（生物物理学专业论文）胞内钙离子荧光显微检测系统的研制.pdf

华中科技大学硕士学位论文 摘要 为了实现胞内钙离子浓度的检测，本文设计了一种新型的胞内钙离子浓度荧光显微 检测系统。论文的工作主要有两部分：单色激发光源系统的设计和微弱荧光检测系统 的设计。 单色激发光源系统中，短弧氙灯发射的光经椭球反射镜聚焦后采用离轴抛物面反射 镜准直成平行光，通过光栅的衍射分光后采用三片型会聚物镜把光能量聚焦到光纤端 面，光纤的另一端面输出单色光。设计时，采用光路偏折的方法，有效地克服了灯源 的噪声，另外，本系统采用易于加工的椭球反射镜代替目前国际上应用比较广泛的超 环面镜。 微弱荧光检测系统中，用光电倍增管采集荧光探针发出的弱荧光，并转化为电信号， 通过增益调节电路和贝塞尔滤波电路对光电倍增管输出的电信号进行放大和滤波。 全文的研究内容主要可分为三个部分。第一部分介绍了单色激发光源系统的结构与 设计过程，重点讨论分光系统的设计，并得出波长控制关系。第二部分论述了微弱荧 光检测系统的设计，采用光电倍增管检测荧光信号。第三部分详细描述了实验过程的 安装、校准及验证过程，首先介绍仪器的安装与调试以及波长校准的过程，然后利用 该系统进行胞内钙离子浓度的检测，得到满意的实验结果。 关键词：单色激发光源光学设计光学系统微弱荧光检测系统 胞内游离钙离子浓度 本论文工作由国家自然科学基金科学仪器基础研究专款( 批准号3 0 3 2 7 0 0 1 ) 和重点项目( 批准号 3 0 1 3 0 2 3 0 ) 资助。 华中科技大学硕士学位论文 a b s t r a c t i no r d e rt od e t e c t c a 2 + i ，an o v e lf l u o r e s c e n tm i c r o s c o p ys y s t e mt od e t e c t c d + ii n l i v i n gc e l lh a sb e e nd e s i g n e d t h em a i nw o r ki sd i v i d e di n t ot w os e c t i o n s ：t h ed e s i g nf o r m o n o c h r o m a t o ra n dt h ed e s i g nf o rt h es y s t e mt od e t e c tt h ef a i n tf l u o r e s c e n ts i g n a l i nt h es y s t e mo fm o n o c h r o m a t o r ，t h el i g h tf r o mt h es h o r t a r cx e n o nl a m pi sf i r s t c o n v e r g e db y t h ee l l i p s em i l t o r , t h e nc o l l i m a w x lb y p a r a b o l o i d a lm i r r o r , a n dd i f f r a c t e db y t h e g r a t i n g ，a t l a s tf o c u s e di n t ot h ef i b e rb yt r i p l e - l e n sw h o s em o t h e re n d e x p o r t t h e m o n o c h r o m a t i cw a v e i nt h ed e s i g no ft h i ss y s t e m ，t h eo p t i c a la x i sr e d i r e c t i o nm e t h o di s e m p l o y e d ，e f f i c i e n t l yr e d u c i n gt h en o i s eo f t h el a m p ，a n dt h i ss y s t e mu s e st h ee c o n o m i c a l e l l i p s em i r r o r ，n o t t h et o r o d i a lm i r r o r i nt h i se q u i p m e n tt od e t e c tt h ef a i n tf l u o r e s c e n ts i g n a l ，t h ew e a kf l u o r e s c e n c ee m i t t e d f r o mf l u o r e s c e n tp r o b e si sc o l l e c t e db yt h ep m t , c o n v e r t e dt oe l e c t r o n i cs i g n a lt h a ti st h e n a m p l i f i e d a n df i l t e r e db yt h ea m p l i f i e ra n db e s s e lf