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硕士论文基因芯片扫描仅软件设计 黛5 3 l s l s 摘要 基因芯片图像的采集和芯片分析是芯片技术的关键环节，芯片图像获取的准确性 和分析的可靠性直接影响芯片的应用。本文首先完成了图像采集系统的自动控制，并 且针对采集过程的特点准确的恢复出扫描芯片的图像。然后从图像分析和数据分析两 方面研究了影响芯片分析的因素，实现了对杂交荧光图像的信号提取和基本的生物信 息分析。 在图像采集系统中，首先完成了扫描仪工作的自动控制，扫描范围可选。为了解 决图像扫描过程中出现的非线性畸变，首先运用仿射变换校正图像象素位置发生的非 线性移位，然后采用线性插值算法进行图像恢复。 针对杂交图像中污点、噪声形状、灰度变化比较大的特点，本文引入模糊形态学 的方法成功抑制了污点、噪声等杂散信号的干扰。同时该方法对于荧光猝灭所造成的 信号点中空现象具有较好的弥补作用。 在网格定位中，本文针对信号点不规则的芯片图像提出了基于图像分割的自动定 位方法阈值分割，该方法简单快速，但对于光密度分布不均匀的信号点，可能会 去掉部分微弱信号，降低了计算的准确性。对于信号点规则的芯片图像，本文采用人 机交互的半自动定位方法，该方法运算速度快，并且效果比较理想。 在信号强度计算中，本文研究了背景、计算方法、归一化三个问题，以及背景滤 除、归一化的解决方案，并针对不同的定位方法使用不同的计算方法咀确保信号点荧 光强度提取的准确性。 本文针对表达型芯片进行了数据分析，研究了表达型芯片数据结果的可视化分 析，即通过阈值图、柱状图、散列图直观显示表达结果。 最后本文实现了基因芯片共焦扫描仪控制系统a r r a y s c a n1 0 和基因芯片分析系 统a n a a r r a y 1 0 。 关键词：基因芯片、基因芯片扫描仪、图像采集、图像恢复、芯片分析、模糊形态 滤波、自动定位、半自动定位、信号强度计算、基因表达分析、基因芯片分析系统 硕士论文基因芯片扫描仪软件设计 a b s t r a c t g n e n c h i pi m a g ea c q u i s i t i o na n dc h i pa n a l y s i s a r et h ek e yp a r t so ft e c h n i q u e sf o r g e n e c h i p a n dp l a yt w oi m p o r t a n tr o l e si nt h ea p p l i c a t i o no f g e n e c h i p i nt h i sp a p e r , f i r s tw e a c c o m p l i s hh o wt o c o n t r o lt h ei m a g ea c q u i r i n gs y s t e m ，a n d r e c o v e r yt h ec h i pi m a g e a c c u r a t e l y ，a i m i n gf o rt h ef e a t u r eo fa c q u i r i n gc o u r s e t h e nw es t u d yt h em e t h o d s o f i m a g e a n a l y s i sa n dd a t aa n a l y s i s i no r d e rt oe x t r a c tt h eh y b r i d i z i n gi n t e n s i t ya n dr e t r i e v et h e b i o l o g i c a li n f o r m a t i o n i ni m a g ea c q u i r i n gs y s t e m ，w ec a r lc o n t r o lt h es c a n n e r a u t o m a t i c a l l y , s c a n n i n gr a n g e c a nb es p e c i f i e db yu s e r i no r d e rt or e s o l v et h en o n l i n e a rd i s t o r t i o no c c u r r i n gi nt h ec o u r s e o fi m a g ea c q u i r i n g ，f i r s tw e a p p l ya f f i n et r a n s f o r m a t i o nt oa d j u s ti m a g e ，t h e nr e c o v e r y i m a g eb y m e a n so fl i n e a ri n t e r l e r a t i o na l g o r i t h m s s o m ef a c t o r ss u c ha sn o i s ef r o mi r r e g u l a rs p o t s ，d u s to nt h es l i d e ，a n