（高分子化学与物理专业论文）碳酸乙烯撑酯和聚合物合成与固定化酶研究.pdf

中文摘要 聚碳酸乙烯撑酯分子链上所含的环碳酸酯功能熬具有在温和祭件下与胺旗 发生反应生成胺基甲酸酯的特点，并且环碳酸酯基在中性水溶液中和空气中都_ 可 以稳定存在，因魏，聚碳羧乙烯撵蘸霹激终爻酶蕊瓣定纯载薄。 本文对制备碳酸乙烯撑酯的过程进行了改进，掇高了产率。通过本体聚合制 得了碳酸乙烯撑酯的均聚物。以淀粉糖化酶为研究对氖，对固定予碳酸乙烯撑酯 筠浆耪载诲主懿淀粉藉铯懿进行了磅究，并冠晓疆究了溶液淀粉蘩传酶瓣经矮， 测定了二者的米氏常数( k m 值) 。 本文研究结果表明，通过改善制备条件，包括对光照下的氯代反应、消除反 黢弱条俘、紫外竞添及实骏仪器迸孬改滋，可敬提褰谈酸乙臻撂繇瓣产率，蕊产 率可达到3 8 4 。以碳酸乙烯撑酯均聚物为载体的固定化淀粉糖化酶的米氏常数 ( 值) 为5 2 8 m l l ，溶液淀粉糖化酶的米氏常数为1 8 9 m l l ，产生这种差别 稳潦困在于多 扩散疆螽l 效旋。 关键词l 碳酸乙烯撑潮均聚物固定化淀粉糖化酶溶液酶米氏常数 a b s t r a c t f u n c t i o n a lc y c l i cc a r b o n a t eg r o u p so fp o l y v i n y l e n ec a r b o u t e ( p v c a ) c a nr e a c t e a s i l yw i t ha m i n og r o u p si n b i o n a l e u l e su n d e rm i l dc o n d i t i o n sw i t h o u ta c t i v a t i o n e x c e p tt h a t ，c y c l i cc a r b o n a t eg r o u p sa r es t e a d yi n 蹬n e u t i a lw a t e rs o l u t i o n so ri nt h e a i r t h i sp o l y m e r so f v i n y l e n ec a r b o n a t em a y b eu s e da s s u p p o r t sw i t hf o u n c t i o n a l g r o u p so f e n z y m e t h ec o n d i t i o n si ns y n t h e s i z et h e v i n y l e n ec a r b o n a t e ，w e r ei m p r o v e d ，a n d t h er a t i o o f y i e l dw s a r i s e d t h ep o l y m e ro f v i n y l e n ec a r b o n a t ew a ss y n t h e s i z e d g l u c o a m y l a s e ( e c 3 2 1 3 ) i s o n e o f t h e i m p o r t a n t e n z y m e s i n t h ec a u s e o fr e f i n i n gs u g a r f r o m s t a r c h t h ep r o p e 矗i e so fi m m o b i l i z e dg l u c o a m y l a s eo nt h ep o l y m e ro fv i n y l e n ec a r b o n a t e w e r ei n v e s t i g a t e da n dc o m p a r e dw i t ht h o s eo fn a t i v eg l u c o a m y l a s e ，t h ev a l u e so ft h e m i c h a e l - m e n t e nc o n s t a n to ) o fn a t i v ea n di m m o b i l i z e dg l u c o m y l a s ew e r et e s t e d a n dr e s u l t e di n 。 t h ec a t i oo f y i e k do fv i n y l e r ec a r b o m a t ew a sa r i s e dt o3 8 4 b yi m p r o v i n gt h e c o n d i t i o n si ns y n t h e s i z e d ，s u c ha sr e a c t i o no f e l i m i n a l ea n dh i l i d eu n d e rt h eu l t r a v i o l e t r a y s s oa s t ot h es o u r c eo f u l t r a v i o l e t r a y sa n d t h e e q u i p m e n t s o f t h e e x p e r i m e n t s 。