i l t e r t h em a i nc o n t e n to ft h ep a p e ri sd i v i d e dt ot h r e es e c t i o n sa sf o l l o w s ：t h ef i r s tp a r t c o n c e r n st h es t r u c t u r ea n dd e s i g no ft h em o n o c h r o m a t o ra n dt h er u l eo fc o n t r o l l i n g w a v e l e n g t h t h ee m p h a s e s i nt h i sp a r ti st h ed e s i g no ft h e s y s t e m t od i s p e r s et h el i g h t t h e s e c o n dp a r ti n t r o d u c e st h ed e s i g nf o rt h es y s t e mt od e t e c tt h ef a i n tf l u o r e s c e n ts i g n a l i nt h e s y s t e m ，w e u s ep m tt od e t e c tt h ef l u o r e s c e n ts i g n a l t h el a s tp a r t p a r t i c u l a r l yd e s c r i b e sa n d t h ep r o c e s si n c l u d i n gs y s t e mi n s t a l l a t i o na n dw a v e l e n g t hc a l i b r a t i o n t h e n ，u s i n gt h i ss y s t e m ， w e g e tt h e s a t i s f a c t i o n a le x p e r m e n tr e s u l t s k e yw o r d s ：m o n o c h r o m a t o r ，o p t i c a ld e s i g n ，o p t i c a ls y s t e m ，s y s t e mt od e t e c tt h ef a i n tf l u o r e s c e n ts i g n a l i n t r a c e l l u l a rc a 2 + c o n c e n _ 【r a t i o n ( c a 2 + 】i ) t h i sw o r kw a ss u p p o g e d b y t h ef u n df o rf u n d a m e n m lr e s e a r c ho f s c i e n t i f i ci n s t r u m e n t s ( n o 3 0 3 2 7 0 0 1 ) a n dt h eg r a n to f a k e yp r o g r a m ( n o 3 0 1 3 0 2 3 0 ) f r o mt h en a t i o n a ln a t u r a ls c i e n c ef o u n d a t i o no f c h i n a i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的 研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：闲么堕 日期：砂哆年j - 月2 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即： 学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许 论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存和汇编本学位论文。 保密口，在 本论文属于不保密盯。 年解密后适用本授权书。 ( 请在以上方框内打“”) 文作：肉云易艚教脚：胎吏 日期：神7 1 年，月目日期：夕e o 年f 月垆日 华中科技大学硕士学位论文 1绪论 1 1胞内游离钙离子浓度的作用及测量方法 作为重要的第二信使，细胞内游离钙离子( c a 2 + ) 几乎调控着细胞内所有的生理活动 1 1 。钙离子从生命的开始就触发受精过程，控制细胞的发育和分化成为特定类型的细胞， 然后调节各种生理活动，最后参与细胞的调亡过程【2 】。一般地说，细胞内的钙离子浓度 ( c a 2 1 i ) 比细胞外的钙离子浓度( c 神o ) 约低4 个数量级 3 】。例如在生理条件下，胰腺b 细胞内的静息 c a 2 + 】i 约为o 1um ，而胞外 c 神。则为1 8 m m 左右，正是这种浓度差成为 c 2 + 发挥生理作用的基础。 