（病理学与病理生理学专业论文）dcr3在涎腺肿瘤中的表达及其意义.pdf

d c r 3 在涎腺肿瘤中的表达及其意义 摘要 目的：通过对涎腺肿瘤中d c r 3 蛋白和m r n a 的表达情况进行检 测，旨在从蛋白水平和分子水平探讨d c r 3 在涎腺肿瘤发生发展中的 作用及其临床病理意义，为涎腺肿瘤的诊断、治疗和预后判断提供一 定的依据。方法：应用免疫组化s p 法和原位杂交方法检测了5 1 例涎腺 肿瘤组织和5 例正常涎腺组织中d c r 3 蛋白和i n 】 a 的表达情况，并分 析d c r 3 蛋白和m r n a 的表达与涎腺肿瘤的临床病理参数之间的关 系。结果：( 1 ) d c r 3 蛋白阳性染色结果主要呈淡黄色或棕黄色颗粒， 位于细胞浆中，在涎腺肿瘤组织中主要表达在肿瘤性上皮细胞的胞浆 中，在正常涎腺组织中主要表达在闰管和纹管的上皮细胞的胞浆中； ( 2 ) d c r 3 m r n a 阳性杂交信号也主要呈淡黄色或棕黄色颗粒，主要位 于细胞浆中，细胞核中可见少量表达，在涎腺肿瘤组织中主要表达在 肿瘤性上皮细胞的胞浆中，在正常涎腺组织中主要表达在闰管和纹管 的上皮细胞的胞浆中；( 3 ) d c r 3 蛋白在恶性涎腺肿瘤中的阳性表达率 高于在良性涎腺肿瘤中的阳性表达率( # = 4 6 4 7 产o 0 3 1 o 0 5 ) ，在恶 性涎腺肿瘤中的表达高于在良性涎腺肿瘤中的表达( z r - 2 5 0 5 产 o 0 1 2 o 0 5 ) ；( 6 ) d c r 3 蛋白和 m r n a 在黏液表皮样癌和腺样囊性癌中的表达与其组织学类型无关 ( z - o 8 6 8 ，尸= o 3 8 5 0 0 5 ；z _ 0 6 0 0 ，尸= 0 5 4 9 o 0 5 ) ；( 7 ) d c r 3 蛋白和 m r n a 在恶性涎腺肿瘤中的表达与其恶性程度有关，在高度恶性组中 的表达高于在低度恶性组中的表达( z - 2 5 7 7 ，尸= o 0 10 o 0 5 ；z r - 2 6 7 7 ，卢0 0 0 7 o 0 5 ) ；( 8 ) d c r 3 蛋白和m i a 在恶性涎腺肿瘤的表达 与其临床删分期和淋巴结转移有关：d c r 3 蛋白和m r n a 在临床 i i i 期中的表达高于在临床i i i 期中的表达( z | _ 2 2 9 4 ，尸：o 0 2 2 0 0 5 ；z ，- 2 4 7 0 ，尸= o 0 1 4 0 0 5 ) ，在有淋巴结转移组中的表达高于在 无淋巴结转移组中的表达( z 兰2 2 4 2 ，仁o 0 2 5 o 0 5 ；z | _ 2 4 8 6 ， 尸= o 0 1 3 o 0 5 ) ；( 9 ) d c r 3 蛋白在涎腺肿瘤中的表达和d c r 3 m 】 a 在涎腺肿瘤中的表达具有显 著正相关关系( r s - 0 5 7 3 ，户= 0 0 0 0 0 0 1 ) 。结论：( 1 ) d c r 3 蛋白和 d c r 3 训刚a 在涎腺肿瘤组织中主要表达在肿瘤性上皮细胞的胞浆 中，在正常涎腺组织中主要表达在闰管和纹管的上皮细胞的胞浆中； ( 2 ) d c r 3 蛋白和训 a 在恶性涎腺肿瘤中的表达高于在良性涎腺肿瘤 中的表达；恶性涎腺肿瘤中，d c r 3 蛋白和m r n a 在高度恶性组中的 表达高于在低度恶性组中的表达。提示d c r 3 蛋白和m r n a 可能参与 了涎腺肿瘤的发生发展过程及涎腺组织细胞的恶性转化；( 3 ) d c r 3 蛋 白和州 a 在恶性涎腺肿瘤中的表达与其临床删分期及淋巴结转 移有关，而与患者的性别、年龄及肿瘤的大小、部位等临床病理参数 无关，提示d c r 3 蛋白和r n j m a 可能成为判断恶性涎腺肿瘤患者的预 后情况及预测恶性涎腺肿瘤的细胞转移潜能的潜在参考指标；( 4 ) d c r 3 蛋白在涎腺肿瘤中的表达与d c r 3 m r n a 在涎腺肿瘤中的表达显 著正相关，两者具有较高的一致性，均可能成为研究涎腺肿瘤发生发 展的有价值的检测指标。 关键词：d c r 3 蛋白；d c r 3 r n j a ；涎腺肿瘤：免疫组织化学； 原位杂交 象 e x d r e s s i o na n ds i g n i f i c a n c eo fd c i bi ns a l i v a i 了g l a n dt u m o r se x p r e s s l o na n ns l g n l i l c a n c eo il j c 量- jl ns a i l v a i 了g l a n qi u m o r s a b s t r a c t ：o b j e c t i v e ：t oi n v e s t i g a t et h er e l a t