（食品科学专业论文）有机磷农药降解菌的筛选、分离鉴定及其降解动力学特性研究.pdf

硕：卜学位论文 摘要 有机磷农药对于防治农业虫害具有经济、高效、方便的特点，一直是国内外 广泛生产和使用的农药产品。但农药的广泛使用对环境造成严重污染，已经危及 到人们的生存以及可持续发展。因此，迫切需要建立一种有效方法用于治理环境污 染以及去除农产品的农药残留。生物修复( b i o r e m e d i a t i o n ) 是近年来发展起来的用 于治理环境污染的- i - j 新技术，它主要是通过微生物的作用将环境中的有机污染 物转化为c 0 2 和h 2 0 等无毒无害或毒性较小的物质。生物修复特别是微生物对残 留农药的去毒降解是目前治理环境污染特别足农药污染的有效途径。 本文采用微生物降解有机磷农药的方法，从长期受有机磷农药污染的种植地 土壤中分离得到两株降解有机磷农药的细菌m 1 ( n o 0 8 0 1 3 0 ) 和m 2 ( n o 0 8 0 1 3 1 ) 。 对菌株m 1 、m 2 进行形态特征、生理生化特性鉴定和1 6 sr d n a 序列分析，研究 所分离的菌株对甲基对硫磷、毒死蜱和乐果的耐受浓度。在土壤模拟体系试验中， 测定菌株m 1 、m 2 对土壤中甲基对硫磷和毒死蜱的降解率和降解半衰期，并与土 壤中固有微生物的降解率进行比较。 通过形态观察、环境因素影响的测定、生理生化特征以及1 6 sr d n a 序列分析， 初步鉴定m 1 菌株是恶臭假单胞菌m 1 ( p s e u d o m o n a sp u t i d am 1 ) ，m 2 是l u d w i g i i 肠杆菌m 2 ( e n t e r o b a c t e rl u d w i g i fm 2 ) ，且菌株m 2 是一株新发现的具有高效降 解有机磷农药功能的微生物。菌株m 1 、m 2 的1 6 sr d n a 的g e n b a n k 登陆号分别 为g q 4 9 9 3 3 3 、g q 3 8 0 5 7 5 。 在土壤模拟体系试验中，培养第3 2 d ，菌株m 1 、m 2 对土壤中甲基对硫磷的 降解率为8 5 、9 3 ，降解半衰期分别为1 4 1 d ，7 1 d ；培养第4 8 d ，对土壤中毒死 蜱的降解率为7 1 、8 1 ，降解半衰期分别为2 9 1 d ，2 6 1 d ，且菌株m 1 、m 2 的 降解速率均大于土壤中固有微生物的降解率和土壤颗粒对农药的吸附降解力。菌 株m 1 、m 2 在含有1 蔗糖的无机盐培养基中对甲基对硫磷、毒死蜱的耐受浓度达 到5 0 0 m e c l ，对乐果的耐受浓度高达1 0 0 0 m g l 。 关键词：微生物降解；有机磷农药；分离；鉴定；降解率 有机磷农药降解菌的筛选、分离鉴定及其降解动力学特性研究 a b s t r a c t o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e sh a v ee x t e n s i v e l yb e e np r o d u c e da n du s e da td o m e s t i c a n do v e r s e ab e c a u s eo ft h ee c o n o m i c ，e f f i c i e n t ，c o n v e n i e n tc h a r a c t e r i s t i c so fa g r i c u l t u r a l p e s t sc o n t r 0 1 h o w e v e r , t h ew i d e s p r e a du s eo fp e s t i c i d e sh a sc a u s e ds e r i o u sp o l l u t i o nt o t h ee n v i r o n m e n ta n dt h r e a t e n e d p e o p l e ss u r v i v a la n ds u s t a i n a b l ed e v e l o p m e n t t h e r e f o r e ，a l le f f e c t i v em e t h o dm u s tb ee s t a b l i s h e dt oc o n t r o le n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n a n dr e m o v ep e s t i c i d er e s i d u e si n a g r i c u l t u r a lp r o d u c t s b i o r e m e d i a t i o ni san e w t e c h n o l o g yo fc o n t r o l l i n ge n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o