在不同生理条件下，定量检测胞内自由钙离子浓度( 【c a 2 + 】0 及其变化是细胞生物物 理研究的重要内容。在测定 c a l i 的诸多方法中，利用荧光标记法测定单个活细胞内游 离钙离子浓度具有较多优点：1 ) 荧光探针易导入细胞，为非损伤性测量法。2 ) 荧光 图像分析技术可提供细胞内钙离子分布的二维或三维图像，并可实时显示，空间分辨 率优子其它方法。3 ) 反应速度快，一次采样检测时间仅需数毫秒。因此，基于荧光探 针标记法的活细胞钙离子浓度检测系统得到了广泛的应用 4 ，5 1 6 7 8 9 1 。 下面以f u r a 一2 作为荧光探针为例，简单介绍其测量原理1 6 j 。由于f u r a - 2 不能自由通过 细胞膜7 1 ，目前的实验中，通常采用两种方法使f u r a - 2 进入细胞，一是利用膜片钳形成 全细胞模式，使电极内液与细胞内液打通，以致内液中的f u r a 2 扩散至胞内。另一种方 法采用f a r a 一2 a m 孵育细胞的方法来处理。利用f u r a - 2 a m 较强的亲脂性，可以穿透细胞 膜进入胞浆，随后又能被特定的酯酶水解成为活性的t i a r a - 2 。f a r a 2 再与游离c a 2 + 结合， 结合物的荧光激发谱会 c a 2 + 浓度的不同而发生变化，即光谱发生偏移，如图1 1 所示。 当激发荧光波长为3 4 0 r t m 左右时，荧光强度随钙离子浓度升高而上升，而当激发荧光波 长为3 8 0 m n 时，荧光强度随钙离子浓度升高而下降，在f u r a - 2 的等荧光强度点3 6 0 n t o 时， 其荧光强度与结合的c a 2 + 浓度无关。这样， c a 2 + 】i 就可以直接由两个激发波长上的荧光 强度的比值来计算。 华中科技大学硕士学位论文 图1 1 荧光探针f u r a - 2 的激发光谱( 监测波长为5 1 0 h m ) 1 2 胞内钙离子浓度检测系统的结构 典型的胞内钙离子浓度荧光显微检测系统的结构1 1 ，1 2 】如图1 2 所示。 圈1 2 胞内钙离子浓度荧光显徽检测系统的原理图 整个系统主要包括以下几个部分：单色激发光源系统、耦合系统、荧光显微镜、 微弱荧光检测系统、计算机等。原理简述如下：单色激发光源在计算机控制下发出所 co一兰oxm oqcoo价世03一上 华中科技大学硕士学位论文 需要的单色激发光，经光纤和耦合系统被引入荧光显微镜，并聚焦到样本平面，激发 细胞中的荧光探针发出荧光，微弱荧光检测系统( 包括电荷耦合器件c c d 和光电倍增 管p m t ) 采集弗记录荧光信号，最后输入计算机进行数据处理。 1 3 本文研究的主要内容 本文从基本理论出发，详细论述了胞内钙离子浓度荧光显微检测系统的原理、设 计、安装、调试和实验验证的过程。本文主要内容如下： 第二章主要论述了单色激发光源系统的设计。首先介绍单色激发光源系统的结构 及系统中各个关键元件选择、设计的依据。重点论述氙灯和闪耀光栅的设计，接着用 p w 方法设计三片型会聚物镜的初始结构参数，并用z e m a x 软件校正其象差。最后给 出系统输出的单色光波长和光栅旋转角间的对应关系。 第三章介绍了微弱荧光检测系统的设计。介绍传感器以及滤波器的选取和设计， 并用查表法快速实现四阶贝塞尔滤波电路的设计。 第四章详细介绍了实验过程以及实验结果。首先介绍胞内钙离子荧光显微检测系 统的安装与调试，以及用多波段窄带滤光片精确校准波长的过程，得出激发光源系统 的光谱输出，并与德国t i l lp h o t o n i c sg m b h 公司的单色光源系统做比较；最后用该 系统测定了p c 1 2 细胞正常情况下胞内自由钙离子浓度以及在高c 去极化刺激下胞内 自由钙离子浓度的变化。 第五章是对全文总结，并对胞内钙离子浓度荧光显微检测系统的改进和发展方向 做一展望。 华中科技大学硕士学位论文 2 单色激发光源系统的设计 2 1 单色光源系统简介 从图1 2 可以看出，单色激发光源是整个胞内钙离子浓度荧光显微检测系统中一个 很重要的部分，它的作用是根据选用的荧光探针的特性输出需要的单色激发光。激发 光的波长精确性、能量和光谱纯度都会影响测钙的实验效果，因此合理设计单色激发 光源系统对胞内钙离子浓度荧光显微检测实验非常重要。 为了得到更好的实验结果，对单色激发光源系统提出了以下要求 1 3 】：( 1 ) 输出的激 发光波长可以连续调节；( 2 ) 由于胞内钙离子浓度荧光显微检测实验中所用荧光探针的 平均吸收波长的峰值从紫# b ( 3 0 0 n m ) n 黄绿光( 5 9 5 n m ) ，因此要求单色激发光源系统在 此波长范围内输出的能量均要满足实验要求；( 3 ) 在保证输出能量的前提下，提高光谱 纯度。 单色光源系统主要由三个部分组成：照明光源和聚光镜，分光系统以及接收系统 【1 4 1 ，如图2 1 所示。由照明光源发出的光束通过聚光镜会聚到小孔s ，形成近似点光源； 由点光源发出的光束通过准直物镜0 1 ，准直成平行光束后射入分光元件d ；由于色散 元件的作用使进入的单束白光分解成多束单色光，再通过物镜0 2 按波长顺序成像于焦 面f f 上，接收系统选择性地接收单色光。