i o nb e t w e e nd c r 3a n d m e c h a n i s mo ft u m o r i g e n e s i sa n dd e v e l o p m e n to fs a l i v a 巧g l a n dt u m o r s a n di t sc l i n i c o p a t h o l o g i c a ls i g n i f i c a n c e ，a n dt op r o v i d eg u i d a n c ef o r c l i n i c a ld i a g n o s i s ，t r e a t m e n ta n dp r o g n o s i so fs a l i v a 叫g l a n dt u m o r sb y e x 锄i n i n ge x p r e s s i o no fd c i 好p r o t e i na n dn 删ai ns a l i v a 叮g l a n d t u m o r s m e t h o d s ：s pi m m u n o h i s t o c h e m i c a lm e t h o da n di n s i t u h y b r i d i z a t i o nm e t h o dw e r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fd c r 3 p r o t e i na n dm 剐n a i n5lc a s e so fs a l i v a 巧g l a n dt u m o r sa n d5c a s e so f n o m a ls a l i v a 巧g l a n dt i s s u e s ，a n dw ea n a l y z e dr e l a t i o n s h i po fb e t w e e n e x p r e s s i o n o fd c l 妈 p r o t e i n a n dm i aa n d c l i n i c o p a t h o l o g i c a l p a r a m e t e r so fs a l i v a 叮g l a n dt u m o r s r e s u l t s ： d c r 3p r o t e i np o s i t i v e s t a i n i n gw a sy e l l o wo rb r o w ng r a n u l e s ，l o c a t e di n t h ec ”o p l a s m ，a n d w e r ee x p r e s s e dm a i n l yi nt h ec ”o p l a s mo fe p i t h e l i a lt u m o rc e l l si n s a l i v a 巧g l a n dt u m o r sa n dt h ec ”o p l a s mo fe p i t h e l i a lc e l l so ft h el e a p t u b ea n dc o 肌g a t e dt u b eo fn o m a ls a l i v a 秽g l a n dt i s s u e d c r 3 m r n a p o s i t i v eh y b r i d i z a t i o ns i g n a l w a sy e i l o wo rb r o 、v ng r a n u l e s ， m a i n l y l o c a t e di nt h ec ”o p l a s m ，t h en u c l e u sc a nb es e e ni nas m a l la m o u n to f e x p r e s s i o n ，a n dw e r ee ) i 叩r e s s e dm a i n l yi nt h ec ”o p l a s mo fe p i t h e l i a l t u m o rc e l l si ns a l i v a 巧g l a n dt u m o r sa n dt h ec ”o p l a s mo fe p i t h e l i a lc e l l s 4 o ft h el e 印t l j b ea n dc o r m g a t e dt u b eo fn o m a ls a l i v a 巧g l a n dt i s s u e ； ( 爹t h ep o s i t i v er a t eo fd c r 3p r o t e i ni nm a l i g