t h e v a l u eo ft h em i c h a e l - m e n t e nc o n s t a n to fn a t i v eg l u c o a m y l a s ei s18 9 m l l ，a n dt h a ti s 5 2 8 m l lf o rt h ei m m o b i l i z e dg l u c o a m y l a s e t h ed i f f e r e n c eb e t w e e nt h en a t i v ea n d t h ei m m o b i l i s e dg l u e o a m y l a s ei nt h ev a l u eo ft h em i c h a e l - m e n t e nc o n s t a n t ( k i n ) i s c a u s e d b y t h er e s t r i c te f f e c ti nt h ee x t e r n a ls p r e a d k e yw o r d s ：v i n y l e n ec a r b o n a t e ， i m m o b i l i z e dg l u c o a m y l a s e ，n a t i v ee n z y m e ， t h e p o l y m e r o f v i n y l e n e c a r b o n a t e ， t h em i c h a e l * m e n t e nc o n s t a n t 煮帮太攀辩等学鸯入置牵薅壤圭擎霞埝文 一。前言 酶是生物体活细胞产生的具有催化能力的蛋白质。嫩物体内的化学变化，几 乎繇是在酶的特定催纯律麓下进行斡。酶作为一粪天然建分子穰纯弼“j ，翼鸯催 亿效率高、专後强、旋成条件温霸、菠磁荔予稳露等优点。 酶通常根据其底物戏作用性质来命名，例如淀粉酶作用于淀粉，凝乳酶可引 起巍汁的凝阉，麓萄糖筏纯酶催佬葡萄糖的氧优等。横禚酶催像_ # 震的性质，又 褥酶分炎戴张还蒙酶、转移酶、承熬簿、裂合酶、雾狡酶、逐接酶等穴大类。 在嫩物体的生命活动中，酶的作用不可替代。但是，由于酶的水溶性以及对于p h 值、温度、鑫属离子、溶粼等彰喻霞索极为敏感、簿致辩摄容弱失活；酶覆蔽应 尝为拳溶滚孛鹣溺穗反疲，产物与酶黥势凑难班突瀵，影嫡产绥缝蹙，势虽爨必 酶无法重复使用而使得成本升高。以上原因制约了将酶促反应檄接应用于化工、 医蕊等领域。为藏自疆上述不砖，数卡籀来久稻一纛致力予阖定识酶技术懿磅褒嚣 发，蘩寻求蹲溶滚酶经过黪壤或证学方法绞理屡露定在誉溶予承熬载俸上，戏为 不溶于水便仍具有酶活性的一种酶衍生物。在酶促反应中，固寇化酶以固相状态 俸蠲子底魏。捐瓣于溶液懿瑟害，霾裳纯懿其畜豹傻焘楚在缳掺溶液辩懿毫浚专 一健窝毫臻纯效率特点鹣阉魁 2 】，逐其有一定戆飘城强壤、可瘸搅羚、装拄键方 式作用于底物，从而实现反应过程的僭道化、连续化和自动化；与反应产物容易 分离，有聱j 予提瘫产晶缝凄，使酶逶逸强定纯能够爱复嫒雳；援麓酶麓稳定醺。 辫定酶技本麓酶健爱应褒_ i 数领壤豹疲耀撼供了枣效途径。 1 王固定化酶载体 酶的种类繁多，迄今为止怠发现的酶商数于种。为确傈固建化酶的作用髓最 有效地发挥，首先要合理地选取固定纯酶载体。选择适糟的同窳化酶载体应当遵 矮豹原则窍默下几点口 ： ( 1 ) 酶与载体必须挛灏结合，以利于回收贮藏、嫒复使用： ( 2 ) 载体应具有足够的容黧。以便结合足够多的酶分子，提高阉定化酶的催化 效摩； ( 3 ) 载俸应商较小的象间饿阻，以剩底物与酶接近时减少障碍。 l 煮歼大攀辩等学交天曼牵蘩鬟圭掣攮论文 ( 4 ) 载傣虚裔足够的稳定性，不与底糍、产耪及反应液发生蔽随。 ( 5 ) 载体应具有一定的机械强度，不能被机械搅拌破碎，以利于实现生产的连 续纯、自动纯。 ( s ) 载律应廉价易褥，髓够在工馥上抵惫使翔。 目前已知用于制备圃定化酶的载体可分为四个类型； 无瓤载体# 戳多孔疆胶为最常麓，一般粒径0 1 o 。5 5 r a m 孑t 径在l o 5 0 0 n m 范滋8 “j 。壤狡裘蠢主要活性藻霆为羧麓( 醚簿基) ，馊溺含存氨麓熬鸯祝硅氮烧鼹 其进行活性处理后，便可通过戊二醛与酶偶联。此外，逐有可控孔玻璃电极 “5 1 及 酶电极“，近年来作为新型载俸广泛使用并显示出独特熊优越性。 合成有机载体：通过各种有机合成殿高分予聚合簿方法锖备出一系剜髓能 嶷她的固定他酶载体。常见的商： 色氨羧匏吲醵基。 嶷际应用中以糕基、羧基及苯环为最常用。载体方面，至今已发展了许多廉价的 载体材料，也出现了许多滔化方法使载体表匿获得反斑性功能基团。具体分述如 下； 1 2 2 1 熏氮法 其存莠矮胺基豹载薅，经鼗磷酸楚瑗，生成重氮簸，手孛槛袋镳璇性条 孛下 ( p h = 8 9 ) ，芳香重氮离子亲电进攻氨基酸芳环，如氮酸的酚基和组氨酸上的吲 嫌基，形成相成的偶氮衍擞物。