（分析化学专业论文）有机小分子与蛋白质相互作用的研究及其分析应用.pdf

山东大学硕士学位论文 摘要 蛋白质是各类生命的基本物质，是生物性状的直接表达者，担负着各种生 理功能，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行。深入研究小分子物质与蛋 白质的作用机理，建立蛋白质快速、简便的分析方法，对分子水平上阐明生命 的奥秘等方面具有重要的意义，是当前生物分析化学研究的前沿和热点之一 本论文利用荧光技术、共振光散射技术、表面张力测定技术、吸收光谱技 术、圆二色谱技术，透射电镜等手段研究了小分子物质与蛋白质的作用机理， 建立了蛋白质快速、准确、简便的分析方法。论文共分五个部分 论文的第一部分主要综述了蛋白质结构和性质、小分子物质与蛋白质相互 作用的研究方法和研究进展，以及共振光散射技术基本原理及其在蛋白质分析 应用中的研究进展等。共引用文献1 4 7 篇。 论文的第二部分中，利用荧光光谱法、紫外光谱法、圆二色光谱法等方法 研究了除草剂双氟磺草胺( n 啪s u l 锄，缩写为f u ) 与血清白蛋白之间的相互 作用机理结果表明：f u 可以显著猝灭b s a 的荧光，其猝灭机制为静态猝灭 f u 与b s a 的结合常数k 在2 9 9 k 和3 0 9 k 时分别为1 5 1 0 4 和7 1 l 矿l m 0 1 1 ， 两者之间存在一个结合位点体系的焓变h 和熵变s 分别为- 5 7 9 k j m o l d 和1 1 3 6 j m o r l 一，说明f u 与b s a 之间主要以氢键作用力和范德华力相互结 合根据f 6 培衙非辐射能量转移理论，f u - b s a 问的结合距离为l ：6 n m ，能量 转移效率为o 4 1 紫外光谱和圆二色光谱实验结果表明，f u 可以导致b s a 构 象发生改变 论文的第三部分应用荧光光谱、紫外吸收光谱、荧光寿命和圆二色光谱法 研究了生理条件和酸性条件下刚果红( c r ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 在非离 子型表面活性剂e 0 l o o 存在时的相互作用机理结果表明在生理条件下和 p h = 2 7 5 的柠檬酸钠盐酸缓冲溶液中c l u 1 0 0 对b s a 有较强的荧光猝灭作 用，其荧光猝灭方式均以静态猝灭为主实验还发现。( 1 0 0 的加入能够促 进c r 对b s a 的荧光猝灭作用，认为c r 和1 0 0 的协同作用，使得c r 、 1 0 0 与b s a 三者形成了大的聚集体，促进了b s a 的荧光猝灭作用有无 1 _ ) 【1 0 0 条件下体系的同步荧光光谱和加入不同物质溶液微环境疏水性研究表 明，c r - i x 1 0 0 使b s a 内部的疏水结构有所瓦解，肽链的伸展程度增加， 山东大学硕士学位论文 c r - 1 x 1 0 0 为b s a 提供了极性较强的微环境。圆二色光谱实验结果表明 1 x 1 0 0 存在下随着c r 浓度的增加，b s a 发生了去折叠过程。 在论文的第四部分，研究了在p h 为5 4 的酸性介质中，表面活性剂十二 烷基苯磺酸钠、稀土离子r + 和蛋白质共振光散射的增强作用，其最大蜂位于 3 5 l n m 处，且其强度与蛋白质的浓度在一定范围内呈线性关系，据此建立了一 种定量测定蛋白质的新方法。b s a 、h s a 、e a 的线性范围分别为 4 o x l 矿5 o 1 0 r 6 、4 o l 矿5 o x l o 气m l 1 和8 o 1 0 t 2 o l o ，g m l 1 ，检出限分 别为o o l o 、o o “和o 0 5 9 烬i n l 该方法用于实际样品人血清蛋白和鸡蛋血 清蛋白总量的分析。结果令人满意 论文的第五部分研究了酸性介质中有机溶剂( 乙醇、丙酮) 和十二烷基苯 磺酸钠( s d b s ) 与蛋白质的相互作用，有机溶剂的加入有效的促进了s b d s 与b s a 的聚集作用，从而导致共振光散射增强，且共振光散射的强度与蛋白 质的浓度在一定范围内成正比，该法可用于蛋白质的测定。丙酮体系中b s a 、 h s a 和e a 的线性范围分别为4 o lo 8 1 o 1 旷、4 o x l o 一1 8 1o 5 和 4 0 x 1 0 ，1 2 x 1 0 5gm l 一，乙醇体系中b s a 、h s a 和e a 的线性范围分别为 8 0 l o 8 1 o 1 0 5 、8 o l o 一1 4 1 0 5 和1 0 x 1 0 4 1 0 x 1 旷gm l 1 。该体系用于实 际样品人血清总蛋白的测定，丙酮体系和乙醇体系相对标准偏差分别为1 4 和3 5 。 本论文的主要特点是： ( 1 ) 本文利用荧光光谱、紫外吸收光谱、荧光寿命和圆二色光谱等多种手 段讨论了三唑嘧啶磺酰胺类除草剂双氟磺草胺( n o 粥t 1 1 a m ，缩写为f u ) 和偶 氮类染料刚果红( c r ) 与血清白蛋白之间的相互作用，丰富了农药和染料等 有机小分子与蛋白质作用的研究内容。 ( 2 ) 研究了表面活性剂存在的条件下，有机溶剂或稀土离子与蛋白质体系 的共振光散射增强作用，建立了灵敏的蛋白质分析方法该方法简便、快速， 具有较宽的线性范围。并利用荧光光谱、紫外吸收光谱、圆二色光谱、透射电 子显微镜等多种实验手段对体系的作用机理进行了研究。 关键词：蛋白质双氟磺草胺刚果红稀土离子y ，+ 十二烷基苯磺酸钠 丙酮乙醇荧光共振光散射 “ 山东大学硕士学位论文 p r o t e i n s 勰m c 姒c e r i a lb a s eo fl 瑜，讪i c ht a k co nd i v 哪i 丘e dp h y s i o l o g i c a l f i l t i o n n 喇船玳t h cc a r r i 盯o fm 姐yp h y s i o l o g i c a lf i l n c t i o n s ，眦da 托a l t l l e d i c t 【p r 伪s 甜o f 叠h y s i o l o g i c a l 醢脚徼l ni sv e r yi m p o r t a n tf b f 坞辩对i h 髓st o e 珥 o l dt h e 蹦：bo fl i f eo nm o l m a ri e v 盯t of i in ：h c rp c 锄e 们土ct h ei n t e 】唧砸o n m 蜥锄b e 帕7 e e n 锄a l lm o l c c 山韶a n d 眦i n ，e s p e c i a l l yt od e v c l 叩r a p i da n d 舯i n 鹳s a yf o r 肚i n s t h i s 删e c ti st h ef 0 ，砌p o s 衔觚dh o tp o i n ti l l b i o c i h 锄a i c a l 趾db i o p h y s i c a l 把缸吐峙s f t h es e e ko fm en e ws p 倒嘶吣so fp r 砷妇缸d 弛s 1 6 h i n g h e j n t e f a c 垃o fp t e i n8 n d 锄a l l 脚1 e c i l i e s ，t h i st h e s i s 删i e dt h e 姗嘲c 矗 m l l a n i 锄b e t w e p t e ：ma n ds m a l lm 0 1 1 1 1 e sl l s i n gt h c 他s e 砌t e c h n i q u 燃 i l u d i n g 妇u o r 龉c ，r l s ，s u r f a c ct e l l s i o n ，u va b s o r p t i o n c i r c l l l 缸d i c h r o i 锄 ( c d ) s p 咖i c m 鹤锄d 仃a n s m i 豁i c l e c 仃o nl n i c r o 瞅 p 岣s o 眦m p 地 c l l 船：c ea n dh a n d y 罄s a y sw d e v c l o p c df o rp r o t e i l lt h i st l l e s i si sw m t e ni n6 v e s c c t i o n s h 曲吧血_ s t 站c t i o n w c 娜m m a r i z e dt h e 咖c t l l 卸dc h 啪c t 盱o f p t e ：鸣t h e 埔s e a r c hm e l h o d 姐dc v o l 谢o no f 州e i nw i m 湖a i lm o l l l i c s ，t h ep 血c i p l eo f r l s m c t h o d 锄d 也c 佗c e m d m l o p m t so f r l sp r o b e f o r b s 九1 4 7 托翩鼬嘲 a 把c i t e d 溉 mt b e 蝴n d 删呱也e 硫嗽t i b c t w e 钮n s i l l 锄o u ，2 ，6 ，8 矗n 啪 5 - n l 敷h o x y 【l ，2 ，4 】缸i a 趵l o 【l ，5 叫p y r i n 埘i f 挣2 乩l f o t 鼬i l i d e ) 锄db o v i s 删m a n 啦n i n s a ) w 嬲弧s c i g a 自e db yn u o 糟s 鹏，u va b s o 删dc d s p c c 们m e 耐as 在口n gn u o r e c n q u 吼c l l i n gw 鹪o b s e e da n dt l i eq u 如c h i n g m e c l l a n i s mw 笛璐i d 凹e d 勰s t a t i cq u e n c l l i n g c o r d i n gt ot l l c 踟m v b l i i l 口 c q _ u a t i o n mb 砌i n gc o n s t a 鹏o ff u 、 ，i t l lb s a a t2 9 9 k 缸d3 