（无机化学专业论文）金属酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究.pdf

辽宁师范大学硕士学位论文 帅f i i 川f i f 川i f f f i f | f i i f f f f 删 y 17 9 5 12 1 摘要 本文采用b 3 l y p 方法对肝醇脱氢酶、金属酶催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化乙醇 生成乙醛的反应进行了理论研究。寻找反应的过渡态，优化得到了反应物、过渡态、中 间体和产物的几何构型并计算了反应势垒。本论文的工作可以归纳为以下两个部分： 1 采用b 3 l y p 方法研究了肝醇脱氢酶催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化乙醇生成乙醛的 反应机理。在蛋白质或水环境下，比较了没有催化剂或以肝醇脱氢酶为催化剂时的 反应势垒。研究结果表明：肝醇脱氢酶在反应中的重要作用在于肝醇脱氢酶中的z n p 离子可以稳定反应中间体乙醇负离子，从而使得乙醇负离子的脱氢过程变得更加容 易。没有催化剂时，反应势垒高达1 7 0k j t 0 0 1 ，常温下反应难以进行；以肝醇脱氢酶 为催化剂时，底物乙醇通过氧原子与肝醇脱氢酶的锌离子形成络合物，从而大大降 低了反应势垒，肝醇脱氢酶的参与使反应势垒降低至约11 0k j m o l ，反应在常温下容 易进行。 2 采用b 3 l y p 方法研究了金属镁、钙、镉取代肝醇脱氢酶中的二价锌离子后形成金属 酶，比较了不同的金属酶作为催化剂对烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化乙醇生成乙醛的 反应的影响。研究结果表明：在同一族中金属酶的催化活性随着金属原子半径的增 大而减小，即随着半径的增大金属酶催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化乙醇转化为乙 醛的反应势垒逐渐增大，且钙金属酶、镉金属酶作为催化剂催化烟酰胺腺嘌呤二核 苷酸氧化乙醇转化为乙醛的反应，在水环境下不容易发生。 关键词：肝醇脱氢酶；乙醇负离子；密度泛函理论计算；锌离子；反应势垒；反应机理； 金属酶。 u ，j 金属酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究 t h e o r e t i c a ls t u d yo nt h em e c h a n i s mo fe t h a n o lo x i d a t i o nt oa l d e h y d e c a t a l y z e db ym e t a le n z y m e a b s t r a c t 1 1 1 em e c h a n i s mo fe t h a n o lo x i d a t i o nt oa l d e h v d ec a t a l y z e db yt h el i v e ra l c o h o l d e h y d r o g e n a s ea n dm e t a le n z y m ew a ss m d m db yd e n s i t yf u n c t i o nt h e o r yb 3 l y pm e t h o d t h eo p t i m a ls t r u c t u r e so fr e a c t a n t s ，t r a n s i t i o ns t a t e s ，i n t e r m e d i a t e sa n dp r o d u c t sw e r el o c a t e d a tt h eb 3 l 懒- 31 g 幸l e v e lo f t h e o r y t h er e a c t i o nb a r r i e r sw e r et h e nc o m p a r e di nw a t e ra n d i np r o t e i na tt h eb 3 l y p 6 - 31l + + g ( 3 d f , 2 p ) l e v e lo f t h e o r y t h ew o r ko ft h et h i sp a p e rc a nb e d i v i d e di nt w op a r t s 邪f o l l o w i n g ： 1 - n l em e c h a n i s mo fe t h a n o lo x i d a t i o nt oa l d e l a y d ec a t a l y z e db vt h el i v e ra l c o h o l d e h y d r o g e n a s ei nw a t e ra n dmp r o t e i nw a ss t u d i e db yd e n s i t yf u n c t