a r c ha n dt h et i m eo f d e x t r i n ，t h e 乜a n s p a r e n c e so f t h et w os t a r c hw h i c hp r o d u c e d b yt h ed i f f e r e n tm e t h o dw e r ed i s t i n c t i v e ，t h es u r f a c eo f n o o d l ew h i c hp r o d u c e db ys t a r c hf r o mg e l s w a sc o a r s e ，a n dt h ei n t e r s p a c ew a sb i g g e r , s ot h eo u t s i d ef a c eo f n o o d l ew a sn o tb e t t e rt h a nt h e n o o d l e sw h i c hp r o d u c e db ys t a r c hf r o ms o u l l i q u i d a to t h e rh a n d ，t h ep r o d u c eo fs t a r c hb yg e t s c o u l dr e d u c e5 0 q u a n t i t yo fw a t e r , m a k et h ep r o d u c t i o no fs t a r c ha u t o m a t o u sa n dr e d u c et h e p o l l u t i o no f e n v i f o n m e n t k e yw o r d ：s t a r c h ，a l g i n a t e ，e n t r a p m e n t ，n o o d l e s i i i 独创性声明 本人声明所里交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成聚。尽我所知，豫了文孛特到期以标往j 隧致 蓦l 的地方外，论文中不毽含其 | 垒 人已经发表或撰写避的研究成聚，也不包台为获得中国农娥大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确兹说明并表示了谢意。 研究生签名： ? 之奶 时间： 2 彬年多月知日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保露遴交论文的笈印 譬和磁盘，允许论文被套阂窝借阗，可以采用影印、缩印或 扫糖等复澍手段保存、汇编学位论文。弱意中国农韭大学可以用不丽方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的仝部或部分内容。 ( 保密的学使论文在解密露残遵守此协议) 研究生签名：趁吸叁罄时间：占年易月功日 导师签名： 多亿蓐时间：k 印6 年6 月加日 1 1 引言 第一章绪论 我国生产绿豆淀粉方法主要势：二合浆法、水癌法帮机械法。相h ：较而言二台浆法的淀 粉得率和质量都比其它的方法好，我们通过研究二合浆法沉淀淀粉了解到，二合浆法主要是 依靠二合浆中的g l 酸巍球藏起作用。 微生物细胞固定化是指将细胞圈定在载体上井在一定的空间范围内进行生命活动p - 固定化细胞能进行正常的生长，繁殖和新陈代谢，所以又称为固定化活细胞或固定化增值细 胞。擞生秘细鼹，植物纲飘和动物细胞都可以谁成围定纯细胞a 遥过对绿豆的电镜扫描可以看到淀粉颗粒之间是通过蛋白结合在一起的。乳酸乳球菌可 以将太的蛋白质分解成小的多肽从而加速淀粉颗粒之间的凝聚。另外乳酸乳球菌的代谢产物 酶翻凝集紊也对淀粉的沉降起翳辕魏作嗣。坦燕其钵静枫理到现在还建没有骧确。 1 2 立题的依据 1 9 1 6 年n e l s o n 和g r i f f i n 发现蔗糖酶吸附在骨炭微粒仍保持与游离酶同样的活性，目前 豳定化主要以此为开端。 微生物纲稳固定住鼹在上世纪7 0 年代发麓起来的，圈定纯徽生物纲胞工业皮翔起源予 1 9 7 3 年日本的千烟一郎簿利用聚丙烯酰胺包埋具有高活性大肠杆菌生产天门冬氨酸。 现在提取淀粉的方法，主要有枫槭分离法、撬板槽法及= 台浆法三擎 。大的淀粉厂一般 都袋莠l 机械势离法，少数也有采用流板横的。徽粉丝对淀耪德状有特殊要求，工厂至今仍采 用= 合浆法生产淀粉口】。通过对二二含浆法沉淀淀粉的机理研究中可以得出乳酸乳球菌对淀粉 的淡淀起主要的作用。