（化学工程专业论文）高效反硝化菌的实验研究及其脱氮动力学分析.pdf

中文摘要 在当前经济发展过程中，水资源紧缺、水环境同趋恶化已经成为 制约我国经济发展的重要因素，水体污染的治理及防治已迫在眉睫。 生物反硝化法是解决水体中硝氮污染问题的主要方法之一。本实 验采用实验室筛选出的高效反硝化菌y z 2 ，研究了不同条件对y z 2 进行生物反硝化的影响。实验分别采用蔗糖、葡萄糖、混合碳源及柠 檬酸钠为碳源进行了间歇实验。首先，通过改变p h 值及温度，进行一 系列间歇性实验，确定了反硝化进行的基本条件；其次，对单一碳源 及混合碳源( 蔗糖、葡萄糖) 在室温及低温下的反硝化效果进行了对 比。结果表明，菌株y z - 2 具有很强的反硝化能力，经y z 2 处理过的 污水可以达到国家标准。 为了对反硝化菌y z 2 的性能有进一步的了解，通过m o n o d 方程 进行了动力学分析，得出了如下模型：c o d 降解m o n o d 模型、硝酸赫 氮反硝化m o n o d 模型、温度对动力学的影响以及p h 值对动力学参数 的影响的模型；本实验还采用海藻酸钠和聚乙烯醇对菌体进行包埋固 定，制成菌球，通过连续性实验，进行了固定化菌球降解硝氮废水的 研究。通过考察实验条件对菌株反硝化效果的影响，确定了最佳的工 艺参数。 关键词：反硝化，反硝化菌。间歇实验，固定化细胞，动力学 注：本研究为天津市自然科学基金资助项目，项目编号0 l3 6 1 0 1 1 1 l a b s t r a c t i nt h ec o u r s eo f p r e s e n te c o n o m i cd e v e l o p m e n t ，w a t e rs c a r c i t ya n d w a t e rd e t e r i o r a t i o nh a v eb e c a m ei m p o r t a n tl i m i t i n gf a c t o r so fn a t i o n a l e c o n o m i cd e v e l o p m e n t si no u rc o u n t r y t h er e m e d i a t i o na n dp r e c a u t i o n o ft h ew a t e rp o l l u t i o nh a v eb e e ne x t r e m e l yu r g e n t b i o l o g i c d e n i t r i f i c a t i o ni so n eo ft h em o s t p o p u l a r m e t h o d st o r e m o v en i t r i t ea n dn i t r a t ef r o mw a t e r i nt h ee x p e r i m e n t ，w eu s e dt h e d e n t r i f i e rn a m e dy z 一2w h i c hh a sb e e ni s o l a t e di nt h e l a b o r a t o r y w e r e s e a r c h e dt h ei n f l u e n c eo fd i f f e r e n tc o n d i t i o n so nt h ed e n t r i t i e r i nt h e b a t c he x p e r i m e n tw eu s e dt h es u c r o s e 、g l u c o s e ，m i x e dc a r b o nr e s o u r c e a n ds o d i u mc i t r a t ea st h ec a r b o nr e s o u r c e f i r s t ，t h r o u g hc h a n g i n gt h ep h v a l u ea n dt e m p e r a t u r e ，w ec a r r i e do nas e r i e so fb a t c he x p e r i m e n t sa n d t h ep r i m a r yc o n d i t i o nh a v eb e e nd e t e r m i n e d ；s e c o n d l y ，w ec o m p a r e dt h e d e n i t “f i c a t i o nr e s u l to f s i n g l ec a r b o nr e s o u r c ea n dm i x e dc a r b o nr e s o u r c e ( s u c r o s e ，g l u c o s e ) u n d e r r o o m t e m p e r a t u r e a n dl o w t e m p e r a t u r e r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t i n d i c a t e s ，d