（物理化学专业论文）基于无机生物有机纳米杂化膜电极的传感、抑制动力学研究及其应用.pdf

李庆波：基于无机生物有机纳米杂化膜电极的传感、抑制动力学研究及其应用 摘要 一基于纳米碳酸钙构筑的抑制型多酚氧化酶生物传感器研究及应用 基于纳米碳酸钙修饰的多酚氧化酶电极所制备的一种高可逆和高灵敏度的安 培型生物传感器被成功地用来测定食品中的防腐剂苯甲酸。苯甲酸的检测是通过 对d t o n a n o c a c 0 3 修饰在玻碳电极上的抑制作用完成。本文详细的研究了酶的底 物类型和底物浓度对抑制作用的影响。电位控制在卸2 0 v ( 相对于标准电极电位 s c e ) ，检测苯甲酸时所选用的底物儿茶酚的浓度为6 “m 。这种抑制型的生物传感 器对苯甲酸有快速的时间响应( 间甲基酚 苯酚 对氯苯酚，其值分别为：5 3 2 9 ，3 3 5 7 ，3 2 2 9 ， 3 1 7 1 和9 4 3m am jc i t l 。表观米氏常数根据酶和底物之间的动力学方程求得。 其值分别为：o 2 5 6 ，o 1 5 7 ，0 0 6 3 ，0 0 4 3 和0 0 3m m 【13 1 。表观米氏常数越小，表明 酶和底物之间的亲和力越强。这些数据表明：从酶与底物之间的亲和力和抑制过 程的效率来看，两者是相矛盾的。与酶的活性中心结合显示出最大亲和力的底物 导致了测定苯甲酸时灵敏度最低。 与其它底物相比，苯甲酸对儿茶酚的最低检测限为4 1 0 培m 。这些实验结果 表明儿茶酚是抑制实验最合适的底物。因此，在下面的实验中，选择儿茶酚作为 酶的底物。 对于抑制型的生物传感器，必须不断改变底物浓度以获得正确的结果【1 8 】。 t a b l e 2 1i n n u e n c eo fc a t e c h 0 1c o n c e n t r a t i o no nb e n z o i ca c i di n h i b i t i o na t i y r o n a n o - c a c 0 3e l e c t l o d e ( 4 0p g 2 0 “g ) 从表中可以看出，最大电流抑制百分比与儿茶酚的浓度无关，大小都接近于8 0 。 而灵敏度与儿茶酚的浓度有着内在的联系，即在同样的放大倍数下，灵敏度随着 儿茶酚浓度的增加而增大。当儿茶酚的浓度达到1 2p m 时，灵敏度最大。可逆性 对于生物传感器的应用也是一个重要的参数。在本文中，可逆性用公式表示为： 李庆波：基于无机生物有机纳米杂化膜i 乜极的传感、抑制动力学研究及j e 戍用 3 l i o 俨，其中i o 表示加入儿茶酚的电流响应值，i o 表示加入苯甲酸后的电流下降值。 当酶的底物浓度越大，可逆性将越差。这可能是由于底物的阻碍作用造成的【9 1 。当 酶的底物浓度为6 州时，此生物传感器对苯甲酸显示出很高的灵敏度和较宽的线 性范围。因此，在下面的实验中，选择儿茶酚的浓度为6 “m 作为酶的底物浓度。 2 3 2 酶膜厚度对抑制剂苯甲酸的影响 为了获得最优条件下的安培型生物传感器对苯甲酸的测定，我们研究了含有 五种不同量的铬氨酸酶的膜厚度对苯甲酸的影响。不同比例t y m ，n a l l o - c a c 0 3 混合 后沉积在电极表面，当n t 0 n a i l o c a c 0 3 比值固定为2 时，膜的厚度对苯甲酸的测 定效果较好。苯甲酸的灵敏度丌始随着铬氨酸酶量的增加而增加，当铬氨酸酶的 量为3 0 “g 时，灵敏度达到最大，然后逐渐降低。所得结果列于表2 2 。 t a b l e 2 2i i l n u e n c eo f b i o c o a t i n g t h i c k n e s s o nb e n z o i ca c i di n h i b i t i o na t t y r o n a l l o - c a c 0 3e l e c t r o d e c a t e c h 0 1c o n c e n t r a t i o nw a s 丘x e da s6p m 另外，可逆性的变化也显示出相同的趋势。生物膜越厚，短时间内滞留在生物膜 3 2 扬州人学硕十学位论文 内的苯甲酸较难洗去，其可逆性就越差。当生物膜厚度太薄( t ) n a i l o c a c 0 3 ，2 0 p l o 肛g ) ，固定的酶容易从生物膜中脱落，这也将导致其可逆性太差。