0 9 kw e 托o b t a i n e d 鹞1 5 x l o 缸d7 1 x 1 0 3lm o r l ，托s p e c 帆e i y 1 h 口cw 弱a 曲嚼eb i n d i n gs i t c b 酿v e e nf u 缸db s a 1 kt l l 锄o d y 伽i cp 搬m 鼬e 培锄t h a l p yc h 锄g e 觚d e r l 仃o p yc h 锄g c ( s ) w e 始c a l c l l l a 自e d 嬲5 7 8 9l 【jm o l 1 姐d 1 1 3 6jm o l 1 k 1 ， u i 山东大学硕士学位论文 i e s p e c 吐v e l y w h i c hi n d i c a l 硝t 1 1 a tt l ”a c t i i l gf o 雠b e t w 嘲f u 锄db s a 懈 脚j n l yh y 出o g b o n d 锄d l d 盯w a a l sf o r c e a c c o r d 沁t o 也ef 6 腓r n m 啪d i a 矗o n e r g yt r a 匝塔f 打t l l e o r yt l l e 孙，e r a g eb i n d i i l gd i s t 锄c eb e t w 啪d o r ( b s a ) 锄1 da c c e p t o r 口u ) w 勰。慨n c d 睁1 6 姗) t h em e s t i g a t i 咄o ft h e u v ，v i s 趾dc ds p e c n ao ft l 埔s y s b 哪s h o w e dt h 砒t h ec 彻f o 咖a t i o fb s aw 撼 c h 强鲥i np r e s e n o f f u i i lt h ct h i r ds e c d o n t h ei n 把m c d sh 婀啪c o q 昏or e d ( c r ) a n db o 、r i 】s 咖m 加吼血 s a ) 懈s t i l d i e di nd i 丘醯e n tc o n d m si nt h cp r e s e n c eo fn o n i o n i c 跚r 蠡眦a n tt r i t o n ) 【- 1 0 0 ( d ( 1 0 0 ) 璐i n gn u o 他s c e n c e ，n s c c n c el i f e t i m c ，u v a b s o r p d o n 雒dc d 印w 的m e t r i e s 1 1 l en d 嘲湖o fb s aw 鸹q l l c n c h e db y c r d ( - 1 0 0 1 kq u e n c b i n gm e c h a i l i s m sw e 他c o n s i d e d s t a l i c 删h i n gi n b o mp h y s i o l o g i c a l 孤dan a 3 c 6 h 5 0 7 h c lb u 丘打l l n i i ki n t 啪c t i m e c i l a n i s mw 雒t 王l o u 曲tt l l a t1 x - l o o 矗l c i l i 诅t e s 也e 缸e r a c 矗o nb e t w e c r 趾dt l 艟 p r o t e i l l a n dai a r g ec o m p l e xw 雒如姐c d 1 ki n 、，e s t i g a t i o no ft l 培c d 叩e c 仃ao f l l 壕s y s t 锄s h o w e dt i 哦t i 璩c o n f 0 皿a t i o f b s aw 勰c h 托g c db yc r _ t x - l o o i l lt h ef 硪hs e c t i o n ，an e wr c s o n 趾c el i g h t a t t e r i l l g ( r l s ) 船s a yo fp r o t e i n s s i l c h 船b o v 妇s 咖ma l b u n l i n s a ) ，h u n 璩ns e 硼m 哪! i n 饵s a ) 缸de g gs e m m a l b 吼i n 嗽) w 勰p n t c d ml h em c d i 啪o fh c x 锄e i h y i e t c l 斓试 o 删t a ) h c l0 h _ 5 4 0 ) b 蛾血e r l so f y 3 + s o d i 咖d o d 酬h b m 黜s 谢f o n 如 ( s d b s ) s y s t e mc o u l db eg r e a ye i l h 眦e db yp r o t c i l l t h ee 血眦e di n t e n s 竹o f l 【l sa t3 5 5 眦w 勰i l lp r o p o r t i o nt ot l l ec o n c 烈l t 蒯o no f p r o t e i 璐i nt h e 砌g eo f 4 1 0 5 o x l o 6 9m l - 1f o rb s 丸4 o 1 0 5 o l o 。