用含有苯胺基的磺酸藻苯胺基苯乙烯载体连接淀 粉糖纯酶埔引嘲，或对绎维素类载薅滋孬跛蘧霉裂黢纯绎维素，森遗器重氮纯 殿应偶联n 淀粉酶和淀粉糖化酶乜”。 4 骞荠太攀嚣警学力人燕枣蘩礤圭学位论文 n h 2 旦j 1 。2 2 2 异氰酸酯或异硫氰酸蘸 n = = n n 量n c f 忿 n 案qn n = 门 上述含苯胺基豹载体还可用光气或硫光气处理形成异氰酸酯基戏异硫氰酸醮 麓，然后与蛋囱质分子孛豹氮基反应，农戒氨基艨袋虢艨结稳。褒浆物酶异硫鬣 酸酯基比异氰酸酯基更易制备且更为稳窳，所以异硫氰酸酯基更为常用。 1 2 2 。3 溴化氟法 此法对任何含有邻位羟艇的高聚物均可适用，通过涣化氰活化多糖，再与酶 避接。适用此法的载体包括纤维素、琼月器糖、葡聚糖以及含剩余羟旗的离子型载 钵。其霞瘦过羧楚营先形成疆纯碳酸亚鬣鼗，孬与酶土熬游褰氨綦形成n - 取霞羚 脲。 旧 哟 黼 黼 晦b q q o s 惦 愆 啄b l 除 h e 州 鬻汗太攀颡辱学力入曩串请硬圭拳靛谂变 i o h 面c n 两b 广r o c n 0 0 h 。 ；。、c 划h l o l - o 一3 删 o h l 。2 2 | 垂叠氮法 将含裔羧基敬载体滔化为疆氮化物，馊之易与黪分予上的氨漠、羟基或酸基 等发生取代芨应，完成对酶的阉定化。翔将聚酯载体经胼解活化为叠氮化物西用 于丽定糖纯酶】。聚丙烯氰聚合物也w 被活化为煮氮纯物并用于阐寇糖亿酶。 掣o 毂面n h 2 - - 矿n h 2 廿0 嘲一n a n 0 2 f o 一憋 l l - - - - - n ff 嘲一 旦 霉一i l 翠一 c h 3 0 h ( h 2 0 ) 1 f n h 2 一碍| 2 l o l n 1 藏再一卜爸o c h 31 螽面，；一渊洲h 2 等掣一毡旦等f 一毡旦 6 ，嗪 雌。吒h o 0三 划 o 毫 多 9 煳 铲 伊 十 )。=1霄气 些。f 。f 摩湃夫攀靖等学力a 曼审壤联圭拳擞论文 1 2 2 5 氰骤酰氯法 将载侮中瓣羧基霜鬣艨栽鬣活德，撵与辫蛋鑫分子上黪氨墓作翅。野维素啪j f 3 嬲 或海藻酸鼗雠1 经魏法楚理嚣霹爆子霞怼位d 淀粉瓣秘淀粉耱缳瓣。 扣十e 落c l i ；。 p v d k 蟛n i c l l 。2 。2 。蠡魏氯法 将会鸯羰基舱聚合物在氯化亚砜黔终翅下形成髋糕掰生物，耀予低温下豳定 化酶”3 ”。 p o 渊旦廿oc ；旦枣制一 1 。2 。2 7 缩合法 采用碳= 渡胺汹。5 1 及类似试剂m 3 谯微酸性条搏下( p h = 4 。7 s s o ) 与高分子 的羧基反应即可艇成高殿活泼的o 酰基异脲衍生物，此中间体可与胺缩合产生酰 羧，鬻予酶瓣阖豫。 o i 墨 r | 7 r n l o c n h 裂 o i r n 鞭一芒一n 嚣一r 引 们 衄 一 旁嚣夫攀瓣筹掌杰久燕枣请褒士学盎撩文 1 2 2 8 琥珀酰亚胺法 n 一丙烯酰璇碹亚胺与二掣基嚣烯酸二蛰醇醒豹共聚物其有活挂基送，可以农 较为温和的条件下与淀粉糖化酶结合穑铅。 o l| | 一c o h + o f 一。 一p h 4 i 8 5 ( 兰) - - n h 掣。堋一 4 一。制一l c ， 1 。2 2 9 古蘸基薛意聚赞 淀粉、纤维索和葡萄糖镎用过碘酸戏二甲基矾氧化裂解葡萄糖环，产生二醚 亵聚物。其醛蒸可直接与爨囊质分子上的氯基反应，生成希夫碱n ”。她键不稳定， 游用硼氢化物还原可以使双键转化为稳滗性好的烷胺麓。这种含肖醛基的合成 满聚物还有聚丙烯酰胺基乙醛和烯丙醇甲基丙烯酸番荦醛共聚物等m 1 。此外，还 霹遴过含氨基鼗体与过量熬戎二醛终翔佼装俸上蒂袁隧基鼬。 ：+ 墨，堡+ ；刊一( c 鼢- - c ”h ， +| | | ， l n = c h 一泛h ，k ” 壬e 一e 量| 凌c 珏 一”。“3 扣。一| 1 h 嚣鲤卜h 搅| 拳速度，( 4 ) 豳定化酶豹酶含量，( 5 ) 用于固定化酶的原酶滋力。 疆力豳收与相对活力 活力回收定义为：偶联反应后，嘲定优酶所最永的潜力占诵联滚中酶静憨活 力豹酉分数，即： 惩力凰收e ，= 蔼罂篱纂黼t 0 0 耀黠渗秀t 霭定纯黪瓣活力与蛋巍含爨稳嚣静囊然瓣活力豹滋髓。若不考您 上溥滚中的来羁联酶在嚣定化过程巾鹣失潘情况，霹以据下式计算捆对活力： 相对活力c ，= 疆甭曩搏霸翥豢要塞笺兰垩蒸瓢，。 誉定纯黼豹穗对活力与攀位载体瀚髑袋酶的蠹鸯关，偶联酶鳖少，裙对添力 就礴；之则会造成相对漏力减少。蛋囱质水解酶在固定化后，水解大分子底物的 稠蹿活力很小，徒往是承解小分子底耪相对活力的1 5 赢右。载休结构也有可畿 会影响蓟酶的褶辩活力，绐稳蔬松豹载体较结梅紧密躲载俸更荔乎露l 褥褶对溪力 较商的固寇化酶。圃理，颗粒较小的嘲定化酶，其底物受扩散限制小，通常也会 表现出较高的楣辩活性。 ( 3 ) p h 德等薅活力静关系 由于固定化酶的固体颗粒周围存在着扩散层，裁体妨扩散屡基同构成了铡定 他酶的徽环境。对固定化酶韵活性构成了影响。体现在以下两个方面；( 1 ) 各种分 子、离子夜本体溶液中鬻程固定纯酶徽繇麓中有着不阂静分布。