（农药学专业论文）d3菌株在土壤和番茄根部的存活及毒死蜱原位修复研究.pdf

摘要 本实验检测了d 3 菌株对常用抗生素的抗性情况，其结果为：d 3 菌株对卡那霉 素、四环素的抗性小于1 0 1 , t g m l 1 ，对氯霉素、链霉素、氨苄青霉素的抗性小于 5 1 , t g m l 一，对新霉素、红霉素的抗性更小，分别为2 1 t g m l l 和小于o 5 1 , t g m l - 1 。并对 d 3 菌株进行了氯霉素的抗性驯化，使其对氯霉素的抗性达到3 0i , t g m l l 。对抗性驯 化的菌株d 3 x 和出发菌株d 3 进行了降解毒死蜱能力的测定比较，结果显示，抗性 驯化后并未影响出发菌株d 3 的降解毒死蜱的能力。 将驯化菌株d 3 x 接种到土壤中研究其在土壤中的存活情况。结果表明，驯化菌 株在自然土壤和灭菌土壤中均可以存活，在灭菌土壤中的定殖水平略高于自然土壤。 驯化菌株接种到土壤后5 d 之内就已达到最高定殖水平，第5 d 时灭菌土壤处理的菌株 定殖密度为4 9x1 0 7 e f u g 土，而在自然土壤处理的定殖密度为2 3 1 07 c f - u g 土，随 着时间的推移，定殖数量均呈下降趋势。在3 0 d 时向土壤中加入蛋白胨和酵母膏营养 后，驯化菌株在自然土壤中的定殖水平会上升。驯化菌株在黄棕壤、黄红壤与砂姜黑 土中的存活力研究表明，d 3 x 菌株在以上三种土壤中均可以存活且无明显差异，说 明d 3 一x 菌株在不同性状的土壤中均具有较强的定殖能力，适合土壤和植物根际污染 修复。 利用根盒实验研究d 3 x 菌株在植物根部的存活情况，结果发现，驯化菌株在土 壤中垂直方向上主要定殖在0 - 1 0 c m 根段间，且随深度增加而降低。在蕃茄播种后1 0 d 以内d 3 x 就达到了最高定殖水平。第5 d 时，驯化菌株d 3 - x 已经延伸到蕃茄种子以 下根长6 c m 以内，在0 - 2 c m 和2 - 4 c m 根段的根际定殖密度分别为4 9 4 ( 1 0 6 c f - u g 根土 和3 2 2 x 1 0 6 c f u g 根土。虽然此时有些番茄根长超过了6 c m ，但6 c m 以下根段并未检 测到驯化菌株d 3 x 。到第1 0 d 时，番茄主根长已超过8 c m ，但驯化菌株主要定殖在 8 e m 以内，在8 c r n 以下根段根表土壤中未检测到驯化菌株。到第5 0 d 时，1 0 c m 根段 以内根际和根表土壤中均有驯化菌株存活，2 4 c m 根段的根际定殖密度为8 4 5 x 1 0 2 c f u g 根土，0 - 2 e r a 根段的根表定殖密度也高达1 1 1 x 1 0 4c f u g 根。无论在根表还是根 际土壤中，在番茄根尖部位都未检测到菌株。由此可见，驯化菌株是从种子向根尖方 向扩散的，但并不与根的生长同步，而是稍迟于根的伸长生长。 比较接种菌株在番茄根际与根表定殖密度之间的关系，结果发现，根表的定殖密 度高于根际土壤中的定殖密度。在番茄播种后同一时间检测驯化菌株，驯化菌株的定 殖数量总体上是顺着根向下呈现出逐渐降低的趋势，即驯化菌株在离番茄种子越近的 根段定殖数量越高：同根段驯化菌株的根际定殖数量随着时间的延长而逐渐降低。 利用盆栽实验研究d 3 菌株对土壤中毒死蜱污染的修复，结果表明，d 3 菌株对毒 死蜱的降解随着初始菌量的增加，土壤中毒死蜱降解速率加快，半衰期缩短，修复作 用和菌量成正相关。在相同的施菌量下对不同污染浓度的毒死蜱土壤进行修复时，在 低污染浓度的土壤中，菌株对污染物修复效果好，毒死蜱的降解速率快，而在高污染 浓度的土壤中修复效果略差一些，毒死蜱降解速率要慢一些。随着农药浓度的增加， 修复效果依次下降。在同一施菌量下，种植番茄与不种植番茄的土壤中，种植番茄土 壤中的毒死蜱降解速度要快于不种植番茄的土壤，特别是在低施菌量的条件下，种植 植物对毒死蜱的降解动态的影响更为显著。 关键词：玫瑰红球菌( d 3 ) ；毒死蜱降解；土壤；蕃茄根际；定殖；原位修复； a b s t r a c t d 3 ( r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u s ) s t r a i n st h a th a dac a p a b i l i t yt ou t i l i z ec h l o r p y r i f o s 弱 t h es o l ec a r b o na n de n e r g ys o u r c e s d 3s t r a i n sr e s i s t a n tt oc o m m o n l ya n t i b i o t i c si ss t u d i e d i np a p e r , t h er e s u l t st h a td 3s t r a i n0 1 1k a n a m y c i n ，t e t r a c y c l i n er e s i s t a n c ei sl e s st h a n10 l a g m l 一，f o rc h l o r a m p h e