ni nr e c e n ty e a r s i tc a nc h a n g eo r g a n i c p o l l u t a n t so ft h ee n v i r o n m e n ti n t oh a r m l e s sc 0 2a n dh 2 0a n do t h e rn o n t o x i co rl e s s t o x i cs u b s t a n c e s t h r o u g ht h er o l eo fm i c r o o r g a n i s m s b i o r e m e d i a t i o n ，e s p e c i a l l y m i c r o b i a ld e g r a d a t i o no fp e s t i c i d er e s i d u e si sa ne f f e c t i v ew a yo fe n v i r o n m e n t a l p o l l u t i o nt r e a t m e n t b yt h em e t h o do fm i c r o o r g a n i s m sd e g r a d a t i o no fo r g a n i cp h o s p h o r u sp e s t i c i d e si n t h i s p a p e r ，s t r a i nm 1 ( n o 0 8 0 1 3 0 ) a n dm 2 ( n o 0 8 0 1 3 1 ) w e r ei s o l a t e df r o m o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e - c o n t a m i n a t e ds o i l t h es t u d i e so ns t r a i nm 1a n dm 2 ， i n c l u d i n gm o r p h o l o g i c a l ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，1 6 sr d n a s e q u e n c ea n a l y s i s ，t o l e r a n c ec o n c e n t r a t i o n st om e t h y lp a r a t h i o n ，c h l o r p y r i f o sa n d d i r n e t h o a t ea n dd e g r a d a t i o nr a t e so f m e t h y lp a r a t h i o na n dc h l o r p y r i f o si nt h es o i l s t r a i nm 1w a si d e n t i f i e dp s e u d o m o n a sp u t i d a m 1 ，s t r a i nm 2w a si d e n t i f i e d e n t e r o b a c t e rl u d w i g i im 2 a c c o r d i n gt om o r p h o l o g i c a lo b s e r v a t i o n ，t h ed e t e r m i n a t i o no f e n v i r o n m e n t a lf a c t o r s ，p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d1 6 sr d n a s e q u e n c ea n a l y s i s s t r a i nm 2w a san o v e l ，h i g h l ye f f i c i e n tp e s t i c i d e - d e g r a d i n gb a c t e r i a g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r so fs t r a i nm 1a n dm 2w e r er e s p e c t i v e l y g q 4 9 9 3 3 3 ， g q 3 8 0 5 7 5 i nt h es o i lt e s t ，s t r a i nm 1a n dm 2c o u l dr e s p e c t i v e l yd e g r a d e8 5 ，9 3 o f m e t h y l p a r a t h i o ni nt h es o i lw i t h i n3 2d a y sa n dd e g r a d a t i o nh a l f - l i f ew a s1 4 1 d ，7 1 d t h e y c o u l dd e g r a d e7 1 ，8 1 o fc h l o r p y r i f o sw i t h i n4 8d a y sa n dd e g r a d a t i o nh a l f - l i f ew a s 2 9 1 d ，2 6 1 d d e g r a d a t i o nr a t e so fs t r a i nm 1a n dm 2 w e r eh i g h e rt h a nt h o s eo fn a t u r a l s o i lm i c r o b e sa n d a d s o r p t i o nc a p a c i t y o fs o i l p a r t i c l e s t h e y c o u l dt o l e r a t e c o n c e n t r a t i o n su pt o5 0 0 m # lo fm e t h y lp a r a t h i o n ，5 0 0 m g lo fc h l o r p y r i f o sa n d 1 0 0 0 m g lo fd i m e t h o a t ei nm i n e r a ls a l tm e d i u mc o n t a i n i n g1 s u c r o s e i i 硕士学位论文 k e yw o r d s ：m i c r o b i a ld e g r a d a t i o n ，o r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ， i s o l a t i o n ， i d e n t i f i c a t i o n ，d e g r a d a t i o nr a t e s i l l 有机磷农药降解菌的筛选、分离鉴定及其降解动力学特性研究 插图索引 图2 1 菌株m 1 扫描电镜照片( a ：5 0 0 0 x ) 一2 0 图2 2 菌株m 2 扫描电镜照片( a ：6 0 0 0 x ) 2 1 图2 3 菌株m 1 生长曲线一2 3 图2 4 菌株m 2 生长曲线2 3 图2 5 菌株m 1 与p s e u d o m o n a sp u t i d aj m 9 ( f j 4 7 2 8 6 1 1 ) 序列比较2 9 图2 6 菌株m 2 与e n t e r o b a c t e rl u d w i g i fk u 2 0 1 3 ( e u 5 5 7 0 2 7 1 ) 序列比较3 1 图2 7 菌株m 1 的1 6 sr d n a 序列系统发育分析3 2 图2 8 菌株m 2 的1 6 sr d n a 序列系统发育分析3 2 图3 1 甲基对硫磷标准曲线一3 6 图3 2 毒死蜱标准曲线3 6 图3 3 各处理组对甲基对硫磷的降解3 7 图3 4 各处理组对毒死蜱的降解一3 8 i v 硕+ 学位论文 附表索引 表1 1 部分有机磷农药对鼠经口的l d 5 0 ( m g k g 体重) 2 表1 2 降解有机磷农药微生物种类一7 表1 3 有机磷农药微生物降解酶的主要作用位点、种类及特性1 0 表1 4 降解有机磷农药的相关基因1 1 表2 1 温度对m 1 菌株生长情况的影响2 1 表2 2 温度对m 2 菌株生长情况的影响2 1 表2 3 渗透压对m 1 菌株生长情况的影响2 2 表2 4 渗透压对m 2 菌株生长情况的影响2 2 表2 5p h 对m 1 菌株生长情况的影响2 2 表2 6 p h 对m 2 菌株生长情况的影响2 2 表2 7 菌株m 1 人工操作生理生化特征2 3 表2 8 菌株m 1 仪器鉴定生理生化特征2 4 表2 9 菌株m 2 人工操作生理生化特征2 4 表2 1 0 菌株m 2 仪器鉴定生理生化特征2 5 表3 1 土壤模拟试验处理组3 4 表3 2 各处理组问降解土壤中甲基对硫磷的方差分析表3 8 表3 3 各处理组间降解土壤中甲基对硫磷的l s d 多重比较表3 8 表3 4 各处理组间降解土壤中毒死蜱的方差分析表3 9 表3 5 各处理组间降解土壤中毒死蜱的l s d 多重比较表3 9 表3 6 取样时间对土壤中毒死蜱的l s d 多重比较表3 9 表3 7 各处理组降解土壤中甲基对硫磷的动力学特征4 0 表3 8 各处理组降解土壤中毒死蜱的动力学特征4 0 v 兰州理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 寸撕 日期：力肋年占月s 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权兰州理工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名： 导师签名： 日期：幻年 日期：劢年 多月箩日 毛具 e i 硕士学位论文 1 1 农药和农药残留概述 第1 章绪论 1 1 1 农药概述 农药是指用于预防、消灭或者控制危害农业、林业的病、虫、草及其他有害生物， 以及有目的地调节植物、昆虫生长的药物的通称。