（生物化学与分子生物学专业论文）拟南芥g蛋白信号转导调节蛋白（atrgs1蛋白）的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究.pdf

顾杰：a t r g s l 蛋白的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究 5 缩略语 a b a 曲口3 口6 f 髓 c 0 1 o d d r t p c r g 姆s g d p g f p g p a l g p c r g p r o t e i n g t p 髓a l - 4 g c 【 g p g p y n a g 3 5 s ：r g 熨 r g s r 铲j 一2 u g t s 英文全称 a b s c i s i ca c i d 中英文对照词 a d p r i b o s y l a t i o nf a c t o r c 0 1 u 】 1 1 b i a d i f f e r e n td i s p l a yr e v e r s e 缸a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s ec 1 1 a i l lr e a c t i o n g t p a s e a c c e l e r a t i o np r o t e i n s g l i a n o s i n ed i p h o s p h a t en u c l e o t i d e g r e e nn u r e s c e n c ep r o t e i i l 0 ls u b u i l i to f g p r o t e i i l g p r o t e i nc o u p l e dr e c e p t i 泔 h e t e r o t r i m e r i cg t p b i l l d i n gp r o t e i l l s g u a n i n et r i p h o s p h a t ei n l c l e o t i d e 仅s u b u i l i t o f g p r o t e i l l ds u b u l l i t o f g p r o t e i i l 所c o m p l e xo fgp r o t e i n n - a c e t ) ，l - d - g h j c o s a m i n e r e g u l a t o ro fgp r o t e ms i g n a j i n g 叭d i l l ed i p h o s p h a t eg l y c o s y l 位u 1 s f e r a s e s 中文名称 脱落酸 a b a 合成突变体 a b a 响应不敏感突变体 a d p 核糖基化因子 拟南芥哥伦比亚野生型 差异显示反转录聚合酶链 反应 促进g ，r p 水解酶活性的蛋 白 鸟嘌呤二磷酸核苷 绿色荧光蛋白 g 蛋白0 【亚基 g 蛋白偶联受体 g 蛋白 鸟嘌呤三磷酸核苷 g p a l 突变体 g 蛋白0 【亚基 g 蛋白d 亚基 g 蛋白阶亚基二聚体 n 乙酰葡糖胺 过表达尺斛基因 g 蛋白信号转导调节蛋白 i s l 缺失突变体 尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转 移酶 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 7 i 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研究成果。除 文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果。对本文的 研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：夕斑友 签字日期：矽孵否月f 7 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部 门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。本人授权扬州大学可 以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国 学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：歹迩疲 签字日期：彻萨名月f 日 导师签名： 签字日期：年月日 顾杰：a t r g s l 蛋白的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究 拟南芥g 蛋白信号转导调节蛋白( a t r g s1 蛋白) 的定位 及在葡萄糖信号转导中的功能研究 研究生：顾杰 导师：梁建生教授 摘要 本研究以拟南芥野生型c 0 1 o 、突变体强，7 2 、印口j 4 、口6 邪和动f j 、过表达3 5 s ：r g 研 为材料，通过转基因细胞系构建、差异显示分析和双突变体构建分析等技术，用分子生物学、 生物化学、分子遗传学等方法研究了a c r g s l 蛋白在拟南芥葡萄糖信号转导途径中的作用。 