n i c o l ，s t r e p t o m y c i n ，a m m o n i ab e n z y lp e n i c i l l i nr e s i s t a n c ei sl e s s t h a n5l a g m l - 1 ，t h en e o m y c i n ，e r y t h r o m y c i nr e s i s t a n c ei ss m a l l e r , 2l a g m l 1a n dl e s st h a n o 5l a g m l r e s p e c t i v e l y d 3s t r a i no fc h l o r a m p h e n i c o lr e s i s t a n c et ot h ed o m e s t i c a t i o n ，t o t h ec h l o r a m p h e n i c o lr e s i s t a n c et o3 0l a g m l - 1 t h ed o m e s t i c a t i o nh a dn os e r i o u se f f e c to n t h ec h l o r p y r i f o s d e g r a d a t i o na b i l i t yo ft h es t r a i n a f t e rt h ed o m e s t i c a t e ds t r a i nd 3 一xw a si n o c u l a t e di n t ot h es o i l ，t h ec o l o n i z i n g d y n a m i c so ft h ed 3 一xi ns o i lw e r es t u d i e db yt h em e t h o do fe n u m e r a t i o no fl u m i n e s c e n t c o l o n i e so na g a rm e d i a t h er e s u l t ss h o w e dt h a td 3 - xs u c c e s s f u l l yc o l o n i z e db o t hi nt h e s t e r i l es o i la n du n s t e r i l es o i l ，a n dc o l o n i z i n gl e v e lo fd 3 一xi ns t e r i l es o i lw a sh i g h e rt h a n t h a to fu n s t e r i l es o i l 1 1 1 ep o p u l a t i o no fd 3 一xr e a c h e dt ot l l e1 1 i g l l e s tl e v e l ，4 9 1 0 7 c f u g a n d2 3 10 7 c f u gs o i lr e s p e c t i v e l yi nt h es t e r i l es o i la n du n s t e r i l es o i la f t e r5d a y s 、矾t l l t i m ed e l a y i n gt h ep o p u l a t i o nd e c r e a s e d t h ep o p u l a t i o no fd 3 - xr i s e dw h e np e p t o n ea n d b a r mp a s t ew e r ea d d e di n t os o i l t h er e s u l t so fs u r v i v a la b i l i t yo fd 3 - xi ny e l l o w - b r o w n s o i l , y e l l o w - r e ds o i la n ds h a j i a n gb l a c ks o i lm e a n tt h a ts t r a i nd 3 - - xc o u l dc o m p e t ew i t h o t h e rm i c r o b e sf o rs p a c ea n dn u t r i t i o ni nd i f f e r e n ts o i l s b e i n gp r e p a r e d 嬲m i c r o b i a li n o c u l a n ta n di n o c u l a t e do ns e e d so ft o m a t o ，t h e c o l o n i z i n gd y n a m i c sa n dd i s t r i b u t i o no ft h es t r a i nd 3 一xi ns o i la n dr h i z o s p h e r eo ft o m a t o p l a n ti nr h i z o b o x e sw e r es t u d i