1 9 7 4 年j e 寒大学生物化学系二台浆研究小组第一次提出了蘸体是沉 淀淀耪的主要原因【3 】。刘文菊猁通过研究二合浆褥出在沉淀淀粉的律鞠因素中乳酸乳球菌 p h 乳酸乳球菌产生的酶系。所以本试验通过固定化乳酸乳球菌来生产淀粉1 4 。改进工厂 中生产淀粉的： 艺，提瓣生产绿豆淀粉静效率，减少污承撵蔽量等。 1 2 1 微生物固定化的优点 通过对微生物细胞的嘲定纯，帮辨有很多箍蔫的优点。 ( 1 ) 同定化微生物细胞保持了细胞的完整结构和天然状态，稳定性好。 ( 2 )固定饨微生物细胞保持了缨腮内原有的酶系，辅酶体系和代澍谗控系统，可默按照 源柬的我 囊 途径进行耨陈代谢，并进行有效的代潇调节控制。 ( 3 ) 发酵稳定性好，可以反复使用或者连续使用较长的一段时间。例如，用海藻酸钙凝 胶包埋法制玺的黑曲霉缨胞，用于生产糖化酶弼姨连续使用一个胃。 ( 4 ) 固定能微生物细胞密度提高，可以提商产率。如海藻酸钙凝胶潮定纯黑曲簿细胞生 l 产糖化酶，产率提高3 0 班上。用中空纤维固定化大肠杆菌生产酰胺酶，产率提高2 0 倍一 ( 5 ) 提高工程菌质粒的稳定性。 1 2 2 翻前徽生物细胞固定纯的应用主要集中在以下几个方耍 1 2 2 。1 利用微生物生产各释产辘 固定化微生物细胞能进行正常的生长，繁殖和新陈代谢，所以利用固定化细胞可以如同 游离细胞那样发酵生产各种代谢物。由于微生物固定化后，受载体影响，故固定化微生物只 能用于生产各种能够分泌到细胞外的产物。其中主要荫下面儿类物质。 ( 1 )涌糖滔类：固定纯酵母等微生物可用于生产溺耩，啤滔，蜂蜜溪，麓德滔，米滔 等。有的已完成中试，这列工照钯生产鲦要求。 ( 2 )氮基酸：闽定优氨蒸酸生产菌可弭j 予生产谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，瓜氢酸，色 氨酸，异亮氨酸等氨基酸。 ( 3 )有机酸：固定化黑曲霹的微生物可生产苹果酸，柠檬酸，葡萄糖酸。衣康酸，乳 酸，醋酸镣有机酸。 ( 4 )酶和辕酶：固定纯微生物可用于生产淀粉酶，穗 艺酶，蛋白酶，鬃胶酶，纤维素 酶，溶镶酶，磷酸二酪酶，天冬虢跤酶等照， 酶，以及辘酶a ，n a d ，n a d p ，a t p 等辕酶。 ( 5 )抗生素：固定化微生物在生产青霉素，四环素，头孢霉素，杆菌肽，氨苄青霉素， 头孢力新等抗生素方面的研究，成果显著。 ( 6 )阎定化微生物细胞还可以用于废水处理。以及有机溶剂，维生索，化工产品等的 生产。 l 。2 2 2 。鞠定亿微生秘缨穗涮造徽生秘传感器 微生物传感器是由固定化微生物细胞于各种内能鬟 转抉器( 电极，燃料电池，场效应管 等) 密切结合而成的传感装鬣。 微生物传感器可分为呼吸活性测定性和电极活性测定型两种。前者是利用固定在高分子 膜上的微生糖细胞的呼吸馋梢，测定戴气戆消耗秘= 氯化碳的生成，从藤确定被测定物质的 量，这种呼吸活性测定型转戆嚣露瑚定他皴生凌麟帮辍电授或二氧纯骧电辍缝含两盛。电掇 活性测定性的微生物传感器楚稠用溺定在簇上的微生稳细艟的新陈代谢作翔，测定电援活性 物质的= l 葭畿化，从而确定样品中欲测定物质的含量，这种传感器有同定化微生物膜与生物燃 料电池，离子选择电极和气体电极等组成。 微生物传感器己成功地j j i 于测定可发酵性糖，葡萄糖，甲酸，乙酸，甲醛，乙醇，头孢 霉素，谷氨酸，硝酸盐，生他器甄蟹，细胞数量等。 1 2 3 溜寇亿微生物在餐肉姊瓣舆体应用 微生物细胞固定化在国内外多用于废水处理例如朱文芳，李伟光等利用吸附法将具有 降解甲醇的微生物固定在活性炭上，组成固定化微生物反应器m 。w a n gj i n l o n g ，q i a ny i 利 _ ! l 角叉蘩黢和壳聚糖固定化微生物降解含有氯酚浆存枫废永【6 l 。武淑文，黄兵用圈定化微生 2 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 物处理二氧化硫气体【7 】。t a k a k om u r a k a n a i - n i t t a 用海藻酸钠固定化h y p h o m i c r o b i u m d e n i t r i f i c a n s 处理二甲基亚砜，固定化的微生物在4 的能连续使用2 4 0h 而游离细胞只能 用2 4h 并且固定化细胞和游离细胞的效率几乎一样h j 。j o s h uc h a n g 等用海藻酸钠、角叉菜 胶和聚丙烯酰胺包埋p s e u d o m o n a sl u t e o l a 处理含氮染料的废水，虽然处理效率在静l t 的条 件下不如游离细胞，但是在含高浓度染料和剧烈搅拌的条件下的处理效果都比游离细胞好。 