dn o n s p e c i f i c h y b r i d i z a t i o nm a k ei t d i f f i c u l tt oe x t r a c td a t a a c c u r a t e l y w e u s e f u z z ym a t h e m a t i c a l m o r p h o l o g yt or e m o v en o i s ea n dd u s tw h i c hc a nl o w e rn o i s es u c c e s s f u l l ya n da l s om a k e u p al o s so f i n t e n s i t yc a u s e db yf l u o r e s c e n c eb l e n c h t oa c q u i r et h et a r g e tr e g i o n ，w ep u r p o s ea u t o m a t i cg r i d d i n gm e t h o db a s e do ni m a g e s e g m e n t a t i o nf o ri m a g ew i t hi r r e g u l a rs p o t s ，i t ss e g m e n t a t i o nt h r o u g ht h r e s h o l d t h i s m e t h o di sp r e s e n t e ds i m p l ya n df a s t h o w e v e ri t sn o ts u i t a b l ef o rs p o t sw i t ha s y m m e t r i c a l i n t e n s i t y a sf o ri m a g e sw i t hr e g u l a rs p o t s ，as e m i a u t o m a t i cg r i d d i n gm e t h o di su s e dt o i m p r o v ep r o c e s s i n gs p e e d ，a n d i tc a na c h i e v eg o o de f f e c t i nt h ee x t r a c t i o no ff l u o r e s c e n t i n t e n s i t y , w e d i s c u s s b a c k g r o u n dr e m o v i n g ，t h e m e t h o d s o f c o m p u t i n g a n d n o r m a l i z a t i o n a c c o r d i n gt od i f f e r e n tg r i d d i n gm e t h o d s ，d i v e r s e c o m p u t i n ga l g o r i t h m sa r ea d o p t e dt oe n s u r et h ea c c u r a c yo fi m a g ea n a l y s i s w e s t u d yt h ed a t aa n a l y s i so fe x p r e s s i o ng e n e c h i p ，p u te m p h a s i so nt h ev i s u a l i z a t i o n o f r e s u l t f i n a l l yw ed e v e l o p t w os o f t w a r e ，o n ei sa r r a y s c a n 1 0 ，t h eo t h e ri sa n a a r r a y1 0 k e yw o r d s ：g e n e c h i p ，g e n e c h i ps c a r m e r , i m a g ea c q u i r i n g ，i m a g er e c o v e r ) , , c h i p a n a l y s i s ，f u z z ym a t h e m a t i c a lm o r p h o l o g y , a u t o m a t i cg r i d d i n g ，s e m i a u t o m a t i o ng r i d d i n g ， e x t r a c t i o no ff l u o r e s c e n ti n t e n s i t y , e x p r e s s i o na n a l y s i s ，a n a a r r a y1 0 硕士论文基因芯片扫描仪软件设计 1 1引言 第一章绪论 随着人类基因组计划的不断推进，大量的基因和蛋白质序列得到解析。目前人们 所面临的主要任务是从如此巨量的序列信息中发掘基因的功能，了解基因对生命活动 的影响。