e db yt h em e t h o do fe n u m e r a t i o no fl u m i n e s c e n tc o l o n i e so n a g a rm e d i a 1 1 1 er e s u l t ss h o w e dt h a tt h es t r a i nc o l o n i z e dm a i n l yi n0 - 10 c r nr o o ts e g m e n ti n v e r t i c a ld i r e c t i o n t h ep o p u l a t i o no fd 3 - xr e a c h e dt ot h eh i g h e s tl e v e lb e f o r e10 d a y sa f t e r s e e d sp l a n t e d o nt h e5 t hd a yd 3 - xs p r e a d6 c mb e l o ws e e d s ，t h ep o p u l a t i o ni n0 - 2 c ma n d 2 - 4 c mr o o ts e g m e n tw a s4 9 4 x10 6 c f - u gr h i z o s p h e r es o i l 3 2 2x10 6 c f u gr h i z o s p h e r es o i l r e s p e c t i v e l y n ol u m i n e s c e n tb a c t e r i aw e r ed e t e c t e db e l o w6 c m ，a l t h o u g hw h e a tr o o t l e n g t hw a sb e y o n d6 c m o nt h e 10 t hd a y , d 3 s t r a i nc o l o n i z e dm a i n l yi n0 - 8 c r nr o o t s e g m e n t ，a l t h o u g ht o m a t or o o tl e n g t hw a sb e y o n d10 c m ，a n do nt h e5 0 t hd a y , t h e p o p u l a t i o no fd 3 一xi n0 - 2 c mr o o ts e g m e n tr e a c h e dt o 1 1 1xl0 c f u gr o o t s o i la n di n 2 - 4 c m 8 4 5 x10 2 c f u gr o o tr e s p e c t i v e l yi nt o m a t or h i z o s p h e r ea n dt o m a t or h i z o p l a n e 1 1 1 e r e s u l t so fr h i z o b o xc u l t u r ee x p e r i m e n ts h o w e dt h a td 3 一xs p r e a df r o ms e e d st o w a r dt h e d i r e c t i o no fr o o tt i p ，b u tn o ts y n c h r o n i z e dw i t ht h es t r e t c ho fr o o t s d 3 - xw a sn o td e t e c t e d i i i i nt h er e g i o no ft o m a t or o o tt l p c 0 1 0 n i z i n gl e v e lo fd 3 xi nt o m a t or h i z o p l a n ew a sh i g h e l t h a n t h a to ft o m a t o r h i z o s p h e r e ，a n dt h ep o p u l a t i o no fd 3 xd e c r e a s e dg r a d u a l l ya l o n gt h er o o t t h ed a t a i n d i c a t e dm a tt 1 1 ec o l o n i z i n gl e v e lo fs 订a i nd 3 一xw a sr e l a t i v et ot h ed i s t a n c eb e t w e e n t h e r o o ts e 田n e n ta n dt h es e e d s ，t h es h o r t e rt h ed i s t a n c ew a s ，t h eh i g h e l t h ec o l o n i n gl e v e lw a s i na d d i t i o n t h ep o p u l a t i o no fd 3 - xi nt h es a m er o o ts e g m e n td e c r e a s e dg r a d u