重复4 次循环的时候固定化细胞还能保持7 0 8 0 的活性，而游离细胞只有5 5 的 活性【9 】。g o u r im u k e r j e e d h a r 等用海藻酸钠固定化r h o d o c o c c u so p a c u s 处理含有多氯化苯的 废水，发现在效率相当的情况下，固定化细胞对多氯化苯的适应浓度提高了i l q 。一些发 酵物的生产。例如，y i n g n a n y a n g ，c h i k a t a d a 等通过研究载体的微观结构选择用丝瓜棉和 聚亚胺酯泡沫固定微生物进行厌氧发酵使甲烷的产率得到很大的提高【l ”。张东霞，达文燕 等利用高分子载体固定化微生物细胞生产l 一苹果酸也取得显著的效果【1 ”。王思新焦中高等 利用崮定化细胞生产果酒，可以改善果酒的风味缩短生产周期，改进生产工艺，降低生产 成本。刘永军，贾敬芬等_ l 固定化多菌种连续发酵产酸模拟白酒的发酵”。王建龙，周定 用冷冻聚丙烯酰胺法固定化黑曲霉生产柠檬酸，改善了聚丙烯酰胺对细胞的毒性提高了产率 ”。汪钊，郑裕国等用固定化微生物细胞改善氨基酸调味液的品质，除去了原先的臭味使 产品既有氨基酸调味液的特点，又具有酱油的风味【l “。j e n h o m gt s e n 利用角叉菜胶固定化 l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 菌发酵生产l a b ，生产效率比游离细胞发酵更高【l ”。k e n j i s o n o m o t o 等利用光联树脂吸附l a c t o c o c c u sl a c t i s 发酵生产乳酸乳球菌肽其产率比游离细胞 高1 7 倍i l “。j a t r e u e s 等用琼脂糖、海藻酸钠、角叉菜胶、和聚丙烯酰胺固定化整个细胞 发酵生产核苷酸，其产率和游离细胞相当但是固定化细胞可以连续使用3 0 次以上，并且活 力不发生很大的变化【1 ”。其他方面。f l a v i ac a s s i o l a 等用温石棉吸附包埋法固定化 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 菌，由于温石棉上的纤维与细胞膜上的多糖通过静电力结合能是此 菌种存活3 年以上【】。m a l - s a r a j 等用载体固定化s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 酵母细胞吸收 溶液中的有害金属离子，f 可游离细胞相比固定化后的酵母除了能吸收汞和镉外对钻、镍、锌 等二价离子也有相同的吸附能力口o l 。 1 2 4 固定化微生物的方法 根据结合的方式微生物固定化的方法有：吸附法、交联法、共价结合法、和包埋法。( h a l l 1 9 9 1 ，s c h e l l e ra n ds c h u b e r1 9 8 9 ，t r a n m i n t1 9 9 3 ，t u r n e re ta 1 1 9 8 7 ) 【3 0 】 1 2 4 1 吸附法 利用各种固体吸附剂，将细胞吸附在其表面使细胞固定化的方法称为吸附法。用于细胞 固定化的吸附剂主要有：硅藻土，多孔陶瓷，多孔玻璃，多孔塑料，金属丝网，微载体和中 空纤维等。酵母细胞带有负电荷，在p h3 5 的条件下能够吸附在多孔陶瓷和多孔塑料等 载体的表面，制成固定化细胞，用于酒精和啤酒等的发酵生产：在环境保护领域广泛使用的 活性污泥中含有各种各样的微生物，这些微生物可以沉积吸附在硅藻土，多孔玻璃，多孔陶 瓷，多孔塑料等载体表面，用于各种有机废水的处理，以降低废水中的化学需氧量和生化需 氧量：各种霉菌会长出菌丝体，这些菌丝体可吸附缠绕在多孔塑料，金属丝网等载体上，用 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 以生产某些有机酸和酶等；植物细胞可吸附在中空纤维外壁，用于生产色素，香精，药物和 酶等次级代谢物；动物细胞大多数属于贴壁细胞，必须依附在固体表面才能正常生长，故可 吸附在容器壁，微载体和中空纤维外壁等载体上，制成固定化动物细胞，用于各种功能蛋白 质的生产。另外微生物通过自身的凝聚特性形成具有一定形状的机构和层次的颗粒。在污水 处理中这种颗粒被称为颗粒污泥。例如硝化菌在流化床中进行白固定化来处理污水时，硝化 菌的活性和处理能力比游离菌的处理规律没有很大的变化1 2 1 j 。 