而且，酶 的量太少，显著的底物抑制作用将发生【9 】。当铬氨酸酶的量比较少( 3 0p g ) ，此生物 传感器对抑制剂具有最高的灵敏度和可逆性。传感器中酶的量较少，能给抑制型 的生物传感器提供最好的分析性能，这和e v t u g ) ，i l e ta 1 报道的实验结论相一致【1 9 】。 所以在进一步的实验过程中选择铬氨酸酶的量为3 0 g 进行研究。 2 3 3 温度对抑制剂苯甲酸的影响 温度是影响生物传感器分析性能的一个最重要的参数。我们在应用电位为 _ o 2 v ，儿茶酚的浓度为6 “m ，苯甲酸浓度为2 0 “m 的条件下，研究了不同温度 条件下d t o n a n o - c a c 0 3 电极的电流响应。所得结果为图2 2 中b 曲线。 2 1 1 8 1 5 1 2 宣 o 9 0 6 o 3 o o 0l o2 0 3 04 05 06 0 t ，o c f i g u r e 2 2t i l ee 仃e c to ft 锄p e 咖l r eo nm ei n l l i b i t o d ，o fm e t ) 哟n a i l o - c a c 0 3b i o e l e c t r o d e r e s p o n s et o6p mc a t e c h o l ( a ) a n d6 “mc a t e c h o l + 2 0 “mb e n z o i ca c i d ( b ) ：印p l i e d p o t e n t i a l _ o 2v 李庆波：基于无机生物有机纳米杂化膜i 乜极的传感、抑制动力学研究及j e 应用 3 3 从图中可以看出，电流响应随着温度的升高逐渐增大，在4 5 。c 时达到最大。在底 物儿茶酚中含有苯甲酸的条件下，可以观察到相同的现象。根据缸t h e i l i u s 方程， l i l f _ ! 璺丝二互 r 2 其中：r 为气体常数，r 为温度，彳为频率因子。表观活化能( 尾) ，可以从直线的 斜率求得，分别为3 8 3 和2 4 6l ( j m o l 一，其中3 8 3k j m o l 。1 是不含有苯甲酸的活化 能，2 4 6k j 恤o l 。是含有苯甲酸的活化能。尽管曲线a 和b 在4 0 比在2 5 时的 电流响应值大1 9 ，但考虑到生物传感器的寿命和可操作性，我们最终选择了2 5 作为实验的最终温度。 2 3 4t y r o n a n o c a c 0 3 电极对苯甲酸的分析性能 图2 3 中左半部分是加入6p m 儿茶酚的安培电流增大的响应值。右半部分是 在含有底物儿茶酚的溶液中持续加入苯甲酸后的安培电流下降值。从图中清楚地 看出苯甲酸抑制了固定在n a i l o c a c 0 3 基质中的铬氨酸酶的活性。苯甲酸每次加入 后，可观察到电流快速地下降。此生物传感器的响应时间即苯甲酸达到最大响应 所用的时间少于5 s 。随着苯甲酸浓度的增加，抑制百分比也增大( 图2 3 中插入的 a 曲线) 。典型的测定苯甲酸的抑制曲线如图2 3 中的b 曲线。底物儿茶酚的浓度 固定为6 “m 。图2 3 中曲线a 表明t ) n a n o c a c 0 3 修饰电极随着时间的变化对 苯甲酸的响应。苯甲酸浓度的对数和抑制百分比之间呈线性关系。线性范围为5 6 1 0 9 2 1 0 巧m ，相关系数r 为0 9 9 3 6 ，n 为1 5 。此线性范围比用碳纳米管修饰 的铬氨酸酶测得的范围要宽【2 0 1 。最低检测线为8 0 l o 8m ，比传统的高效液相色谱 ( h p l c ) 【2 1 1 和气相色谱( g c ) 川测得的值要低。i o 5 ，即抑制剂浓度达到抑制信 号5 0 ，从图2 3 中的数值计算得出为1 2 9 l m 。这个值低于溶液中铬氨酸酶测定 的值【2 2 】和通过丝网印刷修饰的铬氨酸酶电极测定的值【2 3 1 。与报道的结果相比，苯 甲酸对此生物传感器的抑制具有较低的i o 5 ，可能是由于n a i l o c a c 0 3 的微环境所 致，从而引起了此生物传感器的灵敏度对底物有显著的提高。 