下面分别介绍单色激发光源系统中各部分的 设计。 s0 1d 0 2 妙 弋 汗 _ - 一 仆 、 乏辩多 图2 1 典型的单色光源系统的原理图 4 华中科技大学硕士学位论文 2 2 照明光源和聚光镜的确定 2 2 1 照明光源的选觏 单色激发光源巾照秘光源静选铎取决予荧光搽钟静我收光谱。翔前辑逑，施内 钙离予浓度荧光显微检测实验中所用的荧光探针的平均吸收波长的峰值的范围是 3 0 0 n m 5 9 5 n m ，具有这些光谱的较常见的强光源有商压汞灯和氨灯h ”。 离压慕灯是剥惩金属泶蒸汽在超高压下放电发光的厦瑷卷4 成盼，光度强，弧长 短，能量比较集中，但是它的光谱不逡续，在某些波段强度磁，如图2 2 ( a ) 所承【1 ”，因 我它豹使曩裁受到谖线豹疆铡。亵匿短弧羲烬缀好妻鏊克鼹7 遽令缺熹，它铡怒揍性气 体氙气在高压下放电发光的舔理制成，发光光谱与太阳光谱棚近，如网2 2 所示，烧 连续畿谱，波峰在4 5 0 n m 5 0 0 n m 之溺，在熬个需要麓波长菰番0 。翔瓤5 9 5 勰) 肉巍 谱平缓。在采集不同的单色光时不会发生明擞的能量波动。窕的操作很方便，启动立 即点燃，发巍过程中，弧光穗定，色游不变，而且它的光遗激、辉魔都很高，使用寿 命很长，医此零文采用短弧甄灯作为照昵光源。 图2 2 超高腿汞灯( 曲和短弧氖灯蝴的光谱图【本豳引1 1 1 1 6 上海电光器件有限公司生产的中小功率鬣弧氤j ：豹瓶格蜀主要技术参数览表2 1 。 选择瓴灯型号时，主要考虑功率、极间距离、光通鬟等几个关键参数。考虑剿对细胞 的损伤，设计此单色光源系统时，不疑选用功率太高的氙灯，通常选用7 5 w 藏1 5 0 w 懿氧灯。极润距离壹羧影穗畿斑静走谤输出，极趣鼯离太丈，会搜哉斑的亮度降馁势 使电流不稳定，太小会使工作工作电压过低，电极损耗增大。综合考虑功率和极间距， 本系绫采焉x q 7 5 垄缀灯律必熬疆光源，它翡毙逶塞楚t 2 0 0 t m ，霹菝缓好遗漩是实羧 5 华中科技大学硕士学位论文 要求，它的亮度分布如图2 3 所示。 表2 1 上海电光器件有限公司生产的中小功率短弧氤灯的规格与主要技术参数 冷却 电源工工作电流a主要尺寸m m方式 型号功率电压作额全安外光中极间风冷 w ( 直流) 电 定使用范围 长装径心高距离速度 v 压v 值 长 度( m s ) x q 3 5 3 5 3 51 1 532 5 - 3 5 8 57 51 03 70 1自然 x q 7 5 7 5 5 01 553 5 51 0 08 2 1 44 01自然 x q l 5 0 1 5 0 5 01 8 585 8 1 5 01 2 51 96 22 4自然 x q l 5 0 1 1 5 0 5 01 8 585 81 5 51 3 0 2 2 6 0 35 x q 2 0 0 2 0 0 5 01 7 51 2 7 1 21 3 d1 0 72 35 33 5 x q 3 5 0 3 5 0 5 0，2 21 61 5 1 71 3 3 1 2 02 36 52 9 5 x q 4 0 0 4 0 0 5 01 92 11 3 2 1 1 5 01 2 52 76 03 4自然 x q 4 5 0 - 1 4 5 0 5 01 92 51 7 2 5 1 1 81 0 02 76 0 4 自然 x q 4 0 0 2 4 0 0 5 01 92 l 1 3 - 2 11 4 61 2 22 76 3 3 4自然 x q 5 0 0 5 0 0 5 02 02 51 7 - 2 51 7 5 1 5 03 17 3 4 自然 x q 5 0 0 - 1 5 0 0 5 0 2 02 517 - 2 51 3 51 4 83 l6 6 4 自然 x q 7 5 0 7 5 0 5 02 33 32 0 3 3 2 0 01 7 53 68 0 4 5自然 x q 7 5 0 - 2 7 5 0 5 02 13 6 2 0 3 8，1 3 61 2 43 65 6 4 自然 x q l 0 0 0 1 0 0 0 6 52 24 5 3 0 - 4 53 2 0 2 7 54 31 2 55自然 x q l o o o - 2 1 0 0 0 6 5 2 24 53 0 4 52 7 52 3 0 4 31 0 35自然 x q l 0 0 0 - 3 1 0 0 0 6 52 24 5 3 0 4 52 0 0 1 7 54 08 04 55 由图2 3 可以看出，短弧氙灯的整个电弧亮度分布很不均匀，阴极附近亮度最高， 在离阴极d = 0 0 7 1 0 ，亮度最大，随着接近阳极亮度逐渐降低。亮度沿着横截面上的 分布是对称的。必须采取相关的措施克服氙灯电弧亮度分布在纵向不均匀的问题a 6 华中科技大学硕士学位论文 2 2 2 聚光镜的设计 圈2 3 短弧氤灯电弧的亮度分布示意图 采用聚光镜可以很好地解决氙灯电弧发出的光束不均匀的问题，因为聚光镜能把氙 灯发出的光束会聚到一个小孔上。