e n i t r i f i e r y z - 2h a s v e r ys t r o n g d e n i t r i f y i n ga b i l i t y t h e l e v e lo fw a t e rc a nr e a c ht h en a t i o n a ls t a n d a r d a f t e rt r e a t m e n tw i t h0 f y z 2 i no r d e rt oh a v ef u r t h e ru n d e r s t a n d i n go nt h ep r o p e r t i e so fy z 一2 m o n o de q u a t i o ni s e m p l o y e dt o a c h i e v ek i n e t i c sa n a l y s i si nt h is s t u d y a n df o u rm a t h e m a t i e a lm o d e lh a v eb e e nr e c e i v e ds u c ha sc o d d e g r a d a t i o n m o n o dm o d e l ，n i t r a t ed e n i t r i f i c a t i o nm o n o dm o d e l ，t h e m o d e lo fi n f l u e n c eo f t e m p e r a t u r eo nd y n a m i c sa n dt h em o d e lo f e f f e c to f p h v a l u eo n d y n a m i c sp a r a m e t e r s m o r e o v e r ，s o d i u ma l g i n a t e a n d p o t y v i n y l a l c o h o la r eu s e dt oe m b e n da n di m m o b i l i z et h ed e n t r i f l e r ， m e a n w h i l e ，t h er e s e a r c ho nd e g r a d i n gt h en i t r o g e nw a s t ew a t e rb yt h e i m m o b i l i z e dc e l lh a sb e e nc a r r i e do u tt h r o u g hc o n t i n u o u se x p e r i m e n t f i n a l l y ，t h eo p t i m a lt e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r s a r ed e f i n e d b yw a yo f o b s e r v i n g a n d s t u d y i n g t h ei n f l u e n c eo f e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o no n d e n i t r i f i c a t i o n k e yw o r d s ：d e n i t r i f i c a t i o n ，d e n i t r i f i e r ，i m m o b i l i z e dc e l l ，k i n e t i c s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得鑫注太茔或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：可确酮 签字日期： 砌p 年 月w 同 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨注盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤注盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索。并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 影确两 i i 导师签名；逢另个 签- 7 - r 期：p 年乙月劢日签字日期：劢弘年乙月加同 第一章前言 第一章前言 随着我国国民经济的不断发展，工、农业经济体系的不断完善，环 境污染问题f | 益成为人们关注的焦点。尤其是在经济发展与生态环境的 冲突中，人们越来越受到自然环境的警告。环境问题已经上升为全球问 题。在环境问题中最为突出的是水污染问题。在当前经济发展过程中， 水资源紧缺、水环境日趋恶化已经成为制约我国经济发展的重要因素。 我国大多数地区的地下水在不同程度上遭受到硝态氮污染【l l f 2 。由于土 壤缺乏吸附硝酸根的能力，所以这些硝酸根就会通过渗透进入地下水中 ，近年来的调查表明国内外都存在着地下水被硝酸盐污染的情况，而 在一些地区，污染已十分严重【4 】。 