扬州人学硕一i ：学位论文 1 4 1 2 1 o o 8 ： - 一0 6 o 0 2 o o o2 0 04 0 06 0 08 0 0l o o o1 2 0 0 1 o o1 6 0 01 8 0 0 t ，搿 f i g u r e 2 3t h er e v e r s i b i l i t yo fi n l l i b i t i o no f b e n z o i ca c i dt om e1 o n a n 0 一c a c 0 3 m o d i f i e dg c e ( a ) 聊i c a lc 岍e n t t i m er e c o r d i n g sa tm et ) 哟n a n o - c a c 0 3 m o d i f i e dg c eu p o ni n c r e a s i n gv a r i o u sc o n c c n t r a t i o n so f b e n z o i ca c i d a p p l i e dp o t e n t i a l ，- 2 0 0m v ；o 1m p b sc o n t a i n i n g6 肛mc a t e c h 0 1 ( b ) a n o t h e r r e s p o n s eo f t h es 锄eb i o e l e c t r o d et o6 mc a t e c h 0 1a r e rc o n t a c t i n gw i t h b e l l z o i ca c i da n d 曲s i n gw i mp b ss i m p l y 1 n s e ta ：r e l a t i o n s l l i p b e t 、e e i lt h e i i l l l i b i t i o np e r c e i l t a g ea i l dt h ec o n c e n t r a t i o no f b e n z o i ca c i do b t a i n e d 行o m t h ed a t ao fc u n ，ea i n s e tb ：l i n e 撕z a t i o no fm ec a l i b r a t i o nc u r v ei n ( i n s e ta ) o b t a i n e do nas e i i l i l o g a r i t l l i n i cs c a l e 这些结果再次表明铬氨酸酶的活性很好地保持在研o n a i l o c a c 0 3 杂化的纳米复 合物中。尤其是这种t ) 哟n a n o - c a c 0 3 修饰的高灵敏度的生物传感器发展成为一种 在较低的浓度条件下来测定苯甲酸的有效的抑制型生物传感器。此外，对于儿茶 酚的初始响应，即酶活性在磷酸缓冲溶液中孵化1 0 m i n 即可恢复。此数据还表明 t ) n a n o c a c 0 3 电极对儿茶酚的响应保持了初始响应值的l o o ( 图3 曲线b ) 。 这种性能显示苯甲酸的抑制作用是可逆的，这与先f j i 的文献报道是一致的【1 0 ，1 2 1 。 这使得此生物传感器可能持续地测定苯甲酸。 李庆波：基于无机生物有机纳米杂化膜i 乜极的传感、抑制动力学研究及】虑用3 5 2 3 5 抑制动力学研究及机理 众所周知，传感器的制备程序影响底物及酶的抑制动力学。因此，在这篇文 章中，苯甲酸对t ) t o n 觚。一c a c 0 3 修饰电极的抑制动力学研究被提出。 通过分析d t o n a l l o c a c 0 3 电极对抑制剂的电流响应和儿茶酚浓度之间的关 系来研究抑制机理( 图2 4 a ) 。 o2 0 04 0 06 0 08 0 01 0 0 01 2 0 0 l c a t e c h o q p m f i g u r e 2 4 ( a ) c a l i b r a t i o nc u r v e so f t ) n a i l o c a c 0 3e l e c 仃o d e f o rc a t e c h o l i n0 1m p b s ( p h6 ) c o n t a i n i n g0p m ( a ) ，2 0p m ( b ) ， 4 0p m ( c ) ，6 0p m ( d ) a i l d8 0 州b e n z o i ca c i d ( e ) 从上图可得到图2 4 b ，且得到它们具有相似的最大电流响应值“嘲= 1 5 1 5p m ) ，但 是具有不同的表观米氏常数聊) ，这两个值是在含有不同苯甲酸浓度条件下得到 的。 