用吸附法制各固定化微生物细胞时，操作简单易行，对细胞的生跃，繁殖和新陈代谢没 有明显的影响，但吸附力较弱，吸附不牢固，细胞容易脱落，使用受到一定的限制。 吸附法是制备固定化动物细胞的主要方法。动物细胞大多数具有附着特性，能够很好地 附着在容器蹙，微载体和中空纤维等载体上。其中微载体已有商业产品出售，供固定化动物 细胞之用。 1 2 4 2 交联法 交联法是利用双功能或多功能试剂直接与细胞表面的反应基团反应，使细胞交联，形成 网状结构来固定化细胞。交联法与共价结合法都是靠化学结合方法使细胞固定化，但是交联 法采用载体为非水溶性的。常用的交联剂是戊二醛，甲苯二异氰酸酯等。交联法固定细胞结 合力强，但是细胞容易失活，另外交联剂对细胞有一定的毒性，在固定化的时候尽量减少交 联剂和细胞的接触时间。例如b s k u b a l 等用戊二醛做交联剂将含有过氧化氢酶的酵母细胞 固定在蛋清蛋白上，用来处理食品中的过氧化氢口“。 1 2 4 3 共价结合法 利用蛋白质上的一些残基( 如氨基、羧基、羟基、硫基、昧唑基) 与活化的有机或无机 载体之间通过共价键结合的方法为共价结合法。其特点是固定化物质与载体之间结合力强， 稳定性好，但反应条件苛刻，失活率高，不利于发酵。 1 2 4 4 包埋法 将细胞包埋在多孔载体内部而制成固定化细胞的方法称为包埋法。包埋法可分为凝胶包 埋法和半透膜包埋法。 以各种多孔凝胶为载体，将细胞包埋在凝胶的微孔内使细胞固定化的方法称为凝胶包埋 法。细胞经包埋i 司定化后，被限制在凝胶的微孔内进行生长，繁殖和新陈代谢。 凝胶包埋法是应用最广泛的细胞固定化方法，用于各种微生物，动物和植物细胞的固定 化。凝胶包埋法使用的载体主要有琼脂，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，明胶，聚丙烯酰胺凝胶、 光交联树脂和聚乙烯醇等。 1 2 441 琼脂凝胶包埋法 5 q 将一定量的琼脂加到定体积的水中，加热使之溶解，然后冷却至4 8 5 5 ，加入 定量的细胞悬浮液，迅速搅拌均匀后，趁热分散在预冷的甲苯或四氯乙烯中。形成球状固定 化细胞胶粒，分离后洗净备用。也可将琼脂细胞混悬液摊成薄层，待其冷却凝固后，在无菌 d 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 条件下，将同定化细胞胶层切成所需要的形状。琼脂凝胶包埋法操作简单，材料低廉。缺点 是由于琼脂凝胶的机械强度较差，而且氧气，底物和产物的扩散比较困难，故其使用受到 限制。 1 2 4 4 2 海藻酸钙凝胶包埋法1 5 “ 取一定量的海藻酸钠，溶于水，配制成一定量浓度的海藻酸钠溶液，经杀菌冷却后，以 一定体积的细胞或孢子悬浮液混合均匀，然后用注射器或滴管将冷凝悬液滴到一定浓度的氯 化钙溶液中，形成球状固定化细胞胶粒。用海藻酸钙凝胶制备的同定化细胞已_ f = 于多种酶的 发酵生产研究。采用4 的海藻酸钠溶液与等体积的黑曲霉孢子悬液混合，滴到1 的氯化 钙溶液中，制成直径约1m m 的固定化黑曲霉细胞，用于糖化酶的发酵生产，取得显著效 果，糖化酶的产率比游离细胞高3 0 ，固定化细胞可连续使用3 0d 。海藻酸钙凝胶包埋法 制备固定化细胞的操作简单，条件温和，对细胞无毒性，通过改变海藻酸钠的浓度可以改变 凝胶的孔径，适合于多种细胞的固定化。海藻酸钠的稳定性不如其他的化学合成材料。 1 2 4 4 3 角叉菜胶包埋法口6 1 将一定量的角叉菜胶悬浮于一定体积的水中，加热熔解，灭菌后，冷却至3 5 5 0 ， 与一定量的细胞悬浮液混匀，趁热滴到预冷的氯化钾溶液中，或者先滴到冷的植物油中，成 形后再置于氯化钾溶液中，制成细球状固定化细胞颗粒。也可按需要制成片状或其他形状。 角叉菜胶还可以用钾离子以外的其它阳离子，如铵离子，钙离子等，使之凝聚成形。角叉菜 胶具有一定的机械强度。若使用浓度较低强度不够时，可使用戊二醛等交联剂处理。进行双 重固定化。角叉菜胶包埋法操作简单，对细胞无毒害，通透性能较好，是一种良好的固定化 载体。自1 9 7 7 年以来，在固定化细胞和固定化菌体方面广泛应用。采用角叉菜胶为载体， 直接固定化枯草杆菌细胞，用于连续生产淀粉酶的研究，取得了可喜的成果。 1 2 4 4 4 明胶包埋法【5 6 】 配置一定浓度的凝胶悬浮液，加热溶化，灭菌后。冷却至3 5 以上，与一定浓度的细 胞悬浮液混合均匀，冷却凝聚后做成所需形状的固定化细胞。若机械强度不够时，可用戊二 醛等双功能试剂交联强化。明胶的通透性也不是很强，对底物的扩散有抑制的作用，机械强 度也不高。 