n a n ts a l i v a 巧g l a n dt u m o r s w a sh i 曲e rt h a nt h a ti nb e n i g ns a l i v a 叮g l a n dt u m o r s ( # ：4 6 4 7 产o 0 3 1 o 0 5 ) ，a n de x p r e s s i o no fd c i 妈p r o t e i n i n m a l i g n a n ts a l i v a 巧g l a n d t u m o r sw a sh i 曲e rt h a nt h a ti nb e n i g ns a l i v a 巧g l a n dt u m o r s ( z _ 一2 5 0 5 ， 尸= o o12 o 0 5 ) e x p r e s s i o no fd c r 3p r o t e i na n dn 删aw a sn o t r e l a t e dt ot h e i rt y p eo fo r g a n i z a t i o ni nm u c o e p i d e n n o i dc a r c i n o m aa n d a d e n o i dc y s t i cc a r c i n o m a ( z _ o 8 6 8 ，尸= o 3 8 5 o 0 5 z - - 0 6 0 0 产o 5 4 9 o 0 5 ) ( de x p r e s s i o n o fd c i bp r o t e i na n dm r n aw a sr e l a t e d t o m a l i g n a n td e g r e ei nm a l i g n a n ts a l i v a 猡g l a n dt u m o r s ，t h ee x p r e s s i o ni n h i 曲g r a d em a l i g n a n tg r o u pw a sh i g h e rt h a nt h a ti nl o w g r a d em a l i g n a n t g r o u p ( z _ 2 5 7 7 ，尸= o 0 1 0 o 0 5 z - 2 6 7 7 ，尸= 0 0 0 7 o 0 5 ) ；e x p r e s s i o n o fd c i bp r o t e i na n dm r n aw a sr e l a t e dt oc l i n i c a ls t a g ea n dl y m p hn o d e m e t a s t a s i si nm a l i g n a n ts a l i v a 巧g l a n dt u m o r s ：e x p r e s s i o no fd c r 3 p r o t e i na n dm i a i nc l i n i c a ls t a g ei i i w a sh i g h e rt h a nt h a ti nc l i n i c a l s t a g ei i i ( z _ 2 2 9 4 ，尸= o 0 2 2 o 0 5 z - 2 4 7 0 ，仁o o 14 o 0 5 ) ，a n d e x p r e s s i o no fd c i 妈p r o t e i na n dm r n aw i t hl y m p hn o d em e t a s t a s i s 5 _ _ 。一 g r o u p w a s h i g h e r t h a nt h a tw i t h o u t l y m p h n o d em e t a s t a s i s g r o u p ( z - 2 2 4 2 尸= o 0 2 5 o 0 5 z _ - 2 4 8 6 ，尸= 0 0 1 3 o 0 5 ) t h e r ew a sas i g n i f i c a n tp o s i t i v e c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e e x p r e s s i o no fd c r 3a n de x p r e s s i o no fd c r 3 i n 】州ai ns a l i v a 巧g l a j l d t u m o r s ( r s _ o 5 7 3 ，尸= 0 0 0 0 o o1 ) c o n c i u s i o n s ：d c r 3 p r o t e i n a n d d c r 3 m r n aw e r em a i n l ye x p r e s s e di nt h