扬州人学顾。l ：学位论文 - 知 薯 二 _ 【( ：a t e c l l o l 】- 1 ji l m 。1 f i g u r e 2 4 ( b ) l i n e w e a v * b u r kp l o t sf o rt h ec a t e c h 0 1w i t h o u t ( a ) a n d w i t h 2 0p m ( b ) ，4 0 “m ( c ) ，6 0p m ( d ) a l l d1 0 0 “mb e n z o i ca c i d ( e ) i n s e ti is h o w st h ep l o to fk h 8 p pa g a i n s tc o n c e n t r a t i o no f b e n z o i ca c i d 根据k 。和3 p p 得出苯甲酸参与了竞争性反应，且苯甲酸与铬氨酸酶的甲酚酶的 活性部位结合【2 4 】。可能的抑制反应机理如下： e+ s 等e s 玉e + p e i i l 其中，e ，s ，i n ，p 分别代表铬氨酸酶，底物儿茶酚，抑制剂苯甲酸和产物邻苯二醌。 + m u 瓦 李庆波：基于无机生物自机纳米杂化膜电极的传感、抑制动力学研究及其应用 3 7 抑制剂在结构上和底物必然与酶的活性中心相关联，并且它们之间相互竞争。在 d e l l ge ta 1 ，【8 】a n dm o r a l e se ta 1 ，【1 川两篇文章中，苯甲酸的抑制效应也是个竞争性 的抑制过程。 根据苯甲酸在不同的儿茶酚浓度条件下对t ) n a i l o c a c 0 3 生物电极的抑制， 再由d i x o n 方程计算出表观抑制常数k ( 图2 4 c ) 。其值为1 7 1 肛m ，与石墨聚四氟 乙烯修饰的铬氨酸酶生物传感器在可逆的溶胶介质中所测得的结果相吻合【1 0 】。 r 1 “1 j 崎 一 c 夕a 1 2 。 1 o 。 ， o 8 o 6 - o 4 k i o 2 夕 钐- - 0 【b e 北o i ca c i d 】p m f i g u r e 2 4 ( c ) d i x o np l o t so ft h eb e n z o i ca c i di i l l l i b i t i o na t t y r 0 n 觚。一c a c 0 3b i o e l e c 仃o d ei nm ep r e s e n c e2 0p m ( a ) 3 0 “m ( b ) 4 0p m ( c ) 锄d8 0 “mc a t e c h o l ( d ) 扬州人学硕i ：学位论文 2 3 6 苯甲酸抑制体系分析实际样品 通过使用t 舯n a n o c a c 0 3 修饰的电极来测定饮料中的苯甲酸浓度是可行 的。选择了四种样品进行试验以此验证此生物传感器的实用性。苯甲酸的量根据 标准曲线可计算出。所得结果列于表2 3 。 t a b l e 2 3d e t e 玎n i n a t i o no f b e n z o i ca c i di ns o m e 嘶n k sb yt y r o n a l l o c a c 0 3 e l e c t m d e 锄dc o m p a r i s o nw i t hh p l cm e m o d 测得的结果与高效液相色谱法( 国标，g b t 5 0 0 9 2 9 2 0 0 3 ) 进行了比较。相对误 差在可接受范围之内。计算结果显示通过用t y r 0 n a n o c a c 0 3 修饰电极测得的结果 和用高效液相色谱法所测得的结果相一致，表明了应用这种先进的 t y r o n a n o c a c 0 3 修饰电极测定饮料样品中的苯甲酸是可行的。 2 4 结论 在本章中，我们发展了一种基于把t ) 哟诱捕到n a i l o c a c 0 3 膜中测定苯甲酸的 生物传感器。动力学解释了b t o n a l l o c a c 0 3 电极对没有和含有不同浓度下的苯甲 酸的儿茶酚溶液的安培响应，得出了此反应是一种竞争型的抑制过程。可以想象， 这种先进的生物传感器具有低成本，构造简单，响应快速，高的灵敏度和非常好 的可逆性等优点，它将在食品应用方面变得商品化和市场化。 