传统的研究基因功能的方法如s o u t h e r n 、n o r t h e r n 印迹等技术复杂，好时长， 检测分子数少，效率低，难以满足实际需要，这就要求发展新的快速、敏感、平行分 析的技术与之配套。基因芯片技术就是在这种背景下产生和发展起来的，它借鉴了计 算机平行分析的实现，利用微点阵技术将大量生物信息集中在一小块固体支持物上， 从而在小空间上快速获取大量生物信息，其出现给生命科学、医学等多个领域带来强 烈的冲击。 1 2 基因芯片 基因芯片，又称d n a 芯片，是指采用大规模集成电路光刻技术和固相合成化学 方法，将大量特定d n a 探针有序地固定在玻璃或硅等基底表面上，通过检测探针与 标记样品分子发生杂交显示的信号，从而实现基因信息的大规模测定。 基因芯片技术以其同时、快速、准确地分析大量基因组信息的特点在诸多领域得 到应用，诸如在基因表达检测、杂交测序、基因突变和多态性检测、基因发现、基因 诊断、基因治疗、药物基因组学和毒理学研究等诸多领域有着重要的应用前景。 1 2 1 基因芯片的技术 基因芯片的相关技术包括：基因芯片设计、基因芯片制备、样品处理、杂交和检 测分析等( 如图i 2 1 ) ，其具体实现可分为三个步骤： 一、基因芯片的设计和制备 基因芯片的设计和制备是根据所选择的基因序列，设计探针阵列，确定每个探针 以及探针在芯片上的排布，然后根据设计结果采用物理及化学方式，将探针固化于载 体的表面，形成致密、有序的d n a 分子阵列。 基因芯片的制备有两种方法：一类是离片合成法，该方法先利用常规方法制备或 硕士论文基因芯片扫描仪软件设计 合成寡核苷酸探针库，然后再将这些探针固定到基片上。离片合成法的优点在于它可 利用现有的寡核苷酸合成方法和仪器，探针的长度可自由选择，且固定也比较容易， 但是它只适合制备小规模的探针阵列：另一类是在片合成方法，如光引导原位合成法、 分子印章法、原位喷印合成法等，该方法利用微加工和原位固相合成技术在基片上直 接合成所需的d n a 探针，其优点在于可以发挥微加工的技术优势，实现高密度芯片 的规模化制备，从而充分发挥基因芯片高通量平行分析的特点。 二、样品的制各和杂交 利用常规方法纯化d n a 或r n a 待测样品，并以荧光予以标记，标记后的样品 与基因芯片进行分子杂交。由于在较小的面积上集成了大量的探针分子，因而杂交效 率大为提高。 三、杂交信号的检测分析 杂交后的荧光信号可经过荧光显微镜、激光共聚焦显微镜或激光扫描仪进行信号 的收集。收集后的信号，经过计算机处理，并与探针阵列的位点进行比较，得出杂交 的检测结果。 图1 2 1 基因芯片的相关技术示意图 1 2 2 基因芯片技术的现状 基因芯片为人们从分子水平上认识生命现象提供了革命性的工具，其重要性可以 与5 0 年代把单个晶体管组装成集成电路芯片相比，它将会对本世纪生命科学和医学 的发展产生无法估计的影响。由于基因芯片广阔的应用前景和巨大的社会、经济效益， 现在世界各国的公司、研究机构都在积极地研究开发新产品，以早日占领市场。较早 2 硕士论文基因芯片扫描仪软件设计 涉足该领域的美、德、英、日等几个国家已经开发出大量有竞争性的基因芯片产品， 取得了令人瞩目的成就。在这样的国际形式下，我国政府对基因芯片的研制也显示出 与日俱增的关注和重视，投资度亦随之增加，并获得了一些突破性进展。 目前基因芯片技术的研究面临两个方面的挑战：一个是制各技术和杂交实验技 术；另一个则是芯片检测和分析技术。基因芯片检测和分析是基因芯片技术的关键环 节，直接影响基因芯片技术的发展和推广。目前关于基因芯片的检测手段主要有两种 ( 1 ) 利用电子摄像器件和计算机等而构成的基因芯片检测仪器。( 2 ) 利用激光共聚 焦扫描成像原理开发研制的基因芯片扫描仪。本文中只是研究基因芯片的信息检测以 及信息分析两个方面的内容。 1 。3 基因芯片扫描仪 基因芯片扫描仪是用来检测基因芯片杂交结果的装置，目前商品化供应的扫描仪 主要有两大类：激光共聚焦微点阵芯片扫描仪和c c d 微点阵芯片扫描仪，其中前者 使用最为普遍。扫描仪通过对玻片表面微点阵区域( 点样区域) 的扫描动作，针对每 种荧光素产生一幅数字图像文件。扫描图像一般以1 6 位t i f f 格式存于计算机中，图 像是黑自的，图像上各个斑点代表微点阵的各个样点，图像的灰度信息表示各个斑点 及周围背景区域的荧光分布与强度。 1 3 1 基因芯片扫描原理 典型的激光共聚焦微点阵芯片扫描仪具有荧光激发、释放荧光采集、空间定位、 释放荧光与激发光分辨、荧光信号检测等功能。被扫描的微点阵区域被看作由许多大 小相等的像素组成。激光器产生激光( 作为激发光) 经物镜聚焦在微点阵表面的一个 像素点上，该像素中的荧光素分子吸收激光光量子，从各个方向上释放荧光光量子， 并部分被物镜捕获。由于玻片的反射作用，物镜同时也捕获了反射回来的激光，且释 放荧光的光量子要比激光的光量子少几个数量级。为此，一个二色性光束分离器和波 段选择性通过滤光片被置于探测器之前，用于分辨释放荧光和反射激光。分辨的基本 依据是释放荧光波长一般略长于激发光波长，分辨的基本功能是最大限度通过被激发 的荧光素释放的荧光信号，而最大限度地消除反射激光信号和其它由玻片、试剂、透 镜、d n a 、另一荧光素等发出的非靶标荧光信号。