取得了以下主要研究结果： l 、建立了拟南芥悬浮培养细胞体系，并对a t r g s l 蛋白及相关结构域进行了细胞定位 根据a 依g s l 蛋白的特有结构，将编码a t r g s l 的两个结构域分别进行克隆表达，结合 i s 1 g f p 融合蛋白表达技术证明：a 依g s l 蛋白定位于细胞膜，a t r g s l - n 端结构域和 a t r g s l c 端结构域分别定位于质膜和细胞核。d 葡萄糖和a b a 处理可以改变a 依g s l 全蛋 白的亚细胞定位，而a t i s 1 _ n 端结构域定位未发生改变。 2 、筛选了a t r g s l 蛋白介导的葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因 以拟南芥野生型c 0 1 o 和突变体，：秽j ，o 为材料，运用差异显示技术筛选a t r g s l 蛋白介导的 葡萄糖信号转导途径中特异表达的基因。经反向n o m l e m 验证，得到四个差异表达蛋白，分 别是拟南芥u d p 葡萄糖苷转移酶( u g t s ) 、拟南芥y 谷氨酰水解酶、拟南芥苏氨酸内切酶、 拟南芥a d p 核糖基化因子( 触江) 。它们很可能是a 吸g s l 蛋白介导的葡萄糖信号转导途径 中重要的作用因子。其中a d p 核糖基化因子( a r f ) 可能和a 侃g s l c 端结构域具有相互作 用，参与了a 吸g s l c 端结构域的迁移，而且可能将处于游离状态的a c r g s l 的c 端结构域通 过胞内运输转运至细胞膜，使其和跨膜结构域重新融合。u d p 葡萄糖苷转移酶( u g t s ) 是催 化拟南芥内源脱落酸( a b a ) 糖基化的一种酶，在外源高浓度葡萄糖处理后，其表达量降低， 这就表明，外源高浓度葡萄糖处理导致内源a b a 分解的速度降低，从而促进a b a 抑制的种子 萌发。而且，u d p 葡萄糖苷转移酶很可能是埘 - g s l 介导的葡萄糖信号转导途径中下游的效应 分子。 3 、明确了拟南芥种子萌发对葡萄糖信号响应过程中a c r g s1 的作用及其与a b a 的关系 2 扬州大学硕士论文 ( 1 ) 以拟南芥野生型c 0 1 o 为遗传背景的突变体为材料，研究了a t i 沿s1 蛋白在葡萄糖 介导的种子萌发过程中的作用。结果显示，与c o l 相比，a t r g s l 过表达的3 5 s ：r g 研和g c 【 缺失突变体g 阳j 4 的种子萌发对d 葡萄糖的抑制作用表现为超敏感，而a t r g s l 缺失突变 体曙s j 2 表现为低敏感。3 5 s ：r g s j 、曙，j 2 和c 0 1 0 种子萌发对葡萄糖类似物甘露糖的响应 无明显差异。己糖激酶抑制剂n a g 处理对葡萄糖抑制种子萌发的效应不明显，但显著降低 了甘露糖对种子萌发的抑制作用。表明在种子萌发过程中，a s 1 参与的葡萄糖信号转导 途径是一特殊途径，且该途径不依赖于己糖激酶。 ( 2 ) 以a t r g s l 缺失突变体喝，j _ 2 、a b a 合成突变体口6 刃、a b a 响应不敏感突变体 动f j 和双突变体口6 刃f 笋j 2 、动f 缮f j 2 ，以及野生型c 0 1 0 为材料，研究了葡萄糖介导的拟 南芥种子萌发过程中a t r g s l 与a b a 3 和a b l l 的相互关系。结果表明：双突变体口6 刃曙，一2 表现出比单突变体对高浓度葡萄糖的抑制作用更加不敏感。说明a t r g s l 和a b a 3 都参与了 拟南芥种子萌发过程的葡萄糖信号的转导。双突变体动f j 曙f j 一2 表现出和单突变体爝f ，- 2 相 似的对高浓度葡萄糖的抑制作用不敏感，而单突变体口6 f j 和野生型c o l 均表现为敏感。说明 在a t r g s l 所介导的葡萄糖信号转导途径中，a 依g s l 在a b l l 的上游发挥作用。 关键词：拟南芥，心s 1 蛋白，脱落酸，葡萄糖，突变体，差异显示，转基因 顾杰：a c r g s l 蛋白的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究 l o c a l 娩a t i o no f r e g u l a t o r o fg p r o t e i ns i g n a l i n g ( r g s ) p r o t e i na n di t sf u n c t i o n a la n a l y s e si ng l u c o s es i g n a l i n gi n a r n b i d 6 i p s i st h n t i a n n p o s t g r a d u a t e ：j i eg u s u p e r v i s o r ：p 1 0 f j i a n s h e n gl i a n g a b s t ra c t n e r e g u l a t o ro fg p r o t e i ns i g n a l i l l g ( r g s ) p r o t e i l l ，r e c e n 廿yi d e n t i f i e di n4 ，d 6 f 如筘打历日托加 ( n 姗e da sa t i 硷s 1 ) 1 1 a sap r e d i c t e ds e v e n - 订a n s m e m b r 锄e 咖c t u r ea sw e l la sa r g sb o x 、v i t l l g t p a s e - a c c e l e r 撕n ga c t i v i 哆a n dm i l sd e s e n s i t i z e sm eg - p r o t e m m e d i a t e ds i g t l a l i n g t h er 0 1 e so f a t r g slp r o t e i ni 1 1g l u c o s es i g n a l i n go fs e e dg e n n i n a t i o n 、v e r ei n v e s d 眦di n 也ep r e s 蹦ts t u d y ， u s i n gs e e d sm a tc a r i ya 肌um u t a t i o ni nm eg e n c se n c o d i n gr g sp r o t e i l l ( a 氓g s l ) ，血ea l p l l a s u b u 血( g p a l ) o fm egp r o t e i n ，s e 由e 吐1 r e o 血ep h o s p h a t a s ea j l dm o l y b d e n 啪c o f a c t o rs u l 如部e 主1 14 砌珧掣括，n a m e d ，黟? 一2 ，拶o 4 ，口6 f 7a n d 刃，r c s p e c t i v e l y ，、v i t hd i 恐r e n ta p p r o a c h e ss u c h a sg e n e t i c s ，b i o c h c m i s t r ya i l dm o l e c l l l a rb i o l o g y t h em a j nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： n e3 5 s ：月6 刚o v e 陀x p f e s s i 鲫s y s t e mw a sc 衄s 仃u c t e db yt o p oc l o m n g 1 kt 渤s g e l l i c s u s p e 商o nc e l lc u l t u r e 舶mc o lw a sc o n s t n l c t e d p r o t e i l ll o c a l i z a t i 伽a 1 1 a l y s i su s i n gr g s l 一g f p 舡i o np r o t e i 工lt e c m q u es h o w e dm a t ，m er g s lp r o t e i nw a sl o c a l i z e di l lp l a s n l am e m b 姗e ，a n d 血e n - t e r m i l l a ld o m a i n ( 7t md o m a i 工1 ) a r l dc t e m l i n a ld o m a i n g sb o x ) o f a t r g s lw e r e1 0 c a l i z e di n p l a s m am e m b r a l l ea n dn u c l e 鸪r e s p e c t i v e l y ，w m c h 、a sc o n s i s t e n t 谢mt h cp r e d i c a o e d1 0 c a l i 蒯o n 埘l hs o 脚a r e ( 删ms 踟v 2 0 ，h t l p ： w r c b s d t u 删s e r v i c e 卵m h m m ) w e 缸t h e ri n v e s t i g a t e dt l l ee x p r e s s i o no fs p e c i f i cg e n e sr e s p o n d i l l gt o9 1 u c o s e 仃e a 衄e n tu s i l l ga d i 仃e r c n h a ld i s p l a yr e v e r s et 眦l s c r i p t i o np c r ( d d r t p c r ) a p p r o a c h ，i t lc o m b i n a t i o n 、v i t l lr e v e r s e n o m i c mb i o 砸n g f o l l rd i 蔬r e n te x p r e s s i 工1 9g e n e sw e r ei d e n i & db e t w e e nc o l oa 喇硌，j - 2 ， i n c l u d i n ga d p r i b o s y l a t i o nf a c t o r ， u r i d i i l e d i p h o s p h a t eg l y c o s y l仃a n s f e r a s e s ，t