ec ”o p l a s mo fe p i t h e l i a lt u m o r c e l l si ns a l i v a 巧g l a n dt u m o r sa n dt h ec y t o p l a s mo fe p i t h e l i a lc e l l so ft h e l e a pt u b e a n dc o m j g a t e dt u b eo fn o r m a l s a l i v a 拶 g l a n d t i s s u e e x p r e s s i o no fd c r 3p r o t e i na n dm r n ai nm a l i g n a n ts a l i v a 叫g l a n d t u m o r sw a sh i 曲e rt h a nt h a ti nb e n i g ns a l i v a 叫g l a n dt u m o r s ，a n d e x p r e s s i o no fh i g h g r a d em a l i g n a n tg r o u p w a sh i g h e rt h a nt h a to f l o w g r a d em a l i g n a mg r o u pi nm a l i g n a n ts a l i v a 叫g l a n dt u m o r s s ow e s p e c u l a t e dt h a td c r 3m a y b ei n v o l v e di nt u m o r i g e n e s i sa n dd e v e l o p m e n t o fas a l i v a 巧g l a n dt u m o r sa n dm a l i g n a n tt r a n s f o r m a t i o no fs a l i v a 巧g l a n d t i s s u ec e l l s e x p r e s s i o no fd c r 3p r o t e i na n dm r n aw a sr e l a t e dt o c l i n i c a ls t a g ea n dl y m p hn o d em e t a s t a s i si nm a l i g n a n ts a l i v a 拶g l a n d t u m o r s ，b u tn o tr e l a t e dt os e x ，a g eo fp a t i e n t sw i t hs a l i v a 叫g l a n dt u m o r s a n ds i z e ，l o c a t i o no ft u m o r s s ow es p e c u l a t e dt h a td c i bm a yb ea p o t e n t i a lr e f e r e n c et oju d g et h ep r o g n o s i so fp a t i e n tg l a n dt u m o r sa n d t o p r e d i c tm e t a s t a t i cp o t e n t i a lo fc e l l si nm a l i g n a n ts a l i v a 巧g l a n dt u m o r s 6 ( 4 ) e x p r e s s i o no fd c r 3p r o t e i nw a ss i g n i f i c a n t l yc o n s i s t e n tw i t ht h a to f d c r 3m r n ai ns a l i v a 巧g l a n dt u m o r s ，a n dt h e yb o t hc a nb ev a l u a b l e d e t e c t e dm a r k e r si ns a l i v a 巧g l a n dt u m o r s k e y w o r d s ：d c r 3 m r n a 】d c r 3p r o t e i s a l i v a 巧g l a n dt u m o r s i m - m u n e o h is t o c h e m i c a l i ns i t uh y b r i d i z a t i o n 7 上_ 皇 刖舌 涎腺肿瘤( s a l i v 哪g l a n dt u m o r s ) 是口腔颌面部常见的肿瘤之一， 占人体全部肿瘤的2 3 ，是发病率较高、组织学具有器官特异性的 肿瘤。