（作物遗传育种专业论文）果蔗乙烯生物合成关键酶基因的克隆及表达分析.pdf

福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 摘要 乙烯( e t h y l e n e ) 是一种植物激素，在植物的整个生命周期中起着至关重要的作用。它 对植物的种子萌发、叶片和花器官的衰老、果实成熟、性别分化等都有着重要影响，同时能 对逆境胁迫如机械损伤、冷害、渍水、病原菌入侵等做出应答反应，从而提高植物的抗逆性， 同时也参于植物细胞的程序性死亡。植物体内乙烯的生物合成是在a c c 合成酶( a c s ) 和 a c c 氧化酶( a c o ) 的催化下进行的，这两个酶的活性直接决定着乙烯的产量，利用基因 工程技术，克隆出乙烯合成过程中的两个关键酶基因，通过反馈调节、反义表达等技术调控 乙烯的生物合成，从而达到调控植物生长发育、成熟衰老、抗逆等生理等过程是近来人们研 究的热点。本研究以果蔗为实验材料，利用同源克隆技术克隆了a c o 基因，并对该基因做 了相关研究。 1 、设计了a c o 基因的特异引物，分别从d n a 和r n a 两个方面克隆出a c o 基因序列， 测序结果表明：该基因的d n a 序列为1 1 5 6 b p ，相应的e d n a 序列为1 0 0 1 b p ，该基因含有 一个1 5 5 b p 的内含子。将该基因在g e n e b a n k 上利用b l a s t 软件进行同源性检索发现与甘蔗 的同源性达到9 8 ( a y 5 2 1 5 6 6 1 ) 与水稻的同源性达到8 9 2 、利用s o u t h e r n 杂交方法分析该基因在1 3 个果蔗材料基因组中的拷贝数，发现该基 因在拔地拉、歪干担、丰城紫皮、白鳝、巴新、肚度、福安、宁德材料中有两个拷贝，而在 其他的几个材料中都只发现有一个拷贝。 3 、利用乙烯利诱导该基因的表达研究中发现：在乙烯利处理后的6 h 内，该基因的表达 受到抑制，表达量明显降低，当到达9 h 时该基因又恢复正常的表达水平，1 2 h 后超出正常 表达水平，有明显上调表达的现象。之后表达量又开始下降，等到7 2 h 之后，又保持了原有 的表达水平。外源乙烯诱导该基因表达量的变化趋势是一个横着的“s ”型 4 、本实验构建了a c o 基因的植物真核表达载体和原核表达载体，并将原核表达载体转 化到大肠杆菌中，利用i p t g 成功诱导了该基因的表达，通过s d s p a g e 分析发现，在大肠 杆菌中分离出约4 0 k d a 蛋白质。 关键词：果蔗、a c o 基因、同源克隆 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 a b s t r a c t e t h y l e n ei sak i n do fp l a n th o r m o n e sw h i c hp l a ya l li m p o r t a n tp a r ti nt h ew h o l el i f ec i r c l eo f p l a n t i ti sn o to n l yh a sg r e a ti n f l u e n c e so ns e e dg e r m i n a t i o n 、p l a n td e v e l o p i n g 、f r u i tr i p e n i n g ，s e x d i f f e r e n t i a t i o n ，b u ta l s oc a nm a k er e s p o n s er e a c t i o nt os t r e s s e ss u c ha sm e c h a n i c a ld a m a g e ，c o l d d a m a g e ，w a t e r l o g g i n ga n dp a t h o g e ni n v a s i o n e t c s o ，t oi m p r o v er e s i s t a n c eo fp l a n ta n di ta l s o p a r t i c i p a t ei np l a n tc e l l sp r o g r a m m e dd e a t h b i o l o g ys y n t h e s i so fe t h y l e n ed e l a y so nt h ec a t a l y s i s o f1 一a m i n o c y c l o p r o p a n e - q c a r b o x y l a t e ( a c c ) o x i d a s ea n da c cs y n t h a s e t h ea c t i v i t yo ft h et w o e n z y m e sd e c i d e se t h y l e n e o u t p u td h c t l y i no r d e rt o t of u r t h e rr e g u l a t e p l a n t sg r o w t h ， e v e l o p m e n t ，m a