1 2 4 4 5 聚丙烯酰胺凝胶包埋法阁 先配置一定浓度的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的溶液，与一定浓度的细胞悬浮液混合均 匀，然后加入一定量的过硫酸钾和四甲基乙二胺( t e m e d ) 混合均匀后静置聚合，获得所 需形状的固定化细胞胶粒。用聚丙烯酰胺凝胶制各的同定化细胞机器强度高，可通过改变丙 烯酰胺的浓度以调节凝胶的孔径，适用于多种细胞和酶的固定化。然而由于丙烯酰胺单体对 细胞有一定的毒害作用，在聚合过程中，应尽量缩短聚合时间，以减少细胞与丙烯酰胺单体 的接触时间。 中国农业大学硕士学位论文 第一章绪论 1 2 446 光交联树脂包埋法p o j 选用一定分子量的光交联树脂预聚物，例如分子质量为1 0 0 0 3 0 0 0 的光交联聚氨酯预 聚物等，加入1 左右的光敏剂，加水配成一定浓度，加热至5 0 左右使之溶解，然而与 一定浓度的细胞悬浮液混合均匀，摊成一定厚度的薄层，用紫外光照射3m i n 左右，即可交 联固定化制成固定化细胞，然后在无菌条件下切成一定形状。光交联树脂包埋法制备固定 化细胞是行之有效的方法，通过选择不同分子量的预聚物可使聚合而成的树脂孔径得以改 变，适台于多种不同直径的酶分子和细胞的同定化；光交联树脂的强度高，可连续使用较跃 的时间；用紫外光照射几分钟就可完成固定化，时间短，对细胞的生长繁殖和新陈代谢没有 面明显的影响。 1 2 447 聚乙烯醇凝胶包埋法p q 聚乙烯醇( p v ) 在加热后溶于水，在其水溶液中加入添加剂后发生凝胶化，或在低温 下( i o ) 冷冻成凝胶，从而将微生物包埋在凝胶网络中。常用的添加剂有硼酸和硼砂， 在聚乙烯醇水溶液中加入硼酸和硼砂，由于化学反应形成凝胶。聚乙烯醇硼酸包埋法是一种 制各容易且价格低廉的固定化方法，利用该法制作的凝胶颗粒机械强度高，使用寿命长，且 弹性好。 微生物固定化常用的方法多为包埋法，不同的就是包埋所用的材料不同，例如陈敏等人 利用p v a ( 聚乙烯醇) 包埋活性碳与微生物，并对有机磷农药水胺硫磷的生物降解进行了 实验研究。结果表明固定化微生物对温度、p h 值和水胺硫磷的浓度适应范围扩大。对其去 除率达到5 5 7 2 ”。黄霞利用无纺布p v a 复合载体固定化优势菌种用于降解喹啉、异 喹啉、吡啶，结果表咀经固定化细胞处理8h 三种有机物降解率达到9 0 以上【“1 。w a n g j i n l o n g ，用p v a 固定化技术，在p v a 与硼酸交联反应的同时引入丙烯酰胺聚合反应，成功 地克服了p v a 凝胶在实际应用中的存在水溶膨胀性。利用改进的固定化方法包埋假单胞菌用 于降解苯酚，结果表明，微生物经固定化后保留着较高的活力f 2 5 】。w a n gj i n l o n g ，q i a ny i 利用p v a 固定化微生物降解邻苯二甲酸酯，微生物的降解活力得到了提高。张立央用海 藻酸钠、纤维素硫酸钠、聚亚基二胍氯化氢固定化酵母细胞和大肠杆菌取得很好的效果 ”。 p o m s a ks r i a m o m s a k 甩从橘子皮和苹果渣中提取的果胶包埋微生物，同用海藻酸钠固定化微 生物相比较没有很大的差别口”。r j m m a o l o v 分别用琼脂、海藻酸钙、角叉菜胶和聚丙烯酰 胺固定化b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s 菌生产p u l l u l a n a s e 最后得到结论为：5 2 0 浓度 的聚丙烯酰胺为最佳的固定化凝胶，可以使酶的产量提高4 倍田】。 1 2 5 固定化微生物产酶 除了将微生物固定化后直接用于生产外，还可以利用固定化微生物产酶。固定化细胞适 用于胞外酶等可以分泌到细胞外产物的生成，固定化原生质体则适合于生产原来存在于细胞 内的酶和其他胞内产物。由于固定化原生质体解除了细胞壁的扩散障碍可以使某些胞内酶分 泌到胞外。 固定化微生物细胞发酵是2 0 世纪7 0 年代后期，在固定化酶的基础上发展起来的发酵技 6 术。固定化细胞是指嗣定在水不溶性载体上，在一定空间范围内进行生命浠动，固定化细胞 发酵有麴下豹特点：缁魏密度大可提商产酶8 力 发酵稳定性好可啦反复使蠲较长时间 细胞固定在载体上流失较少可以在高稀释率条件下进行连续发酵，利于连续化自动化生产 发酵渡中含越体较少，剥予产品分离挺纯，提商产品艨量等。细胞谯一定条锌下培养生长， 其生长过程一般经历调整期，生长期，平撷期和衰退期4 个阶段。邋过分析比较细胞生长与 酶产生的关系，可以把酶生物合成模式分为4 种类型：同步合成型延续合成型中期合 成型滞后合成型。 