水体中过基的硝酸盐对人体的健康危害极大，其在人体内会在微生 物作用下被还原成亚硝酸盐，引起高铁血红蛋白症及婴儿青紫症。另外 硝酸盐和亚硝酸盐在一定条件下会转化成亚硝胺和亚硝酰胺，它们是高 度致癌、致变、致畸的物质。由此可见，水体的治理及防治已迫在眉睫。 当前硝酸盐污染问题已被各国政府列于议事日程中，世界卫生组织对水 体硝态氮含量的指导性标准为1 0 m g n o ；一1 。 目前处理水体中硝态氮的方法有多种，主要分为物理化学法和生物 反硝化法。生物反硝化法与物理化学法相比，具有低能、高效、无二次 污染的特点，其不是将硝酸盐简单的浓缩，而是将它转化为对人体无害 的氮气，是脱除水体中的硝态氮的主要方法之一。反硝化作为生物脱氮 的一个重要的环节，将硝态氮和亚硝态氮通过反硝化细菌还原成无害的 氮气逸入空气，从而使氮循环顺利进行。 基于上述分析，本文研究了不同条件对菌株进行生物反硝化的影响； 为了对反硝化菌y z 2 的性能有进一步的了解，通过m o n o d 方程进行了 动力学分析，得出了一系列模型；并采用海藻酸钠及聚乙烯醇作为载体 对菌体进行了包埋固定，进行模拟受硝态氮污染的废水脱氮的实验研究， 确定反应器的最佳工艺参数，试图为废水的生物脱氮研究和应用提供一 些理论依据和工艺参数。 第二章文献综述 第二章文献综述 2 1 地下水中硝酸盐的来源及危害 2 1 1 地下水中硝酸盐的来源 氮是自然界中主要的一种组成元素。它在自然界里不断地进行迁移、 转化和循环( 如图2 1 ) 。氮气是氮最主要的存在形式，而在水中氮以氨 氮、硝态氮、亚硝态氮和有机氮的形式存在。自然界中的氮循环作用本 来可以避免环境中某种形式氮的积累，但各种人为因素破坏了这种自然 的平衡作用，则可能造成地下水硝酸盐污染。 整 彘 培 譬 霉 u 联 有机h 畿降蚺糕瓤蕾珏原i 舶。i 瓤彦还原 “。2 j 醚j 舶； 镌i 埔 姆i 瑚 l 球 隳叩堂型 图2 - 1 氮在自然界的循环 f i g2 - lt h ec y c l eo fn i t r o g e ni nt h en a t u r e 地表水由于作物的吸收作用、稀释作用及微生物的作用，一般硝酸 根浓度较低。硝态氮的污染主要存在于地下水中，农业生产施用的大量 氮肥及有机肥是硝态氮污染的主要来源，研究表明，全世界旌用土壤的 肥料有3 0 5 0 经土壤淋溶进入地下水硝酸盐的含量与氮肥的施用量 呈正相关关系【5 】1 6 】；城市生活污水和工业废水中也常含有定数量的氮 等营养物，生活污水中含有的有机氮和氨氮，来自于人体食物中蛋白质 2 筏一 3+4、11“6嗍悔慨n隧际隧_拗别 一 豢嚣鲡硼 第二章文献综述 的代谢废弃物。新鲜生活污水中含有有机氮约6 0 ，氨氮约4 0 ，而硝 态氮仅微量或无。陈1 日生活污水或在通往污水处理厂的管道中停滞时间 过长，废水中的细菌可将蛋白质分解和将尿素水解，使有机鲺转化为氨 氮从而使氨氮比例上丹。 另外，我国很多大中城市的污水处理率很低，污水的直接排放及灌 溉也是地下水硝态氮污染的主要原因之一。 2 1 2 硝态氮污染的危害 工业生产过程中排放的含氮废水及生活污水排入水体以及土壤中的 氮肥随雨水流入江河，会对水体及人体健康造成严重后果，具体表现在： 造成水体的富营养化 富营养化是水质衰老的一种现象，是指在人类活动的影口向下，为生 物所需的氮、磷等营养物质大量进入湖泊、河口、海湾等缓流水体的水 生态系统中，引起藻类及其他浮游生物迅速繁殖，水体透明度下降及溶 解氧量减少，使水体的功能及生态系统受到阻碍和破坏、老化速度加快 的一种现象 j 。 在自然条件下，湖泊也会从贫营养状念过渡到富营养状态，沉积物 不断增多，不过这种自然过程非常缓慢。常需几千年甚至上力年。而人 为排放含营养物质的工业废水和生活污水所引起的水体富营养化现象， 可以在短时期出现j 。 增加了给水处理的成本 在水厂加氯对，原水中氨的存在会使加氯量大大增加( 每克n h 3 n 需增加8 1 0 克c 1 2 ) 。含有大量单细胞藻体的源水。为了脱色、除臭、 除味而使化学絮凝刹投加量成倍增加。藻类也会造成滤池堵塞，使滤池 的反冲次数随之增加。 水体溶解氧量下降 氮污染是造成地表水体富营养化的主要原因之一，它可使地表水体 中溶解氧降低，致使鱼类等水生生物的大量死亡，严重者会造成死湖， 从而破环生态平衡。当还原态氮排入水体会因硝化作用而耗去水体中大 量的溶解氧，造成水体黑臭。一个氨态氮氧化成硝态氮需硝化四个氮， 按重量比，耗氧重量为氨态氮重量的4 5 7 倍。上海黄浦江，正是出于氨 氦浓度逐年上升使黑臭逐年加重，对上海一千万人民赖以生存的水源和 人民健康构成了威胁。因此水体中氨氮浓度成为评价水体污染程度的一 第二章文献综述 个极重要的指标。 危害人类及生物的生存健康 硝酸盐披摄入人体后 ! 1 5 分会被还原成业硝酸盐，业硝酸撒町氧化皿 液中的铁血红蛋白为高铁血红蛋白，后者不具备结合氧的能力，随着血 液中高铁血红蛋白含量增加，血液输送氧的能力下降，严重者导致人体 组织紫疳，临床上称高铁血蛋白症 9 1 。三个月以下的婴儿受此危害最大。 再者，亚硝酸盐会在胃中与氨氮结合形成亚硝基胺或其化合物而具有致 癌作用。 