6g m l 1f o rh s a 锄d8 o 1 0 2 o l o 5gm l - f o re a m i rd 毗c t i l i l n i t sw e 1 o 1 0 ，1 1 l 矿a n d5 9 x l 矿gm l 1 ( s 悄) ，他s p e c 虹v e i y s 锄叩l 鹊w e 他d e t 锄：i l i r l e ds a t i s r i l y bt h e 丘f l l ls e c t i o n ，w ef o u n dt h a tt h e w c 托i n t e r t i o n s 锄o n go r g a n i cs o l v e n t c t o o re 吐i 锄0 1 ) ，s d b s 觚dp r o t c i n i tw 雒f o dn 埝t i nt h ec 蹦ca c i d k 2 肿0 4b u 胁0 肛2 5f o ra c c 咖cs y s t c m 趴dp h _ 3 4f o re l l a i l o ls y s t 锄) ，m e w e a k 他s 强l i g h t 辩a n c 血go 也s ) o f e t o n e - s d b s ( o re t h 锄o l - s d b s ) w 鹊 c n i 啪c c d 掣e a t l yb y 也ca ( 1 d “i o no fp r o t c i n t h ee n h a n c e dr l si m c 粥i t yw 觞i n p r o p o n i o nt o 也ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e h t h ed e t e c t i o nl i m i 协f o rb s a ，h s a 锄d t v 山东大学硕士学位论文 e aw e 北2 3 1 0 毫，2 5 1 0 a n d2 o 1 0 。8gn 1 】l 1 ( s 小= 3 ) i na c e t o s y s t e m 锄d w e 坤8 o 1 矿1 o 1 旷、8 o x l o r 8 1 4 1 旷a n d1 o l 矿：1 0 x 10 5gm l 1i ne n l 龃o l s ) ，s l e 】n ，r e s p l e c t i v e l y a c t l l a l 鞠加p l e i e ，h s aw 勰出瞳e 卿血a e ds a t i 虹敏枷l y 柚d t h er s do f e t o 始s y s t 鼬缸d 甜删的ls y s b e mw 凹ci 4 a n d3 5 ，r e s p c c 吐v e l y 如m yo p i n i o n t h eo r g a i l i c l v e mc o l l l d 缸i l i t a _ t e 血ei n e m c t i b e t 、张e ns d b s a n dt h e p r o 伦i n ，锄dal a r g ec o 玎叩l e xw 勰为咖e d ，w h i c h 他筑d t e di n 血e 彻h a n c e m e mo f r l 1 1 圮c l l i e f 吐眦t e r i s d c so f t h i st 1 1 c s i sa 雒f o l l o w s ： ( 1 ) h 也i st h e s i s ，w es t i j d i e dt h ei n c e 托c t i o nm e c h a n i s m sb c t w e b s a 强d 鼬a l l o r g a n i cm o l e c i l l a 船s u c h 勰a w 仃i 锄i o p y r i l l l i d i n e 如l f o n a n i l i d eh e r b i c i d e n o m 姒i a m 锄dab i s a z od y cc o n g or c d 郴i n gn u o 舱s c c e ，丑u o r e s c e n c c 渤e u 、，a b s o r p t i o n 锄d c ds p c c 缸啪“e s ，砌c hc 血d 1 葩m er c s e a r c h i nm e 丘e l d so f h e r b i c i d e 锄dd y e 硝r h c r l s 毗岫咖蹦o fs y s t 锄o f o r g a n i c l v 钮t 也er a r ee a r n l i o 哟 、枷lp t c i ni np 把s e n o f 鲫曲c t a l 吐s d b sw 勰s t l l d i e d ，w l l