由于正常涎腺发生过程及形态结构较复杂，同时涎腺肿瘤具有 细胞增殖、分化和凋亡的异常，导致涎腺肿瘤细胞形态、组织结构和 生物学行为复杂，且涎腺肿瘤组织学分类分型很多，不同组织学类型 的生物学行为也不尽相同。多形性腺瘤、基底细胞腺瘤、w 砒h i n 瘤 为常见的良性涎腺肿瘤，但多形性腺瘤术后易复发，可发生癌变，而 基底细胞腺瘤和w r a n h i n 瘤则复发和癌变都较多形性腺瘤少见。黏液 表皮样癌、腺样囊性癌为常见的恶性涎腺肿瘤，呈侵袭性生长，粘液 表皮样癌根据癌细胞的分化程度和粘液细胞的多少分为高分化、中分 化和低分化，根据分化程度、生物学行为和预后情况又可分为低度恶 性、中度恶性和高度恶性，低度恶性为高分化，术后复发率仅为6 ， 很少发生转移，5 年生存率高达9 5 ；中度恶性为中分化，术后复发 率为2 0 ，少数发生发生转移，5 年生存率可达8 0 9 0 ；高度恶性 为高分化，肿瘤生长快，侵袭性强，术后8 0 发生转移，常发生远处 转移，5 年生存率仅有2 5 3 0 。腺样囊性癌根据细胞的排列方式 分为筛状型、管状型和实体型，侵袭性强和易发生转移是腺样囊性癌 的两个显著特征，肿瘤可侵犯腺体、肌肉、骨膜，易侵犯神经、血管， 常发生远处转移，组织类型和预后密切相关，筛状管状型的复发率 和转移率为1 4 3 6 ，8 年生存率为5 7 1 0 0 ，实性型的复发率 为7 0 ，8 年生存率仅有3 0 ，贲呈瑞等乜1 研究表明，筛状型为低度 恶性，管状型为中度恶性，实体性为高度恶性。尽管涎腺肿瘤的细胞 形态、组织结构和生物学行为复杂，且涎腺肿瘤组织学分类分型很多， 但可以从整体上对涎腺肿瘤的发生机制进行研究。 肿瘤的发生发展是一个多因素、多阶段、多步骤渐进性衍化的过 程，除了与原癌基因的激活、抑癌基因的失活或丢失等有关外，细胞 增殖和凋亡的动态平衡的破坏也在肿瘤的发生发展中发挥着重要作 用。诱骗受体3 ( d e c o yr e c e p t o r3 ，d c r 3 ) ，又称为t r 6 ，是1 9 9 8 年p i t t i 等发现的肿瘤坏死因子受体( t u m o rn e c r o s i sf a c t o rr e c 印t o r ，n 虾r ) 超 家族的新成员。2 0 0 0 年b a i 等发现d c i u 编码基因m 6 8 位于人类染色鼋。 体2 0 q 1 3 3 ，和另外3 个基因共同构成一个与肿瘤发生密切相关的基因 簇，其编码区共有三个外显子，在人类肿瘤细胞中会发生基因扩增和 亨 基因重排。全长c d n a 编码一条3 0 0 个氨基酸组成的完整多肽，n 端前 2 9 个氨基酸为信号肽序列，随后是4 个半胱氨酸富集区，这一特点与 ， t n f r 家族其他成员非常相似，并且在第1 7 3 位天冬氨酸处有1 个n 糖 基化位点，序列分析发现，d c r 3 与o p g 、n 师l 也和f a s 的序列同源性 分别达31 、2 9 和1 7 ，但d c r 3 缺乏跨膜序列，是分泌性的蛋白分 子，其分子质量约为3 5 k d ，d c r 3 与相应配体结合后不能传递凋亡信 号口5 1 。d c r 3 主要通过竞争性地结合l i g h t 、f a s l 和t l l a ，抑制 l i g h t 、f a s l 和t l l a 介导的细胞凋亡，从而影响细胞增殖与凋亡的 动态平衡，在肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。 已有研究显示：d c r 3 在人类胚胎肺、脑、肝和成人胃、脊髓、 9 淋巴结、气管、脾、结肠、肺中存在低表达b 4 1 ，但在多种恶性组织 肿瘤组织都存在扩增和高表达，如d c r 3 在肺癌b 1 、胰腺癌阳1 、乳腺癌 1 、 胃癌陋9 1 训、食管腺癌1 、结肠癌n 别、肾细胞癌n3 | 、肝细胞癌j 5 1 6 | 、 喉癌n7 1 、神经胶质瘤n 8 1 引、弥漫性大b 细胞淋巴瘤心叫等肿瘤组织表达 明显增高，且其表达与肿瘤的分化程度、临床分期和淋巴结转移有关。 提示d c r 3 可能在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。研究还发 现d c r 3 在肿瘤患者的血清或腹水中的表达也增高，w u 等心研究发现 5 6 2 ( 8 2 1 4 6 ) 的肿瘤患者血清中d c r 3 阳性，而阳性患者中有9 8 8 患 有恶性肿瘤，在胃癌中，血清t r 6 水平和肿瘤的分化程度和临床分期 有关。且肿瘤切除后血清t r 6 水平明显下降，从而认为血清t r 6 来源 与肿瘤组织。m a c h e r - g o e p p i n g e r 等n 33 研究发现肾细胞癌患者中血清 d c r 3 的表达在临床高分期和有远处转移的患者血清中明显增高。 