t u r a t i o na n ds e n e s c e n c e ，p h y s i o l o g i c a ls t r e s s ，f e e d b a c k r e g u l a t i o na n da n f i s e n s e e x p r e s s i o nt e c h n i q u ew e r eu s e dt oc o n t r o le t h y l e n e b i o l o g ys y n t h e s i sa n dg e n e t i ce n g i n e e r i n g t e c h n i q u ew a su s e dt oc l o n et h ek e ye n z y m e s i nt h i ss t u d y , u s i n gc h e w i n gc a n ea se x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s ，c l o n e da c og e n eb yh o m o l o g yc l o n i n gt e c h n i q u e sa n dm a d es o m eo t h e rr e s e a r c h e so n i t 1 d e s i g ns p e c i f i cp r i m e rp a i r so fg e n eo fa c o ，t h eg e n ea c o w a sa m p l i f i e db yr t - p c r f i o mt w oa s p e c t so fd n aa n dr n a s e p a r a t e l y , t h er e s u l to fs e q u e n c i n gs h o w e d ：t h es e q u e n c eo f d n ai si15 6 b p ，t h ee d n ai s10 01b pa c c o r d i n g l y , t h i sg e n ec o n t a i n si n t r o na b o u t15 5 b p t o c o m p a r e t h a to f c h e w i n gc a n ea n dr i c e ，t h eh o m o l o g yo f t h i sg e n ew a s9 8 ( a y 5 2 1 5 6 6 1 ) ，a n d r i c ew a s8 9 伪p 0 0 5 5 5 9 3 ) b yh o m o l o g ys e a r c h 2 t h ec o p i e so fa c oo n13d i f f e r e n tc h e w i n gc a n em a t e r i a l sw e r ea n a l y z e db ym e a n so f s o u t h e r n b l o lt h er e s u l td e c l a r e d ：t h i sg e n eh a st w oc o p i e si nb a d i l a , w a i g a n d a n ，f e n g c h e n g z i p ， b a i s h a n ，b a x i n ，d u d u , f u a na n dn i n g d e ，h a v eo n ec o p yi nt h er e m a n i n gm a t e r i a l s 3 a c og e n ew a si n d u c e db ye t h y l e n e ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ：i nt h eb e g i n n i n g ，t h e e x p r e s s i o no ft h i sg e n ew a si n h i b i t e d , b u ta f t e r9h o u r s ，t h ee x p r e s s i o nr e c o v e r e dn o r m o ll e v e l ，12 h o u r sl a t e r , t h ee x p r e s s i o no v e r s t e pn o r m o ll e v e la n di n c r e a s eo b v i o u s l y t h e n , t h ee x p r e s s i o n s t a r t e dt od e c l i n e ，a f t e r7 2h o u r s ，r e c o v e r e dt ot h eo r i g i n a ll e v e l t h i sp h e n o m e n o ns h o w e d ：u n d e r t h ei n d u c i n go f e t h y l e n e ，t h ee x p r e s s i o no f t h