基因突变致家族性扩张型心肌病.ppt

LMNA基因突变致家族性扩张型心肌病,中山二院心内科王景峰袁沃亮,前言,家族性扩张型心肌病（familialdilatedcardiomyopathy，FDC)，定义为至少有2个有紧密血缘关系的家庭成员有DCM。FDC的病例在逐步增加，目前占DCM的比例约为20-50。,BurkettEL,HershbergerRE.Clinicalandgeneticissuesinfamilialdilatedcardiomyopathy.JAmCollCardiol2005;45:969-81,前言FDC的遗传方式,常染色体显性遗传(autosomaldominant，AD)，目前至少16个基因被发现可引起FDC；占FDC90以上X染色体伴性遗传（X-linked）：主要见于DMD/BMD(肌营养不良)；常染色体隐性遗传(autosomalrecessive，AR)：很少最常见的是编码-肌球蛋白重链的MYH7基因以及编码laminA/C蛋白的LMNA基因,前言,2005年3月发现一名扩张型心肌病合并心房纤颤及度房室传导阻滞的患者，其伴有肢带型肌营养不良（LGMD）；家族中有多名类似的肌病患者，合并心脏损害，是一个家族性扩张型心肌病的家系。展开家系调查；并以LMNA基因作为候选基因进行突变的筛选检测，以阐述其分子遗传学机制。,资料与方法：,该家系共30人4代共9名患者，目前存活的患者共5人，病史在1538年间。临床表现：缓慢进展的四肢无力、肌肉萎缩、肌张力减退，以肩带及盆带部明显，走路呈“鸭步”，无腓肠肌假性肥大。,实验方法,血清：心肌酶（谷草转氨酶、肌酸磷酸激酶、肌酸磷酸激酶-同功酶MB、乳酸脱氢酶、乳酸脱氢酶-同功酶1）、C反应蛋白及肌钙蛋白T。所有成员行心电图、超声心动图检查肌肉活检：4位患者及一个表型正常者病理学方法：苏木素-伊红染色（HE染色）、免疫组化Dystrophin染色,异常基因检测,家系中患者临床特点符合LGMD-1B的表现。根据分子生物学的研究提示，LGMD-1B与位于1q21上的核纤层蛋白LaminA/C编码基因突变相关。以核纤层蛋白LaminA/C作为候选基因作突变的筛选，以发现其遗传规律,材料和方法,标本样品：家系所有成员抽取外周血置于EDTA抗凝管5ml2管，混匀后置于-80冰箱中保存。正常对照取自中山大学遗传学教研室采集的正常志愿者血样本。外周血基因组DNA的提取：采用QIAampDNAkit抽提DNA，按照试剂盒附带的说明书进行。LMNA基因的聚合酶链扩增：对LMNA基因的全部12个外显子、外显子-内含子交界区设计引物，进行聚合酶链（PCR）扩增。,PCR扩增反应体系：PCRBuffer3L、4种dNTP各20mmol/L、MgCl21.6mmol/L，上游和下游引物各0.17mol/L、TaqDNA聚合酶1.2U，加ddH20至30L。扩增程序：反应条件为：94预变性3min；94变性30s、54退火45s、72延伸45s、共35个循环；最后72延伸10min。反应在Geneamp9700PCR仪上完成。,测序程序：PCR产物经Excol和SAP预反应，以去除多余的引物和dNTP，然后以BigDye按标准程序进行正反双向测序（982分钟，9610秒，505秒，604分钟，30次循环；4恒温保存。）产物经纯化以清除多余的原料和非特异性产物；最后在ABI3100测序仪上进行分析。,结果,系谱图：先证者为5。该家系共四代，目前存活的共30人，有27人参与了调查，其中男性14人，女性13人；年龄0.572岁，平均年龄23.57.5岁。,临床特点,所有患者均有四肢肌无力和肌萎缩，以肩胛带和骨盆带明显，病程长者较病程短者萎缩更为明显；所有患者无关节挛缩，无腓肠肌假性肥大。先证者为43岁男性患者有胸闷、心悸、活动后气促等病史一年余，经心电图证实为心房颤动并房室传导阻滞、室性早搏；行心脏彩超示心脏扩大。给予安置VVI起搏器。,临床特点,先证者的大姐（2）和二姐（3）均有肌营养不良病史，均已发生猝死，其中二姐在医院死亡时经心电图证实为窦性停搏。11、15及1有心悸,表1患者临床情况总结,表2患者心肌酶及肌钙蛋白T结果,表3超声心动图结果,右图：11：度AVB,左图：5：房颤、起搏心律、室性早搏,15：快速房颤,1：窦性心动过速,正常对照HE染色（200）,肌营养不良HE染色（200）,可见肌肉萎缩、肌裂、核内移,正常对照Dystrophin免疫组化染色（）（200）,肌营养不良Dystrophin免疫组化染色（）(200),结果基因检查,4名患者及一名表型正常的患者子女5（2岁，目前无症状，为携带者）都存在着LMNA基因c.73CG（g.Arg25Gly）突变，家系中所有的正常人以及正常对照都没有该位点的突变。,讨论,家系病变特点总结：FDC表现符合常染色体显性遗传临床及肌肉病理提示合并肌营养不良；Dystrophin(+)。,讨论,家系病变特点总结：分子遗传学分析证实LaminA/C编码基因（LMNA）发生了突变（c.73CG），第25号氨基酸由精氨酸突变为甘氨酸（g.Arg25Gly）该突变位点为国内首次报道。,LMNA基因及其突变,LMNA基因及其编码蛋白位于（1q21.2q21.3），基因组序列全长56.7kb，包含12个外显子。LaminA/C的类型不同主要表现为端球型“尾”部长短不同。prelaminA(664a)laminA(646a)laminC(572a),LMNA基因突变,引起肌肉、心脏、神经以及间质的异常LMNA基因突变是导致FDC的重要原因。常见EDMD、LGMD、DCM，其中EDMD或LGMD类型可合并出现心脏损害,心脏损害主要表现有心律失常一个meta分析中显示，299个明确LMNA基因突变的患者，其中190个为EDMD或LGMD，109个为DCM患者。30岁以上的患者中92有心律失常，死亡的患者中46死于猝死。心脏扩大，心力衰竭限制型心肌病、右室扩大等,vanBerloJH,deVoogtWG,vanderKooiAJetal.Metaanalysisofclinicalcharacteristicsof299carriersofLMNAgenemutations:dolaminA/Cmutationsportendahighriskofsuddendeath?JMolMed2005;83(1):7983,讨论,该突变与基因、蛋白的结构和功能关系发生突变的部位位于第一外显子，在其头部球状功能区。发生突变后，该位点序列由精氨酸变为甘氨酸，其等电点由10.76变为5.9