i o nt h e o r yb 3 l y p m e t h o d 1 h ec a l c u l a t i o nr e s u l t ss h o wt h a tt h eh i g hr e a c t i o nb a r r i e r se x i s t sf o rt h ep a t h w a y w h e r er i oc a t a l y s ti si n v o l v e d ，s u g g e s t i n gt h a tt h eo x i d a t i o nc a n n o tt a k ep l a c ea tr o o m t e m p e r a t u r ew i t h o u tc a t a l y s t s al o wr e a c t i o nb a r r i e re x i s t sw h e nt h el i v e ra l c o h o l d e h y d r o g e n a s ei si n v o l v e d ，i n d i c a t i n gt h a tt h el i v e ra l c o h o ld e h y d r o g e n a s ec a t a l y z e d r e a c t i o nc a l lt a k ep l a c ea tr o o mt e m p e r a t u r e 卫1 er o l eo ft h el i v e ra l c o h o ld e h y d r o g e n a s e i nt h er e a c t i o nw a se x p l o r e d 2 n em e c h a n i s mo fe t h a n o lo x i d a t i o nt oa l d e h y d ec a t a l y z e db ym e t a le n z y m ei nw a t e ra n d i np r o t e i nw a ss t u d i e db yd e n s i t yf u n c t i o nt h e o r yb 3 l y pm e t h o d w ec o m p a r e dt h e r e a c t i o nb a r r i e r sw i t ht h ed i f f e r e n tm e n t a le n z y m ec a t a l y s i s t h ec a l c u l a t i o nr e s u l t ss h o w n t h a tt h ea c t i v i t yo fm e t a le n z y m e 、v o u l dd e c r e a s ea st h ei n c r e a s i n go ft h er a d i u si nt h e s a m ec l a na n dt h eb a r r i e r sw o u l di n c r e a s e d n er e a c t i o n so ft h ec a l c i u ma n dc a d m i u m m e t a le n z y m ea sc a t a l y s t sc a t a l y z e dt h en i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d em a d + ) t o o x i d a t ee t h a n o lt oa l d e h v d ea tr o o mt e m p e r a t u r ei nw a t e rc a nn o tt a k ep l a c e k e yw o r d s ：l i v e ra l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ；e t h a n o la n i o n ；d e n s i t yf u n c t i o n a lt h e o r y ；z i n c i o n ；r e a c t i o nb a r r i e r s ；r e a c t i o nm e c h a n i s m ；m e t a le n z y m e i i 4 一 辽宁师范大学硕士学位论文 目录 摘要1 a b s t r a c t i i 引言卜 1 肝醇脱氢酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究5 1 1 简介5 1 2 模型与计算方法5 1 3 结果与讨论8 1 3 1 没有肝醇脱氢酶参与反应时8 1 3 2 肝醇脱氢酶参与反应时11 1 4 结论1 6 2 金属酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究1 7 2 1 简介一1 7 - 2 2 计算方法1 7 2 3 结果与讨论2 0 2 3 1 金属镁取代锌离子参与反应时2 0 2 3 2 金属钙取代锌离子参与反应时2 2 2 3 3 金属镉取代锌离子参与反应时- 2 4 2 3 4 不同金属酶催化乙醇转化为乙醛反应的能量比较2 6 2 4 结论2 7 结论2 8 参考文献- 2 9 一 攻读硕士学位期间发表学术论文情况3 2 一 致谢3 3 鑫， 1 3 辽宁师范大学硕士学位论文 引言 近年来随着生物技术的发展，生物酶在工业生产、纺织工业、食品、化妆品以及医 学应用等方面引起了广泛的关注。