当水中氨氮超过1 m g l 时，即会使水生生物的血液结合氧能力降低， 超过3 m g l 时，可在2 4 9 6 h 内使盒鱼、鳊鱼死亡。 世界卫生组织( w h o ) 现行标准制定于1 9 8 4 年，其对水体中硝念 氮含量的指导性标准为1 0 m g n o ；一n 1 ，推荐标准为5 m g n o ；一n 1 ，美 国的标准为1 0 m g 1 ，我国现行的标准为2 0 m g 1 ，我国即将公布的新的水 质标准将限制到1 0 m g l 。 2 1 3 国内外研究现状及应用 国外在污水生物脱氮方面做了大量的工作，开发了许多新的脱氮技 术与工艺过程。6 0 年代后期迅速发展起来的固定化细胞技术，在氨氮工 业废水处理领域具有广阔的应用前景0 0 l 。b j o r nr u s t e n 等丌发了一种能 在低温下有效脱氮的浮动床生物膜反应器；h e l m e r 和k u n s t i 】用生物转 盘反应器处理n h 3 一n 垃圾渗滤液，去除率达到9 0 。s a k ak i b r a r 等开 发出电化学生物反应器，可将氢作为电子供体还原硝酸赫。m u l d e r 等在 研究脱氮流化床反应器时发现。氨可直接作为电子供体而进行反硝化反 应。近年来不少研究和报道证明，反硝化可发生在有氧条件下，它为 利用一个生物反应器在一种条件下完成脱氮反应提供了微生物基础。国 外还报道了结合各种方法的新的氨氮脱除工艺。如o l a h a v 和 m g r e e n t 旧】使用沸石作为离子交换材料，既作为把氨氮从废水中分离出 来的分离器，又作为硝化细菌的载体。 国内在污水生物脱氮方面也做了许多工作，方振东【l3 】等在生物陶粒 反应器中得到了9 0 的n h 3 一n 去除率；周定【”】等人首次将p v a h 3 8 0 3 法用于包埋固定化脱氮微生物，建立了脱氮微生物的p v a h 3 8 0 3 固定化 方法。吕锡武等验证了氨氮废水处理过程中的好氧反硝化的存在，并对 好氧反硝化的机理进行了探讨。李汝琪等指出曝气生物滤池同时存在好 4 第二章文献综述 氧，兼性和厌氧微生物，可以同时进行硝化和反硝化反应。另外，姜淑 霞等使用超重力法处理氨氮废水，探索了处理吹脱过程的最佳工艺条件。 李呵彬等研究了用乳状液膜法去除废水中的氨氮，去除率达9 7 以上。 曲久辉等研究了不同水质下高铁酸盐对饮用水中氨氮去除效果。杜鸿章 等对催化湿式氧化法作了一系列的研究，研制的催化剂可使焦化污水氨 氮的去除率达到9 9 6 。 2 2 硝态氮的去除方法 脱除硝酸盐的方法主要有物理化学法和生物反硝化法两大类( ”j ”1 。 2 2 1 物理化学法 物理化学法包括膜分离法和离子交换法。物理化学法处理费用较高， 且会产生高浓度的含盐废水，可用于小型处理厂或近海地区【1 5 】。 2 2 1 1 膜分离法 膜分离法是指在某种推动力的作用下，利用膜的透过性能，达到分 离水中离子或分子以及某些微粒的目的。用于地下水脱硝的膜分离方法 包括反渗透和电渗析两种。 反渗透的推动力是外加的压力。反渗透膜对硝酸根无选择性，各种 离子的脱除率与其价数成正比，在除去硝酸盐的同时也将除去其它的无 机盐【9 ，因此反渗透法将降低出水的矿化度。常用的反渗透膜主要是醋 酸酯膜。为延长反渗透膜的使用寿命，反渗透前须对进水进行预处理以 减少矿物质、有机物、水中其他悬浮物在膜上的沉积结垢以及污染物、 p h 值波动对膜的伤害。 电渗析的膜推动力是与膜正交的电场力。其可选择性地脱除阴阳离 子。电渗析和反渗透的脱硝效率差不多，电渗析是使用半透膜选择性地 脱除离子。但电渗析脱硝法只适用于从软水中脱除硝酸盐。 膜分离法适用于小型供水设施，其缺点是费用高( 尤其是电渗析法) ， 产生浓缩废盐水，存在着废水排放问题。 2 2 1 2 离子交换法 离子交换是利用碱性树脂所具有的阴离子交换能力，通过氯离子或 重碳酸根与被处理水中硝酸根的交换达到去除地下水中硝酸盐的目的。 第二章文献综述 离子交换是让要处理的水通过一个强碱性树脂床。水中的硝酸根与氯离 子或重碳酸根交换，直到树脂的交换容量耗尽。用过的树脂用氯化钠或 重碳酸钠浓溶液再生，也可以用海水再生。目前，离子交换工艺已成为 水体脱硝的主要手段之一。 离子交换法的最大优点是处理出水水质好，处理过程很少受温度影 响，后处理工序少；缺点是要耗用大量再生药剂，再生沈脱液会引起二 次污染1 9 1 。 2 2 2 生物反硝化法 反硝化由一群异养微生物完成，主要是将硝态氮或亚硝态氮还原成 气态氮或氮氧化物，反应在无分子氧状态下进行 8 1 。反硝化细菌包括 假单胞菌属、螺旋菌属和无色杆菌属等。它们多数是兼性的在溶解氧 浓度极低的环境中可以利用硝酸盐中的氧作电子受体，有机物则作为电 子供体提供能量并得到稳定化。 一般在缺氧的情况下，兼性厌氧菌首选硝酸根进行其呼吸作用，将 懈还原为m ： n o ；+ 6 h + + 5 e 一= 1 2 n 2 ( g ) + 3 h 2 0 ( 2 - 1 ) 通过以上对比分析，可以认为离子交换法和生物反硝化法都可用于 大规模的水处理，但离子交换法成本高，需要频繁再生，且会产生大量 含高浓度硫酸盐和硝酸盐的废液，如果处景不当，容易造成二次污染。 