a l l yw i t h t i m ed e l a y l n g r e s 砌i n gt h ee f f e c to fd 3s t r a i no fc h l o r p y r i f o s0 1 1b i o r e m e d i a t i o n ，t h er e s u l t s i n d i c a t e dt h a td 3s t r a i no nt h ed e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o s a st h ei n i t i a la m o u n to ft h e i n c r e a s e t h er a t eo fs o i ld e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o sa c c e l e r a t e d ，s h o r t e n i n gt h eh a l f - l i f e ， b a c t 甜aa n dr e p a i ro fap o s i t i v ec o r r e l a t i o n i ns a m ea m o u n to fb a c t e r i a ，t h ee f f e c to fp l a n t o nt h ed e c o m p o s i t i o nh a l fl i f eo fc h l o r p y r i f o si sv e r yr e m a r k a b l e t h ed e g r a d a t i o n r a t eo f c h l o r p y r i f o si ns o i lp l a n t e dt o m a t o e s i sf a s t e rt h a nt h a ti ns o i ln o tp l a n t e dt o m a t o e s k e yw o r d s ：r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u s ( d 3 ) ： r h i z o s p h e r e ；c o l o n i z a t i o n ：b i o r e m e d i a t i o n ； d e g r a d a t i o no fc h l o r p y r i f o s ；s o i l ；t o m a t o 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：雄 时间：2 。8 年6 月2 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解安徽农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：雌 时间：2 0 0 8 年6 月2 日 导师签名：羞鲤鱼签 时间：2 0 0 8 年6 月2 日 综述 2 0 世纪6 0 年代出现的第一次“绿色革命”为人类的粮食安全做出了重大贡献， 其中作为主要技术之一的农药为粮食的增产起到了重要的保障作用。因为农药具有成 本低、见效快、省时省力等优点，因而在世界各国的农业生产中被广泛使用，但农药 的过分使用产生了严重的负面影响。1 9 8 5 年，世界的农药产量为2 0 0 多万t 【l 】；在我 国，1 9 9 0 年的农药产量为2 2 6 6 万t 【2 1 ，其中甲胺磷一种农药的用量就达6 万t 【3 1 ， 但到了2 0 0 7 年中国的农药产量已高达1 7 3 1 万t 。化学农药主要是人工合成的生物 外源性物质，很多农药本身对人类及其他生物是有毒的，而且很多类型是不易生物降 解的顽固性化合物。人们在使用农药防治病虫草害的同时，也时常产生了粮食、蔬菜、 瓜果等农产品中的农药残留超标，污染严重，同时给非靶生物带来伤害，每年造成的 农药中毒事件及职业性中毒病例不断增加【3 _ 6 】。同时，农药厂排出的污水和施入农田 的农药等也对环境造成严重的污染，破坏了生态平衡，影响了农业的可持续发展，威 胁着人类的身心健康。农药不合理的大量使用给人类及生态环境造成了越来越严重的 不良后果，农药的污染问题已成为全球关注的热点。因此，加强农药的降解研究、解 决农药对环境及食物的污染问题，是人类当前迫切需要解决的课题之一。 早在2 0 世纪5 0 年代，c o r n e l1 大学任教的m a r t i na l e x a n d e r 与他的学生，针对寂 静的春天出版后，人们对环境中农药污染和残毒问题的关注而展开了农药在土壤中 可降解性的研究，为后来生物技术在环境保护中的应用打下了基础。生物修复 ( b i o r e m e d i a t i o n ) 是指利用微生物或其他生物将存在于土壤、地下水和海洋中的有 毒、有害污染物降解为二氧化碳和水或转化为无害物质的系统，与物理化学方法相比， 被公认为是一种有效、安全、廉价和无二次污染的方法p j 。