李庆波：基于无机生物有机纳米杂化膜i 乜极的传感、抑制动力学研究及其应用3 9 参考文献 1 p a i l ，z ；w a n g ，l ；m o ，w ；w a n g ，c ；h u ，w ；z h a n g ，j a n a lc h i ma c t a 2 0 0 5 ，5 4 5 ， 2 18 2 2 3 【2 d o n g ，c ；w a n g ，w a n a lc h i ma c t a 2 0 0 6 ，5 6 2 ，2 3 2 9 3 e u r o p e a np a r l i 锄e n ta n dc o u n c i ld i r e c t i v en o 9 5 2 e c ，f e b m a 巧19 9 5 4 d o n g ，c ；m e i ，y ；c h e i l ，l jc h r o m a t o 黟a 2 0 0 6 ，1 11 7 ，1 0 9 - 11 4 5 】t h o m a s s i n ，m ；c a v a l l i ，e ；g u i l l a u m e ，y ；g u i n c h a r d ，c jp h a n nb i o m e da n a l ， 1 9 9 7 ，1 5 ，8 3 l 一8 3 8 6 l a b a t ，l ；k u m m e r ，e ；d a l l e t ，p ；d u b o s t ，j p jp h 砌b i o m e da n a l ，2 0 0 0 ，2 3 ， 7 6 3 7 6 9 7 r e v i e j o ，a j ；f e m a n d e z ，c ；l i u ，f ；p i n g a r r o n ，j m ；w r 姐g ，j a n a lc h i ma c t a 1 9 9 5 ，3 1 5 ，9 3 9 9 8 d e n g ，q ；d o n g ，s j a n a l y s t ，1 9 9 6 ，1 2 1 ，1 9 7 9 - 1 9 8 2 9 s 骶f i 试k ；k a a t z ，h ；b a u c g ；m a k o w a ；s c h u l m e i s t t ；s c h e l l f w ； s z e 酉e t e s ，t ；m a l l e n d w ；1 1 1 0 m a s ，p j ；r o s e n b e n mt b i o c h 锄i s 吼1 9 9 9 ，3 8 ， 1 2 2 1 3 3 10 m o r a l e s ，m d ；m o r a n t e ，s ；e s c 唧a ，a ；g o n z a l e z ，m c ；r e v i e j o ，a j ； p i n g a n o n ，j 。m t a l a n t a ，2 0 0 2 ，5 7 ，l18 9 一l l9 8 1 1 t o p 9 u ，s ；s e z 西n 僦km k ；d i n 眯a ”，e b i o s e l l sb i o e l e c 昀n ，2 0 0 4 ，2 0 ， 5 9 2 5 9 7 1 2 】s h a n ，d ；s h i ，q f ；z h u ，d b ；x u e ，h g1 、a l a m a ，2 0 0 7 a ，7 2 ，1 7 6 7 1 7 7 2 1 3 】s h a i l ，d ；z h u ，m ；h a i l ，e ；x u e ，h g ；c o s n i s b i o s e i l sb i o e l e c t i o n ，2 0 0 7 b ，2 3 ， 6 4 8 6 5 4 【1 4 w a n g ，y ；c h e n j f p o w e rs c i e l l c ea n dt e c l l i l 0 1 0 夥1 9 9 8 ，4 ，5 1 1 【1 5 】d u c k w o n h ，h w ；c o l e i i l a n ，j e jb i oc h e i i l ，1 9 7 0 ，2 4 5 ，1 6 1 3 - 1 6 1 7 【1 6 】d a l ，j c ；e s t e b a i l ，s ；g i l ，j ；c a s t i l l o ，j r t a l a n 饥2 0 0 6 ，6 8 ，7 9 1 7 9 9 