同步合成型：又称为生长偶联型，该类型酶的生物台成速度与细胞生长速度紧密联系， 生物合戒伴随着细胞的生长箍开始，进入旺盛生长期时酶大量合成，进入平衡期时生长停止。 大部分组成酶生物合成属于同步合成型，一部分诱导酶也是。 延续合成型；在生长阶段开始进入平衡期后还可以延续成一段较长时间。可以是组成 酶，诱昌酶。 中期台成型：在细胞生长到一定阶段以后再开始，进入平衡期后就停止。 滞后台成型：此类簿是在细胞生长一段时游进入平衡期以詹才开始，其生物合成大攮积 累，犬部分水瓣酶属予此类型，又称为a # 生长偶联型。进入乎德期后开始犬量形成。 1 2 5 。1 固定化微擞物产酶的优点 相对于游离细胞来说固定化微生物细胞产酶有以一f 的优点； ( 1 ) 提高酶产率，固定化嚣密度增大，爵丽生纯反成速度加速，飙丽掇高产酶率。 ( 2 ) 可以反复使用或连续使用较长时闻( 在载体上不易脱落可避行半连续发酵，也可以 崔商稀释率条件下连续发酵较长时阐) 。 ( 3 ) 基医工程菌静壤趣稳定，不翁丢失( 结构稳定瞧和分裂稳定性捷离) 。 ( 4 ) 发酵稳定性好( 对温度，p h 值的使用范围宽) 。 ( 5 ) 缩短发酵蜀期，提离设备利用率。 1 2 s 2 固定纯徽皇糍发簿：跨莽 圈是纯细艟制鍪好鞋后，一般蜜进行颈培莽，竣利于固定在载体上的纲麓生长繁臻。为 了使固定化细胞生长良好，预培养鹿该采用适合细胞生长的培养基和工艺条件。 1 252 1 溶解氧的供给 固定纯细胞在进行培养和发酵过程中，由于受载体的影响，氧的溶解和传递受到一定的 阻碍。特别是采闳包埋法制镰的固定他细胞，氧要首先潞解在培养基中，然后通道载体层扩 散到内部，不能搅拌必须通过增大通气量，琼脂不利于氧的扩散，应尽量不闱或少用作载体， 或莱趣避鬣亿氢薅与细胞共嗣定化，在培养基中添加遥蓬过氧化氢。为了使氧气能穿透包埋 载体，载体的厚度是有一定的限制的。一般说来海藻酸钙凝胶的厚度为0 0 8 0 1 0m i l l 为最 佳，琼腊凝胶的厚度为o 1 o ，1 5m m ，所以得到结论楚载体的最佳大小为o 1 o 3i i 】“2 ”。 1 2 5 2 2 培养基组分静拉锯 固定亿绍腿培葬蘩从营葵学角度来看，与游离细胞培养基没有显著区剐，从固定傀缨胞 7 的结构稳定性和供氧方面考虑却有特殊性，在培养基_ 舀已置过程中需注意，例如培养基的某些 组分可能影响某些匿定化载体盼结构，为了维持隧定能细赡的完整性，在培募基的配置过程 中成控制其含量。海藻酸钙凝胶制备的固定化细胞，过爝的磷酸盐会使其结构受到破坏，所 戳魔谈限螽l 磷酸盐的浓度，并在其中添热一定浓度的钙离子，保持稳定性剥于氧的溶解和传 递，培养基浓度不宜过商，特别是黏度尽量低一蝗好。 1 3 目前淀粉生产情况 1 _ 3 1 现状 荷兰拉波银行( r a b o b a n k ) 2 0 0 3 年发表了一份关于世界淀粉生产情况的国际食品与农 业磷究报告，指爨淀耪已经成为世界穰食瀵费的主要渠遵之。在擀霄擒= 农产晶中，淀粉 的应用范嗣最为广阔。淀粉及其制品可用于汤类、调味品、肉类、面包制品、饮料、纺织品、 纸、燃辩、胶糕剂、塑料、油漆等产品的生产加工。经过对原料的初加工，可生产出原始淀 粉恭l 经过修改淀粉：经过对原始淀粉和经过修改淀粉驰深加工，煎4 可生产出承鳞淀耪产晶， 例如葡萄糖、糖类代用物、麦芽糖淀粉酶、山梨糖醇、柠檬酸、维生素c 等。 2 0 0 3 年，擞界淀粉慧产鬃为4 9 0 0 万吨。其中，以粮食为骧羁生产出的淀耪这弼4 3 5 0 万吨( 3 9 4 0 万吨来自玉米，4 t 0 万吨来自小麦) ，以木薯为原料生产出的淀粉约为3 0 0 万吨。 以豆为琢料生产出的淀粉为2 6 0 万吨。荣国和欧盟垄断着世界淀粉生产业，美国的淀粉产 量达至4 世界生产憨量鲍5 0 以上。2 0 0 3 晕，美国的淀粉产量为2 4 9 0 万睫。到2 0 0 4 年，全 世界每年燕生产淀粉5 5 0 0 6 0 0 0 万吨，其中美国占5 0 。世界各地的淀粉生产情况差异悬 臻，琢瓣供应程度也苓一样，能美渊地嚣象产淀粉主娶以玉米为原料，美国生产的淀耪中有 9 0 是玉米淀粉。欧洲主要以小麦和玉米为原料，亚洲则主要以术薯为原料口”。在国外， 有关绿豆淀粉生产的撤道很少。究箕原因，可能一部分是因为饮食习惯和地区差异的问题， 再者，绿甄产量相对较僬，绿爱淀粉提取率低，袋自帮纾维素等其镪成分褥不到充分利用或 尚未利用，造成资源浪费，淀粉成本过高，从而导致绿厦淀粉产量一直很低。由于绿豆淀粉 成本高，所殴建藏肉绿曩淀耪主要是臻来锖备粉丝。 