i 职o n i n e e n d o p e 幽d a s ea n dg 猢a _ g l u t a m y lh y d r o l a s e nw a ss u g g e s t e dm a tm e s ef o u rg e l l e s e n c o d e d p r o t e i i l sm a yp a l yi r n p 咖tr o l e s 抽g l u c o s es i g n a l i n ga n d t h e i rp o s s i b l em l e sw e r ea l s od i s c u s s e d t h er o l e so fa 汛g s lm 舀u c o s e m e d i a t e ds e e dg e m l i i l a t i o nw e r ea 1 1 蛔db yc o m p a r i n gm e 4 扬州大学硕士论文 d i 侬r e n tr e s p o n s e so fs e e dg e m l i n a t i o no fc o l - oa 1 1 d 曙，j - 2 鲫l 切i 】tt og l u c o s ea i l dm ee 疵c t so f g l u c o s ea i l a l o ga n das p e c i f i ch x ki i “b i t o r ，- a c e 锣l g l u c o s 锄i n e ( n a g ) 1 kr e s u l t ss h o w e d 让l a t ， i nc o 删t o 谢l dt y p ec 0 1 0 ，侈，j - 2s e e dg e 肌m a t i o n 、v a si i l s e n s i t i v et o9 1 u c o s e ，w b i l em o s eo f g 矽j 一4a n d3 5 s ：r g 钳、v e r eh y p e r s e n s i t i v et og l u c o s e t h eg e 册j i 】a t i o no fc 0 1 o ，3 5 s ：r g 卯a n d 馏s j 一2m u t a n ts e e d ss h o 、v e dt h es 锄er e s p o n s e st om a i 1 0 s e n l ei r l l l i b i t i o no f s e e dg e n n i n a t i o nb y g l u c o s e 仃e a t n l e n tw e r en o to b v i o u s l ya 仃e c t e d b yn a g ，b u ts i g i l i f i c 枷l ya l l e v i a t e dm ei 1 1 l l i b i 恤g e 虢c to fm a i m o s eo ns e e dg e n l l i i l a t i o n t h e s ed a t as u g g e s t e dt h a ta 吸g s1 p r o t e i nm o s tl 诙e l y f - u n c t i o n si 1 1a 1 1m 一i n d 印e n d e n tg l u c o s es i g l l a l m gi 1 1 加a b i d o p s i ss e e dg e 衄i n a t i o n n l er e l a t i o i l s h i p sb e t w e e na t r g s1 、) l ，i t ha b a 3a i l da b i1i 1 1g l u c o s es i 朗a l i l l gw e r ea l s o i n v e s t i g a t e du s i 工l gv 越o u ss h 培l ea 1 1 dd o u b l em 吡m t s ，i h es e e dg e r i i l i r l a t i o no f 口6 口3 拶r j 2d o u b l e m 删w a s1 e s ss e n s i t i v et o1 1 i g hc o n c e 删o ng l u c o s e ，a sc o n 叩a r e d 而t hm o s eo fs i l l g l em l l t a i l t ， ，翟丐j 一2 砒1 d 口6 刃，w h i c hi m p l y i n gt 1 1 a tt 1 1 eh y p o s e n s i t i v i t ) ro f ，g 苫j 一2m u t a n ts e e dg e 姗i n a t i o nt o e x o g e n o u sg l u c o s em i g h tb et h er e s u l t so f l ei i l l p a i m l e n to fa b ab i o s ) ，1 1 t h e s i sa 1 1 dt ：h e1 1 0 n n a l d e 伊a d a t i o no fe n d o g e n o u sa b