（基础兽医学专业论文）鱼肌肉中杀虫脒和双甲脒残留检测气相色谱法的建立.pdf

华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 摘要 杀虫脒和双甲脒是两种高效的杀虫剂，这两种药物可以通过食物链对人体造成 潜在危害，其中间代谢产物对人体有致癌作用。已被农业部，卫生部列为高毒性药 物，禁止使用。建立一种有效检测这两种杀虫剂残留的方法，不仅可为出口水产品 中的违禁药物残留检测提供技术支持，而且保证水生动植物安全和消费者健康。 本文建立了鲢鱼和鳗鱼肌肉中杀虫脒以及草鱼和鳗鱼肌肉中双甲脒残留检测的 气相色谱法。 在杀虫脒残留的检测中，样品经碱化后用乙酸乙酯提取，经浓缩后用正己烷溶解， 再经f l o r i s i l 固相萃取柱净化、氮气吹于、正己烷定容后，用带有氮磷检测器的气相 色谱仪测定。该方法的线性范围为0 0 5 - 2 0 g m l ，相关系数r = 0 9 9 9 8 ，最低检测 限为3 9 9 k g ，日内、日间变异系数均低于1 2 8 ，向样品中添加5 0 - 5 0 0 9 9 k g 浓度 水平的杀虫脒，回收率在8 2 4 8 9 1 4 之间。 在双甲脒残留检测中，草鱼和鳗鱼肌肉匀浆样品经甲醇提取，正己烷萃取，再 经水解、衍生后用带有电子捕获检测器的气相色谱仪测定。在进样口温度2 5 0 、检 测器温度3 0 0 ：程序升温：初始温度5 0 ，保持0 5 m i n ，然后以7 m i n 升温到 2 2 0 ，保持5 r a i n ；载气9 9 9 9 9 高纯氮气，流量1 0 m l m i n ；尾吹气流量3 0 m l m i n 、 无分流进样的色谱条件下，该方法的线性范围为2 2 0 0 “g l ，相关系数r = 0 9 9 9 5 ， 最低检测限为5 “g k g ，日内、日间变异系数均低于1 8 1 ，向样品中分别添力1 1 0 9 9 k g 、 2 0 9 9 k g 、2 0 0 9 9 k g 浓度水平的双甲脒，平均回收率在7 8 6 9 0 5 之间。 这两种方法的建立都经过样品处理和色谱条件的优化，灵敏度、准确度和精密度 均符合我国农业部兽药残留分析方法的要求，适合在国内普及推广。 关键词：鲢鱼；草鱼；鳗鱼；肌肉；杀虫脒；双甲脒；残留；气相色谱 鱼肌肉中杀虫脒和双甲脒残留检测气相色谱法的建立 a b s t r a c t c h l o r o d i m e f o r r na n da m i t r a za r et w oh i g h l ye f f e c t i v e l yi n s e c t i c i d e b o t ha n dt h e i r i n t e r m e d i a t em e t a b o l i t e sa r eh i g h l yt o x i ca n dc a nc a u s e p o t e n t i a ld a m a g et oh u m a nh e a l t h t h r o u g hf o o dc h a i n c h l o r o d i m e f o r ma n da m i t r a zw e r er e c o n s i d e r e da sh i g h l yt o x i cd r u g s a n dtp r o h i b i t e dt oa p p l i c a t i o nb yt h em i n i s t r yo fa g r i c u l t u r ea n dt h em i n i s t r yo fh e a l t h t h ee f f e c t i v em e t h o d sf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fr e s i d u eo f b o t hd r u g sw e r ee s t a b l i s h e dn o t o n l yt op r o v i d e ds u p p o r tf o r t h ed e t e c t i o no fp r o h i b i t e dd r u g si na q u a t i cp r o d u c t sb u ta l s o g u a r a n t e et h es a f e t yo fa q u a t i ca n i m a l s ，p l a n t sa n dt h eh e a l t ho fc o n s u m e r s h 1t h ee x p e r i m e n to ft e s t i n go fc h l o r o d i m e f o r mr e s i d u ei nm u s c l eo fh y p o p h t h a - l m i c h t h y sm o l i t r i xa n de e l ，t h eo p t i m i z e ds a m p