1 9 9 1 年3 月，第一届原位 生物修复( i ns i t ub i o r e m e d i a t i o n ) 国际会议在美国圣地亚哥召开，出版了“i ns i t u b i o r e m e d i a t i o n 和“o ns i t eb i o r e c l a m a t i o n 两本论文集，标志着以生物修复为 核心的环境生物技术进入了一个全新的发展时期。 由于生物修复技术具有纯生态过程的显著优越性，从根本上体现了可持续发展的 战略思想，因此生物修复技术已成为环境保护技术的重要组成部分。生物修复的两大 主体是微生物和植物，而微生物以其代谢方式丰富多样，底物范围广等优点成为生物 修复技术中的主力掣引，另外，少部分利用植物作为环境污染控制的生物。 1 降解农药的微生物种类 农药的微生物降解研究从最早的有机氯农药d d t 开始，已有几十年的历史。世界 各国的科研工作者分离筛选了大量的降解性微生物【9 】，国内的研究工作者也在这方面 做了大量工作【1 0 , 1 1 】。在我国，由于有机磷杀虫剂的大量使用，所以我国有关农药生物 修复的研究主要集中在有机磷化合物的降解方面，而国外近年来因大量使用了除草 剂，环境污染问题也随之产生，因此可降解除草剂的微生物的分离和利用便成为国外 近期研究的热点。目前已报道的能降解农药的微生物包含细菌、真菌、放线菌、藻类 等，大多数来自于土壤微生物类群( 表卜1 ) 1 2 , 1 3 】。细菌由于其生化上的多种适用能力 以及容易诱发突变等特性从而占了主要的地位，其中假单胞菌属菌株是最活跃的菌 株，对多种农药等化合物有分解作用，其模式菌株p u t i d ak t 2 4 4 0 全基因组序列测序 已经完成【8 1 。 表i - i常见农药的降解微生物 t a b l el 一1d e g r a d e dm i c r o o r g a n i s mo f p e s t i c i d e s 2 微生物降解农药的机理 目前，对于微生物降解农药的研究主要集中于细菌上，因此对于细菌代谢农药的 机理研究得比较清楚。细菌降解农药的本质是酶促反应【1 4 - 16 1 ，即化合物通过一定的 方式进入细菌体内，然后在各种酶的作用下，经过一系列的生理生化反应，最终将农 药完全降解或分解成分子量较小的无毒或毒性较小的化合物的过程。如莠去津作为假 单胞菌a d p 菌株的唯一碳源，有3 种酶参与了降解莠去津的前几步反应。第一种酶是 2 at z a ，催化莠去津水解脱氯的反应，得到无毒的羟基莠去津，此酶是莠去津生物降 解的关键酶；第二种酶是at z b ，催化羟基莠去津脱氯氨基反应，产生n 一异丙基氰 尿酰胺；第三种酶是at z c ，催化n 一异丙基氰尿酰胺生成氰尿酸和异丙胺。最终莠 去津被降解为c 0 。和n t t 3 t 1 7 1 。微生物所产生的酶系，有的是组成酶系，如门多萨假单 胞菌d r 一8 对甲单脒农药的降解代谢，产生的酶主要分布于细胞壁和细胞膜组分【5 】； 有的是诱导酶系，如王永杰等 1 8 1 得到的有机磷农药广谱活性降解菌所产生的降解酶 等。由于降解酶往往比产生该类酶的微生物菌体更能忍受异常环境条件，酶的降解效 率远高于微生物本身，特别是对低浓度的农药，人们想利用降解酶作为净化农药污染 的有效手段。但是，降解酶在土壤中容易受非生物变性、土壤吸附等作用而失活，难 以长时间保持降解活性，而且酶在土壤中的移动性差【2 0 】，这都限制了降解酶在实际中 的应用。现在许多试验已经证明，编码合成这些酶系的基因多数在质粒上，如2 ，4 一d 的生物降解，即由质粒携带的基因所控制【l9 1 。通过质粒上的基因与染色体上的基 因的共同作用，在微生物体内把农药降解。因此，利用分子生物学技术，可以人工构 建“工程菌 来更好地实现人类利用微生物降解农药的愿望。 2 1 微生物在农药转化中的作用 2 1 1 矿化作用 有许多化学农药是天然化合物的类似物，某些微生物具有降解它们的酶系。它们 可以作为微生物的营养源而被微生物分解利用，生成无机物、二氧化碳和水。矿化作 用是最理想的降解方式，因为农药被完全降解成无毒的无机物，如石利利等【2 l 】研究了 假单胞菌d l l 一1 在水溶液介质中降解甲基对硫磷的性能及降解机理后指出，d l l 一1 菌可以将甲基对硫磷完全降解为n 0 。一和n 0 。一。 2 1 2 共代谢作用 有些合成的化合物不能被微生物降解，但若有另一种可供碳源和能源的辅助基质 存在时，它们则可被部分降解，这个作用称为共代谢作用，这一作用最初是由f o s t e r 等【l3 】提出来的。如门多萨假单胞菌d r 一8 菌株降解甲单脒产物为2 ，4 一二甲基苯胺和 n h 。，而d r 一8 菌株不能以甲单脒作为碳源和能源而生长，只能在添加其他有机营养基 质作为碳源的条件下降解甲单脒，且降解产物未完全矿化，属于共代谢作用类型【5 】。 关于共代谢的机理，现在还存在争论。由于共代谢作用而推动的顽固性人工合成化合 物的降解一般进行的较慢，而且降解程度很有限，参与共代谢作用的微生物不能从中 获得碳源和能源，但是自然界中还是广泛存在着大量的具有共代谢功能的微生物，它 们可以降解多种类型的化合物。