i sg e n ee m e r g e d “s t e n d e n c y 4 e u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro f a c o a n dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o ro f a c ow e r ec o n s t r u c t e d t h e yw e r et r a n s f o r m e di n t oe c o l ib l 21 ( d e 3 ) a n di n d u c e dt oe x p r e s s a4 0 k d af u s i o n p r o t e i np r o d u c tw a sd e t e c t e db ys d s p a g ew h i c hi si nt h es a l t l es i z ea se x p e c t e d ，t h er e s u l t s h o w e dt h a ti tw a se x p r e s s e di ne s c h e r i c h i ac o bb l 21s u c c e s s f u l l y k e yw o r d s ：c h e w i n gc a n e ，a c og e n e ，h o m o l o g yc l o n e 2 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中己作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名： 壤奇 论文使用授权的说明 日期：d 叉o6 i 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位c 论文作者亲一：发扩寄吼 指导教师亲笔签名： 闭卅刁 口 。p 6i | 7 日期：pr dz j 7 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 1 前言 1 1 植物生长物质及其化学调控作用 植物生长物质( p l a n tg r o w t hs u b s t a n c e s ) 是指且有调节植物生长发育的一些生理活性物 质，包括植物激素( p l a n th o r m o n e so rp h y t o h o r m o n e s ) 和植物生长调节剂( p l a n tg r o w t h r e g u l a t o r ) 两类。植物激素是植物体内合成的并从产生之处运送到别处，对植物生长发育产生 显著调控作用的几类微量有机物质。也称为植物天然激素或植物内源激素。植物生长调节剂 是指一些具有植物激素活性的人工合成的物质。目前大家公认的植激素有5 类，即生长素类、 赤霉素类、细胞分裂素类、乙烯和脱落酸。前3 类都是促进生长发育的物质，乙烯主要是一 种促进器官成熟的物质，脱落酸是一种抑制生长发育的物质。 生长素( a u x i n ) 是最早发现的一种植物激素，主要在植物的叶原基、嫩叶和发育中的种子 中合成，在植物的根尖、胚中也有合成。生长素在高等植物中分布很广，主要分布在根、茎、 叶、花、果实、种子及胚芽鞘等生长旺盛的部位而在趋向衰老的组织和器官中则甚少。生长 素可从合成部位向其他组织运输，主要采取极性运输方式。生长素的生理作用很广泛，它影 响细胞的分裂、伸长和分化，也影响营养器官和生殖器官的生长、成熟和衰老。其主要作用 是促进生，这是生长素促进细胞伸长的结果。生长素的另一个作用与顶端优势，生长素可以 代替顶芽的作用控制侧芽的萌动。 赤霉素( g i b b e r e l l i n ) 和生长索一样较多存在于植物生长旺盛的部分，如茎端、嫩叶、根尖 和果实种子，赤霉素在植物的体内运输没有极性。根尖合成的赤霉素沿导管向上运输，而嫩 叶产生的赤霉素则沿筛管向下运输。赤霉素在高等植物中生物合成的位置至少有3 处：发育 着的果实( 种子) ，伸长着的茎端和根部。其主要作用是促进麦芽粮化、促进营养生长、防止 脱落和打破休眠。 细胞分裂素( c y t o k i n i n ) 是一类促进细胞分裂、诱导芽的形成并促进其生长的植物激素。 高等植物中的细胞分裂素主要存在于进行细胞分裂的部位，如茎尖、根尖、未成熟的种子、 萌发的种子和生长着的果实。细胞分裂素在植物体内的运输，主要是从根部合成处通过木质 部运到地上部，少数在叶片合成的细胞分裂素也可能从韧皮部运走。其主要作用就是促进细 分裂和扩大、诱导花芽分化和延缓衰老。 脱落酸( a b s c i s i ca c i d ) 在植物体中的根、茎、叶、果实、种子都可以合成，它是植物体内 最重要的生长抑制剂，它能抑制核酸和蛋白质的生物合成促过成熟和脱落【1 j 。 乙烯( e t h y l e n e ) 是一种结构极其简单的植物激素，在植物的整个生命周期中起着至关重 要的和作用，如植物的种子萌发、生长发育、叶片和花器官的衰老、果实的成熟、性别的分 化等都有着广泛的影响。