设计一个好的聚光镜，就可以把小孔近似为一个均 匀发光的点光源。 聚光镜一般有两种形式：透射型和反射型。透射型聚光镜的应用比较广泛，实现简 单，但是它容易产生色差，而且光束透过它以后总会有部分被吸收，产生损耗；反射 型聚光镜很好的克服了上述缺点，它不会产生色差，而且在反射过程中光线并没有透 过任何光学材料，不会产生吸收损失。因此本文采用反射型聚光镜。 图2 4 椭球反射镜的原理 华中科技大学硕士学位论文 由于聚光镜的作阁是把氤灯发出的光束会聚到一个小孔上。本文选用的短弧氙灯， 光发巷霉集孛，设计浆光镜辩霉疆把裁灯近繇梵点党滚。嚣魏，聚必镜戆终怒是熹瓣 点成像，可以采用椭球反射镜实现。它的原理如图2 4 所示，在短焦处的点光源发出的 光线邋过穗球反射镜发射磊，冒瓠在椭球的长焦处成完善象。 荧光探针的吸收特性要求激发波长的光谱范屡是3 0 0 n m 5 9 5 n m ，为了减小背景光 的干扰，设计单色激发光源时，要求滤去波长大于5 9 5 n m 的w 见光和红外光。因此本 文选用椭球冷反光镜t 它的内表面镀镌4 壤密光学冷反必干涉朕系，对可见党茅曩紫外光 ( 冷光) 高反射，红外光( 热光) 商透过。 淀阳汇撼光学鼓零骞鼹公霹生产熬髓球冷反射镜缝缀好蟪渍是本文戆设诗爨要，京 的技术参数和产品型母参数分别如表2 2 和2 + 3 所示，其中出射端面的数值孔径用式2 。l 求密。 k a = 9 3 l 红箨先平蚜透遘率 7 5 嚣，粪鍪篷 瓣 | 使用温度范围 - 4 0 + 4 2 0 i 平均寿命 1 0 0 0 ，j 、对 8 华中科技大学硕士学位论文 表2 3 椭球反射镜的产品型号参数 产品型号口径底孔直高度短焦长焦出射端数 d ( m m )径d ( m m )h ( m m )f l ( m m )f 2 ( m m ) 值孔径 h b1 2 2 0 一t 3 8 03 8 07 51 8 36 08 0 00 ，2 9 4 3 h b l 2 2 0 t 3 6 03 6 07 51 7 56 08 0 00 2 7 6 8 h b l 2 2 0 一t 3 4 03 4 07 5 1 4 36 08 0 00 2 5 0 5 h b l 2 2 0 t 3 1 83 1 86 01 4 26 54 5 50 4 5 2 9 h b l 2 2 0 一t 3 1 03 1 07 5 1 2 06 08 0 00 2 2 2 2 h b l 2 2 0 一t 1 8 01 8 04 08 82 55 3 0 0 1 9 9 5 h b l 2 2 0 - t 16 01 6 0 4 07 73 02 1 00 5 1 5 4 h b l 2 2 0 一t 1 4 01 4 0 2 75 62 82 5 20 3 3 6 3 h b l 2 2 0 一t 1 0 41 0 42 7 5 01 4 52 0 00 3 2 7 5 h b l 2 2 0 t 0 9 09 0 1 85 31 41 6 5 0 3 7 2 8 h b l 2 2 0 - t 0 8 08 0 2 23 51 51 2 00 4 2 5 8 h b l 2 2 0 - t 0 7 07 0 1 8 54 1 l o1 3 00 3 6 6 0 h b l 2 2 0 一t 0 6 56 5 1 63 3l o1 0 0 0 4 3 6 4 h b l 2 2 0 - t 0 5 0 5 01 3 73 7 9 25 0 60 8 7 8 4 2 3 分光系统的设计 2 3 1 准直物镜的确定 如前所述，准直物镜把点光源发出的发散光准直成平行光。理想情况下，可以采 用抛物面镜作为准直元件，如图2 5 ( a ) 所示，由图可| 丛看出，同轴抛物面反射镜的平行 光传播方向与光轴平行，这就给后续的光路设计带来了困难，因此本文采用离轴抛物 面反射镜实现光路的准直，如图2 5 ( b ) 所示，选用德国k u g l e r 的离轴抛物面反射镜， 焦距，兰3 8 1 m m ，口径西- - - - 2 5 4 m m ，离轴角度6 0 。 粤 华中科技大学硕士学位论文 ( a ) 2 3 2 分光元件的设计 图2 5 抛物面反射镜的工作原理 ( a ) 同轴抛物面反射镜，( b ) 离轴抛物面反射镜 如前所述，短弧氙灯照明时，发出类似与日光的连续光谱，选取其中某个波长的 光波作为激发光是本章的一个重点和难点。目前，单色激发光源系统根据其工作原理 不同可以分为滤光片分光和衍射光栅分光两种。采用滤光片分光的单色光源系统简单 实用，成本低，光谱特性由滤光片得到有效保证，但是它只能根据所选用滤光片的特 征，输出某几种特定波长的单色光，无法对波长进行连续调节；光栅式单色光源系统有 效地克n t 上述缺点，它的光谱分辨率很高，在光学扫描器的驱动下，可以高精度地 实现波长的快速、连续调节。 衍射光栅是由大量等间距的狭缝构成的光学元件，它能使入射光的振幅或位相或 两者同时产生周期性空间调制【i l l s 。当入射光的波长远远大于狭缝宽度时，衍射条纹 的强度变化缓慢，可以认为此时光栅没有衍射作用；当入射光的波长远远小于狭缝宽 度时，光栅面就相当于一个平面镜，也不产生衍射；光栅的刻线宽度与使用的波长在 同一个数量级范围内，才会产生衍射作用。 