s i m o n 等幢蹦研究发现d c r 3 在卵巢癌病人的血清中水平高于正常对照 组。c o n n o r 等乜3 1 研究发现，4 4 例晚期卵巢癌病人的腹水中均检测到 d c r 3 的表达，且其表达和临床分期相关。进一步提示d c r 3 可能在肿 瘤的发生发展中发挥着重要作用。目前d c r 3 还被作为恶性肿瘤的治 疗靶点进行临床研究，s h i 等乜们设计使肿瘤细胞表面表达d c r 3 ，然后 将这些细胞灭活作成肿瘤疫苗，发现它能保护老鼠不受母细胞株的侵 害；w a n g 等心5 3 研究发现经转染的d c r 3 r n a i s w 4 8 0 的结肠癌细胞其 d c r 3 训 a 的表达降低，肿瘤细胞的生长数量减少，凋亡增加；吴 泰璜等心6 1 研究发现d c r 3 反义r n a 可使肝癌细胞凋亡增多；陈罡等乜7 1 研究发现肝癌细胞高表达d c r 3 ，d c r 3 中和性抗体可抑制肝癌细胞的 1 0 生长。研究结果从反面进一步提示d c r 3 在肿瘤的发生发展中起着重 要作用，并可作为恶性肿瘤的治疗靶点。 尽管目前有关d c r 3 与其他肿瘤关系的研究较多，但涎腺肿瘤中 d c r 3 在蛋白和分子水平表达的研究还未见报道。本研究拟应用免疫 组织化学链霉素抗生物素一过氧化物酶染色法( s t 玎印t a v i d i np r o x i d o s e i m m u n o h i s t o c h e m i s t 巧m e t h o d ，s p 法) 和原位杂交( i ns i t uh y b r i d i z a t i o n ， i s h ) 方法对d c r 3 蛋白和d c r 3 m i a 在涎腺肿瘤中的表达情况进行 检测，旨在从蛋白水平和分子水平探讨d c r 3 在涎腺肿瘤发生发展中 的作用及其临床病理意义，为涎腺肿瘤的诊断、治疗和预后判断提供 一定的依据。爹 材料与方法 1实验材料 1 1 组织标本及处理 标本选自泸州医学院附属医院病理科2 0 0 8 年3 月2 0 0 9 年3 月期 间外科手术切除的涎腺肿瘤组织，其中良性涎腺肿瘤2 4 例( 多形性腺 瘤8 例，w a n h i n 瘤8 例，基底细胞腺瘤8 例) ，恶性涎腺肿瘤2 7 例( 黏液 表皮样癌1 6 例，腺样囊性癌1 1 例) ，并选取5 例正常涎腺组织做对照。 所有标本经4 多聚甲醛固定，石蜡包埋，原位杂交用6 m 厚连续切片， 免疫组织化学用4 岬厚连续切片。所有涎腺肿瘤标本均根据w h o 肿 瘤组织病理类型分类标准经两位有资历的病理医师复查确诊。 1 2 临床病理资料 性别：男性2 9 例，女性2 2 例；年龄： 5 0 岁者2 5 例，5 0 岁者2 6 例；部位：腮腺2 6 例，颌下腺9 例，腭腺1 l 例，其它小涎腺5 例。所有 肿瘤患者均为首次发病，术前均未进行放疗、化疗或生物治疗，并且 病历资料保存完整。术后根据病理大标本确定肿瘤的大小及有无淋巴 结转移将涎腺肿瘤分组：肿瘤直径2 c m 者有2 7 例，2 c m 者有2 4 例； 有淋巴结转移者有7 例，无淋巴结转移者有2 0 例。根据肿瘤的组织学 形态及生物学行为将恶性涎腺肿瘤分为：低度恶性者1 2 例，中度恶性 者8 例，高度恶性者7 例。根据国际抗癌联盟( u i c c ，2 0 0 2 ) 临床t n m 分类分期将恶性涎腺肿瘤分为：i i i 期1 9 例，i i i 期8 例。 2 实验方法 2 1 免疫组织化学 2 1 1主要仪器 石蜡切片机( l e i c 冰m 2 0 3 5 ) ； 电热恒温鼓风干燥箱( d h g 9 0 7 0 ，上海益恒实验仪器公司) ； 自动恒温孵育箱( w k 8 9 1 型，重庆) ； 酸度计( p h s 3 c ，成都方舟科技开发公司) ； s a n y o 低温冰箱( 日本) ； ， 不锈钢高压锅( 苏泊尔) ； 1 0 0 0 w 电炉； 光学显微镜( o l y m p u sc h 2 0 b i m f 2 0 0 ) 。囊_ 2 1 2 主要试剂 ( 1 ) d c r 3 兔抗人多抗隆抗体( 购自美国b i o w o r l d 公司，浓度1 ：5 0 ) ； ( 2 ) 山羊抗兔免疫组化s p 试剂盒( 购白福建迈新有限公司) ； ( 3 ) d a b 显色试剂盒( 购自武汉博士德公司) ； 蟹 ( 4 ) 粘片剂多聚赖氨酸( p o l y - l l y s i n e ) ( 购白北京中山生物技术有限 公司) ； ( 5 ) 中性树胶封片剂( 购自武汉博士德公司) ； ( 6 ) o 1 mp b s ( p h 7 2 7 4 ，配制方法：1 0 0 0 m l 双蒸水加n a c l4 5 9 ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 03 0 8 9 ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 02 8 9 ，p h 7 2 7 4 ) ； ( 7 ) o o l m 枸橼酸盐缓冲液( 配法：1 0 0 0 m l 双蒸水加枸橼酸三钠3 9 ，枸 橼酸盐o 4 9 ，p h 调至6 0 ) 。 