1 3 2 冒麓淀粉生产王艺及特点 目前，国际上对淀粉的生产工艺主要可分为五种，即二合浆分离法，流槽分离法，离心 分辫法，离心规麓流器踺套分离法和全旋藏器分离法。淀粉工业发达的重家，如赞兰，美国 、日本，波兰是以第三，四种方法为主，少数几个国家已经应用最先进的全旋流器分离法， 我强大部分懿，j 、型淀耪厂是戳流槽法和离心祝分离法为主，部分大壁淀粉厂是以离心机分离 法和离心机旋流器配套分离法为主口“。 国外少量的绿豆淀粉生产主要燕采用离心机旋流器配套分离法，即美闲d o r r - o l i v e r 公 司蓠先箍出的臻式离心机与麓液器缀合分离淀粉。离心税分离帮预浓缩作用，旋漉嚣洗涤淀 粉乳中的鬣白质和其他杂质的作用。此方法效率离，淀粉得率高( 8 0 以上) ，动力消耗 低，产品鹱量离( 蛋自质含量氇3 以下) 。缺点是投资较高，而茸产品不适合用于大孛眈量 8 生产绿豆淀粉。 国内绿豆淀粉生产的方法主要有三种，即二合浆法、机械分离法和土法二合浆法生 产绿豆淀粉主要把豆浆放嚣一些时候，经过自然发酵，逐渐变酸，就成了能沉淀淀粉的二合 浆。豆浆中除淀粉矫，还含有蛋白质、细纤维等。为了馒淀粉与蛋白质、细纤维较快遗分开， 传统工艺加入二台浆，二台浆中含有大量乳酸乳球蘸，具有凝集淀粉颗粒的能力，这样，淀 粉颗粒不仅脱离了渣子中的太部分蛋f 与质、细纤维的破附作用，箍旦使其沉降速度大大加快， 从两淀粉与蛋臼质和细纤维分离开。用机械分离法生产绿豆淀粉的泡豆、磨浆等工艺与二：二舍 浆法相同，只是在分离豆浆中淀粉、蛋白质和缁纤维的时候采用碟片式离心机分离工艺，也 可用5 级旋流洗涤工艺，或者二者含用。合周工艺即先健豆粉浆经过碟片分离机将蛋白质、 细纤维等大部分分出，得到粗淀粉乳，再经过5 级旋流洗涤器的进一步净化，得到精剁淀粉 乳。此法工艺先进，适会大规模连续纯生产，但要求生产设备投入丈，两且生产的淀粉制出 的粉丝嗣感、外观郝不甚理想。所阻，粉丝厂一般不用机械分离法来生产绿豆淀粉 土法作坊式生产绿豆淀粉，步骤同二合浆法相差不大，只是在分离豆浆中的淀粉、蛋白 矮和细纤维的时候不加二会浆，而是利用淀粉、蛋白质、细纤维的大小和密度的不同，采用 自然沉降法获 寻淀耪。即将绿豆浸泡质，用石蘑或砂轮磨磨成豆浆装在双层细滤布用袋里， 悬空在大短上，加承把淀粉漂洗入缸内，除去上面的豆渣，让粉浆在缸墨静嚣1 6h 左右， 吸去上瑟澄清水及徽黄的液汁，把沉积在缸里的淀粉取出，放进布袋里沥干后，取出淀粉块， 将冀蹬晒戏烘干制成千淀耪。比较适合于小作坊手工加工，生产餐比较小。 现在，我国对绿巍淀耪的提取主要停留在传统的加工方法上。郎用= 合浆法生产绿豆淀 粉。融为对同一品辨的绿豆来说，二合浆法提取的淀耪的质量、纯度都商予机械提取的。这 主要是因为二浆法提取绿疆淀粉时，浆水中禽有的乳酸乳球菌对淀糟颗粒有很好的凝聚作 用，还能将大分子的蛋白质分鳃成小分子魄多肽，从丽使蛋白质和淀粉粒报快分汗，加大了 淀粉粒和蛋自质分子阁的比重差，淀粉粒便迅速沉淀下来，丽蛋自质和多肷等存在予上层浆 水中被除去。而利用其他方法，如机离心法和出洗法皋4 褥淀粉的得率、提取率及纯度均低于 二含浆法鼠其成品中蛋囱矮、灰分等杂质的含量均离于二含浆法。淀粉的色泽，制出粉丝的 性质也远不如= 舍浆法。掰以长期以来至今，在我国对绿豆淀粉的生产绝大多数还停留在传 统的绿豆淀粉韫加工上，加工车橱一般也是纯手工的小作坊或者半手工半机械亿生产，很少 有犬蟹的机械加工率阍。 1 4 实验的方案 1 4 。l 实验的目的 铸绕的绿豆淀粉生产方法主要是加i n _ - 2 含浆沉淀淀粉，这就需要有养浆的过程，另外一 旦浆没有算好还会出现大批的淀粉沉淀不下来，浪费了原材料。二合浆法生产淀粉产生的污 承含有大攫的蛋囟质，对环境的污染情况严重。这些因素都不利于现代化的规模生产。所以 本课题研究的内容是将二合浆中的优势菌乳酸乳球菌分离提纯后，同定于载体上，用于绿豆 淀粉的生产。使生产不受传统的经验因素的影响。改善现在的二合浆生产淀粉的工艺步骤， 9 实现大规模的1 二业化和自动化生产，缩短生产淀粉所用的时间，提高淀粉的得率- 降低淀粉 生产的成本。同时将生产出来的淀粉同二合浆法淀粉理化性质相比较，并对两种淀粉制各的 粉丝进行比较有无差异。 1 4 2 实验方法选择的依据 由于吸附法固定化微生物时，吸附力比较弱，细胞容易从载体上脱落。使用的时候受到 一定的限制。共价结合法和交联法固定化微生物时，细胞膜表面的蛋白质发生反应，细胞膜 很容易被破坏。包埋法主要是将微生物细胞包埋在内部，这就可能使细胞的生长造成一定的 限制，阻碍了营养物质的进入。