目前应用的比较广泛的衍射光栅有以下几种：平面衍射光栅、闪耀光栅、迈克耳 孙阶梯光栅、凹面光栅、正弦( 振幅) 光栅等。平面衍射光栅的衍射作用使没有色散 1 0 华中科技大学硕士学位论文 的零极占了总能量的很多一部分，这对于光栅的应用是很不利的；闪耀光栅可以克服 这个缺点，它能使能量几乎全部集中到所需要的那一级光谱上去，使光能量从干涉零 极主极大转移并集中到某一级光谱上去，从而使衍射效率大大提高；迈克耳孙阶梯光 栅的光谱级很大，它的自由光谱范围很大，因而这种光栅适于分析光谱线的精细结构， 不适于分光：凹面光栅除产生衍射作用外，还兼有准光和聚焦作用【1 9 1 ，但本文需要光 栅衍射后输出平行光，因此凹面光栅不适用。正弦光栅是对入射光波振幅的调制按正 弦或余弦函数变化的光栅，也就是说它对入射光波的振幅调制不均匀的，本文要求系 统在整个较大的波段范围内输出连续的单色光，采用这种光栅也是不可取的。综合上 面的分析，本文就采用闪耀光栅作为分光元件。 闪耀光栅是平面反射光栅，垂直入射时，其截面如图2 6 所示。这种光栅是以磨光 的金属板为坯子，用楔形钻石刀在其表面上刻划出一系列等间距的锯齿形槽面制成。 槽面与光栅平面之间的夹角r 称为闪耀角。闪耀光栅的巧妙之处是它的刻槽面与光栅 面不平行，两者之间有一角度，使单个槽面衍射的零极主极大和诸槽丽间干涉的零 极主极大分开，从而使光能量转移，集中到需要的能级上去。 2 6 闪耀光橱的截面图 参考基本的物理光学知识，得出垂直入射对，缝衍射的强度分布公式 ，r s i n a | 2 卜厶l 了j n 6 s m 一 o s l n 一 ( 2 2 ) 1 1 华中科技大学硕士学位论文 式中，。是单缝产生的光强度，口= 丁k a s 证臼，女是波矢量，口是缝宽，口是衍射角， j = 等d s i n 毋，d 是缝距。闪耀光栅中，由于光栅面和槽面之间引入了个夹角r ， 就使得闪耀光栅得能量分布可用式2 3 表示： 简写为 f 箬- o ) l 百如m 妒 s m 掣d ( s i n y + s i n o ) l s i n 要d ( s i n ，+ s i n 口) l ，：厶f 业1 2 国 n u s m 一 u s m 一 ( 2 3 ) ( 2 4 ) 式中，= 要d s i n ( r 一口) ，d ：- ；- d ( s i n r + s i n p 由式( 2 3 ) 可以看出，闪耀光栅盼衍射图样的强度分布由两个因子决定：一为单缝衍射 f 要i n o , $ 1 1 1 a s m 一目) l 一 一f ) 因子j l | - ；- d s i n ( y p ) l几 7 ，曲线如图2 7 9 ( a ) 所示，它表示宽度d 的单缝的夫琅和费衍 射强度分布：另一是多光束干涉因子i 生d ( s i n y + s i n o ) f 。i n 竿 l s i n 手d ( s i a y + s i n e ) 曲线如图2 7 ( b ) 所示， 它表示强度为1 单位，相继两束光的位相差为等d ( s i n y s i n 口) 的多光束产生的干涉图 样的光强度分布。所以，可以这样来理解光栅的衍射图样，如图2 7 ( c ) ，它是单缝衍射 图样和多光束干涉图样的组合，是衍射和干涉两个因素共同作用的结果。衍射图样的 光强分布是多光束干涉条纹由单缝衍射因子作强度调制的结果。 华中科技大学硕士学位论文 警。 蛇 量 k-_m-_叫 _-_ ( b ) 图2 7 多缝衍射产生的原理 1 3 华中科技大学硕士学位论文 衍射条绞的裰大使置由多缝干涉辫子决定，由式( 2 3 ) 可知，当满怒条粹： 弓- d ( s i n y + s i n o ) ：掰帮l l q ：0 ，l ，2 ，+ - 3 ， 即d ( s i n r + s i n o 、= 删五 霹，衍砉手条纹取得极大篷，各级圭投大强度必： ，= n 2 厶 s i n 等d s i n 0 , 一奶 要d s i n ( r p ) 元 7 ( 2 5 ) ( 2 6 ) 以上讨论的是光柬垂直与槽面入射的情况，如果入射光线以任意角( o n 射到光栅袭 蚕，莰藏说入麓竞线零| 入了一个镶焦国，毖潜毙撵裁蓑分毒懿透数分蠢表述蕊昃蔫辩 2 2 式加入偏角即可以得出： m 巨竺s m 竺( r - 二o ) 竺+ s m 竺( r - 二0 圳 j 竺兰竺竺! 、1 2 i s i n 三d ( s i n f + s i n 秽) j 2 d 筹 ( 2 7 ) ( 2 8 ) ( 2 9 ) 建制作王芑相间的情况下，闪耀光栅的设计主要考虑鼹个主要因素：闪耀波长； n 刻线密度，其它的技术参数都可由此算出。分析闪耀波长、刻线密度与衍射能量之间 的关系，利予我妇邀耀会遁敬毙援。 由上面的分析可以看出，光栅在灏直入射和斜入射时，它们的能纛分布烧相同的， 灵蔻麓凄发生了镶移，竣交毙耱餐骞重辕窭熬穷淘，毽忿麓了穷蠖，我稻在分辑毙掇懿 闪耀波长、刻线密度与衍射能爨之间的关系时，可以只考虑爨直入射的情况。 