同时与逆境胁迫如机械伤害、冷害、渍水、病原菌入侵等方面有关； 并参于植物细胞的程序性死亡，促进凋谢和d n a 的片段化f 2 1 。乙烯还能诱导产生多胺，这 是一种作用非常广泛的生理活性物质，对植物的生长发育的许多过程都具有调节作用。乙烯 的作用是双重的，既可刺激生长，也可抑制生长而促衰老成熟，这与植物的乙烯的浓度、植 物的发育时期和生理状态有关。对生长器官，它一般抑制伸长，而在成熟器官，它促进成熟、 3 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 衰老和脱落。所有的植物组织都能产生乙烯，而产量通常很微少，但是当植株受到外在的环 境刺激时，乙烯的产量会明显增加，同时在植株生长发育的某些阶段，如种子萌发、成熟、 衰老等阶段，乙烯的产量也会明显增加。许多研究表明乙烯对植物的各种生理影响都由控制 乙烯的生物合成和感受的因子所调节( 3 】。 1 2 乙烯的生理作用 1 2 1 乙烯在植物生长发育中的作用 实验结果表明，乙烯在植物体内的作用方式在于它能调节r n a 和蛋白质的合成，并能 够调节细胞质膜的透性嗍。同时，乙烯在其生物合成过程中能进行自我正、负反馈调节 5 - 1 5 】。 在植物的生长发育过程中，乙烯能够促进果实的成熟、促进离层的形成和植物器官的脱落、 加速植物的衰老、促进次生物质的排泌、使黄化幼苗顶端钩展开、抑制幼苗伸长、促进根的 形成、并与植物性别分化和植物幼苗上胚轴的负向地性生长等功能有密切关系。当乙烯与生 长素同时作用植物时其效果更为显著 4 , 1 6 , 1 7 】。 l 211 乙烯与营养生长 乙烯对植物幼茎的生长有抑制作用。黄化豌豆幼苗经微量的乙烯处理后发生三种反应： ( 1 ) 茎伸长生长受抑制；( 2 ) 上胚轴直茎膨大；( 3 ) 茎的负向重力性消失，发生横向生长。 这就是所谓的“三重反应”( t r i p l er e s p o n s e ) 。这种生长习性可能是幼苗生长时避免障碍物的 适应手段。因障碍物的胁迫而产生乙烯，通过乙烯的物殊作用使生长方向发生改变【l 引。 1 2 1 2 乙烯与生殖生长 乙烯能诱导菠萝等风梨科植物开花，并且开花提早，花期一致，但乙烯对大多数植物的 成花诱导没有作用。在成花诱导完成以后，乙烯表现出对性别分化具有调控作用。研究表明： 用1 0 0 - 2 5 0 m g k g 乙烯利处理黄瓜幼苗，可使幼苗早期产生雌花，雌花数成倍增加【1 ”3 1 。此 外，乙烯利还能诱导水稻和小麦的雄性不育。 乙烯的另一个主要功能是对花衰老的调控。以牵牛花和康乃馨为材料的研究揭示，花老化时 产生大量的乙烯，施用乙烯利或a c c 可促进花凋谢，但施用乙合成抑制剂或作用抑制剂( 如 【a g s 2 0 3 】3 ) 可明显延缓衰老。花老化与授粉具有密切的关系，康乃馨及喇叭花在授粉后， 雌花及花瓣中的乙烯也迅速增加。但很多植物花的凋谢不受乙烯的影响，常见的例子有蝴蝶 花及菊花等，通常这些花被称为乙烯不敏感花卉，而这类花卉的老的控制因素隧待研究【l 引。 1 2 1 3 乙烯与果实成熟 乙烯是公认的成熟激素。在果实成熟的过程中，乙烯含量的变化动态最有规律也最明显， b i a l e 研究认为，可根据果实采后成熟时有无呼吸跃变现象这一特点，将果实分为跃变型和 非跃变型两大类1 2 4 1 。m c m u r c h i e 等提出跃变型果实中乙烯生成有两个调节系统：系统i 负责 跃变前果实中低速率的基础乙烯的生成，系统i i 负责跃变时成熟过程中乙烯自我催化大量生 成，而非跃变型果实的乙烯生成速率相对较低，变化平稳，整个过程中只有系统i 的活动( 系 统i i 不参于) 【2 5 1 。因此，跃变型果实的乙烯的产生与呼吸跃变有着相似的模式，即有一个 4 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 明显的上升期和生产高峰，只是在时间进程式上，各果实品种间可有所不同，而非跃变型果 实的内源乙烯水平一直维持在很低水平，没有产生上升跃变现象2 6 1 。这在许多跃变型果实 如猕猴桃2 72 8 1 、苹果、香梨、柿子【3 1 1 、巴梨p 2 1 、核桃p 3 1 及非跃变型果实如板栗3 4 1 、柑 桔3 5 1 、葡萄p 6 3 7 、鲜枣p 7 1 上都已有研究报道。 在跃变型果实中诱导和促进成熟证据有以下几点：( 1 ) 外源乙烯处理能加速果实的成熟； ( 2 ) 用乙烯生成抑制剂o w g a o a ) 处理果实抑制成熟；( 3 ) 乙烯生成增加与呼吸强度上升时间 进程一致；( 4 ) 除去果实中的乙烯，推迟成熟；( 5 ) 乙烯作用拮抗物( a g + , c 0 2 ) 抑制成熟；( 6 ) 利用a c c 合成酶和a c c 氧化酶基因的反义r n a 技术，能抑制乙烯的产生，同时也延缓了 果实的成熟。乙烯对非跃变型果实如柑橘和橙等亦有同样效果。乙烯促进果实成熟的可能原 因是：增强质膜的透性，加速呼吸，引起果肉有机质的强烈转化【l 】。 1 2 1 4 乙烯与器官脱落 乙烯对植物器官的脱落有极显著的促进作用。空气中乙烯浓度相当低时，即可促进植物 叶片和果实即可脱落。实际上，在自然脱落的过程中，也有乙烯参与。用乙烯利处理棉花叶， 有加速离层的形成、叶片的衰老( 变黄) 和脱落的作用，老叶表现更为明显。