农药可以是化学合成的，也可以是来 源于生物或其他天然物质的一种或者几种物质的混合物及其制剂。农药是以其毒性作用 来消灭或控制昆虫生长的。 农药的毒性作用具有两面性：一方面，可以有效控制或消灭农业、林业的病、虫及 杂草的危害，提高农产品的产量和质量；另一方面，使用农药也带来环境污染，危害有 益昆虫和鸟类，导致生态平衡失调。同时也造成了食品农药残留，对人类健康产生危害。 因此，应该正确看待农药使用带来的利与弊，更好地了解农药残留的发生规律及其对人 体的危害，控制农药对食品及环境的污染，对保护人类健康十分重要【啦l 。 1 1 2 农药残留概述 农药残留物是指由于喷施农药后存留在环境和农产品、食品、饲料、药材中的农药 及其代谢产物，还包括环境背景中存有的污染物或持久性农药的残留物再次在商品中形 成的残留。一般来说，农药残留量是指农药本体物及其代谢物的残留量的总和，并构成 不同程度的毒性。这些残留农药在食物中达到一定的浓度( 既残留量) 后，人或其他高 等动物长期进食这些食物，就会使农药在体内积累起来，引起慢性中毒，这就是农药的 残留毒性，简称残毒【3 ，4 l 。农药残毒的主要来源有三个：施用农药后药剂对作物的直接污 染；作物对污染环境中残留农药的吸收；生物富集与食物链。农药残毒所造成的污染也 是多方面的，包括通过毒化大气、水系和土壤所造成的环境污染，进一步影响生活在自 然界中的各种动物，引起动物相的改变、敏感种的减少与消失、污染种的增多与加强； 还会造成对农副产品、乳肉制品等食品污染，进而通过食品、呼吸等渠道使残留农药进 入人体，影响人类的健康1 5 j 。 1 2 农药的分类 目前，全世界实际生产和使用的农药品种有上千种，其中绝大部分为化学合成农药。 根据防治对象的不同，常将防治害虫的农药称为杀虫剂，防治红蜘蛛的称为杀螨剂，防 治作物病菌的称为杀菌剂，防治杂草的称为除草剂，防治鼠类的称为杀鼠剂，等等。根 据农药的来源，可分为化学农药、植物农药、微生物农药。根据化学组成和结构，可分 为有机磷类、氨基甲酸酯类、有机氯类、拟除虫菊酯类、苯氧乙酸类、有机锡类等。按 其毒性可分为高毒、中毒、低毒三类。根据农药在植物体内残留时间的长短可分为高残 有机磷农药降解菌的筛选、分离鉴定及其降解动力学特性研究 留、中残留和低残留三类【4 l 。 我国是世界上农药生产和消费大国，近年生产的高毒杀虫剂主要有甲基对硫磷、甲 胺磷、氧乐果、毒死蜱、久拌磷、对硫磷、甲拌磷等，因而，这些农药目前在农作物中 残留最严重。 1 3 有机磷农药残留及检测方法 有机磷农药是研究使用较早的农药，属于磷酸酯或硫代磷酸酯类化合物。大多有机 磷农药为无色或黄色油状液体，性质不稳定，容易光解、碱解和水解等，可溶于多种有 机溶剂，少数还可溶于水。 1 3 1 有机磷农药残留毒性与危害 有机磷农药的生产和应用也经历了由高效高毒型( 如对硫磷、甲胺磷、内吸磷等) 转变为高效低毒低残留型( 如乐果、敌百虫、马拉硫磷等) 的发展过程。有机磷农药化 学性质不稳定，分解快，在作物中残留时间短【6 , 7 1 。有机磷农药对食品的污染主要表现在 植物性食物中。水果、蔬菜等含有芳香物质的植物最易吸收有机磷，且残留量高。有机 磷农药的毒性随种类不同而有所差别。各种有机磷农药的l d 5 0 间表1 1 。 表1 1 部分有机磷农药对鼠经口的l d 5 0 ( m g k g 体重) t a b 1 1t h el d 5 0o f m i c eb yt h em o u t ho fp a r to ft h eo r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s ( m g k gb o d yw e i g h t ) 有机磷酸酯为神经毒素，可竞争性的抑制乙酰胆碱酯酶的活性，导致神经传导递质 乙酰胆碱的积累，从而引起中枢神经中毒，表现出一系列的中毒症状，如流汗、流泪、 恶心、呕吐、腹痛、腹泻、心动过缓、瞳孑l 缩小等。严重者可出现呼吸麻痹、支气管平 滑肌痉挛甚至窒息死亡【8 ，9 1 。 1 3 2 常见的有机磷农药及危害 1 3 2 1 敌敌畏( d d v ) 硕士学位论文 o ，o 二甲基o ( 2 ，2 二氯) 乙烯基磷酸酯 d d v 为一无色液体，有芳香味，微溶于水，易溶于有机溶剂，中等毒性，兼有熏蒸、 胃毒和触杀作用的广谱有机磷农药。用于防治粮谷、薯类、蔬菜等作物的病虫害及仓库、 室内杀虫【1 0 l 。食入敌敌畏残留过高的食品可引起中毒。敌敌畏可直接快速地一致人体 内的胆碱酯酶，当超剂量摄入时，可迅速引起人体内的乙酰胆碱大量积累，从而导致一 系列的中毒症状【1 1 】。 1 3 2 2 甲基对硫磷( 1 6 0 5 ) 0 ，o 二甲基o 对硝基苯基硫( 酮) 代磷酸酯 甲基对硫磷为一白色结晶物，溶于烷烃以外的大部分有机溶剂，微溶于水，是一种 高效高毒的有机磷杀虫剂1 1 2 】。