ad u r i n gs e e dg e n i l i n a t i o n t h es e e dg e r n l i n 矾o no f 动f j 舢l 切n t w a sh y p e r s e n s i t i v et ol l i g hc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s e ，a n dm a to f 口6 f j t 笋，一2d o u b l em l l 切n tw a s i r l s e n s i t i v et og l u c o s e ，i 1 1 d i c a t i l l gt h a tt h em l l l 么垤s ja 1 1 e l ei s 印i s t a t i ct ot h en u h 口6 f ja l l e l ei n g l u c o s es i 印a l i n g 蔓哂，w o r d s ：么朋6 溉猡西，a t r g s 1 p r o t e 妣a b a ，g l u c o s e ，m 此m t ，d d r t p c r a n s g e l l i c s u s p e n s i o nc e u 6 扬州大学硕士论文 第一章文献综述弟一早义l 颚三示硷 摘要：由异三聚体g 蛋白( h e t e r o t r i m 砸cgp r o t e i n s ) 介导的信号转导途径( s i 印a l 的n s d u c t i o n p a t h 、v a y ) 是拟南芥识别、感知、转导外界刺激信号众多途径中最重要的途径之一。而拟南芥 g 蛋白信号转导调节蛋白( r e g u l a t o ro fgp r o t e i l ls i g m l i n gp r o t e i l li i l 么m 6 渤哪西，加，f ( 聊口， a t r g s l ) 在g 蛋白介导的信号转导途径中起着十分重要的作用。本文主要介绍了a c r g s l 蛋白在g 蛋白介导的信号转导途径中的作用机制，以及该蛋白在葡萄糖信号转导途径中的作 用。 关键词：拟南芥，g 蛋白，g 蛋白信号转导调节蛋白，信号转导，葡萄糖 无论是动物还是植物，在其生命周期中常受到外界环境的各种刺激( s t i i n u l i ) 。经过长 期的进化，生物体通过某种( 些) 机制将这些胞外刺激转换为胞内信号，并通过胞内一系列 信号转导过程，最终引起生理生化响应( r e s p o n s e s ) ，以适应这些环境胁迫条件。尽管在生 物体内负责识别、感知、转导外界刺激信号的途径很多，但由异三聚体g 蛋白( h e t e 萤d t r i m e r i c g p r o t e i l l s )( 以下简称g 蛋白) 介导的信号转导途径( s i g n a l 衄1 s d u c t i o np a m 坝l y ) 是真核 生物细胞内最重要、也是最为保守的途径之一，已成为当今信号转导研究最为活跃、取得进 展最快的领域之一。 1 动物细胞中g 蛋白介导的信号转导途径 g 蛋白是指能与鸟嘌呤三磷酸核苷( g t p ) 结合，具有水解g t p 酶活性，广泛存在于真 核生物细胞中的一类蛋白。它由a 亚基( g 仅) 、p 亚基( g p ) 、丫亚基( 研) 组成，三个亚 基聚合形成异三聚体。g 蛋白o c 亚基既可以和g d p 结合，也可以与g t p 结合，当与g d p 结合时，g 嘎处于非活化态( 基态) 。g 蛋白介导的细胞信号转导是真核生物细胞信号转导机 制中最为保守的信号转导途径之一，它将胞外信号转换为胞内信号，并传递给下游的效应分 子( e 虢c t o r s ) ，进而调节细胞的生长和发育等过程。典型的g 蛋白介导的信号转导途径模 式如图l 所示。当位于细胞质膜上的g 蛋白偶联受体g p c r ( gp r o t e h 卜c o u p l e dr e c e p t i d r ) 与 其特异性配体( 1 i g a n d ) 结合后，其构象发生变化，诱导g t p 替换与g 0 【结合的g d p ，使g c 【 亚基被活化，同时异三聚体g 蛋白的a 亚基与p 1 ，亚基解离( p 亚基和丫亚基常以二聚体形式 存在) ，活化态的g c ( g t p ) 和g p 丫分别与下游各自的效应分子相互作用，并通过一系列信 号传导过程最终引发胞内相关基因的表达和生理生化响应( t e m p l ea n dj o n e s ，2 0 0 7 ) 。当g 幔 亚基利用自身的g t p 水解酶活性催化g t p 水解为g d p 时，使g o 【( g d p ) 与效应物解离， 并重新结合g 叶形成异三聚体形式，g 蛋白又回到基态。因此，g 蛋白介导的信号途径的组 成成分包括g 蛋白偶联受体( g p c r ) 、g 蛋白、效应分子( 蛋白) 及其它调节蛋白等。 g p c r 位于细胞质膜上，具有典型的7 次跨膜( s e v e nt r a l i l s m e m b 姗e ) 结构域以及胞外 顾杰：a 艰g s l 蛋白的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究 7 氨基酸末端和胞内结构域，胞内结构域与g 蛋白的a 亚基偶联影响其活化状态。