浓度高时，幼 叶也会脱落。在其浓度合适时，不影响功能叶片及幼叶的生长，而只加速老叶的脱落。生产 上可喷施浓度适当的乙烯利促使棉花老叶脱落，以改善棉茎部通风透光条件。有人用 1 0 0 0 m g k g 乙烯利水溶液喷施在葡萄上，很快引起落叶，而果实不掉，可提高收获时的工作 效率。在果树栽培中，在盛花期和末花期，用2 4 0 4 8 0 m g k g 的乙烯利喷施梨，可达到疏果 的效果。 叶片的脱落由叶柄离层组织所控制，当离层细胞处于敏感状态时，低浓度的乙烯即能促 进纤维酶及其他水解酶的合成与转运，导致叶片脱落。乙烯对花和果实的脱落具有与落叶相 似的调节作用。 1 2 1 5 乙烯与次生物质的排出 乙烯还可促进植物体内次生物质的排出，从而达到增加产量效果。实验证明，无论是乙 烯利的水剂或油剂处理，都能使乳胶的产量第2 d 即上升。总干胶产量可增加2 0 , - - 4 0 以上 3 8 1 。此外，乙烯也能增加漆树、松树和印度紫檀等重要木本经济作物的次生物质的产量。 有人还用乙烯利进行了刺激安息香产脂的试验，处理后的产脂量可增大7 9 倍，有的达1 0 倍以上。 1 , 2 2 乙烯在植物抗逆反应中的作用 植物在生长发育的过程中会遇到各种各样的不利环境，这些对植物生长发育的环境就构 成了逆境。逆境会对植物的生长发育造成一定的压力( 胁迫) 甚至伤害( 胁变) ，而植物在 长期的进化过程中也形成了对各种胁迫一定的抵抗与适应能力( 即抗逆性) ，这种抗逆性可 以表现在基因表达调控的分子水平与形态结构适应的水平，也可以表现在植物体内各种组成 成分变化及代谢调节的生理生化水平 3 9 , 4 0 1 。 5 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 在生物学系统中，逆境乙烯充当一个信号分子的角色，具有“遇激而增，信息应变”的性 质和作用【4 。经研究发现，各种环境的胁迫都能引起乙烯产量的增加，如：机械损伤胁迫、 渍水胁迫、低温胁迫、干旱胁迫、病源病入侵等，都能引起引烯产量的增加。目前国外对逆 境乙烯的产生有2 种推测：一种认为逆境乙烯的产生仅是植物受害后的症状，可通过降低乙 烯的量来提高植物的抗逆性；另一种认为逆境乙烯的产生是植物在逆境中的一种适应现象， 它可能在植物逆境胁迫的感受适应中通过启动和调控某些与逆境适应相关的生理生化过程 来诱导抗逆性的形成【4 。 l 22l 乙烯与水份胁追 植物对淹水反应与乙烯是密切相关的，体内乙烯会在较短的时间内成倍的增加，通过扩 散作用作为一种信使传播刺激信息，就地或在受影响的组织打破原有平衡【4 2 】。植物体内乙 烯的增加是由于【4 3 】：( 1 ) 植物体内乙烯向外扩散受到水的阻碍，因为乙烯在水相中扩散要 比在气相中慢大约l 万倍；( 2 ) 植物体内乙烯的合成受到淹水的刺激。乙烯大量产生后主要 生理作用有以下几点m 】：( 1 ) 刺激不定根的生成，在受淹时，通气组织和不定根的形成具 有着很大的适应意义。实验表明不定根具有较高的水分吸收率，在淹水植物中不定根的形成 和气孔再开放有关；( 2 ) 刺激通气组织的发生和发展，实验表明淹水和乙烯处理都可引起处 理部位的纤维素酶的活力的升高，在受淹植物中氧的亏缺激发了乙烯生物合成，乙烯的增加 则刺激纤维素酶的活力，从而导致通气组织的形成和发展。 b r a d f o r d 等报道，番茄在渍水胁迫7 2 个h 后，体内乙烯增至对照组的2 0 倍。董建国等 瞰】报道了在渍水前10 d 对小麦地上部分喷施a c c 或乙烯利，使小麦生长受一定程度的抑制， 并显著提高抗渍性。向日葵在渍水的情况下，根部会产生大量的高浓度的乙烯，这些高浓度 的乙烯会引起叶片的卷曲、偏上生长、脱落、茎膨大加粗、根系生长减慢等性状从而表现出 对渍水的适应性【4 3 】。有研究认为，水稻沉水时，节问生长速率的提高是3 种植物激素一乙 烯、脱落酸、和赤霉素相互作用的结果。低氧分压诱导乙烯的合成，乙烯引起脱落酸水平的 降低，而后者又是赤霉素拮抗物，赤霉素则是引起节间生长的主要激素。因此在这里乙烯是 通过促进生长来缓解水份胁迫的。徐锡增认为，杨树无性系在涝渍胁迫时体内乙烯含量提高 是苗木对涝渍胁迫的一种有效生理反应，经过一定时间的代谢调节，苗木又重新建立起与环 境之间的平衡关系，乙烯含量降低并逐渐接近正常水平晰】。 1 2 2 2 乙烯与干旱胁迫 植物在生长发育的过程中经常会遭受干旱胁迫的影响，植物在受到干旱胁迫时，体内活 性氧产生与清除的代谢系统失调，导致活性氧过量积累而破坏膜结构，进而氧化细胞内蛋白 质和核酸等重要的结构和组成物质【4 7 】。而乙烯作为植物五大内源激素之一对干旱的胁迫有 着重要的调节作用。张骁等认为，干旱胁迫下施用乙烯利不仅改善了植物体内的水分状况， 而且刺激了体内保护物质( 如腩氨酸) 的合成累积，从而稳定了细胞膜的结构；同时保护物 质的存在也会加快壁物质的填充，进而增加壁的可塑性【4 引。有研究表明，在干旱处理前用 不同浓度的乙烯利处理玉米幼苗，能显著改变其体内的相对含水量和渗透调节能力，增强其 6 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 抗旱性。乙烯提高玉米幼苗抗旱性的生理基础可能是通过脯氨酸、s o d 和p o d 的抗氧化作 用来保护细胞膜免受破坏或者是破坏程度受到消弱而提高抗旱性【4 9 1 。