探测器的功能是将释放荧光的光 量子转换成电流，最常用的探测器是光电倍增管( p m t ) 。一个光电倍增管可将一个 硕士论文 基因芯片扫描仪软件设计 光量子转换成多个电子，最多可达1 0 0 万个。放大率可通过改变p m t 的电压供应来 调节。最后，数模( a d ) 转换器将电子转换成一系列的数字信号，数字化过程是个 光量子时空平均化步骤，结果是每个像素产生一个代表其总荧光强度的数字信号。一 个针孔光栅被置于p m t 探测器之前，用于控制物镜的聚焦深度，以便只有从玻片表 面位置发出的荧光信号能被检测到；即只有在玻片表面激发光聚焦点上被激发的荧光 素的释放荧光，才能由探测器透镜组聚焦与针孔部位，恰好通过针孔。玻片表面以下 或以上位置上产生的荧光信号( 如由一片杂质产生) 达到针孔时，其聚焦点将在前述 释放荧光聚焦点之前或之后，故而只能有极少部分的光信号能通过针孔。 微点阵区域上不同像素点的连续扫描动作，是通过马达水平移动芯片装载平台， 或通过微反光镜移动入射激发光束，或两者兼而有之来实现的，最终获得针对某色荧 光标记的图像文件。而对于不同荧光标记，则通过切换不同波长的激光来激发相应荧 光素释放荧光，同时切换选择性通过不同波长范围的滤光片( 即选择不同荧光扫描频 道) 来检测相应释放荧光信号，重复扫描，分别获得各色荧光标记的图像文件。 有许多种“噪音”在扫摇图像中形成背景信号干扰扫描结果，通常将噪音分为两 大类：源噪音除了未被消除的反射激光和非激发荧光素的干扰信号外，还有玻片上的 杂质、试剂、非特异性杂交或沉积的荧光素标记靶分子、玻片本身、甚至d n a 本身 产生的荧光信号。探测器噪音主要是在信号放大和数字化过程中产生。 可以根据需要，通过调节扫描参数设置( 如扫描率、激光能量p m t 电压等 来 达到最佳扫描效果。一般情况下，激光能量越高，将会激发更多荧光光量子，产生更 强的源信号，同时也导致更强的源噪音。p m t 的电压越高，信号放大率越高，将会 产生更强的探测器信号，但同时也引发更强的探测器噪音。研究者更倾向于使用更高 的激光能量，因为它是激发更多的荧光光量子，而不是每个量子转换成更强的电信号。 但过高的激光能量将会因光漂白作用而损坏杂交核酸样品。因此，通常根据每张芯片 将被扫描的次数来选定合适的激光能量。有些扫描仪只有p m t 电压可调。此时，过 高的p m t 电压将会导致像素“饱和”，即光量子被放大至一定数量的电子时，数模转 换器只能将光量子数默认为6 5 5 3 5 ( 2 1 6 1 ) 。通常p m t 电压被调节在最亮的像素刚 好低于“饱和”的水平。 1 3 2 基因芯片扫描仪特性 微点阵芯片扫描仪是个复杂的检测装置，体现在大量的参数和规格标准上。 1 检测极限。检测极限是指在荧光素分子以最大光量子强度释放荧光时，扫描 仪能够成功地从背景信号中分辨并检测到的最低斑点荧光信号。从扫描装置角度来 4 硕士论文 基因芯片扫描仪软件设计 看，其度量单位应是单位面积上荧光素分子数量( f l u o r s u m 2 ) ，但由于芯片制作和杂 交过程的不可知性，研究者无法知道各个样点上的荧光素分子的密度。因此，常用某 个基因所能检测到的最低表达水平来表示。微点阵特性和扫描仪特性均可能称为检测 极限的限制性因素。如果芯片制作和杂交过程中引起荧光背景过高，则微点阵特性称 为限制因素。如果扫描仪本身产生的噪音混入荧光素产生的荧光信号中无法除去，且 当噪音超过前述本底，扫描仪特性成为限制性因素。 2 灵敏度和分辨率。灵敏度是指扫描仪将特定波长的荧光信号转换成电信号的效 率。灵敏度不依赖于微点阵芯片的荧光检测特性。如果激发能力和探测器性能均已被 调至最大，微点阵上所能检测的荧光信号仍然太弱，此时灵敏度对检测极限起着限制 作用。激发能力和探测器性能调至最大的不足前文已述。扫描仪的分辨率用单个像素 大小来表示，通常为5 、1 0 、2 0 啪；像素越小，分辨率越高。微点阵区域是被分成 多个像素单元进行逐个扫描的，一般像素以不大于微点阵中最小斑点直径的1 8 至 1 1 0 为基准。比如，某个斑点直径为1 0 0 u r n ，当分辨率为1 0 u r n 时，有7 0 个像索完 整地落于斑点区域内，当分辨率为5 u r n 时，则有3 0 0 个像素完整地落于斑点。完整 地落于斑点区域内的像素、横跨背景区域和斑点区域的像素、完整地落于背景区域内 的像素的荧光强度依次减弱，后两者常被当作背景信号用于校正。因此，分辨率越高， 越有利于在表达数据提取过程中消除斑点边缘效应和噪音的影响。当然，单个斑点内 像素的增加会使单个像素感受激发光量和释放荧光强度减少，导致灵敏度的牺牲。 3 激发光波长和荧光扫描频道。微点阵技术采用两种或两种以上荧光素标记，因 此针对不同荧光素，扫描仪应可切换不同波长的激光，并可通过调节滤光片组即 以不同扫描频道选择通过不同波段的荧光信号，达到分别对不同被激发的荧光素的荧 光信号的检测目的。单个激光器配以不同扫描频带会造成不同荧光素信号之间的干 扰，多数情况下一个扫描仪中具有多个激光器，分别产生不同波长的激光。 1 4 芯片分析 芯片分析是通过杂交图谱上每个信号点的荧光强度及其探针序列来推断样品的 遗传信息。