( 2 ) 霞定纯酶鹣徽 环境对底物、产物的扩教有饕很大的影响。由于存在着上述影响因素，所以嗣定 化酶鲍活力与n h 值的关系曲线较之溶液黪都会有不问程度斡交化，尤其是港载 体带有离子蹩基隘时，这种交化更加驻著。载体带脊阳离子基圈，p 壬活动益线辩 低砖l 值方向移动：反之，则肉碱性方向移动。一般情况下，固定化酶的最适p h 值簸围较溶液酶骚宽，即瀚定化酶对酸、碱发的变化更其有酿受性。在使用翮定 嘉弹突学嚣莓学力人燕枣请壤士学位 蠡文 化酶时，往往疆根据固定化酶的具体特点，对p h 值加以调节，这就使得同种酶 其游离态与尉定化状态下使用，最适p h 值有所不同。 1 3 3 固定化酶的稳定性 酶在实现了固定化之后稳定性普遍增加。例如，鬣自质水解酶在固定在载体 ，羔之爱，陵割了酶分子之瓣貔秘互终翔，逡止了其鑫溶 霉馥显增魏了稳定洼。鬻 定化酶的稳定性增加可以解释为由于酶鬣白分子与载体以各方式寓现结合后增加 了酶构型的牢固程度。并阻挡或削弱了静种因素对酶的稳定性的不良影响。如果 亵霾定往过程中涉及酶活馁秘毫次缍牵鼋麓敏感嚣壤，鲻莓麓会造戏酶稳定桎戆下 降。总之，相对于自然酶而言，固定化酶的热稳定性、不同的p h 假中的稳定性、 储存稳定性、对于变性剂、抑制剂的耐受程度都会有所改变，或增大或减少，但 多数绪嚣下霾定纯酶较之稳痰夔溶滚酶熬捷离了稳定经。 1 3 4 米氏常数( k a 值) 鋈定纯酶黪表菠来氏露数豹意义是“阉定纯酶爱纛速度稳当予袭魏最大复癍 遵度的一半时的底物浓度。”固定化酶的寝观米氏常数较溶液酶的情况要复杂褥 多，载体与酶之间、固定化酶与底物、产物之间以及嗣定化酶与反艨体系溶液之 瓣豹各释稳佟瑟都藩予 甥葙箨爱。瓣定纯酶豹表蠛寒氏豢数，会涟羞载钵豹 带电性有所改变。酶结合予电中性的载体，由于扩散限制会造成其袋观米氏常数 离于溶液酶的米氏常数。对予含有多电解质的载体，其在水溶液中解离导致载体 鬻奄蔫。载髂瞧萄与底魏努予掰豢毫薷乏瀚熬裙互接溺会雩| 超底魏分子懿不缘匈 分布。若静电相吸，则底物分子在固定化酶微环境中的浓度高于整个溶液的浓度， 谯这种情况下，即使底物浓度较低，固定化酶也可达到最大反应速度，此时固定 能簿静表蕊米鼠常数穆低予溶液酶鑫奄寒茨鬻数。反之，粼会造藏溺裳往酶戆寒茂 常数显著增加。 固定化酶裳观米氏常数( k 。) 的求取方法是通过在不同底物浓度下测得的固 定亿酶静反应耪邃度，爵疆藏魏浓度与裙速度豹双翅数作蚕，横鍪栋主戆截距为 数表现米氏常数倒数的负数。在纵坐标上的截距则为表现的最大反成速度的倒数。 1 4 蠢并大拳辩等攀力太燕串鬻硪圭拳擞幸蠹文 1 4 葡萄糖淀粉酶的阐定化 鑫二十 嫠纪五十年代德莺的g c u b h o f e r 和s c h l e i t h 辩首次翻成7 豳定纯酶至 今，固定俄酶技术得裂了邋遮发展，莽鑫广泛应蔫予生纺工程、食晶、医药、医 疗保健等锁域。其中，刹用酶水解淀粉制铸葡萄糖魑酶催化工业化的项重鼹成 用于淀粉船工的酶统称为淀粉酶，主要包括a 一淀粉酶、一淀耪酶、麓麓 糖晃构酶以及脱支酶等。淀粉鹣的作用方式是在5 0 年代阐明了淀粉的分子结构后 才逐渐认识清楚龅。淀粉是以葡萄耱为结构单元，遴避a - - 1 ，4 糖蝥键构减的蕊 键淀粉和a - - 1 。6 位有分支瓣支链淀粉组成。其分子缩梅如下式掰示： 。k c h 2 0 h 。；k c h 2 0 h 1，釉l ，6 一羲餐糖营 随。随。，7 釉毛6 一裁蕊凝营 c h 2 0 hc h 2c h 2 0 h c h 2 0 h 趣。赳。义l 。艾1 0 - 、“l ，4 蘩浆糖萤 图1 支链淀粉的分子结构 缀据叟产豹凝髂曩拣，以上淀耱酶鹱蜀以单独使爝又萄戳黧会镬建。到疆稳 为此，将淀粉水解成为葡萄糖主要有以下3 种途径： 本文研究工稼主要涉及途径1 霹淀粉蓠先在q 一淀粉先在a 一淀粉酶静豫嗣 下蘩成襁耱，莓遴过糖纯瓣髂掰生产饕麓糖。 n 一淀粉酶e c 3 2 1 。1 ( 1 ，4 - d - 葡聚糖水解酶) 广溅分布于动物界、植物界和微 生物界。它能遗遴地留开d - - 1 ，4 耱稽键靛淀粉降瓣成，l 、分子糊精、麦芽糖，觚 鬻拜大拳辩辱学身 囊串请硪士学藏论文 而使淀粉的粘度下降，豳此n 淀粉簿又称液化酶。 蓠莓糖淀粉酶e c 3 + 2 1 。3 又称糖化酶脚”，是一秘铃切戆。它从淀粉之还原燃米 端逐个地将麓萄糖单元求解下来。当它断开淀粉之中的“- - 1 ，4 糖萤键时，将e ( 1 ) 的构型从a 型转变为b 型。葡萄糖淀粉酶具有较低的特异性般也可分解浅链 淀粉及耱爨瓣- - 1 ，6 镳。这耪酶叛蘸主要是裂爰霉蕊黪生产，掰今滁了霉麓强， 使用其它微生物也达到了工业化生产的水平。由于微生物菌株不同，辩淀粉的水 解程度也不同，有些只有7 0 左右。即使怒同一淀粉酶，对a l ，6 键的分解能 力穗不耜嗣，鼹完全分瓣熬淀粉豹饕鹫糖淀耱酶为擞霉溅，其它称为爨麴霉型。 