i c hw 嬲m i l i z c dt o d e i c i m i p r 0 钯i 瑚t 1 l em e t ：h o dw 曲n p l e 瑚【p i d 锄dh a da 丽d cc o n 蛐倒o n l i n e 盯m g e ：s “e f a li n s 觚l m e n t sw e r c 璐e dt os t i l d yt h ei n t e r a c t i o nm e c l l a 血锄o f t h cs y s t e ms u c h 勰n u o r c s c e n c e ，u va b s o r p t i o na i l dc ds p 仃o p h o t o m e t 盯趾d t e m k e ) w o r d s ：p r o t e i n n o 勉s u l 锄，c o n g o d ，y 3 + ，d i 哪d o d e c y l b 笳 s i l l p h o n a t e ，e t o ，e t 】 l a n o i ，f h l o r e s c c n ，圮s o i l a d 沈l i g h t a t t e l 妇g v 山东大学硕士学位论文 f d n a ： b s a ： e a ： c p b ： s d b s ： s l s ： t r i s ： f u ： t e m ： f ： i r l s o ： i r l s ： 龇： 符号说明 鱼精子脱氧核糖核酸c 回n a ： 小牛胸腺脱氧核糖核酸 牛血清蛋白 h s a ： 人血清蛋白 鸡蛋清白蛋白c t 似b ：十六烷基三甲基溴化铵 十六烷基溴化吡啶t x 1 0 0 ： 曲拉通x - 1 0 0 十二烷基苯磺酸钠 s d s ： 十二烷基磺酸钠 十二烷基硫酸钠 删1 a ： 六次甲基四胺 三羟甲基胺基甲烷 b rb r i t o n r o b i l l s o n 缓冲溶液 双氟磺草胺 c r ： 刚果红 透射电子显微镜 c d ：圆二色谱 样品体系荧光强度i 也s ：共振光散射 空白体系共振光散射的强度 样品体系共振光散射的强度 加入样品后体系共振光散射光强度的增强值 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研 究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：盟谴邀日期： 逋主。! ! 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盘缝攮。导师签名：薹_ ：枣日期：颦：! 山东大学硕士学位论文 第一章绪论 蛋白质是组成自然界中各类生命的基本物质，在生物体的生命活动中担负 着各种生理功能，从整体上维持生物体新陈代谢活动的进行，是生物性状的直 接表达者。有关蛋白质的各类研究是当前生命科学、化学、药学及临床医学研 究中所共同感兴趣的课题。特别是对蛋白质与药物小分子之间相互作用的研 究，如建立药物蛋白结合的体外模型，了解结合的紧密程度、结合部位、结 合力、结合常数等问题，不仅有助于分子水平上认识蛋白质与小分子的作用机 理和规律，了解蛋白质结构与功能的关系，为生命科学研究提供有用的信息和 数据，而且为药物分子的设计与筛选及新药的开发提供有益的启发与重要指 导。 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，在蛋白质与药物等小分子化 合物相互作用的研究中，白蛋白是目前研究的最广泛的一种蛋白质。它能在体 内与许多内源性物质及许多药物小分子作用，并具有多个结合部位，且其数目 是未知的在结合过程中，蛋白质分子也往往发生构象变化。血清白蛋白分子 与小分手间相互作用的研究涉及许多相关学科，如生物学、化学、物理学等， 因而加强各学科之间的协作必将推动这一研究领域的进步。 蛋白质的定量测定是生物化学和其他生物学科中经常涉及的分析任务，是 临床检验中诊断疾病及检查治疗效果的重要指标，也是许多生化药物分离提纯 中质量检验及食品检验中常见的分析项目。因此，建立准确、灵敏、简便快捷 的蛋白质定量分析新方法十分必要近年来，共振光散射s ) 作为一种新的 分子光谱技术灵敏度高，方法简便。弓l 起了国内外分析化学界的注意。 第一节血清白蛋白的结构和性质 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，容易较大量、高纯度的制备。 本节简要介绍血清白蛋白的结构、性质。 山东大学硕士学位论文 蛋白质由a - 氨基酸相互结合而成，水解后产生a - 氨基酸。一个氨基酸的氨 基与另一个氨基酸的羧基以肽键结合成肽链，再由个或一个以上的肽链按各 自特殊的方式组合成蛋白质分子。随着氨基酸分子数目、排列次序以及肽链数 目和空间结构的不同，形成为不同的蛋白质。 根据研究蛋白质结构的结果，己确认蛋白质的结构可分为一级、二级、三 级和四级结构【l ，2 】。蛋白质的一级结构是指氨基酸如何连接成肽链及氨基酸 在肽链中的排列顺序在一级结构中，一致公认肽键为主要连接键，多肽是一 级结构的主体。