l et r e a t m e n ta n da n a l y s i sc o n d i t i o n sf o r g a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) w e r es e l e c t e d a f t e ra l k a l i z a t i o n ，t h es a m p l ew a se x t r a c t e dw i t h e t h y la c e t a t e , t h eo r g a n i cp h a s ew a sa b s t r a c t e d ，c o n c e n t r a t e d ，d i s s o l v e dw i t hh e x a n ea n d c l e a n u pb yaf l o r i s i lc a r t r i d g e t h er e s i d u ew a sd i s s o l v e dw i t hh e x a n ea n da n a l y z e db y c a p i l l a r yg a sc h r o m a t o g r a p h y - n i t r o g e n p h o s p h o r u sd e t e c t o r t h el i n e a rr a n g ew a sf r o m 0 0 5 t g m lt o2 0 1 a g m l a n drw a s0 9 9 9 8 t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r e8 2 4 8 9 14 w h e ns a m p l e sw e r es p i k e dw i t hf r o m5 o l x g k gt o 5 0 o l x g k g t h ed e t e c t i o nl i m i tw a s 3 i r t g k g t h ei n t r a - d a ya n di n t e r - d a yp r e c i s i o n sw e r el e s st h a n12 8 i nt h ee x p e r i m e n to f t e s t i n go fa m i t r a zr e s i d u ei nm u s c l eo fc t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u sa n de e lw a se s t a b l i s h e d b yo p t i m i z e ds a m p l et r e a t m e n ta n da n a l y s i sc o n d i t i o n sf o rg a sc h r o m a t o g r a p h y ( g c ) a m i t r a zw a se x t r a c t e dw i t hm e t h a n 0 1a n dp a r t i t i o n e dw i t hn h e x a n e a f t e rt h ed r u gw a s h y d r o l y z e da n dd e r i v a t i v e dw i t hh f b a ，t h ed e r i v a t i v e sw e r ea n a l y z e db yc a p i l l a r yg a s c h r o m a t o g r a p h y - e l e c t r o nc a p t u r ed e t e c t i o n m e nt h es p l i t 1 e s si n j e c t i o nw a sc a r d e do u t a t2 5 0 。c ，t h ed e t e c t o rt e m p e r a t u r ew a sa t3 0 0 。c ，t h eo v e n t e m p e r a t u r ep r o g r a mw a sa s f l o w ：i n i t i a lt e m p e r a t u r ea t5 0 。c ，h o l df o ro 5 m i n ，a n dt h e np r o g r a m m e da t7 c m i nt o 2 2 0 。