农业生产中因施用该农药而造成食品污染，摄入量较大时 可引起食用者中毒。中毒者主要表现为头痛、恶心、呕吐、多汗、无力、兴奋等精神症 状。长期摄入可发生慢性中毒，表现为胆碱酯酶活性持续地显著下降，并出现不同程度 的植物神经调节障碍，如迷走神经兴奋性增高等。少数中毒者可产生迟发性神经损伤， 主要表现为下肢共济失调，肌无力和食欲丧失等。严重者症状可持续发展，出现下肢麻 痹。 1 3 2 3 乐果 o ，o 二甲基s ( n 甲基胺基甲酰甲基) 二硫代磷酸酣1 3 】 乐果为白色有光泽的针状结晶，微溶于水，易溶于有机溶剂，是一种高效、低毒、 低残留农药。对害虫有触杀和内吸作用。主要用于蔬菜、果树、茶、棉花及油料作物， 防治多种刺吸和咀嚼口器的害虫。当水果、蔬菜及油料作物施用乐果后，会有微量残留， 通过食品摄入较多时可引起中毒。而进入人体内的乐果氧化后可成为氧化乐果，毒性增 加。中毒后可出现头痛、乏力、恶心等症状。与其它农药混用时，毒性会增加。 1 3 2 4 毒死蜱 o ，o 二乙基o ( 3 ，5 ，6 三氯2 吡啶基) 硫( 酮) 代磷酸酯1 1 4 j 毒死蜱是一种个有广谱杀虫活性的药剂，具有触杀、胃毒、熏蒸等作用，但无内吸 性。它可用于防治蚊幼虫和成虫、蝇类、各种土壤害虫和许多叶类作物害虫，也可防治 牛、羊的体外寄生虫【1 5 l 。其毒性较低，对雄大鼠口服急性毒性l d 5 0 为1 6 3 m g k g ，雌大 鼠为1 3 5 m g k g 。 1 3 3 有机磷农药的检测方法 1 3 3 1 常规检测技术 ( 1 ) 波谱分析测定方法：波谱法是一种微量化学试验法，主要用于商品农药的鉴别 试验，检测结果限在微克级水平，常用分光光度计法、红外光谱法和荧光分光光度法测 定有机磷农药1 1 6 1 。a o a c 1 7 1 规定了用红外光谱法检测敌敌畏、保棉磷、甲拌磷，用分光 有机磷农药降解菌的筛选、分离鉴定及其降解动力学特性研究 光度法检测马拉硫磷、对硫磷等。周向阳等首次采用傅立叶【1 8 j 变换近红外光谱法( 兀n 承) 对十字花科、旋药科、菊科、伞形花科、觅科等2 0 余种叶菜类中有机磷农药残留的鉴 别进行了系统研究。 ( 2 ) 薄层色谱法( t l c ) ：t l c 始于1 9 3 8 年，其基本原理首先由i z m a i l o u 等发表， 便到了1 9 5 9 年才由s t s h l 等发展成近似于目前的薄层色谱法。薄层色谱法实质上是以固 体吸附剂( 如硅胶、氧化铝等) 为担体，水为固定溶剂，流动相一般为有机溶剂所组合的 分配型层析分离分析方法【1 9 l 。例如：徐宏喜等采用t l c 检测中药中有机磷农药残留量 j ，不需要特殊设备和试剂，方法简便、快速、直观、灵活，但是灵敏度不高，近年来 较少使用，多作为分离手段。现经常与其它技术联用，对样品被分离的一种或多种成分 进行定性定量分析。 ( 3 ) 气相色谱法( g c ) ：使用气相色谱法可分析含有多种残留农药组分的复杂样品， 可得到很好的定量分离效果，再配以高性能的选择检测器，可使分析速度更快，结果更 可靠。气相色谱法具有操作简便、分析速度快、分离效能高、灵敏度高以及应用范围广 等特点，是目前应用最多的农药残留检测方法，占相关报道的7 0 以上。用于气相色谱 法的检测器主要有f i d ，e c d ，f p d 等，填充柱和毛细管柱均可用于分离样品。j i a n l u n w u 2 1j 等用g c n p d 测定了三种中药材中六种氯基甲酸酯类农药。万益群等【2 2 】用 g c e c d 测定了中草药中8 种菊酯类和1 1 种有机氯类农药。陈桂云等采用g c 法测定 中药浙八味中有机氯农药残留量分析。陈伟东等【矧采用毛细管气相色谱法测定蔬菜中9 种有机磷类农药和3 种氨基甲酸酯类农药残留量，其具有很高的灵敏度。x u e l 2 4 】等采用 g c 法测定3 1 种中药中的1 8 种有机氯农药。 ( 4 ) 气相色谱质谱法( g c m s ) - 气相色谱质谱联用技术是将气相色谱仪和质谱 仪串联起来，成为一个整机使用的分析检测技术。它既具有气相色谱的高分离性能，又 具有质谱准确鉴定化合物结构的特点，可达到同时定性、定量检测的目的。适用于挥发 和半挥发性的有机杀虫剂、除草剂等农药的残留分析，主要包括有机氯类、有机磷类、 有机氮类、氯基甲酸酯类等化合物，尤其是在样品中干扰杂质较多的情况下，通过质谱 检测器的定性检测具有重要意义。气相色谱顾谱联用技术日臻成熟，现已广泛用于果 蔬样品分析。孙秀燕【2 5 】利用g c p c i m s 测定了人参、金银花中的1 1 种有机磷农药。近 年，由于串联质谱的发展及其具有减少干扰物的影响、提高仪器的精密度的优点，g c m s 的联用技术已得到了逐步的应用，在进行农药残留检测时，可以达到飞克水平的灵敏度。 美国在2 0 0 0 年建立了水果和蔬菜样品中2 5 1 种农药及其代谢物的残留g c m s 检侧 方法。