设诗对选用竞稻豹l 级光谱，取辫= 1 ，瞧魏可辩，嚣壹入射薅，对于阖耀波长： l 莲 华中科技大学硕士学位论文 目= y ，代入式2 5 即可得出光栅的闪耀角y 和闪耀波长砧之间的关系： 2 d s i n y = 九( 2 1 0 ) 光栅的色分辨本领a 是光栅的一个重要质量指标，它是指光栅能分辨两条波长差 很小的谱线的能力，一般是根据瑞利判据来决定的。光栅的色分辨本领正比于光谱级 次m 和光栅线数，与光栅常数d 无关，可用下式表示： 4 ：二l ：m n ( 2 1 1 ) m 因此，某一波长处能分辨的最小波长差为： 从：三：二l( 2 1 2 ) a 删 由于荧光探针的激发波长范围是3 0 0 m 丑 5 9 5 n m ，光栅的闪耀波长也应该在这个范 围内，才能更好地满足实验要求，计算时选用几个特殊点的波长：3 4 0 h m ，3 8 0 r i m ， 4 0 0 r i m ，4 2 0 r i m ，4 5 0 r i m ，4 8 0 r i m ，5 1 0 r i m ，5 5 0 r i m ，5 9 0 n m 。根据目前的生产工艺，光 栅的刻线数一般为( 单位：条r a m ) ：1 2 0 ，1 5 0 ，3 0 0 ，6 0 0 ，8 3 0 ，9 0 0 ，1 2 0 0 ，1 8 0 0 ，2 4 0 0 。 表2 1 3 列出了已知闪耀波长和刻线密度时，其对应的闪耀角和闪耀波长处的分辨率， 其中闪耀角、色分辨本领、和闪耀波长处的分辨率分别用式2 1 0 、2 1 1 和2 1 2 求出。 由表2 4 可以看出，随着光栅刻线密度的增加，光栅的色分辨本领明显增强，同时 闪耀角也增大。因此为了提高整个系统的分辨率，设计时选用刻线密度较大的光栅， 刻线密度小于6 0 0 可以不予考虑。但是，随着刻线密度的增大就会产生两个问题：( 1 ) 加工成本提高；( 2 ) 降低具体某一波长的能量，因此必须选用合适的刻线密度。下面分 析刻线密度、闪耀光栅与能量之间的关系。 对于非闪耀波长，由式( 2 5 ) 可以得出衍射角和波长之间的关系，用式2 1 0 表示： 口= a r c s i l l 竹- s i n ) , ) ( 2 1 3 ) 取m = l ，并代入( 2 6 ) 式，得出光栅的能量分布和波长之间的对应关系： = n 2 i o s m ! d s i n 驴一a r c s 血一一s 证y ) 2 等蹦n ( y a r c s m p 一s i n y 】) 以 7 ( 2 1 4 ) 华中科技大学硕士学位论文 表2 4 光栅的分辨率、闪耀角与刻线密度、闪耀波长之间的关系 刻线色分闪耀闪耀角闪耀波刻线色分闪耀闪耀角闪耀波 密度辨本波长 y ( 。) 长处的密度辨本波长 y ( 。) 长处的 硝条领 厶( n i l l ) 分辨率讲条领一 九( 衄) 分辨率 j m m )( r i m ) r a m ) ( m ) 1 2 03 3 6 03 4 0i 1 6 90 1 0 11 5 04 2 0 03 4 0l ，4 6 10 0 8 l 3 8 01 3 0 7o 1 1 33 8 01 6 3 30 0 9 1 4 0 01 3 7 50 1 1 94 0 0i 7 1 90 0 9 5 4 2 01 4 40 1 2 54 2 0 1 8 0 50 i 0 0 4 5 0 1 5 4 70 1 3 44 5 01 9 3 40 1 0 7 4 8 01 ，6 5 00 1 4 34 8 0 2 0 6 30 u 4 5 1 0 1 7 5 40 1 5 25 1 02 1 9 2o 1 2 1 5 5 01 8 9 1 0 1 6 45 5 0 2 3 6 40 1 3 l 5 8 01 9 9 4 0 1 7 35 8 02 4 9 3 0 1 3 8 3 0 08 4 0 03 4 02 9 2 30 0 4 1 6 0 01 6 8 0 03 4 05 8 5 4 0 0 2 0 3 8 0 3 2 6 80 0 4 53 8 0 6 5 4 60 0 2 3 4 0 03 4 4 00 0 4 8 4 0 06 8 9 2 0 0 2 4 4 2 03 6 1 20 0 5 0 4 2 0 7 2 3 90 0 2 5 4 5 03 8 7 0 0 0 5 44 鲫 7 7 5 90 0 2 7 4 8 04 1 2 90 0 5 7 4 8 08 2 7 9 0 0 2 9 5 1 0 4 3 8 70 0 6 15 1 0 8 8 0 10 0 3 0 5 5 04 7 3 20 0 6 6 5 5 09 4 9 70 0 3 3 5 8 0 4 9 9 10 0 6 95 8 0 1 0 0 20 0 3 5 8 3 02 3 2 4 0 3 4 0& 1 1 20 0 1 5 9 0 02 5 2 0 03 4 08 8 0 1 0 0 1 4 3 8 09 0 7 3 0 0 1 63 8 09 8 4 6 0 0 1 5 4 0 09 5 5 5 o 