2 1 3 操作程序 ( 1 ) 载玻片防脱片处理。切片常规脱蜡至水； ( 2 ) 磷酸盐缓冲液( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ) 中浸染两次，每次 5 m i n ： ( 3 ) 抗原热修复：将切片浸入o 0 1 m 枸橼酸缓冲液( p h 调至6 0 ) 中， 放入高压锅中，加入至沸腾后持续15 m i n ，自然冷却后，p b s 浸洗 5 m i n 3 次； ( 4 ) 切片放入湿盒中，滴加5 0 “l 过氧化物酶阻断溶液( 试剂a ) ，以阻 断内源性过氧化物酶活性，室温下孵育l o m i n ，p b s 溶液充分浸洗 5 m i n 3 次。 ( 5 ) 每张切片滴加5 0 l 非免疫动物血清( 试剂b ) 封闭，室温下孵育15 分钟，倾去多余血清，勿洗，滴加5 0 p l 一抗，4 过夜，p b s 溶液充分 浸洗5 m i n 3 次； ( 6 ) 每张切片上滴加5 0 “1 生物素标记二抗( 试剂c ) ，盖好湿盒，放入 3 7 孵育箱中孵育l o m i n ，p b s 溶液充分浸洗5 m i n 3 次； ( 7 ) 每张切片上滴加5 0 p l 辣根标记链酶卵白素溶液标记二抗( 试剂d ) ， 3 7 孵育箱中孵育l o m i n ，p b s 溶液充分浸洗5 m i n 3 次； ( 8 ) 每张切片上滴加1 0 0 p l 新鲜配制的d a b 显色液，显微镜下观察显色 效果，控制显色时间，以特异性显色最强，而背景基本不着色为准， p b s 溶液充分浸洗5 m i n 3 次； ( 9 ) 苏木素复染，分色，返蓝； ( 1 0 ) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察。 2 1 4 对照设计 用磷酸盐缓冲液( p b s ) 代替一抗( d c r 3 兔抗人多克隆抗体) 作 阴性对照，用已知的结肠癌标本作为阳性对照。 2 2原位杂交 2 2 1主要仪器 石蜡切片机( l e i c ar m 2 0 3 5 ) ； 电热恒温鼓风干燥箱( d h g 9 0 7 0 ，上海益恒实验仪器公司) ； 自动恒温孵育箱( w k 8 9 1 型，重庆) ； 酸度计( p h s 3 c ，成都方舟科技开发公司) ； s a n y o 低温冰箱( 日本) ； 压力蒸汽消毒器( 成都成华区消毒设备厂) ；豪 光学显微镜( 0 l y m p u sc h 2 0 b i m f 2 0 0 ) ； 原位杂交专用盖玻片( 购自博士德公司) 。 ， 2 1 2 主要试剂 ( 1 ) d c r 3 原位杂交检测试剂盒内含：d c r 3 寡核苷酸探针杂交液、胃蛋 矿 白酶、预杂交液、封闭液、生物素化鼠抗地高辛、s a b c p o d ( 链霉 亲和素过氧化物酶复合物) 、生物素化过氧化物酶( 购自武汉博士 德生物工程有限公司) ； ( 2 ) 粘片剂多聚赖氨酸( p 0 l y - l l y s i n e ) ( 购自博士德公司) ； ( 3 ) o 1 焦碳酸二乙酯( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，d e p c ) ； ( 4 ) 1 多聚甲醛； ( 5 ) 2 0 甘油缓冲液( 2 0 m l 甘油加8 0 m l 双蒸水) ； ( 6 ) 3 柠檬酸( 1o o m l 双蒸水加柠檬酸3 9 ，p h 2 o 左右) ； ( 7 ) 2 s s c ( 柠檬酸钠溶液，配法：1 0 0 0 m l 双蒸水加氯化钠1 7 6 9 ， 柠檬酸三钠8 8 9 ) ； ( 8 ) o 5 s s c ( 配法：3 0 0 m l 双蒸水加1 0 0 m l2 s s c ) ； ( 9 ) 0 2 s s c ( 配法：2 7 0 m l 双蒸水加3 0 m l2 s s c ) ； ( 1 0 ) 原位杂交用p b s ( 配法：1 0 0 0 m l 双蒸水加氯化钠3 0 9 ， n a 2 唧0 4 。1 2 h 2 06 9 ，n a h 2 p 0 4 2 m oo 4 9 ，p h 7 2 7 4 ) ； ( 1 dd a b 显色试剂盒( 购白博士德公司) 等。 