我国在2 0 0 6 年颁布的国家标准g b t1 9 6 4 沪- 2 0 0 6 水果和蔬菜中5 0 0 种农药及 相关化学品残留的气相色谱一质谱法中检测组分高达5 0 0 种i 驯。 ( 5 ) 高效液相色谱法( h p l c ) ：近年来h p l c 在农残分析的应用越来越广泛，具 有分离速度快、检测效率高、重复性好的特点，主要分离检测强极性、大分子量及离子 型农药，尤其对不易气化或受热易分解的化合物更能显示出它的优点，且可以与柱前提 取、纯化及柱后荧光衍生反应并与m s 等联用，大大提高了液相色谱法的检测效率、灵 硕士学t f 7 ：论文 敏度、分析速度和操作自动化程度。但它在分析组分比较复杂的样品时，选择性和灵敏 度不如气相色谱好。现常用于氯基甲酸酯类化合物分析测定。t r a j l o v s l a 等【27 j 采用高效 液相色谱- - 级管阵列检测器检测葡萄酒中的特敌草胺、灭菌丹特丁津和亚胺硫磷农药。 黄琪【冽等采用高效液相色谱串联质谱法于多反应监测( m r m ) 模式下同时测定了烟草中 1 5 种有机磷农药的残留量。检测限为2 5 8 1 1 5 p g k g ，回收率为6 6 1 0 4 ，相对标准 偏差不大于8 9 9 。d i m i t r aa t 2 9 j 等综述了液相色谱在分析农药残留中的应用。 1 3 3 2 农药残留检测分析的新技术 近年来，随着分析仪器及技术的不断发展和完善，免疫学、分子生物学、生物化学 等学科的不断发展，农药残留检测方法的研究有了迅速的发展，在食品、农作物、环境 中农药残留分析等领域已有了比较广泛的应用，并逐步应用到中药中农药残留分析中。 ( 1 ) 高效液相色谱质谱法( h p l c m s ) ：l c m s 联用技术的研究开始于2 0 世纪 7 0 年代，此技术为农药残留检测提供了强有力的分析手段，可以对极性农药进行有效分 离、定性和定量分析，无需衍生化，因此是农药分析中非常有吸引力的分析手段。主要 用来分析分子质量较大、低浓度、难挥发、热不稳定性和强极性农药，具有检测灵敏度 高、选择性好、结果可靠等优点。l c m s 先后产生4 种接口技术：热喷雾、粒子束、 电喷雾电离、大气压化学电离。j a n s s o n 等闭l 采用h f l c m s 法分析水果和蔬菜中5 7 种 农药残留。庞国芳等【3 l j 建立的多残留方法采用l c m s m s 技术，可同时分析测定多达 数十种不适于g c 分析的农药。吴永江等1 3 2 】用h p l c m s 法测定铁皮石斛和西洋参及制 剂中多菌灵残留。 ( 2 ) 超临界流体色谱( s f c ) ：超临界流体( 常用的有c 0 2 ) 是处于临界温度和临界压 力的一种物质状态。它弥补了g c 和h p l c 各自的不足，由于s f c 具有g c 和h p l c 的 双重性质，其粘度小、传质阻力小、扩散速度快，其分离能力和速度可与g c 相比。超 临界流体色谱可以使用各种类型的较长色谱柱，可以在较低温度下分析分子量较大、对 热不稳定的化合物和极性较强的化合物，可与各种气相、高效液相色谱检测器匹配，可 与红外光谱仪、质谱仪联用，可以通过调节压力、温度、流动相组成多重梯度，选择最 佳色谱条件，已成为一种强有力的分离和检测手段。e l - s e a i d 等【3 3 】采用s f c 技术对罐 头食品、水果、蔬菜中合成除菊酯、氯基甲酸类等农药残留进行分析。 ( 3 ) 毛细管电泳法( c e ) ：由于毛细管电泳法具有分离效率高、快速、样品用量少、 运行成本低等特点，近年来得到了迅速发展。它非常适合用于那些难以用传统的高效液 相色谱分离的离子化样品的分离与分析，其分离效率可达数百万理论塔板数，操作简便， 具有很大的灵活性，但是毛细管电泳尚缺乏灵敏度很高的检测器，可利用的紫外检测器 虽能检测几个皮克，但因样品量只用几个纳升的体积，故所用样品浓度被限制在1 0 r 6 。 f a r r a na 等【3 4 】建立了用胶束电动毛细管法测定乐果、保棉磷等有机磷农药的方法。阙未 旺f 3 5 】采用胶束毛细管电泳法测定有机磷农药，分离检测效果良好。 ( 4 ) 传感器技术：传感器法是将传感技术与农药免疫分析技术结合而建立起来的， 有机磷农药降解菌的筛选、分离鉴定及其降解动力学特性研究 可以说它是免疫分析技术的一种延伸或分支，包括生物传感器和免疫反应传感器等。其 基本原理是将生物敏感元件发生的特异性反应及信号经由物理元件转变为光、电、声等 易检测信号，从而间接获知待测物的有关信息。该方法具有分析样品用量少，响应速度 快，甚至可以实现在线快速跟踪分析的优点。缺点是分析结果的稳定性差、重现性差、 使用寿命短和使用成本高。a l b a r e d a s i r v e n t 掣3 6 】用戊二醛交联法将乙酸胆碱酯酶固定在 铜丝碳糊电极表面制成传感器，可检测1 0 0 0 m o l l 的对氧磷和1 0 d l m o l l 的克百威。 ( 5 ) 免疫分析o a ) ：免疫分析被列为9 0 年代优先研究、开发和利用职权的农药残 留分析技术。免疫分析法是一种以抗体作为生物化学检测器对化合物、酶或蛋白质等物 质进行定性和定量分析的分析技术。免疫分析具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、分 析容量大、分析成本低、安全可靠等优点，特别适用于难气化与难分离的高极性离子性 农药或大分子化合物的分析。目前，在农残快速检测中应用最多的酶免疫测定技术 ( e n z y m e 1 i n k e di m m u n oa s s a y ，e l i s a ) ，农药残留分析中用得最多的是酶联免疫吸附测定 法。l e e 等【了7 j 建立了一种酶联免疫吸附测定法用于检测农作物和水中i p r o v a l i c a r b 的残留 量。王军等【3 8 j 报道可用单克隆抗体e l i s a 检测番茄和苹果中的噻菌灵，检出限小于 0 2 m g k g 。 1 4 微生物降解有机磷农药的研究进展 1 4 1 农药污染现状 农药污染是我国影响范围最大的一种有机污染，不仅污染土壤环境和农作物，而且 还进一步污染到地面水体和地下水以及海洋环境，直接威胁着人类的生存环境和身体健 康。湖南省相关调查显示，由于农药质量问题、不合理用药和喷施机械落后等原因，每 年因食用农药残留超标的农产品而中毒或农药生产过程中发生中毒的人数达千余人，其 中死亡数十人。全省每年农药使用量达6 万吨以上，各种规模的生产性中毒事故每年发 生百余起，浪费农药4 万多吨，造成直接经济损失达6 亿元。加入w t o 后，国内外市 场对农产品中农药残留的严格要求，向我国农产品提出了严峻的挑战。因此，如何降低 农产品中有机磷农药的残留和解决农田生态系统中有机磷农药污染问题，已经成为急需 解决的问题p 引。 1 4 2 微生物降解有机磷农药残留 我国是个农业大国，农药，尤其是化学农药的使用，依然是保证粮食作物增产、稳 产的重要的和有效的手段，为了解决这个矛盾，一方面要开发高效、低毒、低残留的化 学农药或生物农药，另一方面则是要找到能够高效、快速降解农药残留的制剂i 加j 。关于 生态环境中残留农药的降解，目前研究者认为生态系统中普遍存在光解、水解、植物修 复、生物修复等降解途径，且这些降解途径与农药本身的化学性质、结构等都密切相关， 其中降解的主要途径是植物修复和生物修复( 主要是指微生物降解) ，而光解和水解作用 效果相对有限且过程漫长，因此自然生态系统中广泛存在的微生物，担负起了农药污染 硕十学位论文 的“清洁工 的重任。农药的微生物降解是指在微生物作用下使农药的结构发生改变， 导致农药的化学和物理性质改变的过程，通过将农药从大分子化合物降解为小分子化合 物，最后成为h 2 0 与c 0 2 ，实现对环境的无害化降解，对降解农药的研究始于4 0 年代末， 至今已取得了很大进展，表现在降解农药的微生物种类不断被发现，降解机理日趋深入， 降解效果稳定提高等方面。 1 4 2 1 有机磷农药降解菌的获得 可降解有机磷农药微生物的获得途径主要有：从受有机磷农药严重污染的土壤中筛 选分离具有降解有机磷农药特性的菌种，在此基础上进行诱变育种及构建工程菌，这是 目前采用最多的一种方法。定向培育优良菌种近年来也受到人们的关注，其方法是在土 壤中通过人为多次施药，培育出可降解该有机磷农药的微生物，当再次施药时，经降解 速率的测定，如发现有机磷农药在该土壤中的降解速率快于未施药土壤，则可确定可降 解该种有机磷农药的微生物种群己被培育起来，而后从中分离出高效菌株。a l i a n w 1 4 l j 等通过向土壤中施加萘丙酸草胺诱发该农药降解菌的产生并分离。王永杰1 4 2 j 通过紫外诱 变育种获得高效菌株。刘玉焕等1 4 3 j 用n t g 诱变曲霉属乐果降解菌，经测定该诱变菌株对 乐果的降解率明显提高。 1 4 2 2 降解有机磷农药的微生物种类 土壤中的微生物具有种类多、变异快、适应强等特点，是生物修复的重要资源。细 菌由于其具有强的适应能力、易被诱变的特点，在农药降解中占据着重要的地位。目前， 已分离出来的能降解有机磷的微生物有细菌【4 4 1 、放线菌、真菌、藻类【4 5 】等，主要分离到 的细菌有：假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、节细菌属( a r t h r o b a c t e r ) 、 棒状杆菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 、放线菌等；真菌有：木霉属( t r i c h o d e r m a ) 、曲霉属 ( a s p e r g i l l u s ) 、青霉) 匮( p e n i c i l l i u m ) 酵母菌属( s a c c h a r o m y c e s ) 等；还有某些藻类对甲胺 磷也有一定的降解作用，如小球绿藻属( c h o r e l l a ) 能降解对硫磷、甲拌磷等i 钓j 。