相反，也有实验证明， 在干旱条件下小麦幼苗喷施乙烯利，可以抑制p e p 羧化酶( p e p c a s e ) 活性，降低叶绿素含 量，增加丙二醛( m d a ) 累积，提高干旱条件下小麦幼苗叶的水势，但复水后其水势恢复 较对照慢，因而不利于小麦幼苗抵御干旱。 1 2 2 3 乙烯与其他胁迫 一般认为，乙烯对抗寒锻炼的启动无直接作用，但些证据证明，乙烯利释放乙烯促进落 叶休眠，增强抗寒力【5 0 1 ，对于香蕉来说，低温抑制了香蕉的a c c 的合成又降低了a c c 的 转化，减少了乙烯的生成【5 1 1 。而外源乙烯又能极显著地减轻n a c i 对苜蓿种子萌发的抑制作 用垆2 1 。胁迫条件下有胁迫乙烯产生，有人将胁迫乙烯产生与多胺代谢联系起来，认为胁迫 乙烯产生与多胺形成是在竞争同一底物【5 3 1 。在盐胁迫条件下，植物叶片中a c c 向乙烯转化 的效率很高，乙烯的释放造成叶片脱落。c o m e z 等【5 4 】在研究中发现，叶片中氯离子的含量 和脱落有很大的相关性，并认为乙烯对盐胁迫造成叶片的脱落起调节作用。 1 2 2 4 乙烯与植物的抗病性 植物与病原物在长期的相互作用，相互适应的，相互选择的过程中，形成了复杂的防御 病原物侵染的抗病原反应，近年来的研究发现，许多物质参于植物的抗病原反应，这些物质 包括：植物抗毒素、抗菌蛋白、几丁酶、葡聚糖酶、酯酶、蛋白酶、磷脂酶、脂氧合酶、过 氧化物酶、酚氧化酶、木质素、纤维素、富含羟基脯氨酸和甘氨酸的糖蛋白、酚多糖、黑色 素、水杨酸、茉莉酸、乙烯、多肽、寡多糖、过氧化氢和活性氧类物质盼5 6 】。其中最受人们 关注的是乙烯。 大量的实验结果表明，植物在受到病原菌侵染后其乙烯的释放量明显增加，乙烯在植物的 抗病反应中起着重要的作用5 7 堋l 。有人则更明确地指出，乙烯是植物防御反应的报警信号物 质并参与防御反应 6 9 o s o n g 等用t r i f l u m l i n 处理棉花可提高其抗镰刀菌( f o s a r i u mo xy s p o r u m ) 的抗病能力，而抗病能力的提高与乙烯含量的降低成正相关7 们。c o o p e r 等将反义a c c 氧化 酶基因转化番茄，其果实的乙烯释放量明显降低，而果实抗病菌( c o l l e t o tr i c h u mg l o e s p o r i o i d e s ) 侵染能力明显提高，比对照提高2 5 倍【7 1 1 。这一实验结果更为有力地证明番茄果实乙烯含量的 降低能提高其抗病能力。也有不同的报道，l u n d 等发现番茄感镰刀菌后乙烯大量产生，而番茄 的抗病能力的提高是和番茄对乙烯敏感性降低的缘故，并非是乙烯合成的降低所致7 2 】； l a u t o w 在拟南芥抗单孢菌的实验中则发现拟南芥抗菌性的获得需要水杨酸，而不是乙烯7 3 1 。 目前关于乙烯在植物抗病反应中的作用机理虽然尚不清楚，但所获得的实验结果已足以 证明乙烯在植物抗病反应中起着十分重要的作用，这一观点已成为人们的一种共识。至于少 数不同的报道结果，则可能是由于不同类型的植物其代谢途径不同所致。然而，关于乙烯在植 物抗病反应中的作用机理需要进一步的研究。 7 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 1 3 乙烯的生物合成途径研究进展 1 3 1 乙烯的生物合成途径 许多研究表明，甲硫氨酸( m e t h i o n i n e ) 是植物体内乙烯生物合成的前体，这一观点首 先是由l i e b e r m a n 和m a p s o n 于1 9 6 4 年基于一个化学模式系统而提出的7 4 1 。随后，他们【7 5 1 又证明1 4 c 标记的甲硫氨酸在苹果组织内转变成了h c 标记的乙烯。由此可以看出甲硫氨酸 确实可以作为高等植物乙烯合成的前体。1 9 7 9 年a d a m s 和y a n g 利用乙烯生物合成过程中 需要氧这一特性，在苹果切片上加l - m e t - o j 4 c ，追踪碳的代谢，证实了s 一腺苷甲硫氨酸 ( s - a d e n o s y l - m e t h i o n i n e ，s a m ) 和l 一氨基环丙烷- 1 - 羧酸( 1 - a m i n o c y c l o p r o p a n e - 1 - c a r b o x y l i c a c i d ，a c c ) 同是此过程的中间产物，催化s a m 为1 氨基环丙烷1 羧酸的是a c c 合酶( a c c s y n t h a s e ) ，a c c 在有氧的条件下和a c c 氧化酶( a c co x i d a s e ) 的催化下，形成乙烯。这 个方法巧妙的证明了a c c ( 1 氨基环丙烷一i 羧酸) 是乙烯生物合成的直接前体，并推断出 了乙烯生物合成途径。 0簿c,-so , 一毫c o o - 毽 辩 a 毛一s = h l ( m i c h o o c 玳 y a n g 循环 陟肿 - - h c k 一 一c 鸭一a 七一p 一。o q h 它。