2 3 硝化、反硝化原理及其微生物 2 3 1 硝化作用及其微生物 硝化作用是指在好氧条件下，水中的氨态氨在微生物的作用下被氧 化为亚硝态氮和硝态氮的过程。硝化过程可以分为两步，分别在两类不 同的细菌作用下完成【旧】。首先，水中的氨氮在亚硝化菌的作用下被氧化 成为亚硝酸，这步过程称为亚硝化，可表示为： m 鬈+ 3 2 0 2 斗u o ；+ h 2 0 + 2 h + ( 2 - 2 ) 硝化菌将亚硝酸盐进一步氧化为硝酸盐，这一过程称为硝化，可表 示为：【2 0 】 6 第二章文献综述 n o ；+ l 2 0 2 斗n o ； ( 2 3 ) 亚硝化细菌和硝化细菌都是化能自养菌，专性好氧，它们分别从氧 化n h ；和n o ；的过程中获得能量，以为唯一的碳源，产物分别为n o ； 和n o ：，它们要求中性或弱碱性环境( p h6 5 - 8 0 ) ，当p h 6 0 时，作用 明显下降。其中亚硝化菌有亚硝酸单胞菌属、亚硝酸螺杆菌属、亚硝酸 球菌属：硝化菌有硝酸杆菌属、硝酸螺菌属、硝酸球菌属等。 另外，其它好氧性异养细菌和真菌，如节杆菌、芽孢杆菌等能将n h ； 氧化为n o ；和n o ；，但它们并不依靠这个氧化过程作为能量来源，对自 然界的硝化作用并不重要。 2 3 2 反硝化作用及其微生物2 1 1 生物反硝化指在缺氧的环境下，兼性厌氧菌以水中的n o ；或n o ；代 替氧作为电子受体，将n o ；或n o ；通过异化作用还原为气念的氮氧化物 n o 和m 0 ，然后继续还原为 的过程。反硝化菌有异养型反硝化菌和 自养型反硝化菌以及兼性化能自养型反硝化菌。 异养型反硝化菌，如脱氮假单胞菌( p d e n i t r i f i c a n s ) 、铜绿假单胞菌 ( p a e r u g i n o s a ) 、荧光假单胞菌( p 疗u o r e s c e n s ) 等在厌氧条件下利用n o ； 或n o ；中的氧氧化有机质，获得能量。 n o ；+ 5 【】( 有机物供给) 寸1 2 2 + 2 h 2 0 + o h 一 ( 2 - 4 ) n o ；+ 3 【日】( 有机物供给) 一1 2 2 + ：o + o h 一 ( 2 - 5 ) 自养型反硝化菌，如脱氮硫杆菌( t d e n i t r i f i c a n s ) 在缺氧环境中利 用n o ；中的氧将硫或硫代硫酸盐氧化成硫酸盐，从中获得能量来同化 c o , 。 兼性化能自养型，如脱氮副球菌( p a r a c o c c u sd e n i t r i f i c a n s ) 能利用 氢的氧化作用作为能源，以0 2 或n o ；作为电子受体，使n o ；被还原成n ：0 或2 。 经研究，目前为大家所公认的从n o ；还原成2 的过程由连续四步反 应完成： n o ；：! o 婀芝斗o 互呻| 2 0 蔓_ n 2 圆 第二章文献综述 式中：硝酸盐还原酶；亚硝酸盐还原酶； 氧化氮还原酶：氧化亚氮还原酶。 每少反应都足山酶催化完成的部分反硝化坌u i 曲烈台自其i i 的 种酶，这意味着完整的反硝化过程可能是在一组互补的微生物群的协同 作用下完成的。 2 4 反硝化的影响因素 与生物反硝化有关的环境因素，主要有以下几种。 2 4 1 碳源( 有机碳) 在反硝化系统中，反硝化菌利用有机碳源作电子供体，n o ；和n o ；作 电子受体，将n o ；和n o ；还原成，同时达到去除有机物的月的可见， 有机碳源也是影响反硝化作用的重要因素之一。 能为反硝化菌所利用的碳源较多，但从废水生物处理的生物脱氮工 艺来看，主要可分为如下3 大类。 2 4 1 1 废水中所含的有机碳源 当废水中含有足够的有机碳源( 以b o d 5 计) 可供生物脱氮需用时， 就不必另外投加碳源。当废水中t k n ( 总凯氏氮时，则为b o d 5 t k n ) 大于3 。5 时，即可认为碳源充足而满足废水生物脱氮的要求。 2 4 1 2 外加碳源 当废水中所含的碳、氮比过低，即b o d 5 i t k n 小于3 5 时，在废水 生物脱氮过程中需另外投加有机碳源。外加碳源大多采用甲醇 ( c h ，o h ) ，因它被氧化分解后为c 0 2 和h ：0 ，且能获得最大的反硝化速 率( 一般来说，该速率约为无外加碳源时的4 倍) 。 2 4 1 3 内碳源 内碳源主要是指活性污泥微生物死亡、自溶后释放出来的有机碳。 其优点是反应器的泥龄( 微生物停留时间) 长或负荷率低，微生物处于 生长曲线的静止期后或衰亡期，反应器的容积较大。这种利用内碳源的 反硝化速率比上述的利用碳源方法要小得多。可是，当废水中碳氮比较 低时，可无需另外投加碳源而达到反硝化脱氮的目的。 第二章文献综述 2 4 2 温度 废水生物处理中的反应温度，对微生物的生长、繁熵关系密切，温 度支配着酶反应动力学、微生物生长速度以及化合物的溶解度等，因而 对污染物的降解转化起着关键作用，一般当温度控制在2 0 3 5 ，可获 得较好的处理效果，超过最高生长温度时，会使微生物的蛋白质迅速变 性，酶系统遭到破坏而失去活性；低温虽然不会使微生物死亡，但会使 其代谢活力降低，进而处于生长繁殖停滞状态。 温度对反硝化作用的影响比其他的废水生物处理过程要大些。对反 硝化作用来说，最适宜的运行温度是2 0 4 0 。