表1 2 中 列出了几种降解有机磷农药的主要微生物【3 j 。 从表1 2 可以看出，一种有机磷农药可被多种微生物降解；同时，一种微生物也可 对多种有机磷农药进行降解。这体现了微生物种类的多样性以及某些微生物功能的多样 性，同时提示某些微生物可以应用于一种或多种农药的降解。可以预见，随着有机磷农 药新品种的不断涌现，新的污染问题也将产生，新的可降解这些有机磷农药的微生物也 将被人们发现和利用。 表1 2 降解有机磷农药微生物种类 t a b 1 2m i c r o b e so fd e g r a d i n go r g a n o p h o s p h o r u sp e s t i c i d e s 有机磷农药降解菌的筛选、分离鉴定及其降解动力学特性研究 = ；= = ；= ；= = = = = = = ；= = = ；= = = = = ；= ；= = = ；= ；= = = ；= ；= ；= ；= = = ；= ；= = ；= ；= ；= ；= ；昌 对硫磷 假单胞菌属、芽孢杆菌属、黄单胞杆菌属、固氮极毛 曲霉属、青霉属、小球绿澡属 杆菌属、短杆菌属、极瘤细菌属、不动菌属木霉属 甲拌磷假单胞菌属、硫杆菌属小球绿澡属 甲基对硫磷 假单胞菌属、芽孢杆菌属、短杆菌属、黄杆菌属、邻 假单胞菌属 马拉硫磷假单胞菌属、节细菌属、黄杆菌属、极瘤细菌属木霉属、曲霉 苯硫磷芽孢杆菌属 敌敌畏假单胞菌属、不动菌属木霉属 地虫磷根霉属、青霉属 乐果假单胞菌属、不动菌属、类产碱假单胞凶属曲霉属 1 4 2 3 降解有机磷农药微生物的特性 ( 1 ) 微生物降解有机磷农药的机理 有机磷农药进入环境后可以通过各种途径进行降解，包括物理降解、化学降解和微 生物降解。物理降解和化学降解主要包括光反应、热反应、氧化还原反应、电化学反应 等；微生物降解主要是多种酶促反应1 4 7 j ，其中，降解方式主要有氧化、还原、脱氢、合 成等几种类型。可降解有机磷农药的酶有多种，主要包括加氧酶、脱氢酶、偶氮还原酶 和过氧化物酶等l 删。在许多情况下，有机磷农药的微生物降解是在多种酶的协同作用下 完成的，因此，与物理和化学降解相比，微生物降解具有反应条件温和、反应速度快和 反应专一性强的特点。 微生物对农药的作用方式可分两大类，一类是微生物直接作用于农药，其实质是酶 足反应。当微生物对农药的降解作用是由胞内酶引起时，整个的降解过程为【4 9 j ：首先将 农药吸附于微生物细胞表面，这一过程是一动态平衡，也是导致降解初期出现“迟缓期 的关键阶段。然后农药穿透细胞膜进入胞内，在菌量一定时农药对细胞膜的穿透率与农 药分子结构参数密切相关。最后农药在细胞膜内与降解酶结合发生酶促反应，这是一个 快速过程。 另一类是通过微生物的活动改变了化学和物理的环境而间接作用于农药。常见的作 用方式有3 种：矿化作用：指微生物直接以有机磷农药作为生长基质，将其完全分解成 为无机物如c 0 2 和h 2 0 等的过程。许多化学农药是天然化合物的类似物，某些微生物具 有降解它们的酶系。它们可以作为微生物的营养源而被微生物分解利用，生成无机物、 二氧化碳和水。矿化作用是最理想的降解方式，因为农药被完全降解成无毒的无机物， 如石利利等【5 0 】研究了假单胞菌d l l - 1 在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能及降解机 理后指出，d l l - 1 菌可以将甲基对硫磷完全降解为n z 0 3 和n 2 0 s ：共代谢作用：指微生物 在有其可利用的碳源存在时，对其原来不能利用的物质也可分解代谢的现象。共代谢现 象【5 1 j 最早是在产甲烷菌中发现的，该菌也能够将乙烷氧化，但不能利用它作为生长基质。 共代谢反应中产生的既能代谢转化生长基质又能代谢转化目标污染物的非专一性酶，是 硕+ 学位论文 微生物共代谢反应的关键【5 2 j 。非专一性酶经生长基质诱导合成，在基因水平上通过基因 抑制因子与操纵子的相互作用开启m r n a 的转录来完成；种间协同代谢：指同一环境中 的几种微生物联合代谢某种有机磷农药。 ( 2 ) 微生物降解农药的途径 酶促作用【5 3 j ：农药的微生物降解通过生物酶的作用，将农药分解成小分子化合物的 过程，一般农药的微生物降解可分为三个阶段：初级生物降解，有机污染物在微生物的 作用下，农药本来的结构发生部分变化，改变原污染物分子的完整性；环境容许的生物 降解，微生物除去农药的毒性；最终生物降解，农药通过生物降解，从有机物向无机物 转化，完全被降解为二氧化碳、水和其他化合物，并被微生物同化。 非酶促作用【5 3 j ：包括以下几个方面：脱卤作用，此作用常见于农药的降解，它是某 些脂肪酸生物降解的起始反应；脱烃作用，作用发生在某些有烃基连接在n 、o 或s 原 子上的农药；胺及酯的水解，如磷酸酯类杀虫剂，酰胺类如苯胺类除草剂等等，有些微 生物可水解这些化合物中的酰胺和酯键；还原作用，由微生物引起的还原作用主要有硝 基( - n o ：) 还原成