酶的生产和应用已经具有9 0 多年的历史，酶这个名 词在1 8 7 8 年由库恩提出，是指活的酵母中可使糖类发酵成酒精的催化物质。1 9 2 6 年 s u m n e r 第一次从刀豆中提取出尿酶，并得到了结晶，证明了该酶具有蛋白质的一切属 性，得出酶的化学本质是蛋白质这一规律。1 9 8 2 年以后，人们陆续的发现了某些d n a 和r n a 也同样具有酶的催化功能，这使人们进一步认识到，酶并不都是蛋白质。现代 科学认为，酶是一种由细胞产生的、对其特异底物起高效催化作用的生物催化剂，其化 学本质可以是蛋白质或者核酸。 大多数酶是由生物细胞产生的，以蛋白质为主要成分的生物催化剂，它有单纯酶和 结合酶两类型。结合酶中非蛋白质的部分叫酶的辅助因子，蛋白部分叫酶蛋白。酶的辅 助因子大多数是金属离子，约2 3 的酶含有金属离子；也可以是小分子有机化合物。常 见酶含有的金属离子k + 、n a 十、m 矛+ 、z n 2 + 、c u 2 + 、f e 3 + 等。它们或者是酶活性的组成 部分如羧基肽酶a 中的z n 2 + ；或者在稳定酶蛋白分子构象方面所必需；或者是连接底物 和酶分子的桥梁，如各种激酶依赖m 矿与a t p 结合发挥作用。 酶的种类很多，在生物体内有数千种不同的酶。按照酶所催化反应的类型可分为： 生物酶是一种无毒、对环境友好的生物催化剂，其化学本质是蛋白质、核酸。生物 酶主要有以下几个特点： ( 1 ) 反应条件温和：酶一般都在常温、常压、p h 近于7 的条件下起催化作用。一般 来说，动物体内的酶最适温度在3 5 4 0 。c 之间，植物体内的酶最适温度在4 0 5 0 。c 之间。 动物体内的酶最适p h 大多在6 5 8 0 之间；植物体内的酶最适p h 大多在4 5 6 5 之间。 ( 2 ) 催化效率高：酶的催化效率比一般化学催化剂高1 0 8 _ 一1 0 1 0 倍。如一个碳酸脱水 酶可使三千六百多万个碳酸脱水。 金属酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究 ( 3 ) 高度的化学区域选择性和立体专一性。一种酶只对具有特定结构的底物键合， 并在特定位置起催化作用。酶能清楚地辨认对映体，例如a - 葡萄糖苷键，对b 一葡萄糖 苷键无效：酵母中酶只能使d 构型糖发酵，而相应l 构型的糖无影响。 ( 4 ) 可降低生化反应的反应活化能：酶作为一种催化剂，能降低反应的活化能，使 反应更容易进行，从而提高化学反应的速率。 ( 5 ) 易变性失活：在受到紫外线、射线、热、表面活性剂、强酸、强碱、金属盐、 其它化学试剂如氧化剂、还原剂等因素影响时，酶蛋白的二级、三级结构有所改变。 目前在化工生产中已经有利用脱氢酶的催化作用将二氧化碳转化合成甲醇j ，这不 仅解决了二氧化碳的循环再利用的问题，同时还为人类提供了重要的化工原料和洁净、 无污染的燃料甲醇。因为生物体内的一切生命活动都是在酶的催化下平衡协调进行的， 临床上的许多疾病都与酶的异常密切相关【2 1 ，且用的药物也是通过影响酶的作用来达到 治疗的目的。 锌是生命活动不可缺少的重要组成部分【3 1 们，成人体内含锌量约为3 9 。锌在人体的 生长和发育阶段起着重要的作用，同时它能有效的治疗并预防传染性疾病，例如疟疾、 肺炎【l l 】。锌在酶中或者是酶活性的组成部分，或者在稳定酶蛋白分子构象方面所必需。 锌能参与生命体中多种代谢过程，例如脂类、糖类、蛋白质与核酸的合成与降解。目前， 在动植物及微生物体中已经鉴定出3 0 0 多种含锌酶。 目前，普遍认为锌酶是四面体构型，在该结构中二价锌离子处于中心位置，并且与 三个氨基酸残基和一个具有催化作用的水分子( 或者氢氧化物) 配位【1 2 1 ，如图l 所示。根 据所连氨基酸残基的种类不同，形成不同的锌酶。例如当x 、y 、z 都是组氨酸与锌离子 配位，形成碳酸酐酶；当x 、y 、z 分别是组氨酸、组氨酸、谷氨酸与锌离子配位，形成 羧酞酶；当x 、y 、z 分别是组氨酸、半胱氨酸、半胱氨酸与锌离子配位，形成脱氢酶等。 辽宁师范大学硕：学位论文 x 一傩j o 7 k 拓凳妊黥 妙c h c h 2 咱h 啪、h c 一， 。 一一u 、c h 一c 一， n 太一h 2 h 2 o h h i s h o o c 沪 j c h c c 、 h 2 n h 2 o h a s p 图1 锌酶的结构特点 f i g 1 c o m m o ms t r u c t u r a lf e a c t u r eo fz i n ce n z y m e s 脱氢酶类是生物体内一种重要的氧化还原催化剂，在生物体内很多醇类代谢都是通 过脱氢酶催化完成的。