低于l5 时反硝化速 率明显下降，而在5 以下时，反硝化过程虽能进行，但速率极低。 2 4 3 p h 值 p h 值也足影响反硝化速率和反硝化域终产物的一个m 竣的j i 境洲 子。对反硝化菌的生长来说，最佳值为6 5 7 5 。在此p h 范围内，反硝 化速率最大，当p h 值不在最佳范围时反硝化速率降低。 环境p h 值可影响到反硝化反应的最终产物，当p h 值 8 0 时，会出现n o ；的积累，且p h 值 越高，n o ；的积累越多这是因为高p h 值抑制了亚硝酸赫还原酶的活 性，而对硝酸盐还原酶的活性影响不大所致。 2 4 4 溶解氧 溶解氧( d o ) 的存在对反硝化过程有很大影响。如果反应器的溶解 氧过多，将会对反硝化菌的异化作用发生抑制作用。其机制为阻抑硝酸 赫还原酶的形成或者仅仅充当电子受体从而竞争性的阻碍了硝酸盐的还 原【2 2 1 1 2 3 】。 一般来说，在反硝化系统中，反应器内的溶解氧应控制在o 5 m g l 以下1 2 2 1 1 2 4 1 【25 1 ，否则会影响反硝化的j 下常进行。n a k a m i m a 2 6 1 等研究了d o 浓度与氧化沟中活性污泥反硝化的关系，发现当d o 浓度上升，反硝化 速率下降，而且氧对反硝化抑制呈简单的竞争性抑制。 第二章文献综述 2 5 固定化 固定化微生物技术( i m m o b i l i z e dm i c r o b i a lc e l l ，简称 m c ) 是生物 工程领域中的一项新兴技术。所谓固定化细胞就是指被限制自由移动的 细胞，即细胞受到物理、化学等因素约束或限制在一定的空间界限内， 但细胞仍保留催化活性并具有能被反复或连续使用的活力【2 7 】【2 8 1 【2 。 与传统的悬浮生物处理法相比，固定化技术具有如下优点：能在 生物处理装置内维持高浓度的生物量，处理时间缩短，设备体积减少【3 0 1 ； 被浓缩固定在不溶性载体上的微生物可迅速沉淀分离，不需要大型沉 淀池；不能形成絮体的微生物也可加以利用；可将筛选培养出的能 降解难分解物质的微生物以及高效脱氮菌、硝化菌、甲烷菌等浓缩固定， 有针对性地使用：受毒物侵害少：剩余污泥量小。与游离细胞相比， 明显地显示出优越性，在实际应用中成果显著。 2 5 1 国内外研究应用概况 固定化细胞技术在废水处理领域得到了广泛的应用，主要用于有机 废水处理l3 1 1 、金属离子污染废水的处理【3 2 1 、工业废水的脱色等方面 3 3 1 。 在脱氮方面，日本的中村裕纪等人用聚丙烯酰胺包埋法固定硝化菌 和反硝化菌，与悬浮生物法相e e ，脱氮速度提高3 倍。市村等人用以聚 乙烯醇为主链的光架桥性树脂预聚物( p v a s b q ) 与海藻酸钠结合包埋 固定化硝化菌，可将n h 3 一n 从8 0 m g 1 降至2 0 m g 1 容积负荷达2 k g n h 3 一n ( m 3 d ) 。 王磊等用聚乙烯醇作为包埋载体，在保证c o d 8 0 去除率的同时， n h 3 n 的去除率高达9 5 5 。 2 5 2 固定化细胞的分类、形态特征1 3 4 l 固定化细胞按其细胞类型分类有固定化微生物、植物和动物细胞三 大类：按其生理状态又可分为固定化死细胞和活细胞两大类。 固定化细胞由于其用途和制备方法的不同，可以是颗粒状、块状、 条状、薄膜状或不规则状( 与吸附物形状相同) 等，目前大多数制备成 颗粒状珠体，这是因为不规则形状的固定化细胞易磨损在反应器内尤 其是柱反应器内易受压变形，流速不好，而采用珠体就可以克服上述缺 点，另外，圆形珠体由于其表面积最大，与底物接触面较大，所以生产 o 第二章文献综述 效率相对较高。 固定化死细胞一般在固定化之前或之后细胞经过物理或化学方法的 处理，如加热、匀浆、干燥、冷冻及表明活性剂等处理，目的在j 二增a i | 细胞膜的渗透性或抑制副反应，所以比较适于单酶催化的反应。 固定化静止细胞和饥饿细胞在固定化之后细胞是活的，但是由于采 用了控制措施，细胞并不生长繁殖，而是处于休眠状态和饥饿状态。 固定化生长细胞又称固定化增殖细胞，是将活细胞固定在载体上并 使其在连续反应过程中保持旺盛的生长、繁殖能力的一种固定化方法。 与固定化酶和固定化死细胞比较，由于细胞能够不断繁殖、更新，反应 所需的酶也就可以不断更新，而且反应酶处于天然的环境中，更加稳定， 因此，固定化增殖细胞更适宜于连续使用。从理论上讲，只要载体不解 体，不污染，就可以长期使用。固定化细胞保持了细胞原有的全部酶活 性，因此，更适合于进行多酶顺序连续反应，所以说，固定化增殖细胞 在发酵工业中最有发展前途。 2 5 3 固定化细胞的制备方法 按照固定载体与作用方式的不同，目前常用的固定微生物细胞的方 法大致可分为吸附法( 载体结合法) 、包埋法、交联法( 架桥法) 和共价 键结合法，其中尤以包埋法应用最为普遍，后两种方法是酶与聚合物载 体以共价键结合方式将其固定，由于反应条件剧烈，使得酶活性有所降 低，故不常使用 3 5 1 。 2 5 3 1 吸附固定法 吸附法是通过静电、表面张力和粘附力的作用而使微生物细胞附着 在载体表面的方法p 。