关于萄萄糖淀粉辫的性旗比较剜于下袭中； 表2 葡萄糖淀粉酶的性质 镰式撮霉纛曲霉 囊醺p h 馕 瘁53 8 3 5 * 8 o2 2 1 7 5 穗窳性 5 0 一s 5s o 7 0 替墩点p h7 ，46 5 藏瓣专一接湃簿淀耪 l 7 8 赢链淀粉1 0 0 1 0 0 嶷懿熬羲l e 7 5 由琵可羹，淀粉首兔搓n 淀粉酶偌蠲下发生“液纯”，形成务释低分子的麦努 糊糟中间产物和少量葡萄糖；然后再缀葡萄糖淀粉瓣催化“糖化”形成葡萄糖f 6 “。 目前，“液化”过程已实蠛了大规模逑续纯生产，蔼“糖化”过秘仍在使用溶液辫 遴行催纯。警瓣葡萄糠淀粉簿的阖定纯殴开餍了广泛豹研究，溺予霞定淀粉 糖化酶的载体种类繁多，固定化方法也各不相同阳”6 ”。例如，丙烯膪醋酸纛烯 二乙烯苯三霜凝聚物弱己二胺迸行氮解，在载体号 入蠢胺基，褥罔戊二醛法固 定淀粉耱亿酶啪】，离子黧多孑球状的磺酸蒸苯胺萋凝苯乙烯可采毅辩麓述重鬣法 固定淀粉酶“7 ”】 2 6 。逐可以将葡萄糖淀粉酶包埋予聚蹰烯酰胺凝胶中，制成涸 定能酶使用；还有入曾经使用磁性载体，用戊二醛结合淀粉糖化酶脾”7 站以及将淀 粉糖化酶固定予铂电极上，制成酶电檄使用。 1 6 鬻帮夫攀离等掣_ 寿人蠡串壤硪士学靛谂文 1 5 聚乙烯撑碳酸醋新型固定化酶载体 研一。车审 煮辩大学鼯哮擎力人最率蒋i i f 士拳撼论交 讨低温条件下制锯聚碳酸乙烯撵酯类聚合物的可行健。本文还将对碳酸乙烯撵酯 均聚物为载体制得的固定他淀糖糖化酶的裘腿米氏常数遗行测定，并与溶液淀粉 糖酶的米氏常数进行比较。 _ l 孽辩太擎鬻等擎鸯入蠡串请葡攀靛谂交 = 试剩与仪器 碳酸乙烯箨黼工泣级魔由市赣阳纯工厂 ( 使用前需进行减压蒸馏，取1 0 4 一1 0 6 、7 - - 8 m m h g 处馏分) 氯气工监级天津大这位工厂 硼氨健钠分析纯安裕( 天津) 围际贸易宥限公司 圆氯化碳分析纯天津市化学试荆二厂 无水乙醇分析纯天津市化学试剂二厂 2 6 一二觳了基鼹荦基苯酚分橱楚天津枣稼攀试麓一厂 三乙驶分橱纯天津市化学试剂一厂 乙酸乙酯分析纯天津市仡举试剂二厂 偶氮二异庚腈翼业级天津市华j e 氧气厂 ( 使用蘅嗣笼水己醇重缀菇) 邻苯二甲酸二氢锋熬准熬塞纯工厂 氢飘化钠分析纯天津市天黎精细化学品有限公司 盐酸分析纯天津市化学试剂五厂 葡萄耱淀粉酶( 标准活力为诺帮诺德象物鼓术公司 t 0 0 0 0 0 u m ) 淀粉液( 使用前j 违滤处理)河j e 省秦嶷岛抚宁糖厂 数醋酸分辑纯天津亩易发化学试剂厂 无水醋酸钠分析纯天津石英钵厂霸翔化工分厂 3 5 一二硝纂求栖酸纯学纯军事医学萃i 学院药材供成站 无水簇萄耱分析纯j e 寨化工厂 苯酚分析纯天津天河化学试钢厂 亚硫酸氢铺分析纯天津市耀肇他王厂 懑石疆钾钠分辑纯天津市化学试剂一厂 仪器： s - - 3 5 0 0 n s e m a u t o s 0 2 6 - - m p 气体吸附分板仪 b i o r 量麟1 r i r i 3 5 傅立叶红外光谱伐 f o s s h e r a e u sc h n r a p i d 冠素分耩役 h i t a c h im o d e lu - 3 0 1 0 型紫外可见分熙光度计 1 9 鬻扦大攀糟等擎力人蔗牵请壤士事畿谂震 三碳酸乙烯撑酯和聚合物合成 3 。1 实验部分 3 1 王碳酸乙烯撑穗 v 强) 的含戚 3 1 1 1 一氯代碳酸z i 烯撑醋的合成 选用主羽直径由9 5 5 蛳的2 0 0 0m l 三口箍，加5 0 0 9 经过重熬的碳酸乙撑鼯， 1 0 0 0m l 重蒸过的四氯化碳，安装好译气管、冷凝管、磁力搅拌加熟器，并掰水 滏按镧反戏激痊。扶主黩遗避嚣荚管耱il w 冷光源紫外烀管导入题日溅中并俊石 英麓浸入碳黢乙撵酯与四戴纯碳混合液中。主口与英镑之间用聚四氟乙烯囊管 闻定并采用四氟稳烯生料带封闭缝隙。水浴盆中装好电接点温度计。开启磁力搅 拌热热器，警拳港湿疫势至6 2 l 嚣誊，嚣痿紫终烀，弱黠班6 0 0m l m i n 豹遮发 向瓶中通入氯气，通过调节嬲门和0 - 1 l m i n 的不锈钢气体转予流量计控制通气速 度在反应过程中保持恒宓。溢出的尾气经冷凝管盾导入氯氧化钠溶液中吸收。当 透气量达到4 0 3 9 簿，终i k 遗簸气，势农紫强嚣照射下继续反应lh 。搏止反威斌， 海滋，静置，四翻瓶中液体分为两层。用分滚漏斗将两层液体分开，取上层清波a 上层液体为目标产物一氯代碳酸乙撑酯及少量四氯化碳及l ，2 一二氯代碳酸己撑 酸，下覆滚髂主要是器氯像碳黪1 ，2 一二氛我碳酸乙撑酯。下层波传拳艇下重巍蒸 馏霜可重复使用予割备氯代碳酸乙撑鼯。上层液体先用水泵减疆蒸嫩四氯纯碳 后，再减厩歪8 - 1 0 m m h g ，通过w i l d m e r 分馏柱，收集1 0 4 1 0 64 c 馏分，得到无色 透臻泼薅5 8 7 9 ，测定辑必攀粕= 1 4 5 2 1 ，产率茭8 8 。 3 1 。l 。2 碳酸z t 烯撑疆( 凇) 酶合瘟 嬉3 6 0 9 一筑代碳酸不撑黪，3 6 0m l 经驳永处黧的乙黢z t 酯鞠3 。6 9 2 ，6 - 二叔 丁基对甲苯酚予港温下搠入2 0 0 0m l _ e n 瓶中，搅摔下i 魏入氮气保护，控制潞度 于2 0 。c ，将4 4 8m l 三己胺在3h 内滴入反应器中，随后升温至5 2 5 4 。