c ，h o l df o r5m i n n i t r o g e n ( 9 9 9 9 9 ) a taf l o w r a t eo f3 0 m l m i nw a su s e da s a u x i l i a r yg a sf o rt h ee l e c t r o nc a p t u r ed e t e c t o r t h ec o l u m nf l o w r a t ew a s1 0m l m i n t h e l i n e a rr a n g ew a sf r o m2 1 t g lt o2 0 0 1 a g la n drw a s0 9 9 9 5 t h ea v e r a g er e c o v e r i e sw e r e 7 8 6 9 0 5 w h e ns a m p l e sw e r es p i k e dw i t h5 0 1 x g k g ，2 0 i t g k ga n d2 0 0 1 a g k g t h e d e t e c t i o nl i m i tw a s 5 1 x g k g t h ei n t r a - d a ya n di n t e r - d a yp r e c i s i o n sw e r el e s st h a n18 1 t h et w om e t h o d sc o u l dm e tt h er e q u i r e m e n t so ft h e m i n i s t r yo fa g r i c u l t u r ea n d a p p l i c a n ti nf u t u r ei nc h i n a k e yw o r d s ：c t e n o p h a r y n g o d o ni d e l l u s ；e e l ；h y p o p h t h a l m i c h t h y sm o l i t r i x ；m u s c l e ；a m i t r a z ； c h l o r o d i m e f o r m ；r e s i d u e ；g a sc h r o m a t o g r a p h y i i 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 缩略语表 i i i 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 否如需保密，解密时间年 月日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一n z - 作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：幻云，彤幽时间：加0 9 年月 i 日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 学位论文作者签名：蜘毛叱山导师签名：段皮 蛳舭毗咖上日 柳钾年多月日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 前言 1 1 引言 改革开放3 0 年来，我国水产养殖业迅速发展，养殖规模不断扩大，养殖品种增 多，产量迅猛增加，我国已经成为世界第一养殖大国。在养殖过程中，为了防病、 治病，养殖者大量使用各种药物，其中包括本文研究的杀虫脒和双甲脒。在农业部 发布的水产养殖用药须知中明确指出：杀虫脒和双甲脒这二种药物的毒性大，还可 以通过食物链对人体造成潜在危害，其中间代谢产物对人体也有致癌作用。已被农 业部，卫生部列为高毒性药物，禁止使用。国外也已经禁用。 杀虫脒由于药效准确、使用方便，曾被广泛用作重要农作物和经济养殖动物中有 害昆虫的一种内吸杀虫剂( 化学通报，1 9 7 3 ) 。但是实验证明，杀虫脒会引发人体意 识障碍、高铁血红蛋白血症、出血性膀胱炎和心脏损伤等为主要表现的全身性疾病 ( 职业性急性杀虫脒中毒诊断标准及处理原则g b1 1 5 1 3 8 9 ) ，具有致癌、致突变等 多种危害。我国农业部、卫生部发布的农药安全使用规定中把它列为高毒、剧 毒杀虫剂。在中华人民共和国农业部第1 9 3 号公告中，杀虫脒属于食品动物禁用的 兽药及其它化合物清单中的药物。欧洲的法律禁止使用杀虫脒，在食品中最高只 允许含1 0 p 眺g 。因此，建立各种不同动植物食品中的杀虫脒残留分析方法是十分必要 的。 双甲脒属于甲脒类杀虫剂，是中等毒性杀螨剂，具有触杀和熏蒸作用。中国预 防医学中心卫生研究所对双甲脒的毒性进行了系统的研究，研究表明，双甲脒及其 中间代谢产物对人体具有急性毒蓄积和三致( 致癌、致畸、致突变) 作用。该类药 物还可通过食物链的传递对人体健康造成危害。该类药物国外也已被明令禁用。在 中华人民共和国农业部第1 9 3 号公告中，双甲脒已划入食品动物禁用的兽药及其 它化合物清单中。早在1 9 9 6 年6 月国家就发布了双甲脒等农药在食品中的最大 残留限量，内容涉及到蔬菜、水果、食用油等农产品。2 0 0 7 年6 月2 0 日，美国环 保署( e p a ) 宣布拟修订双甲脒( a m i t r a z ) 的联邦现行法规，涉及的产品包括：蜂 蜜、蜂巢、棉花、蛋、山羊、家禽、绵羊、蛇麻草、乳、猪、牛。但是，在水产品中 双甲脒残留限量尚未提出，适合水产品中双甲脒残留分析方法尚未建立。我国是水产 养殖和水产品消费与出口的大国，建立广泛适用的水产品中双甲脒残留分析方法是 十分必要的，这也是我们选择草鱼和鳗鱼为样本建立双甲脒残留检测方法的出发点。 