【1 7 】s h a l l ，d ；m o u s 劬c ；c o s n i s a n a lc h 锄，2 0 0 4 ，7 6 ，1 7 8 一1 8 3 18 】s e z g i n 位r k ，m k ；g 6 k t u 季，t ；d i n 9 k a y a ，e f o o dt e c h r l ob i o t e c h h o l ，2 0 0 5 ，4 3 ， 3 2 9 3 3 4 【1 9 e v t u g y n ，ga ；b u d n i k o v ，h c ；n i k o l s k a ) 码e b 1 a l a n t a ，1 9 9 8 ，4 6 ，4 6 5 - 4 8 4 扬州人学硕：学位论文 2 0 】z 1 1 a o ，q ；g u a i l ，l ；g u ，z ；z 1 1 u a n g ，q e 1 e c t r o a n a l y s i s ，2 0 0 5 ，1 7 ，8 5 - 8 8 2 l 】s a a b ，b ；b 撕，m f ；s a l e h ，m l ；趾瑚a d ，k ；t a l i b ，m k m jc h r o m a t o ga 2 0 0 5 ，10 7 3 ，3 9 3 3 9 7 2 2 k a h l l ，v ；a n d r a w i s ，a p h ”o c h e m ，1 9 8 5 ，2 4 ，9 0 5 - 9 0 8 2 3 w a n g ，j ；n a s c i m e n t o ，vb ；k a n e ，s a ；r o g e r s ，k ；s m ”h ，m r ；a n g n e s ，l 1 a l a n t a 1 9 9 6 ，4 3 ，1 9 0 3 1 9 0 7 2 4 s t a n c a ，s e ；p o p e s c u ，i c ；o n i c i u ，l t h l a n t a ，2 0 0 3 ，6 1 ，5 0 1 - 5 0 7 2 5 】n a t i o n a ls t a n d a r do fc h i n a ，g b t 5 0 0 9 2 9 - 2 0 0 3 ，t h ed e t e c t i o nm e t h o do fs o r b i c a c i da n db e n z o i ca c i di nf o o d s t u f f s ，n a t i o n a ls t a n d a r dp r e s s ，b e i j i n g ，2 0 0 3 ( c h i n a ) 李庆波：基于无机生物自机纳米杂化膜电极的传感、抑制动力学研究及其心用4 1 第三章基于自组装膜l a p o n i t “c h t 中辣根过氧化酶 直接电化学及应用 3 1 引言 酶作为生物催化剂具有高效、高选择性、催化反应条件温和及无污染等特点， 引起研究者的广泛关注。在众多酶的研究中，过氧化物酶占有重要地位，尤其以 辣根过氧化物酶( h r p ) 的研究居多。辣根过氧化物酶( h r p ) 是一种对氢受体有特 异性、对氢供体缺乏特异性的酶，是过氧化物酶中最重要的化合物，它参与诸多 不同类型的生理过程，如生物活化氧分子和生物合成细胞壁等。h r p 以血红素为 氧化还原中心；由于来源方便、提纯容易，因此，一直被作为研究过氧化物酶结 构、热力学和动力学性质的代表性化合物，特别是被广泛用于阐明过氧化物催化 氧化底物的生物过程。关于h r p 的结构、动力学性质及在分析化学中的应用等已 有若干综述性文章报i ：苣【1 。3 1 。 酶作为一类典型的生物大分子和特殊的催化剂，在生命过程中扮演着极其重 要的角色。尤其是在呼吸链中生物氧化和新陈代谢是靠多种酶的共同作用才完成 的。研究酶的直接电化学无论在理论上还是在应用中都具有重要意义。在理论上， 酶与电极之间的直接电子传递过程更接近生物氧化还原系统的原始模型，这就为 揭示生物氧化还原过程的机理奠定了基础。另外，酶直接电化学的研究也可望为 推断澄清生物氧化还原系统中电子传递反应的特异性提供一定的理论依据。在应 用上，酶直接电化学可用于研制第三代生物传感器和发展生物燃料电池【4 】。因此， 以h i 冲为代表的酶的直接电化学研究引起人们的广泛关注。 