脱氢酶在临床与检验、病理与治疗机制的研究中意义重大。醇脱 氢酶的种类繁多，可以根据肽链的长度分为短链醇脱氢酶、中链醇脱氢酶、长链醇脱氢 酶。醇脱氢酶所含肽链氨基酸残基数分别为2 5 0 ，3 7 5 ，6 0 0 7 5 0 。肝醇脱氢酶( l a d h ) 能可逆催化脂肪醇或芳香醇转化为相应醛或酮。l a d h 含有两条单多肽亚基，每1 条又 含有2 个二价锌离子，它们分别处于分立域。其中一个二价锌离子位于催化域，它也和 基本的辅酶n a d 十结合在一起，并和2 个半胱氨酸根的硫原子、一个组氨酸的氮原子、 一个具有催化作用的水分子配合。另一个二价锌离子的4 个配体是半胱氨酸的硫醇根， 它不能接近溶剂，且认为后一个锌离子只是具有保持酶蛋白结构的作用，而不具有催化 作用。 近年来随着绿色化学概念的提出，醇脱氢酶酶促反应引起了人们的广泛关注。国内 外大量的文献介绍了溶液的p h 值 1 3 - 1 6 1 、温度【1 7 1 、底物浓度等因素对金属酶活性中，t h , 结 构的影响，研究了氢负离子转移和氢质子转移过程【1 8 - 2 3 ，还有一部分文献介绍了金属酶 活性中心的金属离子【2 4 】的竞争、重组，氨基酸的残基【2 5 】的置换对酶催化活性的影响。人 们从实验和理论上对酶的酶促反应进行了研究。v a n h o m m e r i g 等【冽使用半经验a m l 和 p m 3 方法对：马肝醇脱氢酶( h l a d h ) 催化烟酰胺腺嘌呤二核苷酸m a d + ) 氧化异丙醇转化 h2 一 h c u 强 旧 鼬泗 哪 呲 詈 h 金属酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究 为丙酮的反应进行了研究，他们的研究结果表明：与z n 2 + 结合的半胱氨酸配体应带一个 单位的负电荷并且应该形成四元配体络合物来催化反应。b a h n s o n 等【2 7 j 研究t l a d h 酶 催化n a d + 氧化苯甲醇转化为苯甲醛反应的动态同位素效应，研究结果表明酶催化氢转 移过程有明显的核量子效应。o l s o n 等【2 2 】使用p m 3 方法考察 h l a d h 酶催化n a d + 氧化 苯甲醛转化为苯甲酸的反应，认为质子优先转移时活化能垒低。a g a m r a l 等 2 8 - 3 0 l 使用r f l f 和p m 3 方法对l a d h 酶催化n a d + 氧化苯甲醇转化为苯甲醛反应进行了研究。t r u h l a r 等 3 1 - 3 2 采用q m ( a m l ) m m 方法对l a d h 酶催化n a d + 氧化苯甲醇转化为苯甲醛反应进行了 研究，计算体系中对c ，h ，n ，o ，s ，z n 共5 4 个原子( q m 区域) 采用半经验量子化 学( a m l ) 处理，而周围的溶剂酶体系共5 5 0 6 个原子( 包括水) 则采用c h a r m m 2 2 力 场模拟，研究结果表明多维隧道效应校正对定量计算反应速率有重要影响，即酶催化氢 转移过程有显著隧道效应。t r e s a d e m 等 3 3 】使用q m ( a m l ) m m 方法研究t l a d h 酶催化 n a d + 氧化苯甲醇转化为苯甲醛反应的动力学同位素效应。c u i 等1 2 3 j 使用 s c c d f t b c h a r m m 方法研究了h l a d h 酶体系中的氢正离子和氢负离子转移反应，他 们发现氢正离子转移优先于氢负离子，并且氢负离子转移有较高的势垒。 h a m m e s s c h i f f e r 3 4 l 研究了在肝醇脱氢酶、二氢还原酶酶促反应中氢负离子迁移过程中 的电子结构和核量子效应，表明在不同的酶促反应中酶运动发挥着不同的作用，酶运动 作用的研究对蛋白质工程和药物设计具有重要意义。 本文采用密度泛函理论b 3 l y p 方法，研究了没有催化剂或以l a d h 酶为催化剂时， 蛋白质或水环境下n a d + 氧化乙醇转化为乙醛反应的反应机理，揭示了l a d h 酶在反应 中的催化作用机理。用金属镁、钙、镉取代肝醇脱氢酶中的二价锌离子，形成金属酶。 比较了不同金属酶作为催化剂对n a d + 氧化乙醇转化为乙醛的反应的影响。 辽宁师范大学硕二t 学位论文 1 肝醇脱氢酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究 1 1 简介 脱氢酶类是生物体内一种重要的氧化还原催化剂，它在生物体内的氧化产能、解毒 等方面具有重要作用，同时在生物催化、生物医学、化工生产领域有广泛应用f l j 5 。肝 醇脱氢酶( l a d h ) 能可逆催化脂肪醇或芳香醇转化为相应醛或酮。人们从实验【3 6 - 3 9 和理 论上对此进行了研究。