鱼肌肉中杀虫脒和双甲脒残留检测气相色谱法的建立 1 2 杀虫脒的研究进展 1 2 1 杀虫脒的结构特点 杀虫脒( c h l o r d i m e f o r m ) ，化学名为n ( 4 氯邻甲苯基) n ，n 二甲基甲脒，别名 n ( 2 甲基4 氯苯基) - n ，n 二甲基甲脒；氯苯脒；。杀螨脒；克死螨，分子式为 c i ( c h 3 ) c 6 h 3 n = c h n ( c h 3 ) 3 ，化学结构见图1 1 。纯品为白色氨样气味结晶，工业品 为浅黄色晶体分子量是1 9 6 6 8 ，蒸汽压为2 9 2 1 0 k p a ，熔点为3 2 ，沸点为1 6 3 - - 1 6 5 ，微溶于水，在丙酮、苯、氯仿、乙酸乙酯、已烷、甲醇中的溶解度大于2 0 ( 重 量体积) ，在甲醇中的溶解度大于3 0 ，密度为1 1 1 ( 2 0 。c ) ，受高热分解，产生有毒 的氮氯化物和氯化物气体，杀虫脒为剧毒品，主要用作农药杀虫剂。 c i c h 3 图1 1 杀虫脒结构图 f i g 1 - 1 s t r u c t u r eo fc h l o r d i m e f o r m 1 2 2 杀虫脒残留的毒性研究进展 无论是在微生物还是在动植物上，杀虫脒都可以代谢成n 甲酰4 氯邻甲苯胺和 4 氯邻甲苯胺。b u r k h a r d l 9 7 1 年用奶牛作研究，每天喂含杀虫脒4 0 - - 2 4 0 p p m 饲料一 公斤，4 2 天后牛肉、牛油和牛奶的残留量均低( 只有0 0 3 毫克公斤) 。而肾、肝的 残留量较高，2 4 0 p p m 组的残留量在0 4 4 , - - - , 0 5 8 p p m 。并得出在喂食含杀虫脒的饲料 后第二天，牛奶与饲料的残留量比率为1 3 。l a n g a n e r 等1 9 7 7 年用中国仓鼠作管 饲法试验，饲料中含有o 、6 0 、1 2 0 和2 4 0 p p m 的杀虫脒，发现处理组动物的细胞核 异常比例显著增加。f a o w h 0 1 9 7 8 年报告认为杀虫脒本身不会引发诱变，而它的 代谢物4 氯邻甲苯胺却引起供试菌株突变。f a o w h 0 1 9 7 8 年报告中也重复这一看 法。浙江医科大学农药室1 9 7 8 年报道，杀虫脒代谢物的衍生物亚硝基脱甲基杀虫脒 显示出其诱变性。药物的诱变性与致癌作用有着密切关系，几乎所有致癌剂也就是 诱变剂。从遗传学观点出发，所谓“癌症”都必须是体细胞发生“突变”的结果。 在短期( 6 0 天) 研究中，s u t e r 于1 9 7 6 年用0 、7 5 0 、1 5 0 0 、3 0 0 0 和6 0 0 0 p p m 的4 氯邻甲苯胺作鼠喂养试验，所有处理组动物均出现溶血性贫血症，所有处理组雄鼠， 2 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 其血红蛋白( h e m o g y l o b i n ) 的浓度、坚实细胞( p a c k e dc e l l ) 和红血球数均比对照 组偏低。并发现脾脏、膀胱充血和粘膜层毛细管扩张，同时还出现浮肿、多发性上 皮内出血及过度白血球细胞上皮局部增生等现象。s u t e r 用同样条件对兔作试验，也 发现所有处理组动物有溶血性贫血症，蛋白质总量减少，肝肿大。在二个高剂量组， 脾脏肿大并有严重的充血和出血现象。二年的长期动物喂养试验，以检验杀虫脒的 致癌作用。其结果是：s u t e r l 9 7 9 年，以含杀虫脒0 、2 0 、1 0 0 和5 0 0 p p m 的饲料，对 鼠作喂养试验。结果，在二个高剂量组，其出血组织，主要是皮下组织、后隔膜和 部分内脏( 肝、肾和脾) 的出血率增加，经显微检验，确定是患血管内皮癌( m a l i g n a n t h a e m a g i o e n d o t h e l i o m a s ) ，是多发性的，并且在肺上已观察到它的转移。s a c h s s e l 9 7 6 年以n 甲酰4 氯邻甲苯胺0 、2 0 、1 0 0 和5 0 0 p p m 对鼠作喂养试验，发现鼠的许多 组织器官受到严重破坏，所有处理组动物的皮下组织、后隔膜和内脏均有严重的出 血现象显微检验的结果是患上血管内皮癌。他以同样剂量的4 氯邻甲苯胺作试验， 结果除了出现出血现象和血管内皮癌之外，在血管还出现良性的变异体。e z u m i 等 于1 9 7 4 年以0 、2 0 、1 0 0 和5 0 0 p p m 的4 氯邻甲苯胺对兔作喂养试验，结果是所有 剂量组的动物的卵巢重量下降，在1 0 0 和5 0 0 p p m 组，观察到一个类瘤物一肝小结， 并认为它不是恶性的。在所有的研究评论中都认为，在处理的剂量下均出现肝瘤， 有时还发现肾上腺肿瘤，而对照组则没有。f a o w h 0 1 9 7 8 年报告中指出，杀虫脒 及其代谢n 甲酰一4 氯邻甲苯胺对鼠是致癌的。并出现一个与剂量有关的，用血管内 皮肿瘤来表示的恶性组织。