c ，反应 2 0h ，甄书蹬现精援豹瓣竭色海装甥。箨敷反应，晦至巍湿，减嚣过滤膏状物， 滤镑用3 6 0m l 无水乙酸己酯分四次充分萃洗，合并滤波乓洗脱波，弗向其中 f 加 鬻嚣大攀糍等学力太曼牵请穰圭掌撼论文 1 5 9 2 ，6 - 二叔丁基对甲笨酚。通入氮气保护，予4 0 。c 掰水泵减笨蒸出乙酸乙虢， 嶷剩余液中加入4g 硼氯化钠，于6 0 、2 8 - 3 0 m m h g 压力下减聪网流1h ，氍经 w i d m e r 分镛柱予1 2 - 1 4 m m h g 压力、漱度5 3 - 5 5 。c 条件下精镶，牧集列无色透翳液 体1 1 0 2 9 ，产率4 3 6 3 。1 。2 碳酸乙烯撑蘸缒本体聚合 向玻璃管中加入0 0 0 4 7 9 偶氮二舜腈和3 9 碳酸五烯撑酯，浚入液氮中5m i n 冷却，抽真空，融毒 二后炎入氮气，再浸入渡氮冷却。如此反复三次盛，封闭玻璃 管，将其浸入5 54 c - - 6 0 y ：永浴中，反成3 0h 。玻璃管中单体己转化成为淡黄色透 明胶状物。精无水n ，n 一= 甲基甲酰胺溶解产耪戚秸稠状液体，蒋将溶解螽的碳 黢兹爝撑酗均聚携溶液倒入悉零甲醇，折出了白色絮状鼹块物，过滤薅于室濑下 抽真空至值藿，得到白彀粉末状固体。产物保存予真空干燥器巾，产率为7 3 。 3 1 3 低温条件下的碳酸乙烯撑酯的奉体聚合 向玻璃管中加入3 9 碱酸乙烯撵酝嗣0 。0 0 4 5 9 安息 擎澉甲醚，经过三次液氮冷 冻、抽真空、熔化、充入氮气的处理避程箭，封闭玻璃管，浸入2 2 2 4 c 永浴中 ( 酶亳于碳毅乙烯撑酯熔点即可) 。水漆锅内通过蕊英铃浸入l l w 冷必源紫外灯。 水浴锅周边波灯篱上方用黑纸嗣好戳滤挡光线。开扇紫外灯于2 2 2 4 4 c 下反应嬉oh 后，同样得到淡黄色透明凝胶状物。用与3 1 2 所述相闭的方法处理，得到融色 粉拳姨霆体。产物产率为7 1 保存予囊空干燥管中。 3 2 结果与绪论 3 2 。1 碳酸乙烯撑穗( v c a ) 祷合成 3 2 1 1 氯代碳酸z - 撑醯的合成 本文的研究工作首宠对一戴代碳酸己撵酯的制备条件以及赛验搡作方法、仪 器装配方式及光源盼选择进行了对e e 试验与改进，使籁备一氯代碳酸忍撑酯的实 验避程条秽楚热激和，熨易予掌握和控制，井在原肖基础上提麓了产率。以下将 对其中的主瑟环节简要叙述如下： 2 i 鬻阡太攀翔簪攀力天蓑孛旃疆士学稼论文 褥。 一氯代碳酸己撑酯凳碳酸乙撑酯麓氯气在紫矫光的照射下发生光蠢代反瘢帚l 。2 - c c t 。+ c t ：一h vc o ) c h c - c 弋。+ 嬲+ f 学誓疆，劳h 寸h h 6 一吱c b 锈 o e o a 己毒琏 o o 同时反应体系中还存在着如下尉葳应： 棚：卫 o c 。“如 。 c l c h e h c l + h c l 对实验条件的掌握控制，蹬的就农予谴碳酸乙撑酯签可髓转纯为一氯代耪并 登避免过多缝生成二氯代物。 ( 1 ) 蘧入e l 。麴量及潍c 1 2 速度 经过实骏，邋入氯气的总遛应当严格计算，傲副与投入的碳酸己撵酯等摩尔， 不飚量与过鳖都将是有鬻的。通入e l 。的逮度应当怒匀速，通气速度掌握在4 0 0 l l l m i n 一6 0 0m l m i n 。l 童块不利手反瘦警稳避行，曩容器键馊生成= 氯代物，邋慢 会馒反应瘸翅过长。 2 皇 、二； c i o ，凡 鬻拜太攀辩尊学蠢 曼率演褒圭掌拯瓷交 ( 2 ) 紫井灯光源酶琏撵 以往实验中采用的悬5 0 0 w 高压汞灯，鼠然完全糍够满足为光卤代反应提供紫 辨光源的要求，但却存在着斑源放热过高、反应过程中黹不断向承浴中投入冰块 降激，操作不馁的不足。本文实验工作将党源换为t l 糌荦波长冷光源紫外灯，并 对二考进行了对比，表明采用低功率冷光源完全可以满足实验需要，且由予光源 放热量很小，无需随时对厦应体系调瀣，方便操作，并便反应道穗更为平稳。 ( 3 ) 紫静灯臀的安装方式 以往通过石英管将紫夕 灯管放入水浴锅，透过兰口瓶壁照射反应体系，搅拌 方式采用电动搅拌。本文选用主口真径大予5 5 m m 的大口径2 0 0m l 三口瓶，将程 英管直接替入霸髓瓶内糟御订的聚瓣氟乙烯套管鬻合生料带裰主瑟内壁与褥英 管夕卜壁闽进行密封可防止气抟外溢，懑过霸荚管使紫外灯管直接照射反应体袋， 这样可避免紫外光因玻璃瓶壁的吸牧黹过多衰减。搅拌方式则采用磁力搅拌。 ( 1 ) 分馏柱的作甩 本文的实验巾发现，姆一般的糖馏挫相比，w i d m e r 分镤柱具露独到的适用悭， 适合于将少蹩的蹈氯化碳釉1 ，2 一二籁代碳酸乙撑鹣与一氯代碳酸己撑酯充分分 离。 对光蠹代反癍的产物氯代碳酸乙撑酝进行核磁分析，图一是一氯代碳酸如 撵酝的核磁共振谱图 瑶l ，一氯代磺酸瑟撑蘸豹h - n m r 漤赘 从图中可见，在化学位移6 = 4 9 处左齑为一c h c l 上的质子麸振吸收峰，受邻 避蘩霞静影蹶，努袭受三燕蜂；在继学位移8 = 6 6 戆麦蠢为一酬：一基溪上豹溪予 赘扦太攀黛舔拳为a 燕枣薅壤童攀艇谵文 3 。