v m o m m e r i g 等【2 6 】使用半经验蝴l 和p m 3 方法对h l a d h 酶催化 n a d + 氧化异丙醇转化为丙酮的反应进行了研究，他们的研究结果表明：与z n 2 + 结合的 半胱氨酸配体应带一个单位的负电荷，且应该形成四元配体络合物来催化反应。o l s o n 等1 2 2 l 使用p m 3 方法考察了h l a d h 酶催化n a d + 氧化苯甲醛转化为苯甲酸的反应，认为 质子优先转移时活化能垒低。a g a r w a l 等【2 8 。3 0 】使用r h f 和p m 3 方法对l a d h 酶催化n a d + 氧化苯甲醇转化为苯甲醛反应进行了研究。t r e s a d e m 掣3 3 】使用q m ( a m l ) m m 方法研究 了l a d h 酶催化n a d + 氧化苯甲醇转化为苯甲醛反应的动力学同位素效应。c u i 等【2 3 j 使用 s c c d f t b c h a r m m 方法研究了h l a d h 酶中的氢正离子和氢负离子转移反应，他们发 现氢正离子转移先于氢负离子，且后者转移有较高的势垒。b r u i c e 等【1 7 1 使用分子动力学 模拟方法研究了温度对嗜热脂肪芽孢杆菌醇脱氢酶( h t a d h ) 结构的影响，发现z n 2 + - - - e t o - 结构几乎不随温度变化。迄今为止，有关此类反应的理论研究一般采用半经验方法。基 于此，本文采用高精度密度泛函理论b 3 l y p 方法，研究了没有催化剂时或以l a d h 酶为 催化剂时，蛋白质环境下或水环境下n a d + 氧化乙醇转化为乙醛反应( 1 ) 的反应机理，首 次揭示了l a d h 酶在反应中的催化作用机理。 c h 3 c h 2 0 h + n a d + _ c h 3 c h o + n a d h + 一( 1 ) 1 2 模型与计算方法 l a d h 酶的催化活性部位由锌离子与4 个配体分子构成，如图式l 中a 所示。本文 将与z n 配位的h i s 和2 个c y s 分别简化为n i - 1 3 和两个h s 。，如图式l 中b 所示。组氨酸分子 如图式l 中c 所示，反应中主要起作用的是组氨酸的侧链咪唑基，所以本文将其简化为 咪唑，如图式1 中d 所示。n a d + 分子如图式l 中e 所示，反应中主要起作用的是烟酰胺 环，所以将其简化为f 。 伽车q 一璐丰s h 伽1 卞o h 2q 一璐1 0 l 。3 t 2 h 毁，年一藤 忡9 文毗 魂王h 图式1 本文采用的简化模型 s c h e m el1 1 l em o d e l su s e di nt h i sp a p e r 对n a d + 氧化乙醇转化为乙醛的反应，本章研究了三条反应途径( 图式2 ) 。途径i 为 没有l a d h 酶参与时的反应途径。途径i 中，1 a 反应为丝氨酸s 的羧酸上氢质子转移至l j r l 的咪唑环的氮原子上，形成丝氨酸负离子i m l ；l b 反应为丝氨酸负离子i m i 夺取乙醇分 子r 2 的羟基氢，使乙醇变为乙醇负离子i m 2 ；l c 反应为带正电荷的含烟酰胺环的r 3 从 乙醇负离子i m 2 中夺取一个氢负离子，从而牛成产物乙醛。途径i i 和途径i i i 为l a d h 酶 参与时的反应途径。途径i i 中，首先发生l a 反应生成丝氨酸负离子i m l ；在以l a d h 酶 为催化剂条件下，反应物乙醇分子取代l a d h 酶中与z n 2 + 配位的水分子形成络合物r 4 ， 2 b 反应为丝氨酸负离子i m l 夺取络合物r 4 的配体乙醇上的羟基氢，生成带一个负电荷 的中间体i m 3 ；2 c 反应为带正电荷的含烟酰胺环的i b 从中间体i m 3 中夺取一个氢负离 子，从而生成产物乙醛与酶的络合物p 4 。途径i i i 为。s c h 3 取代与z n 2 + 配位的s h 。途径i i i 中，首先发生l a 反应生成丝氨酸负离子i m l ：在以l a d h 酶为催化剂条件下，反应物乙 醇分子取代l a d h 酶中与z n 2 + 配位的水分子形成络合物r 5 ，3 b 反应为丝氨酸负离子i m l 夺取络合物r 5 的配体乙醇上的羟基氢，生成带一个负电荷的中间体i m 5 ；3 c 反应为带正 电荷的含烟酰胺环的r 3 从中间体i m 5 中夺取一个氢负离子，从而生成产物乙醛与酶的 络合物p 5 。 我们使用g a u s s i a n0 3 程序【柏】中的b 3 l y p 方法寻找各步反应的过渡态，计算反应势 垒。比较三个途径的反应势垒，从而确定最有利于反应进行的反应途径。计算中金属锌 原子采用l a n l 2 d z 基组和赝势，其它原子采用6 3 1 g * * 基组，优化得到了各个反应物、 中间体、过渡态和产物的几何构型，并进行了振动频率和i r c 计算以确定所得结构是正 确的。