酶的直接电化学，即酶与电极间的直接电子转移，在裸电极上很难实现，其 氧化还原电化学反应通常是不可逆的，原因主要是：酶的分子很大，结构复杂， 氧化还原中心被深埋于酶蛋白之中，很难接近电极表面，阻碍了其与电极间的电 子转移；氧化还原酶吸附在电极表面常伴有变形，变形后的蛋白质经常经历不可 逆的电化学反应并影响其自由扩散分子的电子转移；蛋白质表面电荷分布的非均 4 2 扬州入学硕 ：学位论文 匀性，影响了其电子反应的可逆性；蛋白质分子量较大，在低浓度的溶液中产生 的响应电流一般较小，其信号容易被电容电流、残余电流等掩盖掣5 1 。因此，实现 酶的直接电化学，需要满足以下两个条件：一是缩短酶的活性中心与电极间的距 离，二是保持或提高酶的生物活性，对底物进行响应。 自组装单分子膜( s e l f - a l s s e m b l e dm o n o l a y e r s ，s a m s ) 是分子通过化学键自发吸 附在固液或气固界面而形成的有序分子组装体系，是研究表面和界面现象的理想 模型。与其它单层膜相比，它们具有制备条件简单、有序度高、稳定性好及缺陷 少等优点，此外，s a m s 还具有热力学稳定、能量较低、易于用近代物理和化学 的表征技术研究等特点，也便于调控膜结构和性质之间的关系。因此，其在生物 分子电子学、生物传感器领域等均具有广阔的应用前景【铺】。 近年来，通过静电吸附用于生物分子的固定化方法已逐渐用于各种生物传感 器的制备。以聚电解质阴、阳离子的静电吸附作用以及与生物分子通过多层交替 自组装制作的各种生物敏化膜，较传统的共价交联与包埋等固定化方法所构成的 生物膜具有生物分子活性好、性能稳定和制作简便等优点【9 】。 纳米粒子具有比表面积大、催化活性高、亲和力强等特点，用于固定生物组 分备受关注。将h r p 固定于金纳米粒子表面，制得的h i 冲a u 胶粒修饰电极，不 需媒介体便能直接催化还原h 2 0 2 ，说明金微粒与h i 冲作用缩短了酶活性中心与电 极表面的距离，实现了直接电子传递过程【i 们。用自组装膜吸附纳米金粒，再固定 h r p ，其辅基血红素直接与电极表面交换电子，且能催化还原h 2 0 2 。此外，研究 者还发现，h 对在电极表面的覆盖量和催化效率与金粒大小有关，直径越小，催 化效率越高。 受以上成功的研究了自组装技术所鼓舞，我们试图设计了一种新的固定h r p 的方案。选择了无毒、非常好的化学惰性和生物相容性的无机粘土1 a p o n i t e 作为 设计的模板。研究表明，人工合成的粘土具有更多的优良性质【1 1 1 。合成的粘土可 以人为控制其多方面特性。诸如其成分、孔径和离子交换能力等。粘土阳离子交 换容量( c e c ，m e 彤1 0 0 9 ) 用可交换阳离子的总量来表示，可交换阳离子分布在粘土 粒子表面的内、外部。有机阳离子可降低矿物的表面能，同时也改善矿物与聚合 李庆波：肇于无目u 生物干机纳水杂化膜电投的传感、抑制动力学研究敷j 应用 物载体之间的润湿作用，使无机粘土矿物与大多数高分子具有很好的相容性。当 l 印o n i t e 悬浮在二次水中的浓度小于1 09 1 4 时，l a p o l l i t e 的结构单元被破坏并且完 全分层后板层堆积在一起形成带负电的胶状悬浮液。另外，l a p o n i t e 具有粘土所有 的特性。如：由于其在水溶液中容易发生溶胀而导致其疏松多孔，能为化学反应 提供惰性的环境，较好的吸附能力，特殊的结构特征和强大的阳离子交换能力 旧“ 。自组装过程如图3 1 。壳聚糖中的氨基和羧基首先发生缩台反应，通过共价 键合到电极表面。在p h 等于7 的条件下，壳聚糖表面带有部分的正电荷【i ”，而 l a p 0 1 1 i t e 带有部分的负电荷，由于静电作用，l a p o n i t e 被固定在电极上，然后带正 电荷的h r p 也由于同样由于静电作用被固定到电极表面。基于这样的体系中，可 以得到h r p 的一对氧化还原峰。自组装过程通过光电子能谱( x p s ) 和交流阻抗 ( e i s ) 及h r p 的电化学行为进行了详细的研究。 n g l l r e 3 1s t e p w 岫s e l 仁船s 锄b l y p c e d u r e s o f h r p 九a p o n i t e ，c h t m o d m e d g c e 扬州人学硕1 ：学位论文 3 2 实验部分 3 2 1 试剂 辣根过氧化物酶( h r p ) 购于f 1 u k a 公司。