共代谢作用在农药的微生物降解过程中发挥着主要的 作用5 , 1 3 ，2 2 。 2 2 微生物降解农药的生化反应【i 3 】 氧化反应微生物体内的氧化反应包括：羟化反应( 芳香族羟化、脂肪族羟化、 n 一羟化) ；环氧化；n 一氧化；p 一氧化；s 一氧化；氧化性脱烷基、脱卤、脱胺。 还原反应还原反应包括硝基还原、还原性脱卤、醌类还原等。 水解反应一些酯、酰胺和硫酸酯类农药都有可以被微生物水解的酯键，如对硫 磷、苯胺类除草剂等。 缩合和共轭形成缩合包括将有毒分子或一部分与另一有机化合物相结合，从而 使农药或其衍生物物失去活性。 在微生物降解农药时，其体内并不只是进行单一的反应，多数情况下是多个反应 协同作用来完成对农药的降解过程，如好氧条件下卤代芳烃的生物降解，其卤素取代 基的去除主要通过两个途径发生：在降解初期通过还原、水解或氧化去除卤素；产生 芳香结构产物后通过自发水解脱卤或卢一消去卤化烃【6 】。 3 微生物降解农药的影响因素 了解影响农药微生物降解的因素，将有利于我们利用可降解农药的微生物资源在 实际应用中，因时因地制宜，创造有利条件，充分发挥降解菌的降解效能 1 。影响农 药微生物降解的因素主要有： 被降解农药的种类和浓度任何一种微生物都有其特定的降解谱，到目前为 止，还没有发现那一种微生物可以降解所有的农药。一般而言，农药生物修复的难易 程度与农药的化学结构密切相关，结构简单的农药较易降解，结构复杂的则较难降解； 分子量小的农药比分子量大的农药较易降解；难溶于水的农药比易溶于水的农药难降 解。虞云龙研究表明，降解菌对拟除虫菊酯和一硫代磷酸酯杀虫剂的降解速率的差异 主要是由各化合物的疏水性参数引起的。农药的浓度对微生物降解农药的影响也很 大，太高浓度的农药往往对降解菌有抑制作用，而太低的农药浓度则难以提供微生物 足够的营养而使生物降解无法进行【2 3 】。 微生物群体的活性特定的农药只能由特定的微生物降解，同时，微生物的 空间分布，群体密度，与其他微生物的相互作用等均决定了微生物的降解 效率【1 1 1 。 环境因子环境因子对农药生物修复的影响是巨大的，这些因子包括温度、 湿度、酸碱度、营养、金属浓度等，这些因子的影响有时甚至决定了农药生 物修复的成功与否【2 4 一冽。 4 微生物降解农药的应用前景和研究趋势 农药污染的微生物修复近年来受到国内外专家学者的普遍关注，报道不断增多。 鉴于土壤污染的严重危害及其资源的有限性，世界各国都非常重视土壤修复技术的研 究，各发达国家纷纷制定土壤恢复计划。荷兰、日本、德国、美国先后投入了大量的 4 资金用于土壤污染的恢复研究和应用。德国在1 9 9 5 年用于净化土壤的投资约6 0 亿美 元，美国9 0 年代用于土壤修复的投资额超过百亿美元。在我国，环境问题在我国已 被提到了重要的议程，首先在法律政策方面逐渐缩小和发达国家的差距。国家环保总 局( s e p a ) 从1 9 9 8 年就开始致力于有关环境保护法律法规的制定，针对环境污染制定 污染预防和削减手册，但是环境中污染物的浓度仍然很高 2 7 】。在技术层面，我国的环 境生物修复技术还处于刚刚起步阶段，与发达国家还存在一定的差距，目前，在其他 污染物如石油污染的生物降解等领域的实际操作已取得突破性进展【2 8 1 ，可作为农药污 染生物修复的借鉴。分子生物学的发展，农药降解菌酶固化技术的研究也为农药污染 生物修复的实际应用提供了可能。 总之，在各种消除农药污染的措施中，微生物修复虽然受农药的种类、环境条件 等因素的限制，但因其高效、安全、成本低、无二次污染等而最具有发展前景，随着 研究的进一步深入，随着对农药微生物修复技术规律的逐渐掌握，农药生物修复将会 有非常广阔的发展空间，在农药环境污染的治理中发挥更大的作用。 在今后一段时间内，微生物修复技术研究可在以下几个领域进一步展开： ( 1 ) 环境微生物种资资源和基因资源的收集与保护；( 2 ) 高分子有机污染物降解过程中的 共代谢机理：( 3 ) 代谢工程与生物修复相结合，解决难降解污染物的生物降解问题； ( 4 ) 研究微生物在生态系统中的组成中相互关系；( 5 ) 污染环境中的降解性微生物分子 生态研究：( 6 ) 增强微生物降解性能的其他属性研究：( 7 ) 土壤宏基因文库中降解性功 能基因的筛选；( 8 ) 通过遗传工程构建高效降解的微生物菌株：( 9 ) 生物降解潜力的指 标与生物修复水平的评价：( 1 0 ) 生物修复与理化方法结合的综合技术的研究；( 1 1 ) 污染物的资源化及生物修复的产业化掣引。 5 毒死蜱 5 1 毒死蜱的理化性质及应用现状 毒死蜱( c h l o r y r i f o s ) 化学名称：0 ，0 - - - 乙基o _ ( 3 ，5 ，6 一三氯- 2 - p 比啶基) 硫代 磷酸酯，商品名称乐斯本( 1 0 r s b a n ) ，其分子式是c 9 h l l c l 3 n 0 3 p s ，相对分子量为 3 4 0 4 9 ，结构式为： c 2 h 5 0 c 2 h 5 0 r 了 羔c 1 | | l 一 s r 、r 一 纯品为白色结晶，有硫醇臭味。