对所得结构采用b 3 l y p 方法，金属锌原子采用l a n l 2 d z 基组和赝势，其它原了采 一 帆 呷c 也 一鑫 辽宁师范大学硕士学位论文 用6 - 3 1 l + + c , ( 3 d f , 2 p ) 基f l t ，采用s c r f ( p c m ) 模型进行蛋白质环境( _ 5 6 2 1 ) t 4 1 】或水环境 ( 6 = 7 8 3 9 ) e 4 ：下的单点能计算以获得更为精确的能量。 途径i 途径i i h 护形+ 一一c 6 h h 艄- - n h 2 r 1 s 一“r = n t r + 碱。h c - n h 2 ( 1 a ) c h 2 0 h c h 3 c h 2 0 h+饿- h c 。n h 2呻c h 3 c h 2 0 - + h o o c - h c - 一n h 2( 1 ” c h 2 0 h c 。h 2 0 h i m 2 c h 3 c h 2 0 + 酬叼一c 如锄+ 剐 l m 2 r 1 s o ( 1 c ) 一一l ：著一h 2 0 * h i q + o o c - n 莲淼c 曲 占h o h 纱+ 一1 苫h 浠卅 si m l 唧t 3n m h 8 中- s h + 啪渊至。- n h 。2 h s - z i n - - s h + h o o c - h c - - n h 2 ( 2 b ) c h 3 c 稿h c h 2 0 h c h 3 c h 2 占 亡h 2 0 h n h 3 h 2 n h s - z n - s h + i c h 3 c h 2 0 - i m 3 l m l o 切 - 7 i m 3 n h 3 h 水 h s 一军n s h + i c h 3 c h o o s ( 2 0 伽伽 郇仓彤 印馏 一 全星堕堡些圣壁墼垡竺堕垄堕星些垫里竺墨塑窒 - _ - - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ l _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ 一一一 途径i i i 尸弋 h 2 0 - h n 十 一一l ：芽一也。形+ + 一h c 如- - n h h 2 c l 砷 r 1sp 1 n h n_h3xlrt3 郾s-il-s町一吨霉蔷气hh3，擘喇h3+一。鼍嚣。”chg c h 2 0 h o “3 0 “2 ” r 5 i m l i m 5 s 掌叫掣r o - 才s c h 3 + h 2 n j 印o 上 ，佣删 仓伽删3l2uohhoh uu h 1 3 结果与讨论 图式2 本章研究的三条反应途径 s c h e m e2t h et h r e er e a c t i o np a t h w a y ss t u d i e si nt h i sc h a p t e r 1 3 1 没有肝醇脱氢酶参与反应时 图1 1 是途径i 中所涉及的中间体复合物和过渡态的几何构型和主要结构参数，以 及过渡态所对应反应坐标的虚频。图1 2 是途径i 的反应势能面，正体数值为蛋白质环 境下的相对能量，斜体数值为水环境下的相对能量，括号中的数值分别为在蛋白质和水 环境下计算溶剂化效应时所采用的介电常数。 一 i m r 1 q 2 - 9 7 3 3c m 1 t s - 1l m p - 1 q 一7 15 3c m - 1 i m r - 3 t s o i m p - 3 图1 1 与途径l 相关的各驻点的几何构型 f i g 1 1 t h eo p t i m a ls 饥i c t u r ef o rt h ef i r s tr e a c t i o np a t h w a y ( b o n dl e n g t hi nn f n ) 2 j 4 o 图1 2 途径i 的反应势能面 f i g 1 2 t h ep o t e n t i a le n e r g ys u r f a c eo f t h ef i r s tr e a c t i o np a t h w a y ( t h ep l a i nn u m b e r s a r eo b t a i n e di n p r o t e i ne n v i r o n m e n tu s i n gg = 5 6 21w h i l et h ei t a l i cn u m b e r sr r co b t a i n e dmw a t e re n v i r o n m e n t u s i n g = 7 8 3 9 ) 9 金属酶催化乙醇氧化生成乙醛反应机理的理论研究 j t l l s c h e m e2 所示，没有肝醇脱氢酶( l a d h ) 参与反应时，首先丝氨酸s 与r 1 的咪唑 环作用，将丝氨酸s 的羧酸上氢质子转移到咪唑环的氮原子上。如图1 2 所示， 在这一 过程中丝氨酸s 、水、r 1 作用首先形成复合物i m r - 1 ，复合物i m r - 1 经过渡态t s 一1 形成 复合物i m p 1 ，在复合物i m p 1 中丝氨酸s 羧酸上氢质子已经转移到咪唑环的氮原子上( 图 1 1 ) 。