g p c r 具有 催化鸟苷酸交换因子( g u a l l i i 圮e x c h a n g e 鼠炳“g e f ) 的活性，可以促进a 亚基由基态向活 化态的转化。g 旺亚基分子中含有类似g 蛋白信号转导调节蛋白( r e g i l l a 细o fgp r o t e i n s i 印a l i n gp r 陕妇，r g s l 蛋白) 的结构域，该结构域具有g d 脚结合位点和加速g t p 酶 水解的蛋白( g 1 p a s e a c c e l 州c i i l gp r o t e i l l ，g a p ) 的活性，从而促进向基态的转化。 l e c t o f s 图1 g 蛋白介导的信号转导模式图 ( t e m p l e 锄dj 0 n e s ，2 0 0 7 ，a n n u a lr e v i e wi 1 1p l a l l tb i o l o 彰5 8 ：2 4 9 - 2 6 6 ) 迄今为止，在哺乳动物和酵母细胞中至少鉴定到约9 5 0 种g p c r ；1 7 个编码仇的基因，包 括2 3 个g a 亚基：5 个g p 基因以及至少1 2 个嘶基因。因此，理论上讲哺乳动物细胞内有一千多 种g 蛋白。根据功能和序列的差异，m 亚基又可以分为4 个亚家族，即g 啦、g 0 c s 、g 和g a l 2 ，1 3 ， 每个亚家族作用于特定的效应分子。g 阱作用的下游效应分子的数目还在增加，包括磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) ，磷脂酶( p h o s p h o u p a s e a 2 ，p l 墟) ，c a 2 + 和k + 通道以及c 衄酶的 异构体等。 2 植物中g 蛋白介导的信号转导途径 与哺乳动物相比，对高等植物g 蛋白介导的信号转导机制的研究进展尚相对缓慢。已经 鉴定到的g 沪c r 和g 蛋白的种类也相当有限。在模式植物拟南芥中大约有2 0 3 0 种与g p c r 具有类似结构的蛋白。另外，在拟南芥和水稻等植物中只鉴定到编码g a 亚基( g p l a l ) 的单 拷贝基因g 拗( m a 订以，1 9 9 0 ) 或尺g h j ( i s b i k a w a 甜以，1 9 9 5 ) 、编码g b 亚基( a g b l ) 的单拷贝基因彳g 曰j 或r g 曰j ( i s h i k a w a 甜以，1 9 9 6 ；w e i s s 甜口f ，1 9 9 4 ) 和编码g i 吖亚基( a g g ) 的2 个基因彳g g j 或r g g j 和4 g g 2 或r g g 2 ( k a t o 酣以，2 0 0 4 ：m a s 0 n 甜以，2 0 0 0 ，2 0 0 1 ) 。 理论上讲，在模式植物拟南芥和水稻细胞中最多存在2 种可能的g 蛋白，即g p 丫1 和m 所2 。 而且，只有一种和哺乳动物( 澄c r 结构相似的蛋白( 称为g c r l ) 被比较详细研究过。该蛋 白具有7 次跨膜结构，与盘基网柄菌( d 妞m 吡砌肌如娩? 删) 的腺苷酸环化酶受体( r c ：c e p 衄 o fc 舢胛，c a r l ) 有2 0 相似性( j o s e f s s 0 na n d 胁k ，1 9 9 7 ；k a n 即l k a 甜以，2 0 0 1 ： 扬州大学硕士论文 p l a l ( i d o u - d y l n o c k 甜以，1 9 9 8 ) ，与g c 【亚基( g p a l ) 具有相互作用( p a l l d e y 觚da s s m a n n ， 2 0 0 4 ) ，但目前还没有鉴定到g c r l 的配体。最近，l i u 等鉴定到一种新g p c r ( g c r 2 ) ，该 蛋白与m 共同作用调控已知的a b a 参与的众多响应过程，并且可与a b a 特异性结合( l i u 况，2 0 0 7 ) 。与哺乳动物相比，植物细胞g 蛋白介导的信号转导途径组分要简单的多。而 且，已经鉴定到的g 蛋白信号转导途径的下游效应分子也很少( j o n e s 甜以，2 0 0 4 ) 。尽管如 此，高等植物细胞g 蛋白介导的信号转导机制与哺乳动物有很多相似的地方( j o n e sa n d a s s m a i l l l ，2 0 0 4 ；k a t o 甜a 正，2 0 0 4 ：u 1 1 a h 甜a 正，2 0 0 3 ) 。 3 g 蛋白信号转导调节蛋白( r e g u l a t o ro f g p r o t e i ns i g n a l i n g ，i s ) 从图1 可以看到，g 蛋白控制的信号转导途径持续时间的长短在很大程度上取决于g a 亚基 处于g ，r p 结合状态的寿命( d o h h l l a i la n dt 1 1 0 m e r ，2 0 0 1 ) 。g 0 【亚基自身的g t p 水解酶活性可以 促使活化态g 0 【亚基回到基态，从而使信号传递终止，并进入下一轮信号转导周期。然而，与 体内研究结果相比，体外g a 亚基g t p 水解酶活性不足以解释生理条件下g 蛋白介导的信号转 导终止的速度，说明在生理条件下细胞内可能存在某种( 些) 调节因子( 蛋白) ，可以加速活 化态g 0 【亚基回到基态。