由于样品与探针严格配对的杂交分子，具有较高的热力学稳定性，所产生 的荧光强度最强：不完全杂交的双链分子的热力学稳定性低，荧光信号弱( 不到前者 的5 - - 3 5 ) ，不能杂交则检测不到荧光信号或只检测到芯片上原有的荧光信号。 因此根据荧光信号的差异，遵循碱基配对的原则，就可以达到样品分析的目的。 芯片分析是基因芯片技术中不可缺少的重要环节，它借助于计算机将检测到的大 量芯片杂交结果映射为生物信息，从而实现基因芯片对样品的高通量、快速分析。芯 硕士论文 基因芯片扫描仪软件设计 片分析的可靠性直接关系到基因芯片的实际应用。例如，对于诊断疾病的样品而言， 一旦分析出错，将发生突变的致病基因误诊为没有发生突变，就可能导致病人不能得 到及时治疗，从而阻碍芯片的应用。 由于芯片分析的重要性，很多国际会议将芯片分析方法的研究作为重点内容加以 讨论。此外，一些基因芯片和生物信息学公司以及研究机构纷纷加强了基因芯片分析 的研发力度，开发了比较成熟的商业化芯片分析软件( 具体情况见表1 4 ) 。这些软件 功能完善，提供了自动、快速分析芯片图像的工具，但是它们价格昂贵，还存在有待 进一步完善的地方。例如在荧光数据提取方面可信度参数的设置有所欠缺，没有考虑 到探针的特异性、实验条件如温度等影响；目前软件的数据分析主要面向表达型芯片， 对于突变型芯片的数据分析涉及较少，仅有a f f y m e t r i x 公司针对某些特殊应用进行了 开发。而国内对于芯片分析的重视度不高，发展比较慢，虽然有一些公司如联合基因 等已经开始着手研究，但目前尚未有成熟的软件推出。鉴于芯片分析的重要性，开发 具有自主知识产权、具有特色的芯片分析软件势在必行。 开发公司软件名称 网址 a f f y m e t r xm i c r o a r r a ys u i t es o f t w a r e w w w a f f v m e t r i x c o m b i o d i s c o v e r yi m a g e n ，g e n e s i g h t w w w b i o d i s c o v e r v c o m i m a g i n g r e s e a r c h a r r a y v e r s i o n t mw w w i m a , i n a b r o e k u c a p a c k a r d b i o c h i pq u a n t a r r a y w w w d a c k a r d b i o e h i d c o m c l o n t e c h a l t a s l m a g e t m w w w c l o n e t e c h c o r n m o l e c u a l a rd y n a m i c i m a g e q u a n t 7 m w w w m d v n t o n i m e d i a c y b e r n e t i c sa r r a y p r o w w w m e d i a e v c o m r e s e a r c hg e n e t i c sp a t h w a y s w w w r e s g e n c o m 表1 4 芯片分析软件列表 作为面向应用的软件，在开发时必须满足一下条件： 1 可靠性：芯片分析的结果必须可靠准确，这是芯片分析最基本的条件。 2 通用性：可以处理不同类型、不同来源的芯片杂交图像。 3 特殊性：针对不同应用( 表达和突变) 的芯片应有不同的方法进行分析。 4 易读性：可以方便直观的了解芯片分析结果。 但是由于芯片分析的对象并非一个简单的数据，它受基因芯片其它技术如芯片设 计、芯片制备工艺、杂交过程等的影响，使上述四个基本条件难以保证，增加了开发 的难度。因此在芯片分析的研究中，必须考虑芯片图像特点以及杂交温度。探针等的 6 硕士论文 基因芯片扫描仪软件设计 因素，设计合适的方法，提高分析的准确度。 1 5 本文的研究目标和内容 本文的研究目标就是结合基因芯片共焦扫描仪的研制，开发商业化的基因芯片扫 描仪控制软件和基因芯片图像处理及分析软件。 我的主要研究工作包括： l基因芯片共焦扫描仪的扫描控制。实现了x 轴( 快速扫描机构) 和y 轴( 慢 速移动平台) 的同步，以及用户任意选择扫描范围。 2 基因芯片图像的数据采集。 3 分析了芯片图像扫描技术原理，并提出相关的图像恢复算法。 4 芯片图像的图像分析，包括图像预处理，网格定位，背景分析，信号强度的 提取等。 5 芯片图像的数据分析，针对表达型芯片进行了研究，表达型芯片是通过对 r a t i o 值的分析了解基因表达水平，文中给出了r a t i o 值的可视化的方法。 硕士论文 基因芯片扫描仪软件设计 第二章基因芯片扫描仪扫描控制软件设计 本课题针对基因芯片共焦扫描仪的研发的需要，开发了具有自主知识产权的扫 描仪控制软件系统a r r a y s c a n1 0 ，实现了从装片，通道选择，探测器接收功率调整， 芯片扫描，数据采集，图像显示的整个过程。该系统在w i n 9 8 环境下开发，具有友 好的入机界面，强大的控制功能，以及运行的准确性和稳定性。 2 。