从图1 1 可以看出过渡态t s 1 结构中，水分子参与了质子转移，即将断裂的o ( 5 ) 一h ( 4 ) 键长( 0 1 3 0 7n m ) 比丝氨酸s t 相应的键长( 0 0 9 7 2n m ) 增加了0 0 3 3 5n m ，比反应前体复合 物i m r - 1 中相应的键长( o 1 0 1 9n m ) 增加了0 0 2 8 8n mg 即将断裂的o ( 3 ) 一h ( 2 ) 键长( 0 1 2 4 2 n m ) t k , 稳定水中相应的键长( 0 0 9 6 5n m ) 增加了0 0 2 7 7a m ，比反应前体复合物i m r - 1 中相 应的键长( 0 1 0 0 0n m ) 增加了0 0 2 4 2n m ；即将结合的o ( 3 ) h ( 4 ) 键长( 0 11 3 4n m ) l t , 稳定水 中相应的键长( o 0 9 6 5r i m ) 长0 0 1 6 9n l t l ，比反应后体复合物i m p - 1 中相应的键长( o 1 0 0 8 n m ) 长0 0 1 2 6n l n ；即将结合的n ( 1 ) - h ( 2 ) 键长( 0 1 2 5 0n m ) 比反应后体复合物i m p l 中相应 的键长( o 1 0 4 8n m ) 长0 0 2 0 2n l n ；过渡态t s 1 结构中丝氨酸羧酸基的c o ( 5 ) 键长( o 1 2 8 5 n m ) 比丝氨酸s e p 相应的键长( o 1 3 6 1n m ) 短0 0 0 7 6n m ，比反应前体复合物i m r - 1 中相应 的键长( o 1 3 2 2n m ) 短o 0 0 3 7n n l ，比反应后体复合物i m p 1 中相应的键长( 0 1 2 6 4n m ) 长 0 0 0 2 1a m 。蛋白质环境中过渡态t s 1 的能量相对于反应前体复合物i m r - 1 仅为3 0 1 k j m o l ，相对于起始反应物为1 2k j m o l ：水环境中过渡态t s 1 的能量相对于反应前 体复合物i m r - 1 仅为2 7 3k j m o l - 1 ，相对于起始反应物为2 0 7k j m o l 一；表明此步形成丝 氨酸负离子过程无论在蛋白质还是水环境下均非常容易发生。 途径i 的第二步反应为丝氨酸负离子夺取反应物乙醇分子r 2 的羟基氢，形成乙醇负 离子i m 2 。势能面扫描研究表明，此步反应的逆反应即乙醇负离子夺取丝氨酸的氢质子 生成乙醇分子的过程为无势垒过程。图1 2 表明，蛋白质环境下乙醇负离子的能量比起 始反应物高2 1 6 5k j m o l ，比乙醇高1 5 2 3k j m o l ；水环境下乙醇负离子的能量比起始 反应物高1 3 9 0k j m o l 一，比乙醇高1 3 2 0k j m o l ，表明生成乙醇负离子的过程在常温下 小可能发生。 途径i 的第三步反应为乙醇负离子i m 2 与带正电荷的含烟酰胺环的r 3 作用，作用结 果是乙醇负离子中的一个氢负离子被r 3 夺取而生成产物乙醛。如图1 2 所示，在这一过 程中乙醇负离子i m 2 与r 3 作用形成复合物i m r - 3 ，复合物i m r - 3 经过渡态t s 3 形成复 合物i m p - 3 ，在复合物i m p - 3 中氢负离子已经从乙醇负离子i m 2 转移到r 3 上( 图1 1 ) ，生 成产物乙醛。从图1 1 可以看出过渡态t s 3 结构中，即将断裂的c ( 6 ) h ( 7 ) 键长( o 1 2 6 6n m ) 比中间体i m 2 中相应的键长( 0 1 1 5 9n m ) 增加了0 0 1 0 7a m ，比反应前体复合物i m r - 3 中 辽宁师范大学硕士学位论文 相应的键长( o 1 0 9 8n m ) 增加了0 0 1 6 8n m ；即将结合的c ( 8 ) - h ( 7 ) 键长( o 1 5 6 8n m ) 比p 3 中 相应的键长( 0 11 0 0n m ) 长0 0 4 6 8n m ，比反应后体复合物i m p - 3 中相应的键长( o 1 0 9 8n m ) 长0 0 4 7 0n n l 。图1 2 表明，途径i 的第三步反应势垒很高，在蛋白质环境中的反应势垒 为1 7 7 9k j m o l 一，在水环境中为1 7 8 0k j m o l 1 ( 相对于起始反应物) ，表明该步氢负离子 转移反应在常温下不能发生。 综上可见：没有催化剂参与反应时，常温下n a d + 不能将乙醇氧化成乙醛。 1 3 2 肝醇脱氢酶参与反应时 图1 3 是途径、途径i i i 中所涉及的中间体复合物和过渡态的几何构型和主要结 构参数，以及过渡态所对应反应坐标的虚频。图1 4 和图1 5 分别是途径i i 、途径i i i 的反应势能面，正体数值为蛋白质环境下的相对能量，斜体数值为水环境下的相对能量， 括号中的数值分别为在蛋白质和水环境下计算溶剂化效应时所采用的介电常数。 