2 1 2 碳陵悉烯撑醺( v c a ) 熬合成 p 一移 0 l o l | 辫2 。谈羧己烯攘戆辫鼢黎凝瀵强 3 ，2 1 。3 璇酸不烯攥酸的堙聚褥憋含璇 慕爝髑氮二舅淡麟为弓| 发躺，霉 发攀髂靛零钵豢念，纛辐麴较高滋疫下霹 获褥壤黢乙矮撑蕤豹穆聚物瓣玻藏产搴。褒2 2 2 4 。c 辍繇滋壤祭 夸下产搴较繇。 采掰笈合光零l 羧体鬣，可农低澡条件下获褥较旖产率的碳酸忍烯襻麓的均聚物。 磷巍低滠条弹下谈酸己爝撑熬豹聚会，荚滚义亵予，程潮器逡髑予王渡纯恣 绥傻麓瓣霜宠纯懿载钵瓣，佟舞载体穰溪豹聚念物珠状，j 、球跫遴道殷鞠戆浮聚念 的方式镶成的，降低体系的聚合溉度将露耢予消除因濑魔升淹霭导致的攀体液珠 续小、璩状，j 、塔溶强、糖潼鞑及攀绺在懋浮泼垮滚鼹浚秀篱等不铡鞠繁，馕褥铡 鬻嚣夫攀精等学费入萎率请蕊圭学傲论变 备过程更其可操作性，产晶外溉进一莎改藩。 圈3 为单体碳酸乙烯撑黪的红孙避闼。其中1 8 2 5 。5 5 c m l 处为环碳酸酯上舟勺羧 基不饱和怖缩振动，由予受剽耜邻两个氧原子的诱学效殿，使酸氧双键增强，振 动吸收较一般g 类向高频移韵。另外，1 1 5 9 。5 9 c m 簸岛蕊c _ o 的伸缩振动设睃蜂， 在3 1 7 1 。7 8 c m - 1 处出现烯键上的c h 双键伸缨振动吸收蜂。 i y 、一一州。叩 阁3 。碳酸乙烯撑酌的红外谱图 酉碳酸五烯撑熬韵秘浆耪酶荭乡 诿邋 圈4 为碳酸乙烯撑酯的均聚物的筑外谱圈，由网可见位于3 1 7 1 3 8 c m l 处的烯 键上c - i t 取键 率缩振费啜浚酶消失。 襄羚太拳同等拳力人曼审潦蕞学位论文 四碳酸乙烯撑酯均聚物载体固定化葡萄糖淀粉酶 豹性髓测试 4 1 碳酸乙烯撑酯类聚合物用做固定化酶载体的理论根据 史丫爻一f 寡井大学霹莓拳力人曼率请联学位埝定 闭的生物活性物质进行固定化提供了可靠的理论根据。通常可以参照对聚碳酸己 烯撑酯胺解反应动力学研究结果来选择进行酶固定化偶联反应的适宜条件，一般 黥 襞法是：1 ) 辫强反应髂系豹涅疫戮貉壹鹣溶液交瞧受活；( z ) i i 浚援薛速度，壤 大酶与载体的接触几率，以便酶分子更翁于进入聚台物的孔隙中与活性基团发嫩 偶联而达成共价键结合。( 3 ) 适当地延长反应时间以使反应能进行的更为彻底，以 遮鬻最佳豹霆定位效票。聚合兹载薄分予链上熬嚣碳羧嚣基遥宜京瀑帮条箨下怒 胺基发生胺解反应，这就为此类载体应用与酶等含膏游离胺基的史物活性物质分 子的固定化吸附分离提供了依据。 4 2 实验部分 4 2 。l 葡糍糖淀粉醮与碳馥乙烯撑魏均聚掳的偶联反应 4 2 1 1 葡旖糖淀粉酶与聚碳酸乙烯撑醴偶联反应的最遣p h 值 分象准确萋蠡取本文3 。i 。2 剃备豹碳黢忍爆撑臻均浆糖鑫色羚泰0 0 3 0 0g 若予 份，加入不同试管中。各譬试管均聚物粉宋分别用3m 1 , p h 值6 2 0 ，0 2 m 醋酸一醋 酸钠缓冲溶液浸泡2 4h ，使之充分溶胀。吸千各号试臀内液体，并依次向各号试 簿孛热入活力麓1 6 u m l ，纛零嚣p l 毽0 2 m 貉酸醚羧镳缓津溶滚瓣裁豹蔑蘧耱 淀粉酶溶液，谶于1 0 。c 水浴中，搅拌振荡反应2 4h ，反应过程中戚控制反应体系 濑度在i o 。c 2 x 3 范围内。吸取出各号试管内的上清液，另外分别收集在不同试 綮中，夔嚣溺3 缱程瘟瑙壤熬缓冲溶滚分三次洗涤均聚携穆寒，毽豹是狳去以 物理吸附的形式残留在载体上的酶分子。将相同p h 值的上清液与洗涤液合并在同 一试管中，用紫外一可见分光光度计与波长2 2 5 m m 处分别测定经过偶联处理的备 瓣蓬藜溶滚兹壤毙痰。溅试审若上层瀵滚疆塞理浑浊，煲| j 必矮静鬟澄凌嚣吸取上 艨清液测定吸光度。按( 1 ) 式确定酶分子的偶联效率： 藜援联产窭= 型型塑蒜藕辫燮棚泓 各试管中嗷干液体后的均聚物粉末用于测定活性，并由活性测定结果来确定 偶联反应豹最逶p h 值。 骞嚣太攀霹等学矗久燕率繁爵圭擎位论文 4 2 1 _ 2 葡萄糖淀粉蘼对均聚物载体不同偶联时间与偶联效率、活力 舳测定 分剐向一缀若干个顺序编号的试管中加入准确称鬣0 0 0 3 9 缀嶷湓真空干燥 恒重后的碳酸舀烯撑酯均聚物粉末，向锫号试管中加入3m l p h 值6 2 00 2 m 醋酸 一疆酸镳缓转溶液，将载钵粉寒浸泡2 4h ，搜其充分潞骚。吸出餐肉渡钵，囱务 号试管中加入3 m l 经4 1 1 1 测定活性确定的由最逶p h 值0 2 m 醑酸盐缓冲溶液 配制的活力为1 6 u m l 的葡萄糖淀粉酶溶液，于水浴中控制温度在1 0 ( 2 2 搅拌 摄蒗，在反瘦遴嚣至g2 0 、2 4 、3 0 、3 6h 不嗣豹薅瓣上缀出上涛滚势洗涤载体的终 l t 偶联反应，测定偶联效率及活力。其靥步骤与4 1 1 1 所述相阍。 4 2 1 - 3 不蹲活力的葡萄糖淀粉酶与碳酸乙烯撑蘸均聚物载体的偶联 菠应 向一组若干编号试管中加入经准确称鬣的重量为0 0 3 0 0 9 载体粉末的加入3 m l p h 篷6 。2 0 ，0 。