但是此方法能将微生物集中到一个局部的微环境中生长繁殖， 给微生物提供一个高含水环境。另外，包埋法固定化细胞时，细胞没有直接参与化学反应， 并且微生物的生长环境改变有利于酶和其它的次级代谢产物的产生和释放，包埋法崮定化细 胞的能力比吸附法强。其中包埋法常用的凝胶有：海藻酸钠、琼脂、聚乙烯醇、聚氨酯橡胶、 明胶、醋酸纤维素酯口“。所以采用包埋的方法固定乳酸乳球菌。为了改善包埋法，主要考 虑到包埋材料的选择，包埋材料的好坏是固定化微生物能否正常生长的关键，选择材料的 关键是：首先，凝胶对细胞没有毒性。其次，用于食品生产中的凝胶必须楚对人体健康不能 造成危害，包括凝胶成型时使用的试剂。凝胶内部的微环境是细胞生长的关键，充足的水 分能为微生物提供生长所需的水分和营养物质。明胶和琼脂作为包埋材料是对物质的通透性 不是很好，能限制物质的进入内部细胞不能得到生长需要的营养物质。所以一般采用海藻酸 钠、聚乙烯醇和角叉菜胶。为了提高角叉菜胶的机械强度也可按一定的比例加入壳聚糖。例 如用海藻酸钠固定化微生物降解有机物质时同时固定化了活性炭、氯化钙和纤维素。增加了 物质的通透性和凝胶的机械强度p ”。溶解氧的供给，固定化微生物在后期产酶的过程中， 需氧微生物要保证氧气的供给。所以固定化微生物的胶体的厚度不应过厚一般控制在o 1 0 3r n m 之间。另外可以同时固定一些产氧的物质。 1 4 - - 3 实验方案及主要内容 本实验主要分为四部分，一、分别对三种天然凝胶包埋乳酸乳球菌进行比较，确定一种 合适的包埋材料。二、对包埋时不同浓度的凝胶和不同的起始菌浓度进行比较，确定一种合 适的包埋条件。三、将实验室确定好的条件应用于工厂实际生产中去，确定单位凝胶使用量 和得淀粉的最佳时间。四、将固定化乳酸乳球菌得到的淀粉和二合浆法得到淀粉之间相互进 行比较，并比较两种淀粉制作的粉丝性质有无差异。 1 5 实验的意义 前面已经提到如今粉丝加工需要的绿豆淀粉大多数是通过传统的二合浆法得到的。二合 浆法生产淀粉有如下的缺点：一、二合浆法生产淀粉时大多数是靠有经验的老师傅控制二合 浆的用量和沉淀时间，无法实际确定用量和脱离人为主观意识。二、二合浆法生产淀粉的时 候经过两次沉淀，此过程中所需水量很大。三、二合浆法生产淀粉的废水中蛋白质含量高， o 孛嚣农韭大学硕士学位论文第一章绪论 对环境污染严重。 固定化拿l 酸乳球甍暹过模拱二食浆生产淀粉的枕理得到淀粉，但是北方法生产淀粉务如 f 的意义： ( 1 ) 遵过褥乳酸乳球藏霸定他可班按照豆浆的量来确定澜定化颗粒的蹋量，郄可驻最 化颗粒的用量，使生产淀粉可以不受传统经验的限制。 ( 2 ) 固定化乳酸乳球菌生产淀耪工艺步骤相对二台浆法简单，只需要一次沉淀淀粉就 可以完成。节省了沉淀时闯，提赢了效率。 ( 3 ) 阎定化乳酸乳球菌相对于二合浆法可以节省用水量，由于固定化乳酸乳球菌只需 要一次沉淀就可l 葵撇浆，不稀要重新补水进行第二次沉淀和清洗淀粉得到二合浆船过程，所 以用水量减少。 ( 4 ) 固定他乳酸乳球菌生产淀粉用水燕的相对减少也可以使废水的排放减少，同时由 于戮定位霉l 酸l 球藿泄漏的藏数比二合浆法的少，袤水的p 毛和蛋鑫含量稍对减少，凌瘩容 易处理。 ( 5 ) 固定纯乳酸巍球蔷可以使生产淀粉半连续讫和连续他，可以满足连续大批量生产 淀粉的要求。 2 1 前言 第= 章三种夭然凝胶包埋乳酸乳球蓠的比较 目前国内9 微生物固定化主要麻用于两方面，一是废水处理。这是【刮定化微生物最早 的实践应用。铆如朱文芳，李伟光等利用固定纯微生物降解甲烷1 5 1 ：w a n gj i n l o n g ，q i a ny i 固定化擞生物降解含有氯酚的废水【6 】。二是生产一些发酵产物。利用固定化微生物发酵生产 一些氨基酸、核苷酸、有机酸等。倒如k _ e n i is o n o m o t o 固定l a c t o c o c c u sl a c t i s 发酵生产乳酸乳 球菌多肽；张衮霞，达文燕固定化微生物生产l 苹果酸【1 2 1 ；j a t r e l l e s 圈定整个细胞发酵 生产梭苷酸”l 。 掇据结合豹方式，微生物国定化鲍方法有：吸附法、交联法、共债结合法和包埋法。( h a l l 1 9 9 1 s c h e l l e ra n ds c h u b e r1 9 8 9 t r a n ，m i n t1 9 9 3 ，t u r n e re ta 1 1 9 8 7 ) p q 。凝胶包埋法是将细胞 包埋在多孔载体内部，由于其包理率撼，包埋材料对细胞纛霉性等副作用，所以是最常用的 一种包埋方法。凝胶