茸由眦 脚h 、r h ，一一o h0 1 4 厂s 强替鬣氮酸 l 诱导院子： l 氲蓉环两馄t - 羧鼹 a c c ) 撇瓴兰叫捧铡荆： c q + i c 1 1 承搪缓和c 扩等 c h l = a 毛 己蟪 l 乙蝽体粥抑涮秘： i 蓐球片二蟠、重蘸蒸珲五二婚秘a 譬t 簪 发挥生理作用 y a n g 和h o f f m a n l l 7 1 ，根据他们的研究结果 1 7 , 7 6 推断出在高等植物体内乙烯生物合成过 8 靖咖裟甜 一一一 酾 一橼 一 ， ， 目 磨慧窘” 嗽 纠腹冷 别 一一一一 一 氟髓钒籼 熊 授 ，热h 秘 生鬃0 例 ；睃 一：|；|一一靴一 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 程及及循环反应如上图。 乙烯生物合成反应分为三个步骤： 第一步：来自于a t p 的腺苷基团与甲硫氨酸结合形成s a m ，该步反应是由甲硫氨酸腺苷转 移酶( m e t h i o n i n ea d e n o s y l - t r a n s f e r a s e ) 催化。反应过程中需要a t p 的参与，这与偶联试剂 d n p 抑制乙烯生成的实验结果相符合。 第二步：s a m 在a c c 合酶( a c cs y n t h a s e ) 的催化作用下，被裂解为5 7 甲硫基腺苷 ( 5 - m e t h y l t h i o a d e n o s i n e ，m t a ) 和a c c 。a c c 合酶为乙烯合成过程中的限速酶。该酶已从 番茄和苹果中被部分纯化，并已成功的从南瓜、番茄和拟南芥等植物中分离了a c c 合酶的 基因。 第三步：a c c 在a c c 氧化酶( a c co x i d a s e , a c o ) 的催化下生成乙烯，a c o 的活性依赖于 膜的完整性，这也说明了a c c 的氧化过程可能与呼吸链或跨膜h + 运输相偶联。 1 3 2 乙烯生物合成影响因素 乙烯的生物合成受到诸多因素的影响，包括内部因素和外部因素两大类，其中内部因素 主要是：植物所处的生长发育时期，不同的生长发育阶段，乙烯的产量与合成速率存在着很 大的差异，如在幼嫩的植物组织或器官，乙烯的合成速度相对较慢，产量也相对较少，而在 植物衰老的组织内乙的合成相对较快，乙烯的含量也较高。同时不同植物间也存着较大的差 异。根据乙烯生存量的多少和性质可以划分为微量乙烯( 系统一i 乙烯) 和大量乙烯( 系统i i 乙烯) 1 7 7 。根据果实和花卉内乙烯大量生存与否，人们把植物分为跃变型和非跃变型两大 类。例如，根据花卉在开花衰老过程中花瓣内乙烯大量生成与否将花卉植物分为跃变型与非 跃变型两大类。跃变型花卉有：香石竹、满天星、蝴蝶兰等。非跃变型花卉有：菊花、石刁 柏、千里红等。 除了内部因素外，乙烯的生物合成还受到许多的外部因素的影响，如：生长素、细胞分 裂素+ 生长素、外源乙烯、细胞分裂素+ c a 2 + 、病原菌入侵、果实成熟、及诸多的胁迫因子( 热 害、冷害、旱害、涝害、盐害、c d 2 + 、l i + 、紫外线等) 7 - s f l ；乙烯生物合成及其生理作用 的抑制剂有：氨氧乙酸( a o a ) 、氨氧乙烯基甘氨酸( a v g ) 1 7 1 、水杨酸( s a ) 8 6 1 、降冰 片二烯( n b d ) 1 4 】、重氮基环五二烯( d a c p ) s 7 s 9 1 、c 0 2 + 例、a g + 1 9 1 9 2 1 等。氨氧乙酸、氨 氧乙烯基甘氨酸是a c c 合成酶抑制剂；c 0 2 + 和水杨酸为a c c 氧化酶的抑制剂：降冰片二烯、 重氮基环五二烯和a g + 则是乙烯作用抑制剂。用这些乙烯抑制剂处理香石竹、满天星等跃变 型的切花，能抑制乙烯的生物合成或拮抗乙烯作用，从而延缓切花的衰老进程【9 3 1 。 1 3 3 乙烯生物合成途径的分子生物学研究进展 高等植物体内乙烯的生合成途径已经确定【1 7 】，即以甲硫氨酸为前体，经s 腺苷甲硫氨 酸( s a m ) 、氨基环丙烷羧酸( a c c ) 而合成乙烯的。整个合成顺序是由s a m 合成酶、a c c 合成酶和a c c 氧化酶催化 1 7 , 9 4 , 9 5 】。其中s a m 合成酶基因属于管家基因，其表达量的高低对 乙烯的生物合成水平没有明显关系，主要原因在于s a m 只有部分用于乙烯的生物合成，大 部分都用于其他生物反应，如作为甲基供体参于甲基化反应，用于多胺的生物合成等 1 7 , 9 6 1 。 9 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 因此s a m 合成酶不是乙烯生物合成的关键酶。真正控制着乙的合成与否以及合成多少的是 a c c 合成酶和a c c 氧化酶。a c c 合成酶催化的反应是乙烯合成反应的限速步骤，a c c 氧 化酶则是乙烯形成酶p7 。 乙烯在调控植物的生长发育特别是在植物的开花结果以及成熟衰老过程中具有特殊的 作用，因此对乙烯的研究一直都很活跃。现已全面的进入了分子生物学水平，且不断的取得 进展。植物体内乙烯的合成多少主要是由a c c 合成酶( a c s ) 和a c c 氧化酶( a c o ) 这 两种酶的活性大小决定，而这两种酶的活性大小主要取决于控制这两种酶合成基因在m r n a 水平上表达量的多少f 9 引。