1基因芯片扫描控制技术 在整个软件系统的开发中，最关键和重要一个技术就是扫描控制技术。 由于基因芯片的扫描范围较大，因此只能采用物扫描成像方式。所谓物扫描成像 就是指光束由光学系统聚焦在样品上，而样品通常采用机械方式沿着x 和y 方向作 高速扫描。物扫描可以实现大范围扫描，同时从光学的观点来看，物扫描方式是共聚 焦扫描成像系统的最佳扫描方式，在这种扫描系统中，对样品上所有的点，其成像的 光学条件完全相同，并且光学系统中的所有透镜均处在最佳校正的条件下使用，即点 光源位于光轴上，且成像于光轴上。但是物扫描是通过机械运动来实现的，在扫描速 度上慢于光学扫描方式，且机械的精度和传动的方式会引起图像的几何畸变。因此对 采集的图像需要进行图像恢复处理。 所谓图像恢复是利用图像退化现象的某种先验知识，建立退化现象的数学模型， 再根据模型进行反向的推演运算，以恢复原来的图像。因此建立图像恢复的反向过程 的数学模型是图像恢复的主要任务。虽然描述图像退化过程所建立的数学模型多种多 样，而且恢复的质量标准也往往存在差异性，但图像恢复方法主要有两种：( 1 ) 运用 线性代数的矩阵方法求解基于线性的，空间不变的退化模型。( 2 ) 运用仿射交换校正 非线性所引起的图像象素位置发生位移的退化模型。 图2 1 1 简单通用图像退化模型 硕士论文 基因芯片扫描仪软件设计 图2 1 1 是一个简单通用的图像退化模型，在这个模型中，图像退化过程被模型 化为一个作用在输入图像f ( x ，y ) 上的系统h 。其与一个加性噪声n ( x ，y ) 联合 作用，输出该系统的退化图像g ( x ，y ) 。根据这个模型，图像恢复就是在给定输出 图像g ( x ，y ) 和退化系统h 的基础上，求出输入图像f ( x ，y ) 的近似表达式。它 们有如下的关系式： g ( x ，y ) = h f ( x ，y ) 】+ n ( x ，y )( 2 1 ) 若假设n ( x ，y ) - - - - 0 ，则h 有如下几个性质： ( 1 ) 线性性质。若k l ，k 2 为常数，f i ( x ，y ) ，f z ( x ，y ) 为输入图像，则： h k i 一( x ，y ) + k 2 ( x ，y ) 】= k l z 4 f , ( x ，y ) 】+ k 2 h ( x ，y ) 】 ( 2 2 ) ( 2 ) 相加性性质。若k l = k 2 = l ，f l ( x ，y ) ，( x ，y ) 为输入图像，则： t i f ，( x ，y ) + 五( x ，y ) = 日【z ( x ，y ) + 【；( x ，y ) ( 2 3 ) ( 3 ) 一致性性质。若f l ( x ，y ) = o 为输入图像，则： h k 2 ( x ，y ) 】= k 2 h 五( x ，y ) ( 2 4 ) ( 4 ) 空间不变性性质。对任意f ( x ，y ) 以及a ，b ，则： h f ( x 一口，y 一6 ) 】= g ( x 一口，y - b ) ( 2 5 ) 图像退化中通常有非线性退化、运动模糊、随机噪声、光学孔径衍射等几种退化 模型。基因芯片扫描仪系统快速扫描机构采用步进电机驱动，采集到的图像存在非线 性畸变，因此需要对其进行图像恢复。对这种非线性畸变图像的恢复主要包括两步： ( 1 ) 空间变换：对图像平面上的象素进行重新排列以恢复原空间关系。设原始 图像为f ( x ，y ) ，受到几何畸变影响变成g ( x ，y ) ，其中( x + ，y ) 表示畸变图 像的坐标。其关系可用下式表示： x s ( x ，y ) ( 2 6 ) y t ( x ，y ) ( 2 7 ) 其中：s ( x ，y ) 和t ( x ，y ) 为产生几何失真图像的两个空间变换。对于线性失真， s ( x ，y ) 和t ( x ，v ) 可以如下表示： s ( x ，y ) = 毛x + k 2 y + k 3 ( 2 8 ) t ( x ，y ) = k 4 x + | j 5 y + 丸 ( 2 9 ) 对于非线性失真，s ( x ，y ) 和t ( x ，y ) 可以如下表示： 硕十论文基因芯片扫描仪软件设计 s ( x ，y ) = k l x + k 2 y + k 3 + k 4 x2 + 尼5 叫+ k 6 y 2 ( 2 1 0 ) t ( x ，y ) = k 7 x + j j s y + k 9 + k l o x2 + k l l x y + k l2 y 2 ( 2 1 1 ) 如果知道s ( x ，y ) 和t ( x ，y ) 的解析表达式，则可以通过反变换来恢复图像。但 实际中常常很难求出其变换表达式，故常常采用定位点法和整体图像配备法。 ( 2 ) 灰度插值：对空间变换后的象素赋予相应的灰度值以恢复原位置的灰度值。 灰度插值的方法很多，最简单的是最近邻插值法，但缺点是不够精确。样条插值方法 是精度比较高的一种插值方法，但是其计算量太大。一种较为折衷的方法是双线性插 值方法( 如图2 1 2 所示) 。它是根据( x ，y ) 点的4 个最近邻象素的灰度值进行灰 度插值。