1 9 9 6 年，有3 个研究小组几乎同时鉴定到哺乳动物中存在一种新的g 0 【 亚基的g t p 水解酶加速蛋白家族r g s 蛋白家族( d r u e y 甜以，1 9 9 6 ；k o e l l ea n dh o r v 娩， 1 9 9 6 ；s i d e r o v s 虹甜以，1 9 9 6 ) 。每一个r g s 蛋白包含一个约1 2 0 个氨基酸的r g s 结构域。由于 它具有加快g t p 水解的酶活性，所以i s 蛋白被认为是异三聚体g 蛋白信号转导途径的主要 脱敏因子。r g s 蛋白的发现不仅可以解释体内和体外g 蛋白信号转导周期的时间差异，也揭 示了g 0 c 亚基可能存在独立于g p c r 的细胞过程的调节功能。 3 1i s 蛋白家族及其结构 3 1 1r g s 蛋白家族 到目前为止，在哺乳动物细胞r g s 家族中已鉴定到2 0 多种r g s 蛋白，这2 0 多种r g s 蛋白进一步分为9 个亚家族( x i ea n d p a l m e r ，2 0 0 7 ) 。最新的研究表明，一种特异r g s 蛋白 可以调节几种不同类型的g 蛋白、受体、离子通道等。同样，多种r g s 蛋白可以调节一种 类型g 蛋白、受体、离子通道等。然而，r g s 的调节作用具有高度的选择性和特异性，行使 这种选择性和特异性的分子和细胞机制很复杂，可在不同层次进行，包括r g s 蛋白的表达和 其作用的目的分子的时空特异性、由其特定结构域和功能域所决定的蛋白质蛋白质相互作用 等( ) ( i ea 1 1 dp a l n l e r ，2 0 0 7 ) 。 顾杰：a t r g s l 蛋白的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究 9 t 曲l e1 c l a s s i f i c a t i o no f r g sp r o t e ms u b f a m i l i e sa n dm e i rs t m c t u r a l 凳a t u r e s ( x i ea 1 1 dp a h n e r ，2 0 0 7 ，j o u m a lo fm o l e c u l a rb i o l o 影) 3 1 2r g s 蛋白的结构 i s 蛋白发挥调节作用不是孤立的。首先，一个完整的r g s 蛋白分子结构中不同的功 能结构域之间存在相互影响，其次，不同的r g s 蛋白分子之间以及与胞内其它分子之间的相 互作用都可能对r g s 蛋白的功能产生影响。r g s 结构域是r g s 蛋白对g a 发挥g a p 活性的 结构基础。 研究发现，r g s 结构域可以单独和g c c 相互作用，并产生g a p 活性。去掉r g s 结构域， r g s 蛋白将丧失q 心活性。r g s 结构域与模仿g t p g 仅水解过程中的过渡态的 g d p m g ”砧f - 4 g c c 有极高的亲和力，r g s 蛋白可以直接和优先结合活性的g t p g a 价 g t p g 、g t p g c 【1 2 1 3 和g t p - g c c s 。 r g s 蛋白分子除了共同保守的r g s 结构域以外，在r g s 结构域的两侧还存在多种不同 数量及长短不一的其它结构域。由于这些结构域直接和或间接的作用，既可能影响到r g s 蛋白自身的q 廿活性，也可能引发新的信号反应，甚至在g 蛋白信号途径与其它信号途径 的交联中产生重要影响，如p d z 、p t b 以及g o l o c o 基序等。p d z 结构域是蛋白质相互作用 元件，它通过与靶蛋白c 末端的特定基序( 一般由3 4 个氨基酸组成) 结合而发挥作用，如 r g s l 2 的p d z 结构域与i l 8 b 受体( c x c i 匕) 的c 末端s t t l 片段选择性结合，对c x c r 2 信号转导起调节作用。p t b 结构域也是蛋白质互作的元件，既与其它蛋白的磷酸化残基如磷 酸化酪氨酸结合，也可以与非磷酸化残基结合，其确切作用有待于进一步研究( n e u b i ga n d s i d e r o v s k i ，2 0 0 2 ) 。 1 0 扬州大学硕士论文 3 2r g s 作用的分子机理 目前，有三种机制解释r g s 在体内作用于g 蛋白信号转导。首先，r g s 是一种加速 g a g t p a s e 活性的蛋白( g t p a s e a c c e r e l a t i n gp r o t e i l l s ，g a p s ) ，可以加速g o 【g t p ( 活化态) 向g u g d p ( 非活化态) 转变，进而终止信号转导。例如，当在眦k 2 9 3 细胞中过表达时r g s 4 和g h 相互作用蛋白( g a 一血e r a c t i n gp r o t e i n ，g a d ) 削弱了缓激肽( g q 介导) 和生长激素抑 制剂( q 介导) 的信号转导，这种抑制效应是由于其g a p 活性所致( h 印1 e r 甜以，1 9 9 7 ) 。 第二，i 埝s 作为一种效应物的拮抗剂，阻止g 蛋白与其效应物的相互作用。