f a o 脚h 0 1 9 7 8 年报告也指出4 氯邻甲苯胺对鼠是致癌 的，对兔的致癌性还缺乏根据( 林天壮，1 9 7 8 ) 。 1 2 3 杀虫脒检测方法研究进展 关于杀虫脒的定性定量检测方法，国内外医学及科研人员有较多的探索，这些 研究主要集中在蜂产品上，也有少量的在柑橘上的报道。这些研究成果为杀虫脒在 鲢鱼和鳗鱼中的残留研究打下了坚实的基础。主要的文献报道如下： 潘建伟等( 2 0 0 2 ) 运用气相色谱质谱法( g c m s ) 测定蜂蜜中杀虫脒及其代谢 物残留量，该方法将杀虫脒水解成4 氯邻甲基苯胺后用质谱检测器检测，方法快速、 灵敏，且重复性很好，方法测定低限为0 0 0 5 m g k g 。色谱条件为：色谱柱为h p 5 石 英毛细管柱，3 0 c m x o 3 2 m m ( 1 勾径) ，膜厚0 2 5 m ；氮气：1 0 m l m i n ；柱温：初始温 度为5 0 c ，以1 0 。c m i n 的速度升温到1 5 0 ，然后以l o 。c m i n 的速度升温至u 2 2 0 ， 保持1 5 m i n ，进样口温度：2 5 0 ；色质传输线温度：2 6 5 ；进样量：1 0 _ - 2 0 u l ； 进样方式：无分流进样。质谱条件为：电子轰击源( e i ) ：7 0 e v ：离子源温度：1 8 5 c ； 分离器温度：7 0 ；离子源灯丝电流：4 0 0 1 x a ；电子倍增器：l k v ；扫描方式：选择 离子扫描( s i m ) m z 1 0 6 ，m z 1 4 1 ，m z 1 4 3 。样品前处理方法：将蜂蜜样品中的杀虫脒 鱼肌肉中杀虫脒和双甲脒残留榆测气相色谱法的建立 用醋酸和氢氧化钠相继处理后水解成4 氯邻甲基苯胺，以液液蒸馏提取器经水蒸汽 蒸馏将4 氯邻甲基苯胺提取到异辛烷中，再用盐酸溶液提取后，于碱性条件下提取 至正己烷中进行气相色谱质谱测定。 庄金侍( 1 9 9 3 ) 采用带有热离子检测器( t s d ) 的气相色谱仪测定蜂蜜中的杀 虫脒，方法简便，符合快速测定要求。该方法的色谱条件为：色谱柱是0 5 m x 3 m m ( 内径) 不锈钢填充柱，内填5 o v l 0 1 c h r o m w h p ( 1 0 0 1 2 0 目) ，柱温1 9 8 ， 进样口温度2 5 0 ，检测器温度3 0 0 ，氢气4 m l m i n ，空气17 5 m l m i n ，氮气3 0 m l m i n 。 样品前处理方法：利用杀虫脒在弱碱性条件下易溶于有机溶剂而不溶于水的性质， 在弱碱性条件下，用丙酮和正已烷直接提取蜂蜜中的杀虫脒，提取液经水洗、浓缩、 定容后，直接测定。 黄志强等( 1 9 9 1 ) 采用溴化法气相色谱测定食品中杀虫脒残留量，该方法将杀 虫脒衍生化后用带有电子捕获检测器( e c d ) 的气相色谱仪检测，也得到了较好的 回收率和精密度，该方法的色谱条件为：色谱柱为玻璃柱2 m x 3 m m ( 内径) ，内填 0 3 o v 一1 7 + 3 o v 2 1 0 c h r o m o s o r b w h p8 0 1 0 0 目，进样口温度和检测器温度为 2 5 0 c ，载气是高纯氮，流速3 0 m l m i n 。样品前处理方法：利用杀虫脒在碱性条件 下溶于有机相，酸性条件下溶于水相的性质，用酸碱石油醚萃取净化样品中的杀 虫脒，然后用饱和溴水衍生，最后进样测定。 j j j i m e n e z 等( 2 0 0 2 ) 采用气相色谱质谱法( g c m s ) 和气相色谱原子发射检 测器法( g c a e d ) 对蜂蜜中的杀虫脒降解规律进行了研究，该方法的色谱条件为： 色谱柱d b 一1 7 石英毛细管柱，3 0 m 0 2 5 m m x 0 2 5 岬，程序升温：初始温度为5 0 。c ， 保持l m i n ，以5 。c m i n 的速度升温到2 7 5 ，保持8 m i n ，载气为氦气：初始压力为 2 0 7 m p a ，以6 8 2 6 m p a m i n 升至2 7 5 8 m p a ，保持0 2 m i n 再以6 8 2 6 m p a m i n 降至 3 4 5 m p a ，再以2 3 m p a m i n 升至1 3 7 9 m p a ，保持5 m i n ，不分流进样，进样口温度为 2 0 0 ，色质传输线温度为2 8 0 。c ，进样量为5 1 t l ，质谱条件为：电子倍增器：2 0 0 v ， 离子源温度：2 0 0 ；分离器温度：1 0 0 * c 。向蜂蜜样品中添j j h p h = 9 的水溶液，然后 加入己烷丙酮( 8 ：2 ，v v ) ，涡旋提取后离心，取上层分析。因为要研究杀虫脒的 降解规律，所以净化过程省略了。 e k o r t a 等( 2 0 0 3 ) 建立了一种用气相色谱质谱法( g c m s ) 检测蜂蜡中杀螨剂 的多残留检测方法，该方法能检测蜂蜡中5 种杀螨剂，其中包括杀虫脒。方法的色谱 条件是：色谱柱为d b 1 7 m s ，3 0 m x o 2 5 r a m 0 2 5 p m ，色谱进样1 2 1 和质谱进样1 ：3 温度 分别为2 4 0 c 和2 8 0 * c ，程序升温：初始温度为5 0 。