设a ，b ，c ，d 四点的坐标分别为： ( i ，j ) ，( h l ，j ) ，( i ，j + 1 ) ，( i + 1 ，j + 1 ) ，而它们的灰度值分别为：g ( a ) ，g ( b ) ，g ( c ) ，g ( d ) 。 aeb ( x ，y ) cfd 图2 1 2 双线形插值示意图 首先计算e 和f 两点的灰度值g ( e ) 和g ( f ) ： g ( e ) = ( 工一0 g ( b ) 一g ( 爿) 】+ g ( 爿) g ( f ) = ( x 一f ) 【g ( d ) 一g ( c ) + g ( c ) 则( x ，y ) 的灰度值g ( x ，y ) 为： g ( x ，y ) = ( y 一) g ( f ) 一g ( e ) 】+ g ( e ) 根据基因芯片扫描仪的扫描原理，在系统中采用如下的图像恢复技术。 为系统扫描采样引起的图像畸变示意图。 设_ a o b = z b o c4 = 中，半径为r ， 则有： a b = r ( 1 一c o s q ) ) b c = r ( c o s q ) c o s 2 r b ) r 2 1 2 ) ( 2 1 3 ) r 2 1 4 ) 图2 1 3 ( 2 15 ) ( 2 1 6 ) o 硕：j ：论文基因芯片扫描仪软件设计 可见 舳_ ( 1 。5 s 由一 1 (217)7bc c o s 2 中) 一 t c o s 国一 + 1 、。 因此系统存在非线性余弦变化所引起的图像畸变。 a y c 厂蕊，、 o c b 1k 7 = 图2 1 3 扫描图像畸变示意图 为了解决图像的非线性畸变，首先运用仿射变换校正图像象素位置发生的非线性 移位，然后采用线性插值算法进行图像恢复。若根据基因芯片扫描仪系统分辨率的要 求，需要对a a 进行n 次等间距采样，则系统所用电机必须为每2 n 一1 个脉冲转动 一周。 则第i 次等间距采样点对应的理想角度为： 0 = a r c c o s ( 一2 f + 1 ) ( 仃一1 ) 其中：i = 1 , 2 3 ” ( 2 1 8 ) 其对应电机的实际转动次数n 应为： n = n t ( ( 2 n n e 2 x ) ( 2 1 9 ) 其中：i n t 为取整运算。 插值方法较多，最简单的是最近邻插值法，但缺点是不够精确。样条插值方法 是精度比较高的一种插值方法，但是其计算量太大。一种较为折衷的方法是双线性插 值方法。基因芯片扫描仪系统中采用一次线性插值法。其过程可表示如下： ：= a g + ( 1 一c o g 十l ( 2 2 0 ) 其中：，为图像点值，g 。，g 。为，n + 1 次采样值a 口为插值系数。 实践证明该方法适用于基因芯片扫描仪，且获得较好的图像恢复效果。图2 1 4 为系统采集的经过图像恢复的物体图像，其图像畸变可以忽略。图2 1 5 为系统采集 顾。i “论文 基因芯片扫描仪软件设计 的未经过图像恢复的物体图像，可见存在较大的图像畸变，特别在图像的两端畸变更 大。 图2 1 4 恢复图像 图2 1 5 畸变图像 基因芯片扫描仪系统的控制软件基于w i n d o w s 9 8 操作系统，利用c + + b u i l d e r 开 发平台进行物体扫描控制以及图像采集等开发，其控制流程图如图2 1 6 所示。首先 装载待扫描的芯片，同时进行必要的初始化工作，主要是测试计算机和扫描仪通信联 络是否成功，然后用户可以设置扫描所需的参数，包括选择扫描范围等，接着用户决 定是否开始扫描，若是，则在电机开始转动的同时启动中断传输子程序进行数据采集， 对数据进行处理以及转换，最后再对图像进行畸变校正，显示采集到的图像。当一次 扫描完成后，用户可以选择是否继续扫描。如果继续扫描，则重新回到参数设置状态， 否则，程序结束。 硕：l 二论文基困芯h 扫描仪软件改计 图2 1 6 物扫描控制流程图 硕士论文 基因：片扫描仪软件设计 2 2 a r r a y s c a n 系统的需求分析和基本任务 2 2 1 需求分析 a r r a y s c a n 系统是由于开发基因芯片共焦扫描仪的需要，实现对仪器的全自动控 制，并利用该软件将采集到的图像进行显示和保存，以便用户对芯片图像进行处理和 分析。 2 2 2 基本任务 。蛐r a v s c a l l 系统的主要目的是方便用户对仪器的控制，获得被扫描芯片的图像， 交给用户进行后续的分析，具体任务包括一下内容： 1 控制装片和退片。 2 扫描通道的选择，激光功率的选择，以及探测器接收激光功率的选择。 3 扫描范围的设定。用户可以直接输入扫描的起始位置，也可以在已经进行扫 描得到图像后，直接在图像上用鼠标选定感兴趣的区域进行再次扫描。 4 根据用户设定的扫描范围，精确的控制电机进行扫描，并保持两个移动方向 的同步。 5 扫描时数据的采集。采用中断传输的方式进行数据采集，不干扰电机的扫描 动作。 6 图像的恢复和显示。将采集到的数据进行必要的处理后，准确的恢复出被扫 芯片的图像，以显示给用户，再由用户根据自己的需要进行相关处理。 7 要求软件系统性能稳定、可靠，用户界面友好，操作简单、明了，易于扩展。 2 3 a r r a y s c a n 系统的设计说明 2 3 1 总体设计思想、开发平台 一总体设计思想 一u - t a y s c a l l 系统的目标在于方便用户控制基因芯片共焦扫描仪正确的工作，并精 确的获得被扫描芯片的图像，提供给用户做下一步的处理和分析工作。