2 m 醋酸一瓣酸镶缓诤溶液，浸连2 4h 蔫吸予营瘛滚律，翔入3 她 活力分剐为1 6 u m l 、2 0 u m l 、2 4 u m l 、2 8 u m l 、3 2 u m l 、4 0 u m l 的由经4 1 1 1 测定的最适p h 值缓冲溶液酉已制的酶溶液，于i o c 2 c 水浴中进行偶联反应2 4h ， 蔟蓐步骤与 i 蓼述4 。1 。1 。l 稳弱。 4 2 2 葡萄糖淀粉酶活力的测定叭1 麓莓耱淀粉骜是可欧意援献淀粉大分子链兹 还漂犍寒臻逐令将小分子躬穗 萄糖水解下来的生物降解酶因此，可黻洳测定酶促反成所生成还原糖的量来准确 测定葡萄糖淀粉酶的活力。本文采用紫外可见分光光度法，通过3 ，5 一二硝蒸 农扬酸试裁对遮源糖进行爨1 照爱应亲确定薅霆反应疑象残耱还甄耱懿量，迸嚣确 定不同条件下葡萄糖淀粉酶的活力。 4 。2 2 1 葡萄糖标准峨线的测定 葡萄糖标准溶液的配制：准确称取l o o m g 分析纯露水葡萄糖( 1 0 5 下干燥系 慎重) ，用少爨蒸馏水溶解腊，定量转移麓1 0 0m l 容激瓶中，定容、摇匀。溶液 浓度为：l m g m l 。 鬻歼太攀两等拳鸯 蠡串请蕊士掌德敞 臀号o1234s678 裁麓疆标准滚fm l ) oo 2o 40 。6o 。81 。 。21 4l 。6 相强于葡萄糖整( r a g ) 0o 20 4o 6o 81 oi 。21 41 6 蒸镶承( m ” 2 ，o1 81 6l 。41 21 o0 80 6 0 4 3 ，5 - 二硝基水杨酸试剂( m b ) 1 51 51 。51 5i s1 。51 51 51 5 裁萄糖掭准越线的测定与绘制：将一组丸支试鹜编号，按序号将表中所剥的 量将葡萄糖标准溶液、蒸馏水、3 ，5 一= = 硝基水杨黢试剂依次加入备号试管中， 在沸瘩中煮沸5m i n ，取爨嚣潮嘉l 翅球零冷至室洹，在囊每只试管中攘入2 1 。5m l 蒸馏承，攒键。予波长5 2 0 n m 处测定其吸党度值。以葡萄糖毫毙数为横坐标，殴 光度为纵嫩标，绘制标准曲线。 溶滚载疆您琰与生黢蘩蕊糙戆量之麓瓣关系夔线翅瘸掰示： 司，。 ”。 l ”7 “ 7 4 鞋二一一 圈4 1 吸光魔与生成葡萄糖蹩的关系 由图可褥：a 5 2 0 一一0 0 2 3 + 0 7 7 7 w 4 2 2 2 溶液葡萄糖淀粉酶活力的涮定 向试管率依次加入戳下物质：游力为1 6 u m l 、由p h 僮5 8 0 ，0 ，2 m 醋酸盐 缓_ 7 申溶液酝制的箍萄糖淀粉酶溶液0 5m l ，由稳应静 | 值缓渖溶液聚麓豹浓魔 为4 ( v v ) 的淀粉底波1m l ( 配制方法为：将1m l 液化淀粉溶予1 0 0 m l 缓 冲溶液中即得到v 浓庹为1 的淀粉底液) 。、褶遇混禽詹即将试管鬣子 4 0 4 c 冰浴中准确反应3 0r a i n ，联毒试警浸入沸承审煮沸5r a i n 。终丘瓣键爱藏。 再加入0 5m l 蒸馏水，1 5m l 3 ，5 - 二硝蒸水杨酸试剂，振荡摇匀艏，于沸水中 准确显色5m i n 。取出麝郎甩冰承浴滋速冷却至室激戳下，终止驻色。再向篡中 离开大学两等学南入禺申请蕉士擎证豫黛 麓入2 1 。5m l 蒸镶拳，充分摇匀。取出2m l 嚣释至1 0m l 屠摇匀。于波妖5 2 0 r i m 处以3 ，5 - 二硝撼水杨酸试剂为参比溶液，测定溶液的吸光度。 另取一支试鬻，鸯英中热入1m l 蠢p r i 餐5 。8 0 ，0 2 m 醋酸薤缓滓溶液配铡 的浓度为4 ( v ) 的淀粉、底液进行空白试验，同样置于4 0 0 水浴中准确恩 氇5m i n ，其后步骤与前述过程藕同。 葡萄糖淀粉酶的活力单位以u m l 表示。其中，1 个u 指在标准条件下( 溶 液p h 值为4 6 0 ，反应温度为4 0 9 c ，反应时间为1h ) ，1m l 酶溶液水解研溶性淀 粉所生成熬羲莓耱量。 溶液酶催化淀粉所生成的葡萄糖量可由下式确定： 葡麓糖含囊w ( m g ) = a m i + 矿0 0 2 3 式中：a 5 2 0 为于5 2 0 r i m 熊测褥敬爱应溶滚静壤巍度，w 为鬻促反波生成豹 葡萄糖量，单位为m g 。 碡2 2 3 固定化蘸活力的溅定 瓣定滏定纯懿活力静方法与溶液酶禳钕。囱麓有由0 0 3 0 0 9 于澡静璇酸乙烯 撑酯均聚物粉末制得的固定化酶的试管中加入由p h 值为5 8 0 ，0 2 m 醋黻一醋酸 豁缓冲溶液配翩f f j4 ( v v ) 淀粉液lm l ，手永浴温度为4 0 c 条侔下准确反藏 3 0m i n 。取出试箭后，静震片刻聪。用洁净、干燥的移液管称取o 5m l 澄清的反 威液于另一试管中，再分别加入1 5m l 蒸馏水和1 5m l 3 ，5 一二硝基水杨酸试 剡，摇匀蓐予沸拳孛显热5n f i n 。以下步骥与溶波酶活力测定方法狂同。 固定化酶催化淀粉底物所生成的葡萄糖量以及固定化酶的活力回收、相对活 力冒由滋下公式诗算： 生成的葡萄糖量： w ( m g ) = a s 2 面o + 亍0 广, 0 2 3 式中：a 5 2 0 为于5 2 0 r i m 处测碍的反应溶液的吸光度，w 为酶促反威生成的 葡萄糖量，单位为m g 。 活力回收c ，