一级结构决定高级结构，决定蛋白质的生物学功能。蛋白质二 级结构是指多肽链骨架中靠氢键维持的局部的有规则的构象，如旺螺旋、b 折 叠、b - 转角、无规则卷曲以及非氢键维系的规则结构和侧链的构象。血清白蛋 白氨基酸残基中约4 8 排列为a - 螺旋，1 5 为5 折叠，其余卷曲回折成球状分 子。蛋白质的三级结构是指多肽链借助各种次级键在三维空问中沿多个方向进 行卷曲、折叠，盘绕成紧密的近似球状结构的构象，是在二级结构基础上的肽 链再折叠。具有三级结构的蛋白质分子单体按一定方式聚合成蛋白质大分子， 即为蛋白质的四级结构。 相对于其它蛋自质而言，血清白蛋白的结构简单，由一条单独的氨基酸多 肽链构成。 h s a 是由5 8 5 个氨基酸残基组成的单个肽链蛋白质，分子量约为6 6 5 0 0 。 h s a 肽链含有3 5 个半胱氨基酸残基，仅3 4 位上有一个巯基，其余都为二硫键， 二硫键中有8 对组成交叉的二硫键，只有接近n 端的是一个单个的二硫键。二 硫键对维系蛋白质空间结构的稳定性起着重要作用。h s a 含有十八个酪氨酸残 基( t y r ) ，三十个苯丙氨酸残基口h e ) ，在2 1 4 位上含有一个色氨酸残基( ，i 印) 。n 端为天冬氨酸残基( a s p ) ，c 端为亮氨酸残基皿e u ) 。 b s a 结构与h s a 相似，分子量相近，二者的氨基酸序列高度相似，且不同 氨基酸均为保守性替换。b s a 的等电点为4 7 ，分子量为6 7 0 0 0 。是一种典型的 球状蛋白，性质比较稳定。因此人们常用b s a 代替h s a 来进行蛋白质小分子 结合实验。 山东大学硕士学位论文 第= 节血清白蛋白与有机小分子相互作用的光谱法研究进展 光谱法作为最常用的分析蛋白质与小分子相互作用的方法包括荧光光谱 法、紫外可见分光光度法和圆二色光谱法等。多年来，国内外的研究工作者 对此做出了大量的研究工作。 一、荧光光谱法 荧光光谱技术在小分子与生物大分子相互作用的研究中有着广泛应厢，它 能够提供激发光谱、发射光谱、s t 6 k e s 位移、荧光强度、能量转移、荧光寿命 等多种参数，可对体系的荧光生色团的结构及其所处的微环境提供有用的信 息。另外，用荧光光谱法研究蛋白质分子构象还有灵敏度高，选择性强，用样 量少，方法简便等优点 在蛋白质与有机小分子作用机理的研究中可以引入外源性荧光物质作为 指示探针，也可利用蛋白质自身的内源性荧光( 蛋白质中色氨酸、酪氨酸和苯 丙氨酸的存在，使其具有内源荧光) ，借助荧光猝灭法可以测得有机小分子与 蛋白质的结合常数k 及结合位点数n ，依据f 6 s t c r 能量转移理论可求出给体- 受 体间的结合距离r 及能量转移效率e 等参数 1 研究内容与方法 1 1 结合常数及结合位数的测定 1 i 1s c a t c h d r d 方程l s c a l c h d r d 等【3 】将小分子配体与大分子结合看作是小分子配体与大分子特 定部位的结合，在此基础上推导了溶液平衡处理的经典理论公式即s c 砒c h d r d 方程，其具体形式为： r | c f = 暇一r x ( 1 ) 式中r 为每个蛋白质分子键合的药物分子的个数，劬游离药物的浓度，n 为结 合位点数，k 为结合常数以r c 对r 作图，可得到n 、k 的值。若反应存在多 种结合位，上式变为； ，= 啊局q ( 1 + 墨c ，) ( 2 ) 通过非线性拟合，可计算珥、k ，n i 、磁分别表示结合位数和第i 位的结合常 山东大学硕士学位论文 数。该方法在应用时须知道反应体系中游离态药物的浓度，这一点用荧光法测 定时常不易做到，而且s c a t c h a r d 作图法所得结果往往不理想，因此，在研究药物 分子与蛋白质的结合反应中，s c a t c h a r d 作图法应用不多。张保林等【4 】曾用此法 研究了葸醌及黄酮类化合物与人血清白蛋白的结合反应。 1 1 2s t e m j v 0 i m e r 方程与l i n 哪e a v e r - b u r l 诹倒数方程 蛋白质与有机小分子发生作用时，可引起蛋白质内源荧光的猝灭，根据猝 灭机理不同，将有机小分子对蛋白质荧光的猝灭分为动态猝灭和静态猝灭。动 态猝灭是药物和蛋白质激发态分子之间的相互作用而导致的荧光猝灭，遵循 s t e m j v o l n l e r 方程【5 】： 届f = l + 丘f o 【q 】= l + b 【q 】 ( 3 ) 式中而为未加猝灭剂时蛋白质的荧光强庞朦示加入猝灭剂浓度为【q 】时蛋白 质的荧光强度，髓v 称为猝灭常数。 静态猝灭是药物和蛋白质在基态时生成复合物，从而导致蛋白质荧光强度 降低。对于l ：1 结合的情况，可推导出公式： r ，= l + k 【q 】 ( 4 ) 式中足为复合物的稳定常数，【q 】为游离药物分子的浓度。根据此式作f 0 ，f - q 】 图，可由回归直线斜率求得k 值。 