其可分为物理吸附和化学吸附，前者是使用具有 高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂等吸附剂将细胞吸附 到表面上使之固定化，这是一种最古老的方法，、操作简单。反应条件温 和，载体可以反复利用，但是结合不牢固，细胞易脱落：后者是根据细 胞在解离状态下因静电引力( 即离子键合作用) 而固着于带有相异电荷 的离子交换剂上，如d e a e 一纤维素、c m 一纤维素等2 9 1 。 2 5 3 2 包埋固定法 包埋法是将微生物包埋在各种不同的凝胶和薄膜中，即将细胞固定 在多聚物的网格中的固定方法。该法操作简单，对细胞活性影响较小， 第二章文献综述 制作的固定化细胞球的强度较高【3 ”，是目前细胞固定化中最常用的方法 【”】，其载体常用琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、骨胶、明胶、 二醋酸纤维等。 2 5 3 3 交联固定法 交联法是一种化学固定化方法，即利用双功能或多功能试剂，与微 生物细胞表面的反应基因如羧基、氨基和巯基等发生反应，使细胞之间 交联成网格结构，从而制成固定化细胞，其结合力是共价键。该方法的 缺点是化学反应激烈，微生物可能受到交联剂的毒害，很难保持细胞中 酶的高酶活【3 9 1 。 2 5 3 4 共价结合法t 3 9 】 共价结合法是微生物细胞表面上功能团( 如a 一，e 一氨基、a 一。0 一或y 一羧基、巯基或羟基、咪唑基、酚基等) 和固相支持物表面的反应 基团之间形成化学共价键连接，从而成为固定化细胞。浚法微生物细胞 与载体之问的连接键很牢固，使用过程中不会发生脱落，稳定性良好， 但反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻。 2 5 4 固定化细胞载体 理想的固定化细胞载体应该是：具有高的载体活性：对微生物 无毒性；材料易得：传质性能良好；性质稳定，不易被生物分解； 价格低廉；操作制备方便，能适用于大规模生产；有较高的机械 强度，能较长时间使用和重复使用1 4 0 】【4 。 固定化细胞载体归纳起来主要分为两类：一类是天然高分子凝胶载 体，如琼脂、角叉莱胶、海藻酸钙等；另一类是有机合成高分子凝胶载 体，如聚丙烯酰胺( 简称a c a m ) 凝胶、聚乙烯醇( 简称p v a ) 凝胶， 光硬化树脂、聚丙烯酸凝胶等。 天然高分子凝胶一般对生物无毒，传质性能较好，但强度较低，在 厌氧条件下易被生物分解。其中尤以琼脂强度最差。天然的角叉莱胶在 分离出影响其强度的l 一角叉莱胶成分后，强度和稳定性都会得到提高， 但价格较高。海藻酸钙凝胶价格低廉，是其中应用较为广泛的固定化细 胞载体。但在高浓度的磷酸盐溶液，或含有m g + 、k + 等微生物生长所必 需的阳离子溶液中，海藻酸钙凝胶不稳定、易破碎和溶解。有人报道用 聚乙烯亚铵溶液处理海藻酸钙凝胶，可防止磷酸盐的破坏作用，又能提 2 第二章文献综述 高其强度 4 2 1 。 有机合成高分子凝胶一般强度较好，但传质性能稍差，在进行细胞 包埋时有时刘细胞活性有影响。a c a m 凝胶在包埋细胞时，由于凝胶交 联过程中的放热以及交联试剂本身的毒性，细胞在固定化过程中常常失 活。p v a 凝胶的制备方法有两种，2 种是p v a 一冷冻法，另一种是p v a 一 硼酸法。一般常用p v a 一硼酸法。在p v a 一硼酸法固定化细胞制备过程中， 用n a 2 c 0 3 事先将硼酸的p h 值调整到6 7 左右，或将制成的凝胶放入水 中浸泡几天，可提高其在高温时强度的稳定性。 2 6 本课题研究意义及其创新点 本课题研究的主要目的在于通过进行与反硝化相关的间歇实验及对 反硝化菌进行固定化的连续性实验对脱氮、去除有机物的影响因素进行 研究，依据实验运行结果探讨它们之问的相互关系及变化规律，并根据 m o n o d 方程进行了一系列的动力学分析，得出实用可靠的参数。因而本 课题研究具有深远的环境意义、经济意义和社会意义。 其创新点主要表现在采用混合碳源进行实验。结果表明，混合碳源 反应器对于生物量的生长及硝酸根的降解均能够满足要求。其次，在固 定化脱氮的实验过程中，通过加入化学试剂，对以海藻酸钠为载体的优 化条件下制得的固定化小球进行了硬化处理，使其机械强度和可重复利 用率均得到提高。 第三章间歇实验的研究 第三章间歇实验的研究 3 1 实验材料及方法 3 1 1 菌种来源 本实验室筛选所得反硝化菌y z - 1 的基础上经紫外诱变而得到的反 硝化菌y z 2 。 3 1 2 硝态氮废水的组成 该间歇实验采用人工合成硝态氮废水，其组成如表3 1 所示。 表3 1 人一】：台成废水的组成成分 t a b l e3 - 1c o m p o s i t i o no ft h es y n t h e t i cw a s t e w a t e r 3 1 3 实验所用仪器和设备 实验所用仪器以及设备见表3 - 2 所示。 3 2 实验工艺流程简图 本实验废水的降解在如图3 1 所示实验装置中进行，其容积为1 8 1 。 反应器的外层有恒温水套，用低温浴槽制冷水通入恒温水套，这样可以 随意控制温度。 