l m r - z n - 3 i m r - z n - c h 3 d l = - 5 6 0 0c m - 1 t s - z n - 3i m p - z n 3 “= - 6 7 1 0c m 。l t s - z n - c h 3 i m p - z n - c h 3 一 全星堕堡垡圣塑些生盛圣壁垦窒垫望塑望笙堕窒一 - _ - _ _ - _ _ _ - - _ _ i _ _ _ _ _ _ _ - - - _ _ _ - l _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ l _ _ - _ _ _ - - 一一 图1 3 与途径i i 、途径i i i 相关的各驻点的几何构型 f i g 1 3 t h eo p t i m a ls t r u c t u r ef o rt h es e c o n da n dt h i r dr e a c t i o np a t h w a y ( b o n dl e n g t hi nn m ) 一1 2 一 辽宁师范大学硕士学位论文 图1 4 途径i i 的反应势能面 f i g 1 4 t h ep o t e n t i a le n e r g ys u r f a c e so f t h es e c o n dr e a c t i o np a t h w a y ( t h ep l a i nn u m b e r sa r eo b t a i n e di n p r o t e i ne n v i r o n m e n tu s i n g 萨5 6 21w h i l et h ei t a l i cn u m b e r sa r eo b t a i n e di nw a t e re n v i r o n m e n tu s i n g 8 = 7 8 3 9 ) 图1 5 途径i i i 的反应势能面 f i g 1 5t h ep o t e n t i a le n e r g ys u r f a c e so ft h et h i r dr e a c t i o np a t h w a y ( t h ep l a i nn u m b e r sa r eo b t a i n e di n p r o t e i ne n v i r o n m e n tu s i n g 萨5 6 21w h i l et h ei t a l i cn u m b e r sa r eo b t a i n e di nw a t e re n v i r o n m e n tu s i n g s = 7 8 3 9 ) 1 3 j置一盔l譬i叠 一1j喜矗誊#i 如s c h e m e2 所示，途径i i 首先发生l a 反应，该反应与途径i 中的第一步相同。 反应 体系存在l a d h 酶时，反应物乙醇分子取代l a d h 酶中与z n 2 + 配位的水分子形成乙醇与 酶的络合物r 4 。途径i i 的第二步反应为丝氨酸负离子夺取络合物r 4 中乙醇分子的羟基 氢，形成带有一个负电荷的络合物i m 3 。势能面扫描研究表明此步反应的逆反应为无势 垒过程。图1 4 表明，相对于起始反应物，带有一个负电荷的络合物i m 3 的能量在蛋白 质环境中为9 5 2l ( j m o l ，在水环境中为4 7 7k j m o l ，表明形成带有一个负电荷的络合 物i m 3 的过程在常温下可以发生。 途径i i 的第三步反应为带有一个负电荷的络合物i m 3 与带一个正电荷的含烟酰胺环 的r 3 作用，作用结果是i m 3 中的一个氢负离子被r 3 夺取而生成产物乙醛与酶的络合物 p 4 。如图1 4 所示，在这一过程中i m 3 与r 3 作用形成复合物i m r - z n - 3 ，复合物i m r - z n - 3 经过渡态t s - z n - 3 形成复合物i m p z n - 3 ，在复合物i m p - z n - 3 中氢负离子已经从中问体 i m 3 转移到i b 上( 图1 3 ) ，生成产物乙醛与酶的络合物1 4 。从图1 3 可以看出过渡态 t s z n - 3 结构中，即将断裂的c ( 6 ) h ( 7 ) 键长( o 1 2 5 8n m ) 比中间体i m 3 中相应的键长 ( 0 1 1l1n m ) 增加了0 0 1 4 7n m ，比反应前体复合物i m r - z n - 3 中相应的键长( o 1 1 0 8r i m ) 增 加了0 0 1 5 0a m ；即将结合的c ( 8 ) - h ( 7 ) 键长( o 1 4 7 0n m ) l ：t p 3 中相应的键长( o 11 0 0r i m ) 长 0 0 3 7 0n m ，比反应后体复合物i m p z n - 3 中相应的键长( o 11 0 0n m ) 长0 0 3 7 0n n l ；乙醇 片段的c ( 6 ) o 键长在r 4 中为0 1 4 5 0n n l ，在i m r - z n - 3 中为0 1 3 8 9