壳聚糖( c h t ，m w 1 1 0 6 9 0 脱乙酰作用) 购于中国医药集团上海化学试剂公司。l 印0 1 1 i t e 来于r o c k w o o d s p e c i a l i t i e si n c ( p r i n c e t o n ，n j ) 。所有的水溶液都用二次蒸馏水配制，其它所有试剂 都是分析纯，使用时没有进一步提纯。双氧水溶液在使用前现配。缓冲溶液用的 是0 0 2 5 m 磷酸缓冲液液( p b s ) ，所需不同p h 可用磷酸或n a o h 溶液调配。 3 2 2 仪器 x 射线光电子能谱( x p s ) 分析在e s c a l a b 2 2 0 i x l 型多功能x 射线光电子 能谱仪上测定。紫外分析在u v - 2 5 5 0 型紫外光谱仪上测定。所有的电化学反应都 在常规的三电极体系中进行，并且保证在氮气饱和的环境中，电位均相对于饱和 甘汞电极( s c e ) 。实验中以圆盘玻碳电极( 直径3m m ) 为工作电极，铂丝为辅助 电极，饱和甘汞电极为参比电极。制作酶电极前先把圆盘玻碳电极在涂有0 0 5 岫 氧化铝粒子的丝绸上仔细打磨光滑，再用二次蒸馏水冲洗干净并在空气中晾干。 所有响应电流的测定都在2 5 的磷酸缓冲液中进行。6 6 0 a 型电化学工作站( 上 海辰华仪器公司) 。制作酶电极实验所用仪器有k q l l 8 型超声仪( 昆山市超声仪器 有限公司) ，可调式微量移液器( 上海热电仪器有限公司) ，p h s 2 5 型p h 计( 上 海雷磁仪器厂) ，9 0 型磁力搅拌器( 上海泸西分析仪器厂有限公司) 。 3 2 3 自组装h r p l a p o n i t e c h i t o s a n 玻碳电极制备 将壳聚糖粉末溶于1 0 叭的醋酸溶液中搅拌形成1 o 叭壳聚糖溶液，再用 二次水稀释成o 5 - o 的壳聚糖溶液。l a p o n i t e 溶液( 0 5m gm 1 。) 通过把l 印o n i t e 置于二次水并搅拌过夜获得。辣根过氧化物酶溶解在0 0 2 5 m 的磷酸缓冲溶液中， 浓度为2 m g m l 。 首先，将预先打磨处理干净的玻碳电极表面羧基化，即在外加电位为1 5 v 的 李庆波：基于无机生物有机纳米杂化膜l 乜极的传感、抑制动力学研究及) 应用 4 5 条件下，浸在硝酸和重镉酸钾的混合溶液中氧化五分钟；接着将其浸没在o 5 的 壳聚糖溶液中，控制温度为5 0 ，控制时间为1 0 个小时：然后将其转移之0 5 m m l 的i 印o n i t e 溶液中，静置1 0 个小时；最后将电极浸在2 m g m l 的辣根过氧化物酶 溶液中静置1 2 个小时。将制备好的玻碳电极浸入o 0 2 5 m o l l 的p h7 o 的p b s 溶 液中过夜。电极不用时将之浸入p h7 0 的p b s 溶液中并放入4 的冰箱中保存待 用。 3 3 结果与讨论 3 3 1 电极自组装过程的表征 3 3 1 1 x 射线光电子能谱( x p s ) 8 7 0 0 善枷 o 3 0 0 2 0 0 1 2 9 52 2 8 52 2 7 5 b i n d i n 9 e n e 嗜y ，d v 4 04 55 56 5 b i n d i n ge n e 哼y ，e v 舢 姗 | | 姗 差耄 姗 、嚣c，oo | 言 啪 啪 啪 枷 枷 o 、芒；oo 扬州人学硕l ：学位论文 、 c 3 o o b i n d i n ge n e r g y ，e v f i g u r e 3 2a - dr e p r e s e n te a c hs t 印i nt h es e l f - a s s 啪b l y p r o c e d u l e so fh r p 1 a p o n i t e c h tm o d i f i e dg c e 为了验证自组装每一步的实现过程，我们通过x p s 进行了表征。图3 2 a 是自 组装过程的第一步，从图中可以看出，在2 8 8 6 e v 处出现了峰值，这与给出的标准 x p s 的羧基结合能相一致，表明了玻碳电极表面成功地实现功能羧基化。图3 2 b 是自组装过程的第二步。由于这层组装的是壳聚糖，里面含有氮元素，从图上可 以看出，很明显氮在