2 2 3 操作程序 ( 1 ) 杂交前准备：实验所用器皿经1 6 0 1 8 0 烘烤3 4 小时；杂交 操作完成前使用的溶液均需用d e p c 水配制并经1 2 0 2 0 分钟消毒灭 活r n a 酶。载玻片用粘片剂多聚赖氨酸( p o l y l l y s i n e ) 防脱片处理。 切片时带口罩手套，所用刀片及刀架等用o 1 d e p c 水清洗，裱片在 d e p c 水中进行。切片厚6 “m 。 ( 2 ) 石蜡切片经常规脱蜡至水。新鲜配制3 h 2 0 2 ，室温l o m i n 以灭活 内源性过氧化物酶。蒸馏水洗3 m i n 3 次。 ( 3 ) 暴露m r n a 核酸片段：切片上滴加3 柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶 ( 1 m l3 柠檬酸加2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀) ，3 7 消化1 5 2 0 m i n 。 原位杂交用p b s 洗5 m i n 3 次。蒸馏水洗1 次。 ( 4 ) 后固定：固定液为1 多聚甲醛o 1 mp b s ( p h 7 2 7 6 ) ，含有 o 1 d e p c 。室温固定1 0 m i n 。蒸馏水洗3 m i n 3 次。 ( 5 ) 预杂交：湿盒的准备( 干的杂交盒底部加2 0 甘油缓冲液2 0 m l 以 保持湿度) 。按每张切片2 0 “l 加预杂交液。恒温箱4 0 2 4 h 。吸取 1 6 多余液体，不洗。 ( 6 ) 杂交：按每张切片2 0 “l 杂交液，加在切片上。将原位杂交专用盖 玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱4 0 杂交过夜。 ( 7 ) 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，3 7 左右的2 s s c 洗5 m i n 2 次， 3 7 o 5 s s c 洗1 5 m i n 1 次；3 7 o 2 s s c 洗1 5 m i n 2 次。 ( 8 ) 滴加封闭液：3 7 3 0 m i n 。甩去多余液体，不洗。 ( 9 ) 滴加生物素化鼠抗地高辛：3 7 6 0 m i n 。原位杂交用p b s 溶液洗5 m i n 4 次。 ( 1 0 ) 滴加s a b c p o d ：3 7 2 0 m i n 。原位杂交用p b s 溶液洗5 m i n 3 次。 ( 1 d 滴加生物素化过氧化物酶：3 7 2 0 m i n 。原位杂交用p b s 溶液沈 5 m i n 4 次。 ( 1 乃d a b 显色：使用d a b 显色试剂盒将显色剂和底物液以1 ：2 0 比例混匀，加至切片上，显色2 0 3 0 m i n ，镜下控制反应时间。充分 水沈。 ： ( 1 3 ) 苏木素复染，分色，反蓝。 ( 1 4 ) 梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，显微镜观察。 2 1 4 对照设计 ” 用原位杂交专用p b s 代替杂交液作阴性对照，用已知的结肠癌标 本作为阳性对照。 2 3 结果判断 d c r 3 蛋白阳性染色结果主要呈淡黄色或棕黄色颗粒，位于细胞 浆中；d c r 3 m r n a 阳性杂交信号呈淡黄色或棕黄色颗粒，主要位于 1 7 细胞浆中，在细胞核中可见少量表达。每张切片由两名观察者双盲交 换判断，1 0 4 0 倍光学显微镜下随机选取5 个独立高倍( 4 0 0 ) 视野， 计数5 0 0 个细胞中阳性细胞所占比例。根据g a t a l i c a 等心引的半定量方 法，将染色强度( i ) 分为四级：无染色o 分，弱染色1 分，中等染 色2 分，强染色3 分；阳性细胞构成比( p ) 分为四级：5 2 5 为1 分，2 5 6 分为( 卅，强阳性) 。 2 4 统计学处理 采用s p s s l7 o 统计软件。计数资料构成比的比较用z 检验；水 平比较用非参数检验( 秩和检验) ：多个样本间比较用k r u s k a l w a l l i s h 检验，两个独立样本比较用m a n n w h i t n e yu 检验；相关分析采用 s p e a m a n 秩相关分析。取萨o 0 5 为检验水准。 结果 ld c i u 蛋白的表达情况 1 1d c r 3 蛋白的表达定位 d c r 3 蛋白的阳性染色结果主要呈淡黄色或棕黄色颗粒，定位于 细胞浆中，阳性对照片呈清晰的棕黄色染色，阴性对照片未见明显着 色。d c r 3 蛋白在涎腺肿瘤中主要表达在腺管、有腺管形成趋势、实 性条索或巢团的肿瘤性上皮细胞的胞浆中；在正常涎腺组织中主要表 达