是由美国陶氏益农公司开发种广谱高效的有机磷杀 虫剂，在中国登记的商品名是乐斯本。原药为白色或灰白色颗粒状晶体( 或块状固体) ， 5 密度1 3 9 8 ( 4 3 5 ) ，熔点4 1 5 4 3 5 ；汽压为2 5 m p a ( 2 5 ) ；在水中的溶解度为 1 2 m g l ，溶于大多数的有机溶剂，属中等毒性杀虫剂。原药大鼠急性经1 3l d 5 0 为 1 6 3 m g k g ，急性经皮l d s o 为 2 9 k g ，对试验动物眼睛有轻度刺激，对皮肤有明显刺 激，长时间多次接触会产生灼伤。大鼠亚急性经1 3 无作用剂量为o 0 3m g k g ，慢性经 1 2 1 无作用剂量为0 1m g k g 。狗慢性经1 3 无作用剂量为o 0 3m g k g 。室内空气中最高允 许浓度为( t l ) 0 1m g m 3 。对鱼类及水生生物毒性较高，虹鳟鱼l c s o 为1 5m g l ( 9 6 小 时) 2 , 2 9 , 3 0 】。该品种具有触杀、胃毒和熏蒸三种作用方式，作为卫生杀虫剂，可以用来 防治白蚁、虱子、跳蚤和蟑螂等多种卫生害虫【3 1 】；作为农用杀虫剂，可有效防治水稻、 苹果、蔬菜等上的蚜虫、螨类、小菜蛾等百余种害虫【强j 。 作为高毒有机磷农药的替代品，毒死蜱( c h l o r y r i f o s ) 是目前全世界生产和销售最 大的杀虫剂品种之一，也是世界卫生组织许可的有机磷品种【3 3 1 ，其使用量正在逐年增 加，欧盟每年消耗大约5 0 t 的毒死蜱，美国每年消耗大约5 0 0 0 t 吨的毒死蜱，在中国， 作为国家发改委推荐使用的有机磷品种，其使用面积和用量也在逐年增大，每年大约 也要消耗将近1 0 0 0 t m j 。 进入2 0 0 5 年下半年到2 0 0 6 年初，随着国内主要有机磷企业的全面介入，技术进 步加快，特别是中间体三氯吡啶醇钠工艺获得突破，毒死蜱生产成本大幅降低，已经 基本具备和国外( 主要是印度) 进口毒死蜱原药竞争的条件。国内规模化生产毒死蜱的 企业有：江苏宝灵农药、山东华阳股份、湖北沙隆达股份、江苏红太阳股份、常州江 南化工、山西三维丰海化工、浙江永农化工、新农化工，安徽丰乐农化、河北衡水北 方等一大批企业。大部分企业原药含量已突破9 7 ，有固体粉状，也有苯油【3 4 1 。 近几年来，由于华东地区( 苏、浙、闽、粤) 等地水稻飞虱、纵卷叶螟、稻瘿蚊等 害虫大面积爆发，其使用量进一步加大。随着毒死蜱制剂大田应用技术的进步，增加 防效、降低农业成本的各类复配制剂发展速度很快。如为了提高速效性，有：辛硫磷 + 毒死蜱，三氯氟氰+ 毒死蜱等：为了延长持效期，有：阿维菌素+ 毒死蜱，氟啶脲+ 毒死蜱等；为了降低成本，有：杀虫双( 或杀虫单) + 毒死蜱，氯氰菊酯+ 毒死蜱，马拉 硫磷+ 毒死蜱等。 5 2 毒死蜱的残存活性 毒死蜱在叶片上的残留期因不同作物而异，各种作物收获前停止用药的安全间隔 期，棉花2 1d ，水稻7d ，小麦1 0d ，甘蔗7d ，大豆1 4 d ，花生2 1d ，玉米1 0d ，叶菜 类7d 【3 5 3 6 1 。l e e 等3 刀研究了大米在煮前和煮后的毒死蜱含量，结果表明，煮前用水 洗大米，能够去除6 0 的毒死蜱：煮熟后，大米中还残留占总药量3 0 的毒死蜱。b y m e 等 3 8 】研究了不同的食品加工方法毒死蜱的残留情况，结果表明，通过煮、烘烤和加工 成罐头三种方法a n t 的食品，毒死蟀残留量为煮 加工成罐头 烘烤。m a g h r a b y t ”】报 道，将储存的大豆上喷上4 5m g k g 的毒死蜱，储存2 4 周后，测得毒死蜱还残留9 0 ， 6 也就是毒死蜱的残留量为4 1m g k g ，超出了储存粮食毒死蜱的残留限量o 1m g k g 。 g o n z a l e z 4 0 研究了毒死蜱残留降解模式，测定了最后一次施用毒死蜱的收获安全间 隔期。实验结果表明，毒死蜱在施用两周后残留量低2 m g k g ，符合欧洲和美国的要求。 但是，还需要2 0 d ，才能达到日本0 5m g k g 的要求。 毒死蜱在植物叶片上的残留期不长，但在土壤中有较长的残留期。试验表明，毒死 蜱在水稻田土壤中的半衰期为6 7 0 1 6 1 1d ，4 0d 以后土壤中的残留量基本低于0 0 0 5m g l 【毋4 1 1 。石利利等【4 2 】试验表明毒死蜱在高尔夫球场土壤施药当天为0 9 4 9m g k g ：第2 0 天为0 2 9 3m g k g ，即2 0d 后砂土层中仍有较高的毒死蜱残留。毒死蜱在土 壤中的半衰期受温度影响较明显。y e n 等m m 对三种土壤进行的实验结果表明，土壤温 度从2 5 升到3 5 ，毒死蜱的半衰期分别从2 8 、1 5 、1 2d 降到2 、3 、7d 。s u n d a r a m 等】试验表明毒死蜱在2 4 个月的试验期内，在土壤中降解了7 5 9 0 。降解特点 是降解速率起初较快，然后较慢，在快速降解中主要是毒死蜱的水解，水解产物主要是 3 ，5 ，6 一三氯2 一吡啶( t c p ) ，而且土壤的碱性越大降解率越高。 5 3 毒死蜱微生物降解研究进展 对于毒死蜱的微生物降解，国外有许多学者报道过，而国内有关报道较少。