另外，还可以利用式( 4 ) 变形为双倒数公式【6 】，即l i n e w e a v e r b u r k 双倒数 方程： 1 ，( 昂一f ) = l ，r + l ( 矗k q 】) ( 5 ) 对于多结合位点的情况，张勇【7 】等提出了一个求取结合位点数的线性回 归公式： l g ( ( r 一乃，f ) = 1 9 足+ 一l g 【q 】 ( 6 ) 1 2 作用力类型的确定 有机小分子与蛋白质间的作用力属于分子间的弱相互作用，包括氢键、范 德华力、静电引力和疏水力。从热力学观点看，在一定的温度和压力下，有机 小分子与蛋白质的结合反应能否自发进行取决于体系的g 。g o ，有利于结 合反应的自发进行。d p r d s s 等 8 】根据大量的实验结果，总结出了判断生物大 4 山东大学硕士学位论文 分子与小分子结合力性质和热力学规律，即根据反应前后热力学焓变h 和熵 变s 的相对大小，可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型。计算公式如 下： l n ( ) = ( 1 五帆) ( 7 ) g = a 日一脚= 一矗丁l n x ( 8 ) g 为吉布斯自由能变，h 为焓变，s 为熵变，k l 、k 2 为不同温度t l 、t 2 下的 结合常数。 1 3 f 6 r s t e r 能量转移理论计算 当一个分子的发射光谱和另一分子的吸收光谱相重叠时，通过分子间偶极 偶极的共振偶合可使能量从给体转移到受体。f 6 r s 衙能量转移理论【9 ，lo 】己发 展成为测定给体受体之间距离的光谱尺。由于蛋白质的内源荧光主要是色氨 酸残基产生的，因此利用f 6 r s t e r 能量转移理论可以计算出有机小分子在蛋白质 上的结合部位与色氨酸残基之间的距离r ，该理论已被广泛用于药物与蛋白质 相互作用的研究。给体与受体能量转移效率为： e = 蜀，( 凡6 + ，) ( 9 ) 式中舶是e = 5 0 时的临界距离。r o 与下列因素有关： 岛6 = 8 8 1 0 趔k 2 一t ， ( 1 0 ) 式中足2 为偶极空间取向因子，为介质的折光指数，为给体的荧光量子产 率，j 为给体荧光发射光谱与受体吸收光谱间的光谱重叠积分，可表示为： ，= f ( a 弦( 旯) 厶a ，f ( 五) 五 ( 1 1 ) 其中，( 五) 为给体在波长九处的荧光强度，占( 五) 则为受体在波长九处的摩尔 吸光系数，能量转移效率可按下式确定： e = l f e ( 1 2 ) 显然，只要得到e ，k 2 和n 并通过实测光谱求出积分j ，就可算出和r o 2 主要研究结果 国外对有机小分子与蛋白结合作用研究较早，国内化学工作者在这方面的 山东大学硕士学位论文 研究也有十几年的历史。目前报道的与蛋白相互作用的有机小分子主要包括药 物和农药。 2 1 药物 研究药物与蛋白质之间的相互作用，有助于了解药物在体内的运输和分布 的情况，对于阐明药物的作用机制、药代动力学以及药物的毒性都有非常重要 的意义。根据药效可将药物分为抗菌素类药、镇痛药、抗癌药和治疗心血管药 物等。表1 总结了近年来在这些方面的主要研究结果。 表1 药物与血清白蛋白结合反应的荧光法研究结果 抗 菌 消 炎 药 镇 痛 药 抗 癌 类 药 物 氟哌酸 毗碾酸 氟罗沙星 司帕沙星 巴马亭 环丙沙星 盐酸环丙沙 星 诺氟沙星 氧氟沙星 灰黄素 依诺沙星 利福平 m o n n 水杨酸 酮咯酸 菲普拉宗 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 静态 甲芬那酸静态 乙酰水杨酸 静态 阿霉素静态 5 氟尿嘧啶静态 丝裂霉素 静态 丝裂霉素c 静态 g e m c i t a b i n e 静态 4 0 2 2 9 2 4 3 7 2 4 4 2 1 0 2 4 6 2 “ 1 7 8 1 0 ( h s a )l 8 0 2 1 0 ( h s a )1 5 4 4 1 0 ( b s a ) 4 4 l x l o ( b s a )0 7 9 3 4 5 8 1 0 ( b s a ) & 3 9 1 0 ( b s a )l 2 0 8 l o ( h s a ) 静电力 静电力 静电力 疏水力 疏水力 i l 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 3 1 l1 7 5 x l 旷( b s a )l静电力1 7 3 1 76 4 9 l o ( b s a )l范德华力 1 7 2 1 56 0 4 1 0 4 ( b s a )氢键和范德华力1 8 4 7 41 7 3 1 0 3 ( b s a )o 7 4氢键和范德华力 1 9 2 5 75 1 5 l o ( h s a ) 2 0 i 3 6 x l o ( h s a )l 2 l 2 0 0 x 1 0 3 ( h s a )i2 2 5 6 77 3 7 7 l 矿( b s a ) l2 3 2 8 72 2 7 x l o ( h s a )1静电力 2 4 5 6 l 2 3 8 1 0 5 ( h s a )1 静电力 2 4 5 3 53 2 4 x l 旷( b s a )l 1 9 l1 