因此a r r a y s c a n 硕士论文 基因芯片扫描披软件设计 系统的建立紧紧围绕扫描控制和图像采集两个基本功能，其具体实现的功能模块和数 据流图如图2 3 1 所示： 芯片装载卜一主界面卜_ 叫 图像处理 上 l 错误处理 叫控制执议界面l l 上上00上 协议打开和保存 扫描范围控制扫描通道控制激光功率控制p m t 功率控制 1r l 图像采集 i 1l ， l圈像输j ：i 图2 3 1 系统功能模块总流程 各功能模块的说明如下： 主界面：是实现用户和a r r a y s c a n 系统交互的中介，包括系统向用户提供的各种 图形化工具条、菜单等。 芯片装载：实现芯片的自动装载和扫描仪的初始化工作。 图像处理：在主界面下打开图像进行基本的处理工作。 控制协议界面：是用户控制扫描仪的主要参数设置界面。 错误处理：处理用户输入参数中的错误，以及扫描仪和计算机通讯过程中出现的 错误。 协议打开和保存：用户可以打开已保存的协议来设置参数，也可以设置好所有参 数后将其保存。 扫描范围控制：让用户选择自己感兴趣的扫描区域。 扫描通道控制：由用户选择合适的扫描通道。 激光功率控制：调整激光功率，以获得最佳的扫描图像。 p m t 功率控制：由用户根据需要调整p m t 的接收功率。 图像采集：完成芯片图像的数据采集和图像的恢复工作。 图像输出：将恢复后的图像显示，用户可以进行打印，保存等工作。 皇型兰蔓主一一一 堇垦：堡丛塑塑堡墼生堡盐 二开发所用的软硬件平台 软件：c + + b u i l d e r5 0p r o f e s s i o n a lv e r s i o n 。 硬件；微型计算机( c p up i l l 0 0 0 m h z ) ，1 2 8 m 内存。 操作系统：w i n d o w s 9 8 2 3 2 系统功能模块的实现表 模块名称实现方案 采用标准的w i n d o w s 窗口界面，利用v c l 的组件实现 主界面 ( t f o r m ，t m a i n m e n u ，t t o o l b a r ，t s t a t u s b a r ，t i m a g e ) 。 利用t m s c o m m 建立计算机与扫描仪之间的通信，利用 芯片装载 函数o u t p o r t b 和l n p o r t b 对a d 板进行操作，控制电机。 写一个类i m a g e p r o c e s s 对图像进行几种简单的处理，包括 图像处理 伪彩色，放大，缩小，打印，保存等。 控制协议界面采用居中的图示化界面，同样利用v c l 的组件实现。 根据用户的输入判断参数的合法性，并予以纠正：通过消 错误处理 息框提示通讯中的错误，并提示用户重新建立通讯连接。 利用对文件进行读写的技术将协议保存，以后可直接打开 协议打开和保存 使用。 利用v c l 的t e d i t 记录用户输入的数值，并传递给扫描 扫描范围控制 控制函数a c q u i r e 。 利用v c l 的t c o m b o b o x 将用户选择的通道数传递给函 扫描通道控制 数a c c e s s c o n t r o l ，由它控制通道的选择。 同样利用t c o m b o b o x ，将参数传递给函数l a s p c o n t r o l 激光功率控制 函数进行激光功率的调整。 t c o m b o b o x 将参数传递给函数p m t c o n t r o l ，进行探测器 p m t 功率控制 接收功率的调整。 图像采集 利用函数a c q u i r e 完成图像采集的工作。 在a c q u i r e 中调用函数h u i f u 对图像进行恢复，然后显示 图像输出 图像。 表2 3 2 a r r a y s c a n 系统各功能模块的实现方案总缆 1 6 硕士论文基因芯片扫描仪软件设计 2 4 a r r a y s c a n 系统的使用说明 2 4 1 用户对象 本系统适用于从事基因芯片研制的科研人员和对基因芯片进行检测的有关人员。 操作人员只需具备w i n d o w s 操作的基本知识即可。 2 4 2 系统运行要求 操作系统：w i n d o w s 9 x w i n d o w s2 0 0 0 c p u ：主频5 0 0 m h z 以上。 显示器：v g a 彩显，分辨率最好是1 0 2 4 + 7 6 8 ，字体采用小字体。 内存：6 4 m 以上。 2 4 3 主要操作说明 a r r a y s c a n 系统的主界面如图2 4 3 1 所示，用户在这里一般执行两种操作，即打 开图像进行观察和装载芯片后打开协议窗体进行扫描参数设置。 图2 4 3 1 a r r a y s c a n 系统主界面 用户打开协议窗体后的协议窗体界面如图24 3 2 所示，这是设置参数，控制扫 硕士论文基因芯片扫描仪软件设计 描仪的主窗体。 图2 4 3 2 协议窗体界面 用户可以调入原来保存的协议，也可以重新设置，并且保存。当设