从 受农药污染严重的土壤或水体筛选、分离具有优良性状的菌种是目前采用最多的一种 方法【4 5 1 。0 m a r 从使用毒死蜱杀虫剂的土壤中分离出1 3 种真菌，在不加磷和硫而加毒死 蜱等三种有机磷杀虫剂的液体培养基中进行培养，在药剂为1 0m g k g 。1 时，真菌对杀 虫剂的降解水平最高；实验还表明，真菌对有机磷中的磷和硫的生物矿化程度基本一 致m 】。也有研究报道土壤中的一些酶类能够提高有机磷杀虫剂的生物降解，从毒死蜱 等几种有机磷农药药效不理想的农田采集了2 1 组土壤，分析了各种土壤中酸性和碱性 磷酸酶、磷酸二酯酶、磷酸酯酶及脱氢酶的活性；实验结果表明这些酶参与或促进了 杀虫剂的生物降解【47 1 。r a c k ek d 等对毒死蜱的初级代谢物t c p 的降解和吸附进行了研 究，试验采集了2 5 种不同地区的土样，结果表明，t c p 的土壤降解率随土样的不同而 有差异，土样之间没有明显的相关性，但与微生物成分相关；从回归模型中可以看出， 微生物的组成明显提高了t c p 的降解，从而得出t c p 是通过微生物介质矿化，但该过程 是分解代谢还是共代谢还不明确。通过混合培养，其中两种土样中的微生物种群可利 用t c p 作为唯一碳、源【5 0 】。m a l li c k 等找到的降解对硫磷等的黄杆菌( f l a b o b a c t e r i u ms p ) 和节杆菌( a r t h r o b a c l e rs p ) 用来降解毒死蜱，取得了良好的效梨4 8 1 。国内外学者分 离出能够降解二嗪磷、对硫磷、甲基对硫磷以及杀螟松等多种有机磷杀虫剂的多种高 效降解细菌，毒死蜱与这些杀虫剂虽然侧链和环不同，但是都有相同的p - 州结构， 因此许多学者开始从使用毒死蜱的土壤中寻找其降解微生物；部分学者进行了一定的 筛选研究 4 9 1 ：有研究报道，分离得到能利用t c p 为唯一碳源的细菌( p s e u d o m o n a ss p ) ， 当t c p 为4 0i n g r 时，7 0 h l i r 够将其完全降解【5 l 】。 国内对于毒死蜱的微生物降解研究报道的有，刘新等分离等到了降解毒死蜱的真 菌y 一曲霉，并对其降解特性进行了研究【5 2 1 。王金花等对毒死蜱降解菌的筛选、降解 特性进行了研究，从污水排放口污泥中分离到三株以毒死蜱为唯一碳源生长的真菌 w z i 、w z i i 和w z 一，鉴定均为镰孢霉属( f u s a r i u n ll k e x f x ) ，三株菌5d 内对 5 0m g l 。1 毒死蜱的降解率分别高达9 3 5 、9 1 4 和8 3 5 【5 3 】。吴祥为等取毒死 蜱废水处理系统出口处的污泥进行驯化培养，分离出能降解毒死蜱的3 株高效降解菌 株b 、d 1 和d 3 ，对降解效果最好的d 3 菌株经中科院微生物研究所鉴定为玫瑰红红球 菌( r h o d o c o c c u sr h o d o c h r o u s ) s 4 1 ；王晓等从土壤中分离到一株能有效降解毒死蜱的细 菌d s p ，该分离株鉴定为侧芽孢杆菌( b a c i l l u s l a t e r s p r o r u s ) 5 5 j 。 由上我们可知道，目前国内外对于毒死蜱的微生物降解研究大部分还处在室内筛 选及降解性质研究阶段，而对于降解菌株在土壤和植物根部的存活定殖研究得较少。 5 4 毒死蜱微生物降解中存在的问题【5 6 j o o 农药在环境中的降解主要受生物因素和非生物因素两个方面的影响。前者是农 药在生物体内代谢与降解，如动植物和微生物的降解转化，后者是农药在非生物因素 如光、热等影响下进行的降解【6 。在生物转化中，微生物被认为是有机磷农药在环 境中降解的最主要因素。尽管毒死蜱生物修复技术已经取得很大的发展，但由于受到 生物特性的限制，还存在着许多局限性。 ( 1 ) 目前对于农药微生物降解的研究工作大部分还局限在实验室，还不能完全使 农药降解菌从实验室走向实际应用，用于生物修复的微生物多为人为培养并添加于环 境中，进入修复场所后，必然会受到土著微生物的竞争，同时，修复场所的温度、湿 度、酸碱度及营养状况也对这些微生物存在影响，农药浓度过高时抑制微生物的活性， 过低时又不能足满足维持微生物种群，严重时将导致微生物修复的失败。 ( 2 ) 随着应用的发展，生物修复所带来的风险也应引起高度重视，如工程菌的安全 性问题，生物修复对农药使用效果的影响，修复剂或微生物酶制剂带来的次生污染问 题和安全问题，并对土壤结构，土壤肥力和其他自然生态过程产生不可逆转的影响等， 如何消除或减轻这些风险，是摆在我们面前的一项艰巨任务。目前，在其他污染物如 石油污染的生物降解等领域的实际操作已取得突破性进展【2 引，可作为农药污染生物修 复的借鉴。 1 引言 1 1 研究的价值和意义 农药污染的微生物修复是综合运用现代微生物技术，使土壤中的有害污染物得以 去除，土壤质量得以提高或改善的过程。目前报道的能降解农药的微生物种类较多， 主要包括细菌、真菌、放线菌、藻类等。虽其发展的历史并不长，还存在许多不完善 的