c ，保持5 m i n ，以5 。c m i n 的速度升 温塑j 3 0 0 。c ，保持3 0 r a i n ，载气为氦气，柱头压为4 0 k p a ，进样量2 9 l ，离子源温度： 2 0 0 。c ；分离器温度：1 0 0 。c 。样品前处理方法：用甲醇提取蜂蜡中的杀螨剂，样品 经过离心后取上层溶液再冷冻离心，上层提取液经c 1 8 固相萃取柱( s p e ) 净化后 进样分析。 4 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 1 3 双甲脒的研究进展 1 3 1 双甲脒的结构特点 双甲脒( a m i t r a z ) ，化学名为l ，5 双( 2 ，4 二甲苯基) 3 甲基1 ，3 ，5 三氮戊 二烯1 ，4 ，化学结构见图1 2 。又称螨克，学名n 甲基双( 2 ，4 二甲苯亚氨基甲基) 胺。原药为无味白色至黄色固体，密度0 3 ，熔点8 6 8 7 。蒸气压5 0 6 6 x l o 7 帕( 3 8 l o 。7 毫米汞柱，2 0 ) ，常温下在水中溶解度很低，可溶于二甲苯、丙酮和甲醇等多种有 机溶剂。不易燃、不易爆。一般加工配制成乳油。可用2 ，4 二甲苯胺、n 甲基甲酰胺、 甲胺为原料而制得。 e h ；c h ；c h ； 图1 2 双甲脒结构图 f i g1 - 2 s t r u c t u r eo fa m i t r a z 1 3 2 双甲脒的应用与毒性 双甲脒主要用于果树及家畜等防治蜱螨，为中等毒性杀螨剂。杀螨谱广，具有 多种毒杀机制。有触杀、拒食、驱避作用，也有一定的胃毒、熏蒸和内吸作用。用 于防治对其他杀螨剂有抗药性的螨也有效。 双甲脒急性毒性国外报道为：大鼠经e l l d s 0 8 0 0 m g k g ，经皮l d 5 0 1 6 0 0 m g k g ： 初步对双甲脒作了致突变三项短期试验，可见显性致死试验中高剂量组的胚胎死亡 率、受孕率、显性致死率与阴性对照组的差异有显著性( 吴建明等，1 9 9 2 ) 。 双甲脒的毒性作用，以生殖系统较为显见；胃肠道次之。双甲脒会导致大鼠睾 丸曲细精管内精子数量减少，双甲脒毒性作用靶器官可能是雄性睾丸曲细精管；雌 性鼠卵巢充血；对胃肠道等直接触及药物的部位有影响( 潘玉英，1 9 9 6 ) 。 1 3 3 双甲脒检测方法研究进展 关于双甲脒的定性定量检测方法，国内外科研人员有较多的研究，研究的对象 主要集中在蜂产品，这些研究成果为双甲脒在草鱼和鳗鱼中的研究打下了坚实的基 5 鱼肌肉中杀虫脒和双甲脒残留检测气相色谱泫的建立 础。主要的文献报道如下： 国家标准食品中双甲脒残留量的测定采用配有电子捕获检测器的气相色谱 仪测定水果蔬菜类和食用油类中的双甲脒残留。色谱条件为：色谱柱是玻璃柱 2 0 m x 3 m m ( 内径) ，填充物为5 s e 3 0 涂于c h r o m o s o r b w ( 8 0 - - 一1 0 0 目) ；色谱柱温度： 1 3 5 ；进样口温度：2 5 0 ；检测器温度：3 0 0 ；载气：氮气( 9 9 9 9 9 ) ，3 0 m l m i n ( g b t 1 7 3 2 9 1 9 9 8 ) 。前处理方法为：试样中双甲脒( 及代谢物) 水解成2 ，4 二甲 基苯胺，正己烷提取，酸、碱反复液液分配净化。用七氟丁酸酐将2 ，4 二甲基苯 胺衍生成2 ，4 - 二甲基苯七氟丁酰胺，用配有电子捕获检测器的气相色谱仪测定。 郑永权等( 2 0 0 0 ) 用气相色谱电子捕获检测器法检测蜂蜜中的双甲脒残留，先 将双甲脒水解成2 ，4 二甲基苯胺，衍生化后测定。色谱条件为：1 3 0 m x 0 2 5 m m 毛细 管色谱柱，固定相为s p b 1 ；气化室温度2 5 0 ；程序升温法：初始温度1 1 0 ，最终 温度1 9 0 c ，升温速率5 m i r a 检测器温度2 8 0 ；载气为高纯氮( n 2 ) 1 m l m i n ，补 充气为高纯氮叫2 ) 3 0 m l m i n 。在此条件下2 ，4 二甲七氟丁酰苯胺保留时问为4 6 8 m i n 。 前处理方法为：将蜂蜜中双甲脒水解成2 ，4 二甲基苯胺，石油醚提取，酸、碱反复 液液分配净化。用七氟丁酸酐将2 ，4 二甲基苯胺衍生成2 ，4 二甲基苯七氟丁酰胺， 用配有电子捕获检测器的气相色谱仪测定。 薛晓峰等( 2 0 0 5 ) 用气相色谱质谱法同时测定蜂蜜中的双甲脒及其代谢物残留， 色谱条件为：色谱柱：d b 5 m s 石英毛细管，规格3 0 m x 0 2 5 m mx 0 2 5 1 x m ；载气：氦 气，恒流模式；柱流速：1 0 m l m i n ；进样方式：不分流进样，l m i n 后开阀；进样量 l l ，进样1 2 1 温度：2 8 0 ；柱温：初始温度6 0 保持l m i n ，以1 0 m i n 升至1 5 0 ， 再以2 0 。c m i n 升到2 8 0 并保持5 m i n 。