4 第三章间歇实验的研究 表3 - 2 实验仪器和设备 t a b l e3 - 2e x p e r i m e n t a le q u i p m e n t 1 一完全混台生物反 应器 2 一磁子 3 一电接点温度计 4 一溶解氧电极 5 一p h 电极 6 一取样口 7 一搅拌恒温电热套 8 一冷却水套 幽3 - l 间歇处理硝态氮的实验装置 f i g3 一l d e v i c ef o rb a t c he x p e r i m e n t 3 3 检测项目和分析方法 检测以及分析方法主要参照国家环保局颁发的水和废水检测分析 方法第三版【4 ”。 第三章间歇实验的研究 表3 - 3 实验检测项目及分析方法 t a b l e3 - 3p r o j c c t sf o rt h ee x a m i n ea n da n a l y s i s 检测项目分析方法 c o d c ， s o ；一n n o ：一n 温度t p h 值 溶解氧( d o ) 细菌浓度 雷磁c o d 5 7 1 紫外分光光度法 。一荣胺光度法 电接点温度计 酸度计 雷磁j p s j 6 0 5 s 型溶解氧分析仪 浊度法 3 3 1 硝酸盐的测定 3 3 1 1 原理 采用紫外分光光度法对n o ；进行测定。在紫外光谱区，硝酸根有很强 烈的吸收，其吸收值与硝酸根的浓度成正比，因此选择在2 1 0 n m 处测定 其吸光度。水中溶解的有机物，在波长2 2 0 及2 7 5 n m 下均有吸收，而硝 酸根在2 7 5 n m 时没有吸收。这样，需要在2 7 5 n m 处做一次测定，以校丁f 硝酸根的吸光度。 3 3 1 2 仪器 日本岛滓u v - 3 0 0 0 型紫外分光光度计；1 c m 石英比色瓶 3 3 1 3 试剂 盐酸溶液( 1m o l 1 ) 氨基磺酸铵溶液( 5 ) 硝酸根标准贮备溶液 硝酸根标准溶液 称取浓盐酸8 3 m l ，用蒸馏水稀释至1 0 0 0 m l 称取氨基磺酸铵( n h 。s 0 3 n h ：) 5 9 溶解于 1 0 0 m l 蒸馏水中 准确称取在1 0 5 - 1 1 0 烘干1 h 的硝酸钾 0 1 6 3 1 9 ，溶于蒸馏水中，并定容至1 0 0 0 m l ， 此溶液1 m l 含1 0 0 1 zg 硝酸根 取硝酸根标准贮备溶液1 0 m l 于1 0 0 m l 容量 瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。则此溶液1 m l 6 第三章间歇实验的研究 含1 0ug 硝酸根 3 3 1 4 分析步骤 标准曲线的测定 准确称取硝酸根标准溶液0 0 ，1 0 2 0 ，5 0 ，1 0 0 ，2 0 0 ，3 0 0 4 0 0 5 0 0 ，6 0 0 ，7 0 0 ，8 0 0 ，9 0 0 ，1 0 0 0ug 于系列5 0 m l 的比色试 管中，加入1 m l 的l m o l l 的h c i 溶液，再加入5 的氨基磺酸铵溶液5 m 1 用水稀释到5 0 m l ，摇匀。在紫外分光光度计上于2 1 0 n m 的波长下，以1 c m 的石英比色皿，比色，用空白做参考，读数a 2 l o ：再把波长调到2 7 5 n m ，同 样以空白对照测定吸光度a 2 7 5 。 同时需要校正吸光度 a = 呜。- 2 4 ， ( 3 1 ) 以硝酸根浓度( 每升中硝酸根的含量( m g ) ) 为x 值，以吸光度为 y 值，绘制标准曲线( 图3 2 ) 。 则标准曲线方程为v = 0 0 0 2 6 x( 3 - 2 ) 02 5 05 0 07 5 01 0 0 0 硝酸根浓度( m g n ) 图3 - 2 硝态氮一吸光度标准曲线 f i g3 - 2s t a n d a r dc u r v eo fa b s o r b e n c yf o rn o ；一n 水样的测定 在5 0 m l 的比色管中，取水样1 0 m l ，加入l m o l 1 的h c i 溶液1 m l ，再加 入5 的氨基磺酸铵5 m l ，用水稀释到5 0 m l ，在紫外分光光度计上，2 1 0 n m 的波长下，以1c m 的石英比色皿，比色，用空白做参考，读数a 2 l0 以后，把 波长调到2 7 5 n m ，同样以空白对照测定吸光度并读数a 2 7 5 。然后从标准曲 5 2 5 l 5 o 2 1 o 越装蓉 第三章间歇实验的研究 线上查得硝酸根的含量。 计算 硝酸根含量按下式计算 a 2 4 1 0 一2 4 2 7 5 n o ；( m g l ) = a v ( 3 - 3 ) ( 3 4 ) 式中：a 一减去有机物的吸收值后，从标准曲线上查得的硝酸根 量( “g ) v 一所取水样体积( m 1 ) 3 3 2 亚硝酸盐的测定 3 3 2 1 原理 水中亚硝酸赫的测定方法通常采用重氮一偶联反应，通过生成红色染 料进行紫外分光光度测定。该方法灵敏、选择性强，常用的重氦和偶联 试剂有对氨基苯磺酸和a 一萘胺或对氨基苯磺酰胺和n 一( 1 氨基) 一己二 胺。本实验选用对氨基苯磺酸和n 一萘胺作为重氮和偶联试剂。 在酸性溶液中，亚硝酸盐能与对氨基苯磺酰胺起重氮化作用，再与 a 一萘胺起偶氮反应，生成紫红色偶氮染料，可在波长5 2