0 1 74 0 0 1 0 3 70 0 1 6 4 2 01 0 0 4 0 0 1 84 2 0 1 0 8 90 0 1 7 4 5 01 0 7 6 o 0 1 94 5 0 1 1 6 80 ，0 1 8 4 8 0 1 1 4 9o 0 2 1 4 8 0 1 2 4 70 0 1 9 5 1 01 2 2 2 0 0 2 25 1 0 1 3 2 70 0 2 0 5 5 0 1 3 1 90 0 2 4 5 5 01 4 3 3 0 0 2 2 5 8 01 3 9 3 0 0 2 55 8 0 1 5 1 30 0 2 3 1 6 华中科技大学硕士学位论文 1 2 0 03 3 6 0 03 4 01 1 7 70 0 1 01 8 0 05 0 4 0 03 4 01 7 8 20 0 0 7 3 8 01 3 1 80 0 1 13 8 02 0 0 00 0 0 8 4 0 01 3 8 90 0 1 24 0 02 1 1 00 0 0 8 4 2 01 4 6 0o 0 1 34 2 02 2 2 l0 0 0 8 4 5 01 5 6 60 0 1 34 5 02 3 8 9 0 0 0 9 4 8 01 6 7 40 0 1 4 4 8 02 5 5 90 0 1 0 5 1 01 7 8 2o 0 1 55 1 0 2 7 3 20 0 1 0 5 5 01 9 2 70 0 1 6 5 5 02 9 6 7o 0 1 l 5 8 02 0 3 70 0 1 7 5 8 03 1 4 70 0 1 2 2 4 0 06 7 2 0 03 4 0 2 4 0 80 0 0 5 3 8 02 7 1 30 0 0 6 4 0 02 8 6 90 0 0 6 4 2 03 0 2 70 0 0 6 4 5 03 2 6 80 0 0 7 4 8 03 5 1 70 0 0 7 5 1 03 7 7 3 0 0 0 8 5 5 04 l3 00 0 0 8 5 8 0“1 10 0 0 9 用m a t l a b 数学处理软件求出能量和衍射波长之间的曲线。如图( 2 8 ) 所示。图中， 横坐标表示衍射波长，纵坐标表示衍射能量。图( a ) 、c o ) 、( c ) 、( d ) 、( e ) 、( d 分别是光栅 在刻线密度为6 0 0 ，8 3 0 ，9 0 0 ，1 2 0 0 ，1 8 0 0 ，2 4 0 0 时的能量输出，在具体某一个图中， 如图a ，以峰值为参考点，从左往右依次表示闪耀波长为3 4 0 h m ，3 8 0 a m ，4 0 0 h m ，4 2 0 h m ， 4 5 0 h m ，4 8 0 h m ，5 1 0 h m ，5 5 0 r t m ，5 8 0 h m 时的能量曲线。从图2 8 可以看出，随着刻 线密度的增加，光栅的能量输出曲线越陡峭，而且衍射波长出现截止现象，这一现象 可以从式( 2 1 3 ) 得出，因此从这一点来说，设计时宜选用刻线密度较低的光栅，因为它 的能量输出比较平缓。另外由图可知，在闪耀波长处，衍射能量达到最大值，与闪耀 波长的偏离越大，能量越低，而且闪耀波长左侧的曲线的能量下降趋势比右侧更加明 显，因此，为了使单色激发光源系统在需要的光谱范围内得到尽可能平缓的能量曲线， 选取闪耀波长时，就应该尽可能地考虑低波段的波长。 一_ 一 1 7 能 量 华中科技大学硕士学位论文 能 量 能 量 能 量 图2 8 闪耀光橱的衍射能量与波长、闪耀波长、刻线密度之间的关系 华中科技大学硕士学位论文 综合上面的考虑，本文选用刻线密度为1 2 0 0 线哪，闪耀波长4 0 0 n m 的光栅，它 的能量曲线如图2 8 ( d ) 中的第三条曲线所示。为了减小光损失，光栅的有效使用面积 必须大于离轴抛物面反射镜的口径，同时为了降低成本，设计光栅的有效面积略大于 抛物面反射镜的口径。由于离轴抛物面反射镜的口径函= 2 5 4 m m ，因此，取光栅的有 效使用面积2 8 x 2 8 m m 2 。 为了减小照明光源的干扰，设计时考虑改变系统中光路的传播方向，光栅起到了 重要作用，由于：口= 2 ，= 2 1 3 8 9 。= 2 7 7 8 。“3 0 。，考虑到机械结构的设计以及光 学件加工的方便，选取光栅的离轴角度为3 0 。，它与离轴抛物面反射镜的综合效果刚 好使光路的传播方向改变了9 0 。 2 3 3 会聚物镜的设计 本文采用光纤把从单色激发光源出射的单色光引入显微镜，这有几个优点：( 1 ) 降 低单色光源系统与显微镜装置之间的机械耦合难度：( 2 ) 在数值孔径匹配的情况下，光 纤能很好地收集光能量，提高光束的空间均匀性；( 3 ) 光纤的损耗一般都很小瓠慵“，例 如我们采用的特种石英光纤：芯径1 2 5 r a m ，数值孔径0 2 2 ，损耗小于0 0 2 d b k m 。 选用光纤连接，就要采用会聚物镜把光栅衍射的光线会聚到光纤端面上。下面以光 学设计为重点，按初级像差理论求取会聚物镜的初始结构参数，以供作光路计算校正 象差之用。 由前面的原理可知，此会聚物镜必需能较