利用基因工程技术，克隆a c s 和a c o 这两个基因，通过反馈调节、 反义表达等调控乙烯的生物合成，进而调控乙烯对植物的生理效应，已番茄等一些跃变型果 实中获得成功t 9 9 。研究乙烯合成酶基因和乙烯氧化酶基因的克隆、表达及调控机理，对全 面了解乙烯的生理效应及化学调控的机理具有重要的指导意义，并已成为现代植物生理学与 植物分子生物学在乙烯作用机理研究方面研究的热点。现在许多植物中克隆了这两酶的基 因，为进一步通过基因操作获得转基因的植物可以调控其乙烯的生物合成，从而调控植物的 成熟与衰老过程打下一定的基础。 1 3 3 1a c s 基因与a c o 基因的克隆及研究进展 a c s 基因是乙烯生物合过程中的限速酶基因，第一个a c s 基因序列是1 9 9 0 年v a nd e r s t r a e t e n 等从番茄果实的c d n a 文库中分离得到的1 0 0 】。y i p 等刚在e c o l i 中表达的a c s 的 c d n a 不能产生具有酶活性的a c s ，但它的1 2 肽活性位点的出现，说明它是a c s 基因。此 外，除了全长的a c s 的c d n a 克隆体外，v a nd e rs t r a e t e n 等还发表了具有4 2 0 b p 的部分核 营酸序列的克隆，它与全长的c d n a 克隆对应的区域具有高达8 2 的同源性。这进一步表 明番茄中a c s 基因不止一个。o l s o n 等【1 0 1 1 又从番茄中分离得到第二个全长的番茄果实 a c s c d n a 克隆，这两个序列极为接近。之后r o t t m a n n 等1 0 2 1 又报道了番茄另外a c s 的序 列。这更进一步说明了a c s 基因序列在番茄中是一个多基因家族。s a t o 和t h e o l o g i s 首先从 西葫芦c d n a 文库中分离出编码a c s 基因的克隆体；n a k a j i m a 等从笋瓜中分离得到了两个 a c s 基因序列及相应衍生的a a 序歹l j t l 0 3 , 1 0 4 。此后又有许多植物的a c s 基因序列被克隆出来， 已见报道的有拟南芥、小麦、水稻、大豆、绿豆、烟草、香蕉、香石竹、苹果、柿子、小胡 瓜、黄瓜、冬瓜、西瓜、马铃薯等。表l 列出了部分a c s 基因序列。 1 0 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 表1 部分已克隆的a c s 基因 t a b l e1s o m eo f a c sg e n e sc l o n e d 通过对所有a c s 基因序列的比对分析发现：它们的编码区内d n a 序列都有6 0 的同源性， 氨基酸序列的相似性变幅为4 8 - - - 9 7 ，蛋白质的同源性为5 0 - - 0 5 ，m r n a 的分子量大 小为l ，8 2 1 k b 左右，植物a c s 基因家族最保守的区段在多肽的内部，差异最大的部分在c 端【1 2 1 】。通过比较苹果、番茄、和西葫芦果实中推断的氨基酸序列，发现它们的相似性约为 8 0 ，有7 个极为相似的高度保守区域，而且各区域的相对位置大小也相同，这些保守区域 至少有8 个氨基酸残基组成，致性高达8 0 以上，其中保守区域5 被为是活性中心，它含 有一个赖氨酸残基，这个残基和结合辅酶p l p 并依赖底物的酶的钝化有关。 a c o 基因的是乙烯生物合途径中的最后一个酶，它的分离和签定要比a c s 困难的多， 因为不能用通常的生物化学方法分离出细胞提取液中的a c o ；但是，采用分子克隆的办法 签定a c o ，使a c o 的研究变得相对较容易些。d a v i e s 和g r i e r s o n 通过差显克隆技术从不同 福建农林大学2 0 0 9 届硕士毕业论文 成熟阶段的番茄中分离得到了a c o 的m r n a ，并使其在兔网状细胞裂解液系统中翻译。用 s d s p a g e 分析翻译产物，他们发现有4 8 个翻译产物的水平在成熟过程中提高。其中一个 是p g ，而其他的功能未知【1 2 2 1 。s l a t e r 等提取了成熟时的番茄p o l y ( a ) + r n a 建立了c d n a 文 库【1 2 3 1 。其中有6 个克隆编码的多肽分子量与g f i e r s o n 体外翻译研究的结果一致。并将其中 一条编码3 5 k d 蛋白质的克隆命名为p t o m l 3 。在番茄成熟过程中的绿熟期果实及叶受伤后， 编码3 5 k d 蛋白质的m r n a r 的出现与乙烯的合成量的增加一致。用p t o m l 3 作为探针在 成熟、损伤未成熟的果实及受伤叶片的r n a 中筛选出的m r n a ，体外翻译同样产生3 5 k d 的蛋白，而未受伤的果实和叶片中却未得到相应的蛋白。因此，根据上面的研究结果s m i t h 等提出，p t o m l 3 可能是一个与乙烯生物合成有关的酣1 2 4 】。用p t o m l 3 作为探针对番茄基 因组d n a 进行s o u r t h e m 杂交，结果表明，在番茄基因组中