质谱条件为：电子轰击源( e i ) ：7 0 e v ：离子 源温度：2 0 0 ：接口温度：2 6 0 ；溶剂延迟6 5 m i r a 扫描方式：选择离子扫描( s i m ) ， 2 ，4 二甲基苯胺目标离子为m z 1 2 1 ，参考离子为m z 1 2 0 ，m z 1 0 6 ，m z 7 7 ，双甲脒 目标离子为m z 1 6 2 ，参考离子为m z 2 9 3 ，m z 1 2 1 ，m z 1 3 2 。前处理方法为：称取1 9 蜂蜜，准确到0 0 0 1 9 ，置于5 0 m l 离心管中，加入1 0 m l p h 为1 1 0 的氢氧化钠水溶液， 涡旋振荡2 分钟，使蜂蜜完全溶解，加入5 m l 正己烷，振荡2 分钟，在超声波清洗仪 超声提取1 5 分钟后，4 0 0 0 r p m 离一t 二, 1 0 m i n ，取上层有机相过0 4 5 t m ( 有机系1 滤膜，待 测定。 赵增运等( 2 0 0 5 ) 采用高效液相色谱法测定蜂蜜中的双甲脒残留，色谱条件为： 色谱柱：k r o m a s i lk r l 0 0 5 c 1 8 ，5 “m ，2 5 0 x 4 6 m m ，柱温：3 0 ；流动相：乙腈+ 水+ 氨水( 8 0 + 2 0 + 0 2 8 ) ，流速1 0 m l m i n ，进样量：2 0 儿，紫外检测器：w a v e l e n g t h = 2 8 9 n m 。前处理方法为：称取1 0 9 样品( 精确至o 1 9 ) 于5 0 m l 离心管中，加入5 m l 水， 涡旋混匀l m i n ，再加入2 5 m l 提取液，涡旋混匀1 m i n ，混匀后于4 5 0 0 r m i n 下离一t 二, 5 m i n ， 吸取上层液转移至2 5 0 m l 分液漏斗中；重复上述步骤两次；加入2 5 m l 正己烷于上述 5 0 m l 离心管中，洗涤残渣；将正己烷合并上述分液漏斗中；在上述分液漏斗中加入 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 5 0 m l 0 2 8 氨水，充分振摇，分层后，放弃下层水相；重复上述步骤两次；将上述 正己烷层通过填充无水硫酸钠柱( 约l o g ) 于1 0 0 m l 鸡心瓶；于3 5 , - - , 4 0 的水浴中旋转 蒸发器浓缩至干，用lm l 乙腈溶解残渣，转移至lm l 离心管；在10 0 0 0 r m i n 离，0 3 m i n ， 待进样检测。 j j j i r n e n e z 等( 2 0 0 4 ) 用g c e c d 测定蜂蜡中双甲脒及其降解产物残留，色谱条 件为：d b 1 7 0 1 石英毛细管，规格3 0 m x 0 2 5 m m o 2 5 9 i n ；载气：氦气，恒流模式； 柱流速：o 8 m l m i m 进样方式：不分流进样，l m i n 后开阀；进样量2 9 l ，进样口温 度：2 2 0 ；柱温：初始温度5 0 。c 保持1 m i n ，以7 。c m i n 升至2 2 0 c ，保持5 m i n ；尾吹 气：氩气甲烷( 9 0 ：1 0 ，v v ) ，流速6 0 m l m i n ，检测器温度为3 0 0 。样品前处理 方法：蜂蜡中的双甲脒用甲醇提取，再用正己烷反萃取，然后将正己烷中的双甲脒 水解、衍生，进样分析。 j a nl e n i c e k 等( 2 0 0 6 ) 用g c i t d 检测蜂蜡中的双甲脒，色谱条件为：色谱柱： r t x 5 m s 石英毛细管柱，规格3 0 m x o 2 5 m m x o 2 5 p m ；柱温：初始温度5 0 。c 保持2 m i n ， 以1 0 r a i n 升至2 5 0 ，保持3 r a i n ：载气：氦气，恒流模式；柱流速：1 o r a l r a i n ； 进样方式：不分流进样。前处理方法为：蜂蜡样品中加入1 0 m l p h = i 5 缓冲液，7 0 溶解3 0 m i n ，离心分层，取液体层水解后分析。 1 4 研究内容 建立鲢鱼和鳗鱼肌肉中杀虫脒残留检测的气相色谱法，包括色谱条件、提取方 法、净化方法的优化和工作曲线、回收率、精密度的测定。 建立草鱼和鳗鱼肌肉中双甲脒残留检测的气相色谱法，包括色谱条件、前处理 方法、水解和衍生化方法的优化和工作曲线、回收率、精密度的测定。 2 鲢鱼和鳗鱼肌肉中杀虫脒残留检测气相色谱法的建立研究 2 1 材料与方法 2 1 1 实验用鱼 鲢鱼和鳗鱼购自本校养殖场，无杀虫脒污染。洗净，去鳞、去头、去皮后取可 食肌肉部分，切成不大于0 5 c m x 0 5 c m x o 5 c m 的小块后用组织捣碎匀浆机匀浆，用 于前处理。 7 鱼肌肉中杀虫脒和双甲脒残留检测气相色谱法的建立 2 1 2 试剂及药品 杀虫脒购自美国s i g m a 公司，生产批号： n o6 1 6 4 9 8 3 。