例如，重组磷脂 酶c ( p h 0 s p h o l i p a s ec p l ，p l c p 1 ) 能使r g s 4 结合到g q - g d p - 烈f 4 。，因而r g s 4 能抑制p l c p 1 催化的磷酸基醇的水解( h e p l e r 以，1 9 9 7 ) 。第三，g t p 水解后，通过提高g 仅与所亚基 的亲和力，加速了异三聚体的重新形成。i 砺s 改变了可以和效应物相互作用的游离阶亚基 的数目。这种结论来自于以下发现：( 1 ) r g s 4 过表达削弱了i l 8 和蛙皮素激活的m a p k 活 性( d m e y 甜以，1 9 9 6 ) 。( 2 ) r g s 2 、r g s 4 和r g s 8 过表达，加速了g 蛋白介导的k + 通道 的关闭( s a j t o h 甜以，1 9 9 7 ) 。 3 3r g s 蛋白的胞内定位 r g s 蛋白的特异性依赖于它的胞内定位。现有的实验证据表明，g 蛋白定位于细胞膜上， 并与跨膜受体紧密联系。而r g s 蛋白存在于细胞中的两个库，即胞质库和膜结合库。且许多 r g s 蛋白可以从胞质转运至膜上( d e 、啊e sa n df a r q u l l a r ，2 0 0 0 ) 。 迄今为止，只有极少数r g s 蛋白在胞内得到精确定位，s 蛇，g 触p ，r g s z l ，r g s 3 ， r g s 4 ，r g s 7 ，r g s 9 都属于膜结合型，另有r g s 4 ，s 蛇，r g s 9 和g a i p 等蛋白己在亚细 胞水平进行了定位。通过免疫电镜、酵母免疫荧光分析等技术研究表明，r g s 蛋白定位于胞 质和质膜的比率依赖于细胞的类型。目前对于r g s 蛋白的亚细胞区分定位还知之甚少。 4 拟南芥中r g s 蛋白 高等植物细胞内是否也存在类似哺乳动物的r g s 蛋白? 如存在，其作用机制又是如何 的? 这些一直是植物科学工作者亟待解决的科学问题。2 0 0 3 年，c h e n 等首次在拟南芥基因 组序列中发现一段与编码哺乳动物r g s 蛋白基因序列同源性很高的序列( 么吠铡， a y 0 9 1 1 4 2 ) ，该序列( 基因) 编码的蛋白质由4 5 9 个氨基酸组成，包含氨基酸末端区和羧基 末端r g s b o x ，其中氨基酸的2 4 8 个氨基酸组成了一个7 次跨膜的结构域( 7 1 m ) ，它与g p c r 的拓扑结构相似，羧基末端( 从氨基酸2 4 9 4 5 9 ) 存在一段r g s - b o x ( 图4 ) 。 顾杰：a 激g s l 蛋白的定位及在葡萄糖信号转导中的功能研究 l l c 。 7 = 一= = 一- = 一一：= 一= 。气，- = ：一_ - - _ - = 。翟： ；：器：嚣了燃；意器：黜嚣毙嚣嚣：器盐；燃嚣：黜：器：嚣：鬻：嚣 燃掰獬器：嚣：嚣：幂器搿翟嚣：端；踌磷嚣瑟鬈焉嚣茹茹器嬲磊嚣品嚣强 b 且g d l 91 “r v c z l 口p t f v 3 l d 以v i e g i m 【t m 0 8 p h t p d n 0 l q r r r l 口柙e “t 明i e 峨嘲p2io ：嚣搿= ；怒粼：嚣篇器嚣：蛊怒鬻鼢鬻罢：= 器：嚣器：搿器篙：裟灌 嘘口s 1 3 5 1 摹t f z v 融e 坩 田s 孵粕 i l t ! o n h t 盯o “ l | 。! x 0 蟮鲫l 摹d 碰z 搿i z ，i - - _ i c m “口p p u f ，p p “m “m n i 【m m o “p p p 9 p p 图4 拟南芥a 垠g s l 蛋白结构及序列比对 f i g 1s t m c t 山eo f 彳，口6 蚴豇r g s 1p r o t e ma n ds e q u e n c ea l i g n m e n t ( c h e n “甜，2 0 0 3 ，s c i e n c e ) 进一步研究表明，a t r g s l 蛋白定位于质膜上，与g a 亚基有很强的相互作用，具有很高 的g a p 活性，且参与了细胞增殖和对糖信号响应等过程的调节( c h e n 甜以，2 0 0 3 ：c h e na n d j o n e s ，2 0 0 4 ) 。应用a t r g s l 突变体倍，2 的研究结果显示，与野生型和g a 亚基突变体印口，一4 相比，僻，j 一2 种子萌发对春化作用、葡萄糖和蔗糖的抑制作用不敏感，对a b a 低敏。不同基 因型种子萌发对a b a 响应差异主要是由于内源a b a 水平的差异，葡萄糖对璃，2 种子突变 体细胞内编码a b a 合成的两关键酶( n c e d 3 和a b a 2 ) 基因表达水平影响不显著。推断葡 萄糖对种子萌发的抑制效应是通过提高内源a b a 含量，且a t i s 1 在此途径中作为一种重 要的信号分子起调节作用( c h e n 甜口正，2 0 0 6 a ) 。另外，a 侃g s l 过表达转基因植株表现出高 的抗旱能力，同时，渗透胁迫处理对a t r g s l 蛋白的亚细胞定位也产生了显著的影响( c h e n 甜以，2 0 0 6 b ) 。以上结果说明，拟南芥a t i s 1 蛋白对g 蛋白介导的信号转导具