9 5 1 0 ( b s a ) 0 9 8 72 5 1 3 5 x 1 0 3 ( b s a )0 8 7静电力 2 6 2 3 3 l o ( b s a ) l 疏水力 2 7 8 0 8 1 0 4 ( h s a )l范德华力 4 9 5 x j 矿( b s a )l疏水力 2 8 4 3 8 1 0 3 ( h s a )l 3 7 61 8 9 10 l ( b s a )1疏水力7 4 2 41 6 4 l o ( h s a ) 3 0 85 9 5 6 1 0 ( b s a ) 2 0 6 7疏水力 2 9 2 1 32 8 l 1 0 ( b s a )1 1氢键和范德华 3 0 6 山东大学硕士学位论文 2 2 农药 农药是防治农林花卉作物病、虫、鼠、草和其他有害生物的化学制剂，使 用极为广泛农药的使用，一方面造福于人类，另二- 方面也给人类赖依生存的环 境带来危害据文献报道，农药利用率一般为l o ，约9 0 的残留在环境中，造 成对环境的污染大量散失的农药挥发到空气中，流入水体中，沉降聚集在土壤 中，污染农畜渔果产品，并通过食物链的富集作用转移到人体，对人体产生危害。 因此研究农药与蛋白质的相互作用，对于明确其在动物或人体内的代谢过程、 中毒机制及指导中毒急救、解毒等方面具有重要意义目前此方面的研究报道 较少 李少旦等【4 4 】通过农药中间体2 ，4 二氯苯酚与人血清白蛋白结合反应的光 谱学特征，探讨了2 ，4 - 二氯苯酚与人血清白蛋白的结合反应机制。荧光静态猝灭 山东大学硕士学位论文 常数舾f 3 7 1 3 l o 3 l m o l 一s - 1 ，结合常数为2 7 4 3 1 0 6 l m o r l ，结合位点数为n 1 ； 2 ，4 - 二氯苯酚对人血清白蛋白内源荧光的猝灭机制，主要是通过疏水作用力，形 成了无荧光特征的复合物引起的静态荧光猝灭。 颜承农等【4 5 】在模拟动物体生理条件下，研究了在不同温度下除草剂百草 枯( p q ) 与牛血清白蛋白结合反应的光谱行为。实验发现，p q 对b s a 有较强的荧 光猝灭作用。两者间发生反应生成了新的复合物，不同温度下反应时复合物的 形成常数k 在2 9 7 k 、3 0 4 k 和3 1 1 k 时分别为2 0 3 5 1 0 4l m o l - l 、3 2 5 6 1 0 4l m o - 1 和2 8 8 9 1 0 4 l m 0 1 1 ；根据f 6 r s t e r 非辐射能量转移理论计算出结合位置距离 2 1 2 位色氨酸残基2 0 7 姗；作用力类型以疏水力为主。z h a n g0 如d l e n g 等【4 6 】 研究了百草枯与人血清白蛋白的相互作用。研究发现百草枯能够通过静态猝灭 机制和非辐射能量转移对h s a 的荧光有较强猝灭作用。两者间形成新的复合 物，结合常数和结合位点数分别为4 8 5 3 1 0 4l m o r l 和1 0 2 1 ，结合位置距离2 1 4 位色氨酸残基3 5 4 咖，疏水力和静电力为主要作用力类型。 童金强等【4 7 】应用荧光光谱技术研究了农药除草剂二氯喹啉酸与牛血清 白蛋白的结合反应的热力学特征研究结果表明：二氯喹啉酸对牛血清白蛋白有 较强的荧光猝灭作用，且符合静态猝灭机理。两者间的结合常数2 4 时为 2 3 4 5 1 0 2 m o l l - 1 ，3 2 时为5 0 7 l 1 0 2 m o 卜l 1 d i l s o n s i l v a 等【4 8 】研究了杀虫剂甲基对硫磷与h s a 和b s a 的相互作用，结 果表明甲基对硫磷对h s a 的猝灭过程为静态猝灭，而对b s a 为动静态过程同时 存在：2 5 时，与h s a 和b s a 的结合常数分别为3 0 7 1 0 4 l m o i - 1 和 1 9 6 x 1 0 4 l m o l - i ，3 7 时分别为1 0 8 1 0 4 l m o i - 1 和8 1 6 1 0 3 l m o l 稻丰散( p h e n t h o a f c ) 为二硫代磷酸酯类杀虫杀螨荆，x uc h a o 等 4 9 】研究 了它与b s a 问的相互作用，结果表明稻丰散对b s a 的荧光强度有较强的猝灭作 用，其猝灭过程为静态猝灭，两者间形成复合物，其主要作用力类型为静电力。 另外，除了常用的荧光分析方法，近年来还涌现了一些新的基于荧光光谱 的新方法，如同步荧光光谱法通过使激发波长和入射波长保持固定的波长间 距，同步扫描激发和发射单色器，可得到同步荧光光谱与普通的荧光技术相 比，同步荧光光谱技术有许多优点，例如，m i l l 盯【5 0 】用同步荧光技术分别测 得1 b 和1 如的特征光谱，而在普通的荧光光谱中，由于二者的激发和发射光谱 山东大学硕士学位论文 互相重叠，因而无法获得。另外，根据发射光谱中波长的改变可判断蛋白质构 象的改变 5 0 5 1 】。 二、紫外可见光谱法 血清白蛋白能够吸收紫外光，一般2 1 0 锄左右的峰是肽键的强吸收 峰，2 8 0 n m 处的峰为芳香氨基酸残基的吸收峰。血清白蛋白在2 8 0 啪的