含量：9 8 8 f l o r i s i l 固相萃取柱填料1 0 0 0 m g 容量6 m ld i k m a 公司 乙酸乙酯( 色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司 正己烷( 色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司 丙酮( 色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司 乙醚( 色谱纯) 天津市科密欧化学试剂有限公司 氢氧化钠( 分析纯)国药集团化学试剂有限公司 无水硫酸钠( 分析纯)国药集团化学试剂有限公司 5 m o l l 的氢氧化钠水溶液称取2 0 0 0 9 氢氧化钠溶解于1 l 水中 6 0 的乙醚正己烷量取6 0 m l 乙醚，加入到4 0 m l 正己烷中 4 0 的丙酮正己烷量取6 0 m l 丙酮，加入到6 0 m l 正己烷中 2 1 3 仪器 气相色谱仪a g i l e n t6 8 9 0 n 配有氮磷检测器( n p d ) 和7 6 8 3 b 自动进样器美 n a g i l e n t 公司 色谱柱h p 5 石英毛细管柱( 3 0 m x 0 3 2 m mx 0 2 5 9 m ) 美 n a g i l e n t 公司 电子天平a b 2 0 4 n 梅特勒托利多仪器有限公司 氮吹仪k l 5 1 2 型，带恒温水浴装置北京康林科技有限公司 固相萃取装置v i s i p r e p 美i n s u p e l c o 公司 高速冷冻离心机s i g m a 2 - 1 6 k 美n i s i g m a 公司 微型旋涡混合仪x w - - 8 0 a 上海沪西分析仪器厂 气浴恒温振荡器s h z 一8 2 金坛市杰瑞尔电器有限公司 组织匀浆机j j 2 b 上海金鹏分析仪器有限公司 2 1 4 杀虫脒标准贮备液的配制 准确称取0 0 2 0 0 9 杀虫脒标准品，用正已烷溶解并定容于2 0 0 m l 容量瓶中，充分摇 匀，配制成1 0 0 0 9 9 m l 的标准贮备液，置于4 。c 冰箱避光保存。根据需要再用正己烷 配成适当浓度的标准工作液。 华中农业大学2 0 0 9 届硕十学位论文 2 1 5 色谱条件的选择 采用气相色谱法测定鲢鱼和鳗鱼中的杀虫脒，样品基质会带来许多干扰，影响 色谱检测。为了使药物峰与试剂及其它干扰因素峰分开，本方法对色谱柱、进样口 温度、柱温、流量、进样方式等色谱条件进行了选择与优化，选择与优化的原则是： 药物峰与杂质峰分开，峰形尖锐，对称。 2 1 6 提取溶剂的选择 样品用5 m o l l 的氢氧化钠水溶液碱化后，分别用正己烷和乙酸乙酯提取其中的 杀虫脒，结构显示两种溶剂均有很好的提取效果，通过对比实验结果，选择更好的 提取溶剂。 2 1 7 净化条件的优化 样品中的杀虫脒经提取后，为避免杂质干扰色谱分析和污染气相色谱柱，本方 法采用较为先进的固相萃取方法对提取液进行净化处理，其中对淋洗液和洗脱液的 配比进行了优化。淋洗液的配比比较试验：在鲢鱼和鳗鱼肌肉匀浆样品中杀虫脒加 标量为1 0 9 9 k g 时，提取液加入到f l o r i s i l 固相萃取柱后，分别用5 m l 2 0 、3 0 、 4 0 、5 0 、6 0 、7 0 的乙醚正己烷( v v ) 混合液淋洗，然后用5 0 的丙酮正己烷 ( v v ) 混合液洗脱，比较每种配比的回收率和去除杂质的效果，每种配比测定3 次。 洗脱液配比比较试验：确定好淋洗液配比后，再分别对8 m l l 0 、2 0 、3 0 、4 0 、 5 0 的丙酮正己烷( v v ) 混合液的洗脱药物的效果进行比较，每种配比测定3 次，以 此优化净化方法。 2 1 8 杀虫脒标准工作曲线的制备 用2 1 4 中的杀虫脒标准贮备液配制浓度( g g m l ) 依次为0 0 5 、o i 、0 2 、0 5 、 l 和2 的杀虫脒标准工作液，按优化后的色谱条件进样分析，测定其峰面积响应值， 以峰面积对质量浓度做标准工作曲线。 2 1 9 回收率和精密度测定 取匀浆后的空白鲢鱼和鳗鱼肌肉，向样品中分别添加4 个浓度水平的杀虫脒： 5 1 a g k g 、1 0 9 9 k g 、2 5 9 9 k g 和5 0 9 9 k g ，每个浓度测定6 次，计算回收率。将上述样 品每个浓度日内测定6 次，日问测定3 次，每次平行设一个空白对照，计算精密度。 9 鱼肌肉中杀虫脒和双甲脒残留检测气相色谱法的建电 2 1 1 0 定量方法 以外标法定量。样品经前处理后，取样品溶液与适量浓度的杀虫脒标准工作液， 作单点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准工作液及样品溶液中药物的响应值均 应在仪器检测的线性范围之内。样品中杀虫脒残留量按式( 1 ) 计算。 c = c s ( 占一占o ) v x10 0 0 c sxm 式中：c l 样品中杀虫脒残留量，单位为微克每千克( p g k g ) ； c ：r 标准工作溶液中杀虫脒的浓度，单位为微克每毫升( 1 t g m l ) 卜样品中杀虫脒峰面积； s 旷空白试验中杀虫脒峰面积； 鼯一标准工作溶液中杀虫脒峰面积； 肛样品中最终定容体积，单位为毫升( m l ) ； 聊一样品